CN115141274A - 一种牛奶过敏原β-乳球蛋白特异性纳米抗体及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种牛奶过敏原β‑乳球蛋白特异性纳米抗体及其应用，所述的特异性纳米抗体为纳米抗体Nb115、纳米抗体Nb108、纳米抗体Nb157、纳米抗体Nb82或纳米抗体Nb187中的至少一种。本发明所述的一种牛奶过敏原β‑乳球蛋白特异性纳米抗体制备周期短，成本低，稳定性高，可实现食品中过敏原β‑乳球蛋白的经济高效、高灵敏快速检测。

Description

一种牛奶过敏原β-乳球蛋白特异性纳米抗体及其应用
技术领域
本发明属于食品领域，尤其是涉及一种牛奶过敏原β-乳球蛋白特异性纳米抗体及其应用。
背景技术
食物过敏可引起局部或全身性不适症状，包括荨麻疹、瘙痒、腹部疼痛、腹泻、恶心、头晕或昏厥等，严重者甚至可危及生命。食物过敏性疾病已经成为了一个全球性、公众性的卫生问题，极大地影响了大众的身体健康。目前，尚无快速有效的治疗手段来对食物过敏进行治疗，唯一的办法就是严格避免摄入含有过敏原的食物。牛奶是常见的八类过敏食物之一，在世界范围是很普遍、一致的过敏原，酪蛋白、α-乳白蛋白和β-乳球蛋白为牛乳中的最主要过敏原，其中β-乳球蛋白属于Lipocalin蛋白家族，是乳清中含量最多的蛋白，占牛乳总蛋白的10％，乳清蛋白的50％，而且约82％的牛奶过敏患者对β-乳球蛋白过敏，所以开发对牛奶中过敏原β-乳球蛋白的检测方法至关重要。
食品中β-乳球蛋白的检测方法主要有色谱法(HPLC)、聚合酶链反应(PCR)、基于单克隆或多克隆抗体的酶联免疫吸附法(ELISA)等，色谱法虽灵敏度高，但样品前处理复杂，需要昂贵的仪器，耗时耗力；PCR技术虽简单易行，但不够直观；基于单克隆或多克隆抗体的Elisa，抗体制备周期长，成本高。在驼源动物外周血液中天然存在一种重链抗体(HeavyChain only Antibodies,HCAbs)，与传统单克隆抗体相比，重链抗体天然缺失轻链及重链第一恒定区(CH1)，只包含一个约15kDa的重链可变区VHH，是目前已知的可结合目标抗原的最小单位，称为纳米抗体(Nanobody,Nb)。与传统抗体相比，纳米抗体具有诸多生物化学特性上的优势，易于获得和表达，亲和力强，稳定性好，可以在4℃保存几个月同时保持完整的抗原结合能力，在-20℃甚至能保存更长时间，在高温、极端pH值甚至化学变性剂的极端条件下也能保持固有的结构域稳定性，而且无免疫原性，可以特异性识别多价抗原的特殊表位。目前，纳米抗体被广泛应用于开发治疗性抗体药物、诊断工具(如毒素、肿瘤靶标的检测)、免疫学研究等基础科学研究领域。现有的食品中β-乳球蛋白的检测方法色谱法虽灵敏度高，但样品前处理复杂，需要昂贵的仪器，耗时耗力；PCR技术虽简单易行，但不够直观；基于单克隆或多克隆抗体的Elisa，抗体制备周期长，成本高。
发明内容
有鉴于此，本发明旨在克服现有技术中的缺陷，提出一种牛奶过敏原β-乳球蛋白特异性纳米抗体及其应用。
为达到上述目的，本发明的技术方案是这样实现的：
一种牛奶过敏原β-乳球蛋白特异性纳米抗体，所述的特异性纳米抗体为纳米抗体Nb115、纳米抗体Nb108、纳米抗体Nb157、纳米抗体Nb82或纳米抗体Nb187中的至少一种；
所述的特异性纳米抗体包括3个互补决定区CDR1、CDR2、CDR3；
对于纳米抗体Nb115：所述的CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述的CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述的CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；
对于纳米抗体Nb108：所述的CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，所述的CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，所述的CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示；
对于纳米抗体Nb157：所述的CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示，所述的CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示，所述的CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示；
对于纳米抗体Nb82：所述的CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.10所示，所述的CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.11所示，所述的CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.12所示；
对于纳米抗体Nb187：所述的CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.13所示，所述的CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.14所示，所述的CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.15所示。
进一步，所述的特异性纳米抗体包括4个框架区FR1、FR2、FR3、FR4；
对于纳米抗体Nb115：FR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.16所示，所述的FR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.17所示，所述的FR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.18所示，所述的FR4的氨基酸序列如SEQ ID NO.19所示；
对于纳米抗体Nb108：FR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.20所示，所述的FR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.21所示，所述的FR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.22所示，所述的FR4的氨基酸序列如SEQ ID NO.23所示；
对于纳米抗体Nb157：FR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.24所示，所述的FR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.25所示，所述的FR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.26所示，所述的FR4的氨基酸序列如SEQ ID NO.27所示；
对于纳米抗体Nb82：FR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.28所示，所述的FR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.29所示，所述的FR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.30所示，所述的FR4的氨基酸序列如SEQ ID NO.31所示；
对于纳米抗体Nb187：FR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.32所示，所述的FR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.33所示，所述的FR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.34所示，所述的FR4的氨基酸序列如SEQ ID NO.35所示。
进一步，所述的纳米抗体Nb115的氨基酸序列如SEQ ID NO.36所示；
所述的纳米抗体Nb108的氨基酸序列如SEQ ID NO.37所示；
所述的纳米抗体Nb157的氨基酸序列如SEQ ID NO.38所示；
所述的纳米抗体Nb82的氨基酸序列如SEQ ID NO.39所示；
所述的纳米抗体Nb187的氨基酸序列如SEQ ID NO.40所示。
所述的牛奶过敏原β-乳球蛋白特异性纳米抗体的应用，所述的特异性纳米抗体在食品过敏原免疫检测中的应用。
进一步，所述的特异性纳米抗体在食品过敏原水解片段的免疫检测中的应用。
所述的牛奶过敏原β-乳球蛋白特异性纳米抗体的应用，所述的特异性纳米抗体在食品过敏原表位鉴定中的应用。
所述的牛奶过敏原β-乳球蛋白特异性纳米抗体的应用，所述的特异性纳米抗体在基于抗体的过敏原纯化和示踪的应用。
相对于现有技术，本发明具有以下优势：
本发明所述的一种牛奶过敏原β-乳球蛋白特异性纳米抗体制备周期短，成本低，稳定性高，可实现食品中过敏原β-乳球蛋白及其水解肽段的经济高效、高灵敏快速检测。
附图说明
图1为本发明实施例所述的β-乳球蛋白特异性纳米抗体筛选富集率的柱状图；
图2为本发明实施例所述的β-乳球蛋白特异性纳米抗体筛选筛选阳性克隆图；
图3为本发明实施例所述的β-乳球蛋白特异性纳米抗体蛋白电泳图；
图4为本发明实施例所述的β-乳球蛋白特异性纳米抗体免疫印迹图；
图5为本发明实施例所述的β-乳球蛋白特异性纳米抗体特异性检测免疫印迹图；
图6为本发明实施例所述的β-乳球蛋白特异性纳米抗体免疫捕获β-乳球蛋白电泳及质谱鉴定结果图；
图7为本发明实施例所述的β-乳球蛋白特异性纳米抗体的亲和力曲线图：7-A为纳米抗体Nb82，7-B为纳米抗体Nb108，7-C为纳米抗体Nb115，7-D为纳米抗体Nb157，7-E为纳米抗体Nb187；
图8本发明实施例所述的β-乳球蛋白免疫检测图。
具体实施方式
除有定义外，以下实施例中所用的技术术语具有与本发明所属领域技术人员普遍理解的相同含义。以下实施例中所用的试验试剂，如无特殊说明，均为常规生化试剂；所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
下面结合实施例来详细说明本发明。
实施例1羊驼免疫和纳米抗体文库的构建
选择健康年轻的成年羊驼进行免疫，每隔一周在其颈部***位置注射0.2mgβ-乳球蛋白(sigma)，总共免疫6次。在最后一次免疫后的第三天，通过采血针从羊驼颈部静脉取血，共采取90mL血液。通过SepMateTM管密度梯度离心分离淋巴单核细胞，然后使用TRIzolTM试剂提取淋巴细胞中的总RNA，将提取的总RNA反转录为cDNA之后，通过巢式PCR获得VHH片段。巢式PCR分两轮PCR来进行，第一轮PCR以cDNA为模板，CALL001和CALL002为引物扩增来自常规抗体和重链抗体(HCAb)的可变结构域到CH2结构域之间的信号序列，得到序列长度为～900bp的IgG1抗体重链以及序列长度为～700bp的IgG2和IgG3抗体重链。之后通过1％琼脂糖核酸电泳将这两条带分离，并用QIAquick凝胶提取试剂盒(QIAGEN)将产物中～700bp的条带进行回收纯化。第二轮PCR以回收纯化的产物为模板，用带有NotI和PstI限制酶位点的引物SapI-PMCF primer和VHH-BACK-SapI对第一次PCR回收产物扩增得到VHH片段并通过PCR纯化试剂盒(QIAGEN)纯化。将纯化后的产物和质粒PMECS-GG在SapI和T4 DNA连接酶的作用下完成重组质粒的构建，重组质粒通过苯酚：氯仿：异戊醇(25：24：1)纯化后，电转至大肠杆菌TG1感受态细胞(Lucigen)中，将转化后细胞接种于添加氨苄抗生素的LB琼脂平板上，37℃倒置培养过夜。第二天用细胞刮板对LB平板上的菌株进行收集，重悬于含10％甘油的LB液体培养基中，并于-80℃冻存，同时通过梯度稀释和平板计数，计算文库的库容量，并随机挑选48个单菌落用引物MP57和GIII测定VHH片段的正确***率。
实施例2特异性纳米抗体的筛选和鉴定
进行3次淘选来富集特异性菌株，将1mL纳米抗体文库加入到300mL含有2％(w/v)葡萄糖以及100μg/mL氨苄青霉素的2×TY培养基中，在37℃下以220rpm培养2h，然后利用～1012pfu VCSM13辅助噬菌体室温侵染TG1 30min，离心收集被侵染后的TG1并重悬于300mL含100μg/ml氨苄青霉素和70μg/ml卡那霉素2×TY培养基中，37℃、220rpm过夜培养后，收集上清液，然后用PEG6000/NaCl沉淀并离心收集上清液中的噬菌体颗粒，用1mL无菌PBS重悬。用96孔细胞培养板平板进行富集，以碳酸盐包被液(pH＝9.6)溶解的10μgβ-乳球蛋白作为“+”孔，不含抗原的碳酸盐包被液作为阴性对照“-”孔4℃过夜包被，第二天上午用1％的明胶室温封闭1h，PBST(含0.05％Tween-20的PBS)作为洗涤剂，洗涤5次后加入收集的～1011pfu的噬菌体颗粒，孵育1h后洗涤10次(第2轮和第3轮分别洗涤25次和20次)以除去未结合的噬菌体，然后加入100μL三乙胺(TEA，pH 11.0)孵育10min来洗脱结合的噬菌体，用100μL 1MTris-HCl(pH＝7.4)中和后转移至无菌Ep管中。接下来取10μL收集的噬菌体在96孔细胞培养板圆底板中用PBS梯度稀释至10-7，然后各取10μL不同梯度的噬菌体37℃侵染90μL处于指数生长期的TG1 30min，然后不同梯度各取50μL侵染后的TG1涂于添加氨苄抗生素的LB琼脂平板上，37℃倒置培养过夜。同时，剩余的噬菌体侵染TG1用于重新扩大培养，以备进行下一轮淘选。
从3轮淘选的LB琼脂平板上随机挑选190个单菌落，接种于含10％(w/v)甘油，2％(w/v)葡萄糖和100μg/ml氨苄青霉素的2×TY培养基的96孔细胞培养板圆底板中，37℃过夜培养后，将100μL菌液接种于含0.1％(w/v)葡萄糖和100μg/ml氨苄青霉素的1mL2×TY培养基中，于2mL深孔板中37℃震荡至OD600nm达到1左右，然后每孔加入终浓度为1mM的IPTG，继续37℃震荡4h诱导表达纳米抗体。离心弃去培养基后，通过冻融法获得周质蛋白，并用Elisa进行阳性克隆的挑选，即4℃过夜包被每孔0.5μgβ-乳球蛋白(包被液作为负孔对照)，第二天室温用1％的明胶封闭1h之后，洗涤5次后正负每孔加入100μL(含80μLPBS)溶解于PBS中的周质蛋白室温孵育1h，然后以1:4000稀释的Mouse anti-His MAb(Invitrogen)作为一抗，以及1:4000稀释的带有碱性磷酸酶标记的Goat anti-Mouse MAb(Invitrogen)作为二抗分别室温孵育1h，对硝基苯磷酸二钠作为底物加入后，在OD405nm处测定孵育5min，15min，30min，60min的OD值，正孔OD值大于0.5且为负孔OD值2倍以上的为阳性克隆，即为针对β-乳球蛋白的特异性菌株，结果如图2所示。将挑选的阳性菌株提取质粒后测序，确定纳米抗体的不同序列。
实施例3特异性纳米抗体的表达与纯化
通过质粒小提试剂盒提取筛选最终得到的阳性菌落中的重组pMECS-GG质粒，并将其化转入大肠杆菌WK6感受态细胞中，将过夜培养的菌液加入到1L含0.1％(w/v)葡萄糖、100μg/mL氨苄青霉素和2mM MgCl2的TB培养基中，在37℃下200rpm培养约2-4h直至OD600nm达到0.6-0.9，加入终浓度为1mM的IPTG在28℃下180rpm过夜诱导表达。第二天离心收集菌体，利用渗透压休克法获得周质提取物，通过Ni2+金属螯合亲和层析法纯化特异性纳米抗体，即将HisPurTM Ni-NTA树脂与周质提取物结合1h后，通过在PD-10柱流穿并用PBS洗去非特异性结合的蛋白后，用500mM咪唑洗脱结合的特异性蛋白，然后用尺寸排除色谱法进一步纯化收集特异性纳米抗体，经SDS-PAGE和免疫印迹分析验证后保存在-80℃备用，如图3-5所示。
实施例4特异性纳米抗体靶向过敏原的确证
利用免疫共沉淀(Co-IP)和高分辨液质(LC-MS/MS)对特异性纳米抗体的靶向蛋白进行确证。将β-乳球蛋白抗原和纳米抗体室温孵育1h形成抗原-抗体复合物，之后加入HisPurTM Ni-NTA磁珠与抗原-抗体复合物室温共孵育1h以将结合了抗原的抗体通过His标签结合在磁珠上，经磁力架磁性分离收集磁珠，用PBS洗涤2次后，加入25μL洗脱缓冲液(含250mM咪唑的PBS；pH＝7.4)孵育15min后经磁力架收集含纳米抗体的洗脱液。在非还原条件下通过SDS-PAGE蛋白电泳对复合物进行分离，并切下靶向条带将其胶内酶解后进行LC-MS/MS分析，结果与Uniprot数据库进行序列比对确定过敏原蛋白为β-乳球蛋白，如图6所示。
实施例5纳米抗体亲和力测定
通过间接ELISA法测定纳米抗体亲和力。将溶于100μl PBS中的1μgβ-乳球蛋白4℃过夜包被在96孔板中。1％BSA在室温下封闭1h后，分别加入100000，10000，1000，100，10，1，0.1，0.01，0.001，0.001，0nM浓度的梯度稀释纳米抗体，在室温下孵育1h。用anti-His MAb和HRP标记的Goat anti-Mouse MAb孵育后，以TMB为显色底物进行显色反应并在450nm测定吸光度，结果如图7与表1所示。纳米抗体的亲和力以平衡解离常数(KD)即响应信号为最大值的一半时的纳米抗体浓度表示。
表1牛奶过敏原β-乳球蛋白特异性纳米抗体的性质
Nb82 Nb108 Nb115 Nb157 Nb187
分子量/kDa 15.77 15.40 15.02 15.91 15.92
等电点 7.18 8.61 7.22 7.97 7.18
亲和力/nM 136.8±31.7 114.2±15.4 371.3±28.6 25.42±4.43 285.8±17.8
实施例6竞争Elisa方法的构建
选择其中较佳的一个抗体Nb82来构建竞争Elisa，将一定浓度的的β-乳球蛋白标准品于96孔板中4℃包被过夜，用PBST洗涤5次，然后在室温下用1％明胶室温封闭1h。将β-乳球蛋白标准品与一定浓度的Nb82于板外1.5mL Ep管中室温结合1h，避免了优先加入抗体或竞争抗原产生的实验影响，随后用PBST洗涤5次后，加入100μL 1：5000稀释的anti-HisMAb和HRP标记的Goat anti-Mouse Mab分别作为一抗和二抗，分别于室温下孵育1h。最后，在加入TMB显色液后，用酶标仪测定450nm处的吸光度OD450nm。
实施例7竞争Elisa方法的条件优化：
对包被抗原和检测抗体浓度、封闭液的选择、显色时间等条件分别进行相应优化。
实施例8 ELISA方法标准曲线的建立：
根据优化的条件，构建基于纳米抗体的竞争ELISA检测方法并测定β-乳球蛋白的标准曲线。将1μg/mL的β-乳球蛋白标准品于96孔板中4℃包被过夜，将系列浓度的β-乳球蛋白标准品与检测抗体竞争结合，以抗原浓度的对数值为横坐标，抑制率为纵坐标绘制曲线。根据绘制的曲线选取最佳的线性范围，检测限(LOD)为空白孔平均值加上三倍标准偏差(SD)所对应曲线上的浓度值，定量限(LOQ)为空白孔平均值加上十倍标准偏差(SD)所对应曲线上的浓度值，所构建方法的LOD和LOQ分别为3.3191ng/mL，12.4640ng/mL检测范围为0.0195-10μg/mL，如图8所示。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 南开大学
<120> 一种牛奶过敏原β-乳球蛋白特异性纳米抗体及其应用
<130> 2022.5.26
<160> 40
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Gly Ser Ile Ser Ser Ile Asn Ala
1 5
<210> 2
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Glu Ser Ser Gly Gly Thr
1 5
<210> 3
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Glu Ile Lys Arg Ser Ser Thr Thr Val Trp Tyr Tyr
1 5 10
<210> 4
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Arg Asn Ile Phe Ser Ile Asn Ala
1 5
<210> 5
<211> 7
<212> PRT
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His Ile Ser Gly Gly Arg Thr
1 5
<210> 6
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
Ala Ala Asp Phe Gly Ile Leu Gln Arg Arg Ser Thr Thr Tyr
1 5 10
<210> 7
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
Thr Arg Ser Phe Ser Met Tyr Ala
1 5
<210> 8
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
Ile Ser Gly Ser Gly Arg Asn Thr
1 5
<210> 9
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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Ala Ala Asp Glu Phe Arg Arg Ser Ser Ser Ser Ser Ser Tyr Tyr Tyr
1 5 10 15
Tyr
<210> 10
<211> 8
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<400> 10
Glu Arg Thr Phe Thr Arg Tyr Ala
1 5
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<211> 8
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Ile Ser Ser Ser Gly Ala Ala Thr
1 5
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<211> 17
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Ala Ala Ala Asp Phe Gly Ile Pro Arg Arg Thr Thr Thr Val Tyr Tyr
1 5 10 15
Tyr
<210> 13
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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Gly Arg Thr Phe Ser Arg Asn Ala
1 5
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<211> 8
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1 5
<210> 15
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
Ala Ala Ala Ala Asp Asp Gly Ile Leu Pro Gln Arg Ser Ser Tyr Tyr
1 5 10 15
Tyr Tyr Tyr
<210> 16
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Met Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser
20 25
<210> 17
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
Met Ala Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Val Leu Val Ala
1 5 10 15
Val
<210> 18
<211> 39
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
Thr Tyr His Ala Pro Ser Val Leu Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp
1 5 10 15
Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Arg Asp Glu
20 25 30
Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
35
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
1 5 10
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<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ser Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Pro Ser
20 25
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<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Arg Glu Arg Glu Leu Val Ala
1 5 10 15
Ala
<210> 22
<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn
1 5 10 15
Ala Lys Asn Ala Val Tyr Leu Gln Met Asp Ser Leu Lys Pro Glu Asp
20 25 30
Thr Phe Val Tyr Tyr Cys
35
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<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
1 5 10
<210> 24
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Asn
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser
20 25
<210> 25
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val Thr
1 5 10 15
Ala
<210> 26
<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
Glu Tyr Leu Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn
1 5 10 15
Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp
20 25 30
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
35
<210> 27
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
Phe Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
1 5 10
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<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Asp
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser
20 25
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<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Tyr Val Ala
1 5 10 15
Thr
<210> 30
<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
Asp Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Ala Ile Ser Arg Asp Asn
1 5 10 15
Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp
20 25 30
Thr Ala Val Tyr Phe Cys
35
<210> 31
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
1 5 10
<210> 32
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser
20 25
<210> 33
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 33
Met Ala Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val Ala
1 5 10 15
Thr
<210> 34
<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 34
Glu Tyr Val Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn
1 5 10 15
Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp
20 25 30
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
35
<210> 35
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 35
Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
1 5 10
<210> 36
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 36
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Met Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Ile Ser Ser Ile Asn
20 25 30
Ala Met Ala Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Val Leu Val
35 40 45
Ala Val Glu Ser Ser Gly Gly Thr Thr Tyr His Ala Pro Ser Val Leu
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Asn Leu Arg Asp Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Glu
85 90 95
Ile Lys Arg Ser Ser Thr Thr Val Trp Tyr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Gln Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 37
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 37
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ser Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Pro Ser Arg Asn Ile Phe Ser Ile Asn
20 25 30
Ala Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Arg Glu Arg Glu Leu Val
35 40 45
Ala Ala His Ile Ser Gly Gly Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ala Val Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asp Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Phe Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Ala Asp Phe Gly Ile Leu Gln Arg Arg Ser Thr Thr Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 38
<211> 124
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 38
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Asn
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Thr Arg Ser Phe Ser Met Tyr
20 25 30
Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Thr Ala Ile Ser Gly Ser Gly Arg Asn Thr Glu Tyr Leu Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Asp Glu Phe Arg Arg Ser Ser Ser Ser Ser Ser Tyr Tyr Tyr
100 105 110
Tyr Phe Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 39
<211> 124
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 39
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Asp
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Glu Arg Thr Phe Thr Arg Tyr
20 25 30
Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Tyr Val
35 40 45
Ala Thr Ile Ser Ser Ser Gly Ala Ala Thr Asp Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Ala Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Ala Ala Asp Phe Gly Ile Pro Arg Arg Thr Thr Thr Val Tyr Tyr
100 105 110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 40
<211> 126
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 40
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Arg Asn
20 25 30
Ala Met Ala Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ala Thr Val Ser Gly Ser Gly Ser Asn Ile Glu Tyr Val Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Ala Ala Asp Asp Gly Ile Leu Pro Gln Arg Ser Ser Tyr Tyr
100 105 110
Tyr Tyr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120 125

Claims (7)

1.一种牛奶过敏原β-乳球蛋白特异性纳米抗体，其特征在于：所述的特异性纳米抗体为纳米抗体Nb115、纳米抗体Nb108、纳米抗体Nb157、纳米抗体Nb82或纳米抗体Nb187中的至少一种；
所述的特异性纳米抗体包括3个互补决定区CDR1、CDR2、CDR3；
对于纳米抗体Nb115：所述的CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述的CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述的CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；
对于纳米抗体Nb108：所述的CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，所述的CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，所述的CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示；
对于纳米抗体Nb157：所述的CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示，所述的CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示，所述的CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示；
对于纳米抗体Nb82：所述的CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.10所示，所述的CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.11所示，所述的CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.12所示；
对于纳米抗体Nb187：所述的CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.13所示，所述的CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.14所示，所述的CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.15所示。
2.根据权利要求1所述的牛奶过敏原β-乳球蛋白特异性纳米抗体，其特征在于：所述的特异性纳米抗体包括4个框架区FR1、FR2、FR3、FR4；
对于纳米抗体Nb115：FR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.16所示，所述的FR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.17所示，所述的FR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.18所示，所述的FR4的氨基酸序列如SEQ ID NO.19所示；
对于纳米抗体Nb108：FR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.20所示，所述的FR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.21所示，所述的FR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.22所示，所述的FR4的氨基酸序列如SEQ ID NO.23所示；
对于纳米抗体Nb157：FR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.24所示，所述的FR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.25所示，所述的FR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.26所示，所述的FR4的氨基酸序列如SEQ ID NO.27所示；
对于纳米抗体Nb82：FR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.28所示，所述的FR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.29所示，所述的FR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.30所示，所述的FR4的氨基酸序列如SEQ ID NO.31所示；
对于纳米抗体Nb187：FR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.32所示，所述的FR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.33所示，所述的FR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.34所示，所述的FR4的氨基酸序列如SEQ ID NO.35所示。
3.根据权利要求2所述的牛奶过敏原β-乳球蛋白特异性纳米抗体，其特征在于：所述的纳米抗体Nb115的VHH的氨基酸序列如SEQ ID NO.36所示；
所述的纳米抗体Nb108的氨基酸序列如SEQ ID NO.37所示；
所述的纳米抗体Nb157的氨基酸序列如SEQ ID NO.38所示；
所述的纳米抗体Nb82的氨基酸序列如SEQ ID NO.39所示；
所述的纳米抗体Nb187的氨基酸序列如SEQ ID NO.40所示。
4.权利要求1-3中任一项所述的牛奶过敏原β-乳球蛋白特异性纳米抗体的应用，其特征在于：所述的特异性纳米抗体在食品过敏原免疫检测中的应用。
5.根据权利要求4所述的牛奶过敏原β-乳球蛋白特异性纳米抗体的应用，其特征在于：所述的特异性纳米抗体在食品过敏原水解片段的免疫检测中的应用。
6.权利要求1-3中任一项所述的牛奶过敏原β-乳球蛋白特异性纳米抗体的应用，其特征在于：所述的特异性纳米抗体在食品过敏原表位鉴定中的应用。
7.权利要求1-3中任一项所述的牛奶过敏原β-乳球蛋白特异性纳米抗体的应用，其特征在于：所述的特异性纳米抗体在基于抗体的过敏原纯化和示踪的应用。
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