CN115137827A

CN115137827A - Gata-3基于核酸的灭活剂在制备用于治疗患有th2驱动型哮喘的患者的药物中的用途

Info

Publication number: CN115137827A
Application number: CN202210796084.9A
Authority: CN
Inventors: 约阿希姆·比勒; 乔纳斯·伦兹
Original assignee: Sterna Biologicals & CoKg GmbH
Current assignee: Tern biological preparation Co.,Ltd.
Priority date: 2015-05-15
Filing date: 2016-05-12
Publication date: 2022-10-04
Also published as: RU2017143014A; HUE046190T2; RU2017143014A3; EP3093022A1; BR112017024394A2; RU2720988C2; CA2985858A1; CN107771082A; AU2016264772B2; AU2016264772A1; SI3093022T1; WO2016184556A1; PL3093022T3; JP2018515611A; EP3093022B1; US10487325B2; PT3093022T; CA2985858C; DK3093022T3; KR20180004816A

Abstract

本发明涉及用来治疗TH2驱动型哮喘的GATA‑3抑制剂，尤其涉及指向GATA‑3的DNA酶，其用于患有过敏性哮喘的患者的治疗，其中所述患者特征在于(i)血液嗜酸性粒细胞计数为3％或以上，特别为4％或以上，更特别地为5％或以上；以及/或(ii)血液嗜酸性粒细胞计数为350×10⁶/L或以上，特别为450×10⁶/L或以上；以及/或(iii)呼气一氧化氮分值在40ppb或以上。

Description

GATA-3基于核酸的灭活剂在制备用于治疗患有TH2驱动型哮喘的患者的药物中的用途

技术领域

本发明涉及用于治疗TH2驱动型哮喘的GATA-3抑制剂，尤其涉及用于治疗患有过敏性哮喘的患者的DNA酶，该DNA酶指向GATA-3，其中所述患者特征在于(i)血液嗜酸性粒细胞计数为3％或以上，特别为4％或以上，更特别地为5％或以上；和/或(ii)血液嗜酸性粒细胞计数为350×10⁶/L或以上，特别为450×10⁶/L或以上；和/或(iii)呼气一氧化氮分值在40ppb或以上。

背景技术

慢性炎症令医疗问题领域日益扩大，而该问题具有重大社会经济意义。特别地，慢性炎症包括以下疾病组：自身免疫病和来自风湿性疾病(表现在皮肤、肺、肾、血管***、神经 ***、内分泌***上)领域的疾病，急性过敏性反应和哮喘，慢性阻塞性肺疾病(COPD)，动脉硬化，牛皮癣和接触性湿疹，以及器官和骨髓移植后的慢性排斥反应。在过去的几十年中，许多这类疾病不仅在工业国家，而且有时在全世界呈现出不断增长的发病率。例如，在欧洲、北美、日本和澳大利亚，超过20％的人口患有过敏性疾病和哮喘。慢性阻塞性肺疾病目前是全球第五大常见的致死原因，根据世界卫生组织(WHO)的计算，慢性阻塞性肺疾病将在2020年成为第三大致死原因。动脉硬化与心肌梗死、中风和外周动脉疾病在发病率死亡率统计方面在世界居于首位。连同神经性皮炎，牛皮癣和接触性湿疹通常是最常见的皮肤慢性炎性疾病。

哮喘是常见的气道慢性炎性疾病，包括多变的气道阻塞，黏液分泌过多，气道炎症和增强的气道高反应性。固有免疫应答和适应性免疫应答的失调被认为在疾病发展中发挥核心作用。在不同的患者群体之间，已经确定了高度的个体间异质性，因此定义了几种几种临床表型和病理生理学内表型¹。研究的病理生理哮喘的最佳条件是T-辅助性(TH)-2型驱动型(过敏性)应答^2,3，也称为“TH2分子内表型”^4,5。

大约有一半的哮喘患者，无论疾病严重程度如何，都表现出这种TH2内表型，其特征在于，TH2细胞的主要活化，该TH2细胞产生细胞因子，如IL-4，IL-5和IL-13。所有这些TH2 细胞因子的表达和产生由锌指转录因子GATA-3严格控制，该锌指转录因子对TH2细胞分化和活化而言是必需的，并且被认为是免疫活化⁶的所述2型(TH2)途径的主转录因子。GATA-3 主要负责初始CD4+T细胞分化为TH2细胞。在这个过程中，TH2细胞分化主要是由两个信号传输途径所控制，即T细胞受体(TZR)和IL-4受体途径：从TZR转发的信号激活TH2细胞特异性转录因子cMaf和GATA-3以及转录因子NFAT和AP-1。IL-4受体的激活导致 STAT6在IL-4受体的胞浆区上的结合，在所述IL-4受体的胞浆区上，它被Jak1和Jak3激酶磷酸化，其中部分的磷酸化导致STAT6向细胞核的二聚化和迁移，在细胞核处，STAT6激活 GATA-3和其他基因的转录。GATA-3是锌指转录因子，其仅在成熟的TH2细胞中表达，而非在TH1细胞中表达。根据GINA⁷指导方针，从患有严重哮喘患者的支气管肺泡灌洗样本和肺活检中，已经观察到GATA-3过度表达，尽管患者进行了合理的治疗。因此，这种免疫网络是有希望的治疗靶点。除了已经获批的抗IgE单克隆抗体之外，还有几种靶向转录因子 GATA-3下游的单个组分新疗法正在开发中⁸。

一种直接靶向战略转录因子GATA-3的替代方法同时干涉所有下游分子/细胞因子。已经分析了GATA-3表达来确定患有慢性炎性疾病的患者的分子表型，并对“TH2高”和“TH2 低”亚组患者进行分层，建议用GATA-3特异性灭活剂(WO 2014/040891)治疗“TH2高”患者。由于GATA-3仅在细胞内表达，具有体内细胞穿透能力的GATA-3的、基于核酸的灭活剂，如GATA-3特异性DNA酶已经被开发(WO 2005/033314)。

在慢性炎性疾病如过敏性哮喘方面，鉴定适当的治疗方案的问题更为复杂。众所周知，在过敏性反应方面，嗜酸性粒细胞的数量增加，导致某些患者的嗜酸性粒细胞增多。然而，嗜酸性粒细胞在表达GATA-3上也是已知的(Zon等人，Blood 81(1993)3234-3241)，因GATA-3 的表达不限于T细胞，并且GATA-3的表达也能在嗜碱性粒细胞、肥大细胞和上皮细胞中得到证实。GATA-3在慢性炎性疾病，特别是过敏性哮喘的免疫发病机理中起着重要作用。已经表明，急性致敏和过敏原的激发导致气道中嗜酸粒细胞积累的程度增高，而淋巴细胞的募集却最小(Paul Justice等人，Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol 282(2002)L302-L309)，并且过敏原激发诱导肺嗜酸粒细胞中GATA-3和GATA-3应答性基因的表达。总之，假设嗜酸性粒细胞可能为所述炎症应答提供积极的反馈。相比之下，已经表明，在慢性过敏性气道炎症中，如过敏性哮喘中，人肺组织中60-90％的GATA-3阳性细胞是CD3阳性T细胞，并且只有不到15％的细胞被鉴定为嗜酸性粒细胞(Nakamura等人，JAllergy Clin Immunol 103(1999) 215–222)。因此，得出结论：在人类哮喘中，GATA-3应答性基因的嗜酸性粒细胞的表达可能不是导致气道炎症的促炎细胞因子的主要来源，但可能只是提供TH2细胞因子的冗余来源，以支持慢性炎症过程(Paul Justice等人，在上述引文中)。

因此，虽然在过敏性病症如过敏性哮喘的情况下，TH2细胞中的GATA-3对治疗性干预而言似乎是一个具有吸引力的目标，但嗜酸性粒细胞的同时存在对这种治疗方法的成功会有什么影响(如果有的话)是完全未知的。此外，能否辨别某些患者群体也是根本无法预测的，该患者群体特别地受益于这种治疗方法。

因此，对过敏性哮喘患者开发新颖、有效的治疗存在很大未满足的需求。本发明提出的解决方案迄今为止都是未知的，并且也并不是本领域的任何普通技术人员所能预期的。该解决方案是基于某些患者群体的鉴定，而该患者群体受益于服用某些GATA-3抑制剂。

发明内容

本发明涉及用于治疗TH2驱动型哮喘治疗的GATA-3抑制剂，尤其涉及用于治疗患有过敏性哮喘的某些患者亚群体的指向GATA-3的DNA酶。

在第一方面，本发明涉及GATA-3的基于核酸的灭活剂，尤其涉及用来治疗患有过敏性哮喘病人的指向GATA-3的DNA酶，其中所述病人特征在于：(i)血液嗜酸性粒细胞计数为 3％或以上，特别为4％或以上，更特别地为5％或以上；以及/或(ii)血液嗜酸性粒细胞计数为350×10⁶/L或以上，特别为450×10⁶/L或以上；以及/或(iii)呼气一氧化氮分值在40ppb 或以上。

在第二方面，本发明涉及治疗患有TH2驱动型哮喘尤其是过敏性哮喘的患者的方法，其中所述病人特征在于：(i)血液嗜酸性粒细胞计数为3％或以上，特别分别为4％或5％或以上；以及/或(ii)血液嗜酸性粒细胞计数为350×10⁶/L或以上，特别为450×10⁶/L或以上；以及/或(iii)一氧化呼气一氧化氮分值在40ppb或以上，其中所述方法包括对所述患者施用 GATA-3的基于核酸的灭活剂，尤其是指向GATA-3的DNA酶。

附图说明

图1示出了研究设计和流程图。图A示出了研究设计和主要研究程序的概览图。图B总结了被纳入分析的患者的人数。在SB010组中，21名患者完成了所有研究评估，一名患者不具有评估资格，因其在过敏原激发治疗前和治疗后服用了不同的过敏原剂量。在安慰剂组中，两名患者不具有评估资格(一名患者在过敏原激发期间需要SABA；另一名患者在过敏原激发治疗前和治疗后服用了不同的过敏原剂量)。因此，SB010组中21名可评估的患者和安慰剂组中19名可评估的患者完成了研究^“*”：在安慰剂组，1名患者缺少LAR数据，因为在过敏原激发4小时后无意停止了连续的肺量测定。

图2示出了过敏原激发治疗前和治疗后4周肺功能的变化。图2A示出了FEV₁水平，其作为过敏原激发后基线FEV₁的百分比。在治疗期开始前和4周治疗期完成后进行过敏原激发。过敏原激发后记保持记录肺功能7个小时。描述每个治疗组+/-SEM的平均值。与安慰剂(■)相比，用SB010(▲)的治疗显著弱化了早期哮喘反应(P＝0.04，Wilcoxon秩和检验)和晚期哮喘反应。研究组的结果整体显示在图A中；血液嗜酸性粒细胞≥4％(图B)及 FeNO≥40ppb的预先指定的亚组(图C)。在随机化之前测量血液嗜酸性粒细胞和FeNO的水平。两个亚组均由12名SB010/12名安慰剂患者组成，在两个亚组中，SB010组中有9名患者，安慰剂组有11名患者。EAR和LAR在血液嗜酸性粒细胞≥4％亚组(分别P＝0.02和P＝0.05) 和FeNO≥40ppb亚组(分别P＝0.02和P＝0.05)。请注意：过敏原激发后第一个小时的发散X 轴出现增大。图2B：肺功能随时间作为基线FEV₁百分比被表达。图中显示的是血液嗜酸性粒细胞分别≥3％、≥4％、≥5％的三个亚组中SB010和安慰剂治疗组的治疗前和治疗后的各自的曲线。图中描述了每个治疗组的平均值加/减SEM。***的框表示，同早期反应(左框)和晚期反应(右框)的安慰剂组相比，在SB010治疗组中FEV₁曲线(AUC)下的面积改善的百分比。此为ANCOVA的统计分析。请注意：X轴在过敏原激发后的第一个小时被拉伸到不同的范围。基于基线血液嗜酸性粒细胞计数，肺功能持续改善。图2C：在该图中，显示了根据基线血液嗜酸性粒细胞计数而分层的三个亚组，用SB010治疗28天后对过敏原激发的反应。为了做比较，血液嗜酸性粒细胞≥3％的亚组治疗后安慰剂反应与其他两个亚组中安慰剂反应没有明显差异。有关详细信息，请参见图2的图例。

图3示出了晚期哮喘反应(LAR)期间曲线下面积(AUC)的个体绝对变化。对于SB010治疗组(n＝21)和安慰剂组(n＝18)中的每个患者而言，均计算并描述了晚期哮喘反应(LAR) 期间AUC值的绝对变化。横线代表平均值，黑点表示在基线状态下血液嗜酸性粒细胞计数 ≥4％的患者；圆圈表示在基线状态下血液嗜酸性粒细胞计数＜4％。LAR反应在这两个亚组之间并没有显著差异。对于整个SB010组，治疗明显减弱了晚期哮喘反应(P＝0.02，参见图2)。个别数据点见补充附录表S4A和S4B。

图4示出了用SB010或安慰剂治疗之前和治疗之后过敏原激发后血浆IL-5水平的变化。还示出了患者的血浆IL-5浓度中平均值±SEM的绝对变化，所述患者显示出对治疗前过敏原激发有反应的可检测的血浆IL-5水平，而治疗前过敏原激发在SB010组(13位患者)和安慰剂组(12位患者)分别为4.21±1.51pg/ml、4.03±0.92pg/ml。在P＝0.05(*)上具有统计学上的显著差异。

图5示出了TH2细胞和GATA-3在过敏性哮喘的发病机制和SB010作用方式中的核心作用，如补充附录所述。

图6示出了补充附录中讨论的mRNA裂解活性和GATA-3DNA酶。用于GATA-3复制 (c)RNA的GATA特异性DNA酶hgd40的体外裂解活性。体外转录的完全开放阅读框cRNA 被用来孵化不同的时间间隔(动力学-A)或hgd40增加的剂量(剂量依赖形-B)，并且所得的裂解产物被分离开，溴化乙锭在琼脂糖凝胶上被染色。类似地，将GATA-3cRNA与非特异性DNA酶孵育以证明DNA酶方案(C)的序列特异性，该非特异性DNA酶具有乱序结合结构域但具有完整的催化序列(乱序DNAzyme1-6),或者该非特异性DNA酶为针对不同转录因子序列的DNA酶(T盒转录因子Tbet，Tbet DNA酶-3)。

图7示出了hgd40的生物活性—SB010的活性成分和hgd40治疗在人类原发性T细胞和鼻组织外植体的效果。图A—通过人类极化TH2细胞的hgd40转染，降低GATA-3的蛋白表达。图B—通过人类极化TH2细胞的hgd40转染，降低IL-13分泌。来自图6中的A和B的数据表示FAM阳性转染细胞的细胞内染色，并被被表示为n＝8-10每组的平均值+SEM。图C 和图D—通过存在于人类鼻息肉组织外植体中的CD+3细胞(绿色)来摄取具有荧光标志的 hgd40，所述鼻息肉组织块是从患有慢性鼻窦炎且具有鼻息肉的患者获得。随着未治疗(图C) 和hgd40治疗细胞(图D)的两种颜色的重叠，通过共焦激光扫描显微镜获得结果。图E— 人类鼻息肉组织外植体中的GATA-3mRNA的表达，所述人类鼻息肉组织块是从离体组织化验中患有鼻息肉(CRSwNP)的患者获得。随着归一化的相对表达单位，数据被表达并被表示为每组n＝6的平均值+SEM。图F—离体组织化验中从人类鼻息肉中释放的IL-5蛋白。数据被表示为每组n＝16的平均值+SEM。通过利用GraphPad Prism 5的学生t检验计算了意义； (*)P<0.05；(**)P<0.01。有关技术细节，请参见补充附录，材料和方法。

图8示出了整个ITT人群和预先指定的亚组的平均治疗差异。这是所述组区别的可视化图表，反映出SB010治疗与安慰剂组之间相对变化的差异。整个研究人群的值显示在表S2 中，血液嗜酸性粒细胞≥4％的患者的预先指定的亚组的值显示在表S3a中，FeNO≥40ppb的患者的预先指定的亚组的值显示在表3SB中。顶部：治疗前和治疗后肺功能百分比变化被表达为曲线(AUC)下的面积。底部：表达的是随着FEV₁最大下降而出现的肺功能百分比变化。 EAR意为早期哮喘反应；LAR意为晚期哮喘反应。

图9示出了SB010和安慰剂治疗对痰嗜酸性粒细胞(百分比)的效果。在过敏原吸入之前和吸入之后，对诱导痰样品进行测量，如材料和方法中所述。在用SB010(▲)和安慰剂(■) 治疗前和治疗28天后进行过敏原吸入。图中示出了每个时间点和治疗组的中值及第25和第 75百分位数范围。左图：小组作为整体；中图：预先指定的亚组，血液嗜酸性粒细胞≥4％；右图：预先指定的亚组，FeNO≥40ppb。在小组作为整体的图中，激发后百分比嗜酸性粒细胞的绝对变化与两个治疗组之间未显示出明显趋势(P＝0.06)，而激发后嗜酸性粒细胞百分比的绝对变化在嗜酸性粒细胞亚组(P＝0.09)和FeNO亚组(P＝0.02)变得明显。痰嗜酸性粒细胞百分比的下降并非由于中性粒细胞的大量增加，如补充附录表S8所示。

具体实施方式

本发明涉及基于核酸的灭活剂，特别是DNA酶，其用于治疗TH2驱动型哮喘，尤其涉及基于核酸的灭活剂，尤其是DNA酶，该DNA酶直接作用于GATA-3用来治疗某些患者亚群体。

因此，在第一方面，本发明涉及GATA-3的基于核酸的灭活剂，尤其直接作用于GATA-3 的该DNA酶，用来治疗患有过敏性哮喘的患者，其中所述病人特征在于(i)血液嗜酸性粒细胞计数为3％或以上，特别为4％或以上，更特别地为5％或以上；以及/或(ii)血液嗜酸性粒细胞计数为350×10⁶/L或以上，具体为450×10⁶/L或以上；以及/或(iii)呼气一氧化氮分值在40ppb或以上。

在第二方面，本发明涉及一种治疗患有TH2驱动型哮喘的患者的方法，其中所述病人特征在于(i)血液嗜酸性粒细胞计数为3％或以上，特别为4％或以上，更特别地为5％或以上；以及/或(ii)血液嗜酸性粒细胞计数为350×10⁶/L或以上，具体为450×10⁶/L或以上；以及/或(iii)呼气一氧化氮分值在40ppb或以上，其中所述方法包括对所述患者施用GATA-3 的基于核酸的灭活剂的步骤，该灭活剂具体是指直接作用于GATA-3的DNA酶。

在本发明的上下文中，术语“基于核酸的灭活剂”是指一种基于核酸的物质，其与靶基因序列至少部分互补，并通过阻止复制、转录或翻译，或通过裂解所述靶序列来使所述靶基因的活性失活。基于核酸的灭活剂可由核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸、非自然存在的核苷酸及其混合物组成，并且可以是单链序列、双链序列或其混合物。根据本发明，基于核苷酸的灭活剂包括siRNA分子、shRNA分子和DNA酶。

在本发明的上下文中，术语“DNA酶”是指催化活性的单链合成DNA分子，其在自然界中不存在。10-23家族的DNA酶代表一类新的反义分子，这类分子在20世纪90年代得到开发，但最近才发现临床应用⁹。

在本发明的上下文中，术语“10-23家族”是指通用DNA酶模型(Sontoro&Joyce,Proc. Natl.Acad.Sci.U.S.A.,94(1997)4262-4266)。10-23模型的DNA酶，也称为“10-23DNA酶” 具有15个脱氧核糖核苷酸的催化结构域，其两侧为两个底物结合域(参见WO2005/033314)。 DNA酶的潜在优点包括相对较高的稳定性，且不依赖于细胞内的酶。

在一个特定的实施例中，催化结构域具有ggctagctacaacga序列(SEQ IN NO.:1)。底物结合域的长度是可变的：它们要么长度相等，要么长度不同。在特定的实施例中，底物结合域由6至14个核苷酸组成，特别地，在每种情况下，至少由9个核苷酸组成。此类DNA酶包含通用序列nnnnnnnnnnggctagctacaacgannnnnnnnn(SEQ IN NO.:2)。在特定的实施例中，底物结合域结合用于编码蛋白GATA-3的mRNA。

指定的中心催化域ggctagctacaacga只是一个特定的实施方案。本领域内的技术人员明白 “10-23DNA酶”可以用具有改良后的催化域的相当的生物活性获得。

在一个特定的实施例中，底物结合域与位于裂解位点两侧的区域完全互补。然而，为了结合靶RNA并将其裂解，所述DNA酶不一定必须是完全互补的。10-23型的DNA酶裂解嘌呤-嘧啶序列伤的靶mRNA。在本发明的范围内，根据WO 2005/033314，所述DNA酶优选地包含针对GATA-3的体内活性DNA酶，WO 2005/033314的内容在适用专利法保护下在此通过参考引用将其并入本文中。

在本发明的特定实施例中，所述患者的血液嗜酸性粒细胞的计数为4％或以上。

在特定实施例中，所述患者的血液嗜酸性粒细胞的计数为5％或以上。

在特定实施例中，所述患者的血液嗜酸性粒细胞的计数为350×10⁶/L或以上。

在特定实施例中，所述患者的血液嗜酸性粒细胞的计数为450×10⁶/L或以上。

在本发明的特定实施例中，所述血液嗜酸性粒细胞的计数是由此而确定的：(i)传统的自动血细胞分类计数(即使用库尔特技术，或希森美康技术或其他技术)，或(ii)使用传统血液涂片的手动显微镜细胞分化。

在本发明特定的实施例中，所述患者具有40ppb以上的呼气一氧化氮分值。

在本发明的特定实施例中，使用手持式NIOX

设备可确定呼气一氧化氮分值。

在本发明的特定实施例中，针对GATA-3的DNA酶选自WO 2005/033314的序列hgd1至hgd70(参见WO 2005/033314的图3)，特别地选自序列hgd11，hgd13，hgd17和hgd40，更特别地选自序列hgd40(5’-GTGGATGGAggctagctacaacgaGTCTTGGAG；SEQ ID NO:3)。

在本发明的上下文中，术语“hgd40”是针对GATA-3的DNA酶，其由具有序列 5’-GTGGATGGAggctagctacaacgaGTCTTGGAG的34个碱基组成。3’和5’区域的9个碱基形成两个结合域，其高度特异性地结合至GATA-3的靶mRNA。所述分子的中央核心代表所述催化域，该催化域导致hgd40与GATA-3mRNA结合后的所述靶标的裂解(参见图5和图6)。药物hgd40特征在于吸入的给药部位的高生物活性和生物利用度。¹²

在本发明的特定实施例中，所述hgd40可以被包含在制剂中，该制剂可通过口服、直肠、肠胃外、静脉内、肌肉内、皮下、体内、***内、腹膜内、鞘内、血管内、局部(粉末、软膏或滴剂)或以喷雾或吸入剂的形式给药。在无菌条件下，根据要求，活性组分与生理上可以接受的赋形剂和可能的防腐剂、缓冲剂或推进剂混合。

在本发明的特定实施例中，所述hgd40可以被包含在用于吸入的制剂中。

在本发明的特定实施例中，所述hgd40溶解于PBS。

剂量类型和剂量方案是根据临床因素由主治医生决定。本领域内的技术人员明白所述剂量类型和剂量方案是取决于不同的因素，如体重、身体表面、年龄、性别或患者的一般健康状况，同时还取决于待施用的药物、给药时长和类型以及可并行施用的其他药物。在这个过程中，根据特别有利的实施例，药物的活性成分的量可以适用于所测量的表达水平。因此，在布置亚组“TH2高”和已确立的非常高的GATA-3基因表达的情况下，可以施用增加剂量的活性成分，尤其是GATA-3特异性的DNA酶特异性的剂量。相应地，在布置亚组“TH1高”和已经确立的非常高的Tbet基因表达的情况下，可以施用增加剂量的活性成分，尤其是Tbet的DNA酶特异性的剂量。

在本发明的特定实施例中，所述剂量由5至50ml的hgd40，特别由5至20ml的hgd40，更特别地由10ml的hgd40的组成。在特定实施例中，所述剂量溶解于2ml PBS中。在特定的实施例中，这些剂量是日剂量。

在本发明的特定实施例中，所述GATA-3的基于核酸的灭活剂为每天施用一次、每天两次或每天三次，特别是每天一次。

在本发明的特定实施例中，所述指向GATA-3的DNA酶在连续治疗中，特别是维持中，为每天服用一次，连续28天。

在本发明的特定实施例中，所述GATA-3的基于核酸的灭活剂被用作治疗哮喘的一种或多种吸入或口服疗法的附加治疗，所述疗法可选自以下选项：皮质类固醇、长效β受体激动剂(LABA)、长效毒蕈碱拮抗剂(LAMAs)、抗白三烯、短效β受体激动剂(SABA)、抗胆碱能药和单克隆抗体。

从下列示例性实施例的描述中，在附图的帮助下，会得到本发明的进一步特征、细节和优点。

实施例

实施例1：临床研究“通过吸入的GATA-3特异性DNA酶弱化过敏原诱导的哮喘反应”

摘要/背景

哮喘最常见的表型特征在于TH2驱动型嗜酸性粒细胞主导的炎症。GATA-3的治疗靶向、 TH2途径的主转录因子可能是有益的。我们评估了特别针对GATA-3mRNA(SB010)的新型DNA酶的安全性和有效性。

方法

在这项随机、双盲、安慰剂对照、多中心的临床试验中，患有嗜酸性粒细胞增多的过敏性哮喘的患者被分配每天一次吸入接受10ml SB010(21位可评估患者)或安慰剂(19位可评估患者)病持续数天，所述患者在过敏原激发试验后表现出双相早期和晚期哮喘反应(EAR 和LAR)。在治疗之前和治疗之后，进行过敏原激发。在LAR中，FEV₁曲线(AUC)下的面积的变化是主要终点。

结果

在治疗28天后，与治疗前相比，SB010将平均值LAR AUC降低了34％，而在安慰剂组，观察到LAR AUC(P＝0.02)上升了1％，通过SB010将EAR AUC降低了11％，而在安慰剂(P＝0.03)之后EAR AUC上升10％。在预先指定的患者嗜酸性粒细胞≥4％(提高LAR41.7％，P＝0.05；提高EAR 28.3％，P＝0.02)或FeNO≥40ppb的亚组中，这些效果更为明显。受SB010抑制的LAR与过敏原诱导的痰嗜酸性粒细胞增多(P＝0.06整组；P＝0.09嗜酸性粒细胞亚组； P＝0.02FeNO亚组)的减少，降低的痰类胰蛋白酶(P＝0.05)和血浆IL-5水平(P＝0.05)是相关联的。过敏原诱导的FeNO水平和气道对乙酰甲胆碱的高反应性不受治疗影响。

结论

在过敏原激发试验后，SB010治疗显著弱化了过敏性哮喘的LAR和EAR。生物标志物分析证实了对TH2调节性炎症反应的显著影响(Clinical Trials-gov number，NCT01743768)。

介绍

SB010的活性药物产品的中央核心代表催化域，该催化域导致hgd40与GATA-3Mrna10 结合后的靶标裂解(参见补充附录中的图1和图2)。Sel等人¹¹报道了能够裂解GATA-3 mRNA的DNA酶的发展，并证明了它们在过敏性气道炎症的临床前模型的功效。药物物质 hgd40特征在于吸入的给药部位的高生物活性和生物利用度¹²，并被选择用于进一步的临床开发；hgd40显着降低GATA-3mRNA和蛋白质，以及随后在人类T细胞和组织外植体中产生TH2细胞因子(参见补充附录中的图S3)。不合格的脱靶效被排除¹³，在广泛的毒理学方案中，确定没有重大的安全问题¹⁴。在最近完成的三个随机、安慰剂对照、剂量递增阶段I 试验(修订手稿)中，研究了相应的药物SB010。颇有成效的结果证明了IIa期试验以评估SB010的疗效。这项研究代表了迄今为止吸入的DNA酶的第一期IIa试验。

方法

研究设计和监督

这项随机、双盲、安慰剂对照研究是在2013年1月(登记第一个患者)至10月(最后一名患者的最后一次访视)在德国于7个专门进行呼吸疾病研究的研究站进行的。经过筛选和极限评估后，用中央生成的随机化列表(Inamed GmbH,Munich,Germany)对参与者进行随机分组，无需分层至4周的积极治疗或安慰剂治疗期。在随机分组(治疗前)和第28天(治疗后)，在筛选(资格)时进行三次吸入过敏原激发。该实验由德国监管机构“德国联邦药物和医疗器械所”批准，并且在开始之前在每个参与中心由中央和地方伦理委员会批准。该研究是根据良好的临床实践和《赫尔辛基宣言》的原则进行的。在进行任何研究的具体程序之前，所有参与者均以书面形式知会同意。在每个研究站收集数据并在INAMED GmbH录入数据库。数据分析由FGK Clinical Research GmbH独立进行。手稿的第一稿由第一作者和最后一位作者编写，他们也决定提交稿件以用来发表。专业医学作家由赞助商在撰写和编辑方面提供支持。第一位作者和最后一位作者，以及作为赞助商员工的作者，保证数据和统计分析的准确性和完整性及对最终协议的保真度。

患者

我们招募了年龄在18岁至64岁之间的白人男性患者，根据GINA指南，在筛查前至少 6个月，他们被诊断为患有轻度哮喘，并且没有接受除吸入性短效支气管扩张剂以外的任何哮喘药物治疗。在筛查时，在任何短效支气管扩张剂摄入后至少6个小时内，FEV₁必须预测正常≥70％。所述患者的哮喘的过敏性质必须通过对常见的气道过敏原和阳性过敏原诱导的早期反应和晚期反应的阳性皮肤刺痛实验(FEV₁下降分别为≥20％和≥15％)进行确认。必须在筛查过敏原激发之前或之后证实痰嗜酸性粒细胞的存在。包含和排除的详细内容和在补充附录中找到。

研究治疗

在2mL磷酸缓冲盐水(或相匹配的安慰剂)中，药物SB010为10mg的人类GATA-3特异性DNA酶hgd40(由位于德国法兰克福的BioSpring GmbH生产)。最终的药物产品由中央制备(Activaero GmbH,Gemünden,Germany)，具有相同的包装，以确保不会混淆。用AKITA²APIXNEB雾化器，通过流量和体积控制的吸入施用药物产品或安慰剂，每天一次，每次持续3-8分钟，连续施用28天，以确保优化的药物沉积¹⁶。在招募之前，患者接受强制性使用设备培训。在治疗期间的每次访视中，在研究人员的监督下，患者在研究现场施用积极治疗或安慰剂。剩余剂量是自我施用的，并使用设备的智能卡检查其服从性。

研究程序

图1A示出了主要研究程序和干预措施的概述(研究程序的完整摘要见补充附录)。

过敏原激发和肺功能测试

在第一次筛查访视时，通过皮肤刺痛试验确定了用于过敏原激发的合适的过敏原(详见补充附录中的表S1)。在第二次筛查访视时(第一次筛查访视后至少一周)，接下来进行皮肤点刺稀释试验连同气道反应性(通过乙酰甲胆碱激发)，以界定用于筛查过敏原激发¹⁷的安全起始浓度。施用浓度增加的吸入的过敏原，直到实现FEV₁≥20％的下降¹⁸。在随机分组(治疗前)前和(治疗后)28天治疗期间，以相同的方式¹⁹施用吸入过敏原的最后三个浓度步骤，这三个步骤会导致FEV₁下降20％。根据最近的指南²⁰，在10至180分钟(早期哮喘反应， EAR)之间以及过敏原激发后7小时(晚期哮喘反应，LAR)重复进行肺量测量。激发之间实现适当的冲洗时间，可用以确保FEV₁和FeNO水平在进一步激发前已经恢复到所有患者的基线值。

乙酰甲胆碱激发测试

根据ATS指南²¹，气道反应性在图1所示的时间被评估，因乙酰甲胆碱(Provocholine， Metapharm Inc.，Brantford，ON，Canada)浓度导致在FEV₁(PC20浓度)中下降≥20％。

呼出气一氧化氮的测量

根据制造商的使用说明书，使用符合ATS/ERS建议²²的手持式NIOX

设备(Aerocrine，Solna，Sweden)在图1中所示的时间测量了呼出的一氧化氮(FeNO)的水平。

痰液诱导

在五个时间点(图1A)进行诱导痰液样品：在筛选前(最多两周)及激发治疗后24小时，以及治疗前(24-48小时)和治疗后24小时。在中央实验室评估上清液中介质的细胞分布和分析。

免疫学参数的测量

根据制造商的使用说明书，在血浆和/或具有TH1/TH2和趋化因子多元序列(MesoScale Discovery,Rockville,USA)的痰液上清液中测量细胞因子和趋化因子TNF-α，IL-1β，IL-8 MCP-1，MCP-4，MIP-1β，MDC，IP10和IL-4，IL-5和IL-13和IFN-γ。根据制造商的使用说明书，使用市售的ELISA(ECP and tryptase:Cloud-Clone,Houston,USA)测量痰液上清液中嗜酸性粒细胞阳离子蛋白(ECP)和类胰蛋白酶。

安全评估

每次探访都会评估不良事件和伴随药物治疗。在第一次给药前和治疗期间的两周间隔期进行安全实验室分析(包括括血液学，临床化学和尿分析)(详见补充附录)。此外，在治疗前和治疗后，对抗核抗体(免疫荧光筛选试验)和类风湿性血清学(igM)进行测量，以排除因用基于DNA酶的药物治疗而引起的(自身)抗体发展。

研究结果测量指标

主要结果测量指标是吸入的SB010的多次剂量对FEV₁曲线(AUC)以下的面积的影响，其被表达为LAR(过敏原激发后4小时)期间基线FEV₁的百分比。使用梯形规则计算AUC。探索性终点包括在EAR(0-3小时)期间SB010对FEV₁曲线下的面积、过敏原诱导的气道中反应性(PC20乙酰甲胆碱)的变化、FeNO水平和血浆和痰液中的生物标志物的影响。

样本量和统计分析

假设I型误差概率为10％，治疗组之间的效果差异为8％，并且效力至少为80％，则需要至少38名可评估对象。根据15％的预期退出率，43名参与者被随机接受试验药物或安慰剂治疗。在所有可评估的患者(意向治疗人群)中分析功效和药效学结果，如图1所示。

使用ANCOVA模型，将治疗组之间的主要功效结果(LAR中的AUC)进行对比，该ANCOVA模型以LAR中基线AUC作为协变量。SB010组中4名患者及安慰剂组中的3名患者仅在第一次治疗后过敏原激发中证实了LAR。对于这些患者而言，来源于这次过敏原激发中的肺功能数据被用作治疗前的值。用同样的模型或使用Wilcoxon秩和检验，其他终点也被分析用于统计分析计划中定义的百分比变化的组之间的对比。患者列出了安全性结果测量指标，并对其进行了描述性统计。统计方法的进一步细节见补充附录。

结果

患者

SB010组中的21名患者完成了所有的研究评估，安慰剂组中分别有18名和19名患者完成了LAR和EAR评估(图1B)。这些患者的人口结构和基线数据如表1A和表1B中所示。

哮喘早期和晚期反应

如图2A(补充附录中标S2)所示，经过SB010治疗后，LAR减轻，曲线(AUC)下的平均面积显著改善了33.7％(P＝0.02)，最大FEV₁下降31.6％(P＝0.09)。EAR也明显减轻，平均值AUC改善了11.3％(P＝0.04)，最大FEV₁下降21.5％(P＝0.04)。

在预先指定的亚组中，哮喘早期和晚期反应

在预先指定的亚组中，在基线水平下，相对血液嗜酸性粒细胞计数≥4％的患者显示出在 LAR中的AUC中有更大改善，并且在SB010治疗(参见图2B和补充附录中图S3A)后对EAR有显著的影响。SB010组中LAR中AUC的下降幅度达41.7％(P＝0.05)(参见表S3A)。同时伴随着EAR出现28.3％的下降(P＝0.02)。SB010和安慰剂治疗后AUC的个体变化如图 3(和补充附录中标S4A和S4B)所示。在基线状态下，FeNO≥40ppb的亚组也报告了类似的观察结果(图2C，补充附录中标S3B)。亚组之间的异质性测试并不显著。

干扰TH2驱动型炎症的标记物

在治疗28天后，与安慰剂组相比，SB010弱化了过敏原诱导的痰嗜酸性粒细胞增多，尽管在整个研究组(P＝0.06)中这个差别并没有统计学意义，但在血液嗜酸性粒细胞≥4％(P＝0.09) 的预先指定的亚组和FeNO≥40ppb(P＝0.02)的预先指定的亚组中却变得显著。痰嗜酸性粒细胞增多的变化伴有血液IL-5水平(图4)中显著的差别(P＝0.05)。在SB010治疗后，在安慰剂组观察到的治疗后IL-5水平未增加。在28天治疗过程结束时，与安慰剂组相比，SB010 治疗组(中值6.39 IQR 2.03-13.88ng/mL)的痰液类胰蛋白酶水平显着降低(P＝0.05)(中值 13.10 IQR 6.05-22.77ng/mL)。过敏原诱导的FeNO水平和气道对乙酰甲胆碱的高反应性在激发后24小时仍然不受研究治疗的影响(补充附录中表S5)。

安全性和耐受性

在接受SB010或安慰剂治疗的患者中观察到的治疗不良事件(TATE)没有显著差异。在安慰剂组中，8例出现有TEAE，而SB010组中为6例(表3)。没有出现严重的TEAE，也没有任何可能或肯定与SB010相关的TEAE。两名患者的两例TEAE(恶心和瘙痒)可能与 SB010有关。没有出现严重的TEAE。其他安全变量没有显示出任何安全问题，包括补充附录中所列的所有安全终点。TNF-α，IL-1β，IL-8，MCP-1，MCP-4，MIP-1β，MDC和IP-10 的治疗前和治疗后测量结果显示出研究组(补充附中表S7)之间没有明显差异；检测到的类风湿性血清学和抗核抗体都没有明显增加，总体上表明没有先天性免疫激活和缺乏脱靶效应。

讨论

吸入的支气管过敏原激发是广泛接受的过敏性炎症和支气管收缩的体内模型18，并且早期临床阶段试验中LAR的治疗性抑制是药物开发程序²⁴后期阶段临床疗效的相当好的预测指标。实施例包括TH2细胞因子如IL-4^25,26,27，IL-5^28,29,30，IL-13^31,32和TSLP³³的靶向途径。在本研究中，在过敏原吸入后，SB010治疗在EAR和LAR期间显著改善了肺功能。由于SB010 具体地、选择性地靶向转录因子GATA-3，所以这些数据强烈支持了TH2驱动型哮喘表型⁶患者在过敏原吸入后，哮喘反应中GATA-3依赖和调节途径的重要性，并标明SB010可能代表了对过敏性哮喘有效的治疗。

我们的患者具有典型的TH2内含型轻度过敏性哮喘，如血液和痰嗜酸性粒细胞升高以及 FeNO^34,35水平升高所示。这种2型内含型不仅存在于原型特应性和过敏性哮喘中，而且最近在哮喘的其他临床表型中也有所观察到，包括高嗜酸性粒细胞迟发性哮喘，持续性和危重型哮喘，以及阿司匹林敏感性哮喘^5,36,37。纳入标准被定义为涵盖患有这种内含型(例如仅“痰嗜酸性粒细胞的存在”)患者的更广泛的范围，并且肺功能数据显示SB010对该研究组作为整体的影响显著。然而，在预先指定的亚组分析中，患有TH2驱动型表型(血液嗜酸性粒细胞水平至少为4％或FeNO水平至少为40ppb)的患者似乎特别受益于SB010治疗。除了对 LAR更显著的治疗效果外，EAR也显示出明显的减轻。自从抗IgE38和几乎最近的抗TSLP33 以后，对任何生物候选药物而言，贯穿哮喘反应的两个阶段的这种双重作用模式尚未有报道。在即将到来的临床试验中，SB010治疗是否对容易发生严重恶化的患者特别有益，还需要研究。在调节TH2反应时GATA-3的核心作用已经确立。TH2效应因子功能的开发和维护都严格依赖于GATA-3³⁹。最近，已经在2型天然淋巴细胞中鉴定到GATA-3的基本功能。然而，这种转录因子也发挥了远远超过TH2细胞亚群的重要作用。GATA-3也在肥大细胞³⁹、嗜酸性粒细胞⁴¹和气道上皮细细胞中表达，在这些细胞中，GATA-3控制与过敏原诱导的过敏反应^42,43相关的重要功能和效应机制。在过敏原激发后，EAR取决于肥大细胞脱颗粒，而LAR 被认为是倾向于T细胞依赖性的，并伴有嗜酸性粒细胞明显流入气道和气管腔。肥大细胞类胰蛋白酶代表可靠且强健的标记，该标记反映肥大细胞激活和肥大细胞脱粒。本研究结果表明，SB010治疗直接或间接影响哮喘反应的这些效应细胞。SB010可能以双重方式履行这种抑制和调节功能，这两种方式均通过调节TH2细胞进行，从而剥夺存活的效应细胞和激活因子，以及通过直接干扰嗜酸性粒细胞中的GATA-3 mRNA和局部炎症组织中的肥大细胞，然而，需要进一步的机理研究来充分阐明GATA-3 DNA酶治疗的生物学作用。

本研究报道的患者，结合I期计划期间报道的个体，包括超过120名个体中的1200多名申请的安全数据库，其中的39名患有哮喘。目前为止，在临床开发期间为检测出安全信号，符合广泛非临床方案的结果。总之，这种概念验证试验提供了吸入DNA酶SB010治疗的有效性的证据，吸入DNA酶SB010治疗明显减轻了过敏原激发后的早期和晚期哮喘反应。有必要进行进一步的临床研究，以探讨这些影响是否转化为具有主要TH2表型的症状性、持续性哮喘患者的临床益处。

表1A：完成本研究的患者人口结构和基线数据

所有数据以平均值(SD)表示，除痰液中的嗜酸性粒细胞(中值，第1和第3四分位数)。在随机分组之前，测量呼气一氧化氮分值(FeNO)，气道高反应性(PC20)，血液嗜酸性粒细胞和诱导痰液中的嗜酸性粒细胞。对于SB010组和安慰剂组，痰液中的嗜酸性粒细胞的值分别基于n＝20、n＝17。P值是根据Wilcoxon秩和检验计算的(见材料和方法)。

所有数据表示为平均值(SD)。在随机分组之前，测量呼气一氧化氮分数(FeNO)，气道高反应性(PC20)，血液嗜酸性粒细胞和诱导痰液中的嗜酸性粒细胞。P值是根据Wilcoxon秩和检验计算的(见材料和方法)。

表2：治疗前和治疗后过敏原激发后晚期和早期反应的变化

图中显示了晚期哮喘反应(LAR)和早期哮喘反应(EAR)曲线(AUC)下的面积的平均值。AUC值从治疗前到治疗后的下降反映了肺功能的改善。上面给出的是AUC和治疗前的值，然后是SB010组和安慰剂组各自肺功能的变化。这些变化被呈现为AUC的治疗前和治疗后的值，以及治疗前和治疗后之间的百分比变化。正值反应了肺功能的改善，负值对应与治疗前相比，治疗后激发具有曲线下方的更大的面积。完整数据集见补充附录中表S2。

表3：***器官类治疗紧急不良事件(TEAEs)-器官***

¹眩晕；²腹泻、恶心；³单纯疱疹，鼻咽炎；⁴裂伤；⁵肌肉痛；⁶头痛、坐骨神经痛；⁷哮喘、支气管阻塞、呼吸困难、上呼吸道分泌增多、口咽痛、上气道咳嗽综合症；⁸瘙痒。

补充附录：通过吸入GATA-3特异性DNA酶引起过敏原诱导的哮喘反应减弱

材料和方法

纳入和排除标准

纳入标准

1.年龄≥18岁且≤60岁的成年白人男性；

2.至少在筛查前6个月被临床诊断患有轻度哮喘(根据GINA指南2008)。除了吸入短效75支气管扩张剂外，没有进行哮喘治疗。

3.在清洗掉吸入的短效支气管扩张剂至少6小时后，筛选FEV₁值FEV₁≥70％的预测正常值(ECSC)。

4.患者必须表现出足够的诱导痰液产生。

5.对常见的空气过敏原(如动物上皮、尘螨)的阳性皮肤刺痛试验(皮肤反应性)。

6.患者必须显示出阳性过敏原诱导的早期和晚期气道支气管收缩。

7.在AC和MCh之前的所有时间点，患者必须显示出FEV₁不低于预测的65％。

8.筛选过敏原激发之前或之后，存在痰嗜酸性粒细胞(第一次或第二次痰液诱导)。

9.患者已经口头和书面被告知临床试验的目标、方法、预期好处和潜在的风险以及他可能面临的不适情况，并在试验开始前及任何试验相关程序开始前，已经书面同意参加试验。

10.患者能够理解并给予书面知情同意书，并签署了由研究人员研究伦理委员会批准的书面知情同意书。

11.在开始临床研究前至少1年内停止吸烟的不吸烟者或已戒烟者，抽烟量＜10包/年。

12.能够以适当的方式吸入(在筛选访视时，患者将接受培训用AKITA2

设备吸入安慰剂药物)。

13.只有在最后一次服用SB010后的6个月内不想做父亲的男性才会被纳入本研究。

排除标准

1.除了哮喘还患有其他临床重大疾病(心血管，肾脏，肝脏，胃肠道，血液学，神经系统，泌尿生殖道，自身免疫，内分泌，代谢等)，研究人员认为这些疾病可能令患者因参加试验而面临风险，或其他可能影响试验结果或影响患者参与能力的疾病。

2.患有相关肺部疾病或胸外科疾病史，如：

已知的活动性肺结核；

间质性肺或肺血栓栓塞史；

过去12个月肺切除手术；

哮喘史；

继发于呼吸***疾病(例如囊性纤维化，Kartagener’s综合症等)的支气管扩张病史；

前四周第一天早上IMP施用，慢性支气管炎、肺气肿、过敏性支气管肺曲霉病或呼吸道感染史

3.除了研究者判断的吸入短效支气管扩张剂之外，伴随治疗的患者；

4.在访视前2小时使用短效β2***2，3，4，5，11和12。

5.在筛查和治疗阶段开始之间，筛查前6个月内急性哮喘住院或急诊室治疗。

6.在筛查访视的前6个月内因哮喘恶化管理而吸入(永久)或住院治疗超过24小时。

7.临床相关过敏或药物特异性史或现有证据。

8.对雾化器溶液的任何活性或非活性成分的过敏反应史。

9.临床相关心电图异常。

10.静息心率＜45bpm，收缩压<100mmHg，舒张压<60mmHg。

11.易发生直立调节障碍、昏厥或停电。

12.过去5年内恶性肿瘤史，离体基底细胞除外。

13.由研究者判断的临床化学、血液学或任何其他实验室变量的临床相关异常。

14.在AC前四周内临床相关的急性感染。

15.临床相关的慢性感染。

16.任何急性或慢性感染人体免疫缺陷病毒(HIV)和乙型病毒肝炎的病毒学检测的结果呈阳性。

17.阳性药物筛选。

18.滥用酒精或毒品。

19.阳性可替宁检测。

20.在首次施用试验药物30天前或试验药物治疗期间，用任何已知的酶诱导或抑制剂(圣约翰草(Johanniskraut)，巴比妥类，吩噻嗪，西咪替丁，酮康唑等)来治疗。

21.在首次施用试验药物之前的两周(对于生物抑制剂：6个月或相应药物的消除半衰期的10倍内，或相应药物的消除半衰期的10倍内，或药理作用的持续时间内，使用任何禁用的伴随药物治疗，治疗期间任何长期或预期的伴随用药。

22.在首次实试验性药物给药之前的14天内和在试验治疗期间，食用/饮用任何酶诱导或抑制的食物或饮料(例如西兰花，布鲁塞尔豆芽，葡萄柚，葡萄柚汁，星果等)。

23.在每次访视的第一个程序前6个小时内食用/饮用含咖啡因的产品。

24.肠胃道手术，该手术可能干扰吞咽部分的药物吸收(注意：这不适用于小腹部手术，如阑尾切割术或疝切除术)。

25.筛选前30天内献血。

26.在试验过程中或试验后6个月内计划捐赠生殖细胞、血液、器官或骨髓。

27.在最后一个月或相应药物的10倍半衰期内参加另一项使用试验药或设备的临床试验。在纳入本项试验之前，生物制剂的最短期限为至少6个月，或药物动力学的持续时间，或相应药物半衰期的10倍。

28.缺乏给予知情同意的能力或意愿，或无能力进行充分合作。

29.试验访视/程序的预期不可用性。

30.弱势对象(例如被关押人员)。

31.临床研究站的员工，研究员的亲戚或配偶。

体外实验

实施体外实验是用来证明GATA-3DNA酶的裂解活性和特异性。在细胞培养实验中，评估生物活性和作用模式，该细胞培养实验使用外周血液T细胞和鼻腔鼻窦组织片段作为粘膜气道组织的模型。

裂解检测(补充附录中图S)

利用如上文所述的体外裂解检测(Sel等人，JACI 2008)进行DNA酶的RNA裂解催化活性的分析。简而言之，将2μl体外转录的GATA-3复制(c)RNA(250ng/μl)添加到4μl 不含RNAse的水，1μl 1M的氯化钠，1μl 10mM的氯化镁和1μl 500mM三羟甲基氨基甲烷 pH 7.4中。加入1μl各自的DNA酶(hgd40，具有扰乱的结合区但完整催化序列的扰乱的DNA 酶1-6，转录因子Tbet特异性DNA酶1-3)或水(阴性对照)，将混合物在37℃的条件下孵育。如果没有另有说明，将DNA酶以10μM的浓度施用，标准孵育时间为60分钟。随后，使用琼脂糖凝胶电泳分离反应混合物，并通过使用标准方法的溴化乙锭染色来观察。

患者和样本选择(补充附录中图S3，C-F)

根据伴有鼻息肉的慢性鼻窦炎(CRSwNP)，病理性鼻内窥镜检查和鼻窦CT扫描的文件记录来选择研究对象。根据目前的“欧美指南”，在比利时根特大学医院的耳鼻咽喉科，本研究独立地表明，在功能性鼻内窥镜手术(FESS)中，从n＝16例患者(年龄为16-72岁，平均年龄为44岁，11例男性，5例女性，8例遗传性过敏症和10例哮喘)。所有患者在参加试验之前都提供了知情同意书，并且本研究得到当地伦理委员会的批准。在手术前至少4周，在所有受试者中停止使用任何可能影响介体测量的口服或局部用药。

鼻腔鼻窦组织片段的制备和治疗(补充附录中图S3，C和D)

一旦对患者进行鼻息肉手术切除后，立即通过切除鼻腔鼻窦外植体，可制备0.9mm³每个的组织片段。将所述组织片段悬浮于RPMI-1640培养基中，单独与组织培养基(TCM)或与4mg/ml的DNA酶hgd40孵育6小时(RNA)和24小时(蛋白)。然后，将组织片段和上清液快速冷冻并储存在-20℃/-80℃，直到蛋白质和mRNA分解。为了研究DNA酶hgd40的摄取，将组织片段单独与TCM，或4mg/ml的罗丹明6G标记的hgd40在脂质体转染制剂中孵育24小时。之后，组织片段嵌入，立即快速冷冻并切成5μm的切片。根据制造商建议，将切片染色为CD3标记。随后，用共焦激光扫描显微镜评估载玻片。

极化TH2细胞的生成和转染(补充附录中图S3，A和B)

根据制造商的说明书，通过Ficoll梯度离心和随后的纯化，用初始CD4 T细胞分离试剂盒(Mlitenyi)从全血或血沉棕黄层中分离初始人CD4+细胞。如前文所述，在IL-2(20ng/ml)， IL-4(20ng/ml)和抗-IFNγ(1μg/ml)的存在10天的条件下，通过用抗CD3和抗CD28的刺激将被分离的细胞极化为TH2细胞。极化后，利用Amaxa***，通过电穿孔，FAM标记的人GATA-3特异性DNA酶hgd40或FAM标记的扰乱的对照DNA酶ODNg3将所述TH2细胞转染。将被转染的细胞再接种并孵育22小时。

极化TH2细胞中GATA-3表达分析(补充附录中图S3A)

经过孵育后，通过荧光流式细胞术(FACS)为GATA-3蛋白表达收集并分析所述的转染细胞。因此，根据制造商的说明书，使用“转录因子染色缓冲液组”(eBioscience)，用Alexra Fluor 647标记的小鼠GATA-抗(克隆L50-823，BD Pharmingen)，对GATA-3蛋白进行细胞内染色。为了分析，将周期时限设置在阳性转染的细胞上，并且在这些细胞中测定GATA-3 表达水平作为几何平均水平。在hgd40转染的细胞和对照转染细胞之间，比较FAM阳性对照的转染细胞中GATA-3蛋白表达的几何平均水平。

鼻腔鼻窦组织片段中的GATA-3表达分析(补充附录中图S3E)

在孵育6小时后，用Aurum Total RNA Mini Kit(Bio-Rad Laboratories)提取RNA，并用 iScript cDNA合成试剂盒(Bio-Rad Laboratories)合成cDNA。在以下条件进行实时PCR扩增：95℃下10分钟，然后在95℃下30秒内循环45次，60℃下30秒，72℃下10秒，溶解曲线分析从60℃到95℃。β-肌动蛋白(ACTB)，次黄嘌呤磷酸核糖基转移酶1和延伸因子1用作标准化的内参。

IL-5蛋白测定(补充附录中图S3F)

在培养24小时后，收集上清液，并用Luminex xMAP技术，按照制造商的指南用市售的荧光素MAP试剂盒(R&D Systems Europe Ltd)，在Bio-Plex 200平台(Bio-RadLaboratories) 上，测定IL-5的浓度。检测极限为1.5pg/ml。

IL-13分泌检测(补充附录中图S3B)

对于IL-13释放的分析，用1μg/ml金黄色葡萄球菌肠毒素B(SEB)刺激转染细胞22小时。根据制造商的说明书，通过FAC分析，用IL-13分泌检测检验试剂盒(Miltenyi)检测IL-13分泌。为了分析，将周期时限设置在阳性转染的细胞上，并且在这些细胞中测定IL-13表达水平作为几何平均水平(GeoMean)。在hgd40转染的细胞和对照转染细胞之间，比较FAM阳性对照的转染细胞中IL-13蛋白表达的几何平均水平。

安全终点评估下列临床化学参数：肌酸酐，碱性磷酸酶，总胆红素，丙氨酸氨基转移酶，天冬氨酸氨基转移酶，γ-谷氨酰转肽酶，总蛋白，尿酸，尿素，钠，钾，钙，氯，葡萄糖(禁食)，乳酸脱氢酶，和肌酸磷酸激酶。血液学参数为：血红蛋白，血细胞比容，平均红细胞体积，平均红细胞血红蛋白，平均红细胞血红蛋白浓度，红细胞计数，差异计数的白细胞计数 (嗜中性粒细胞，嗜酸性粒细胞，嗜碱性粒细胞，淋巴细胞，单核细胞)和血小板计数，活化部分凝血活酶时间，凝血酶原时间，INR，纤维蛋白原。评估以下尿分析参数：白细胞，亚硝酸盐，pH，蛋白质，葡萄糖，酮，***原，胆红素，血液(血红蛋白和红细胞)。记录以下心电图参数：使用根据Einthoven和Goldberger的引线以及根据Wilson的6个胸导线，记录仰卧位5分钟后的12导联心电图。

统计分析

用FGK Clinical Research GmbH(Munich，Germany)生产的SAS(9.3版)软件进行统计分析。用GraphPad Prism(版本5.0)软件制备图S2。

图S1的讨论：

在过敏原暴露后，气道树突细胞对TH0细胞呈现出过敏原，在上皮衍生的细胞因子如 TSLP，IL25和IL-33和初始IL-4(例如由2型先天性淋巴细胞产生的ILC2)的影响下，该TH0细胞分化为TH2细胞。GATA-3代表TH2分化和活性的主要转录因子，并且对TH2细胞因子，如IL-4，IL-5，IL-13的生产而言是不可或缺的。通过释放这些细胞因子，TH2细胞涉及几种效应机制，如B细胞产生igE，随后结合肥大细胞、募集和活化嗜酸性粒细胞以及发展杯状细胞增生。这些效应细胞释放的介体进一步促进炎症，导致平滑肌收缩和粘液生成，随后气道变窄及血管渗漏。在这个过程中，SB010通过特异性地裂解TH2细胞中的信使RNA来干扰上游。因此，就产生了较少的GATA-3蛋白，这然后可能不会充分地转录TH2细胞因子，随后抑制所有下游过程。与其在TH2细胞中的活性类似，SB010还可以抑制其他GATA-3表达细胞中的GATA-3的产生，该其他GATA-3表达细胞例如具有2型细胞因子释放的下游抑制的ILC2、肥大细胞和嗜酸性粒细胞，其也抑制肥大细胞和嗜酸性粒细胞中效应因子的产生。图S1还示出了hgd40的生物活性，该hgd40是SB010的活性化合物。有明显证据表明，hgd40、活性GATA-3DNA酶对GATA-3表达的直接和特定作用，以及下游生物作用。一系列体外和原位实验清楚地显示了SB010的作用模式，SB010作用模式的结果如图S2和图S3 所示(技术细节参见补充附录)。最初，使用所述裂解检测示出了hgd40的特定活性、SB010 中的活性GATA-3DNA酶，所述裂解检测代表高度特异性的体外方法，以确定10-23DNA酶的催化活性。为此，在体外转录复制RNA(cRNA)中，在本例中为人GATA-3cRNA，被与 DNA酶一起孵育。在孵育期间，活性DNA酶将目标cRNA催化裂解为两个产物，而通过琼脂糖凝胶电泳可以证明这两个产物。基于一系列裂解检测分析，结果表明，hgd40即SB010 中的活性成分，是关于GATA-3 cRNA裂解活性的最有活性的DNA酶。图中显示hgd40可服用并且时间依赖性地裂解GATA-3 cRNA(图S2A和S2B)。裂解是高度特异性的，如同通过分析非GATA-3特异性DNA酶对GATA-3cRNA的功效所证明的那样(图S2C)。同时还证明了，即使在低浓度(0.5μMhgd40)的条件下，hgd40也能特异性地裂解单链RNA，并且即便在不是高浓度(20μMhgd40)的条件下，也不会裂解双链DNA。此外，不需要的脱靶作用，如先天免疫细胞的激活，或涉及过敏原效应机制的细胞，之前已经被排除(Dicke T et al. Nucleic Acid Therapeutics 2012；22(2):117-26)。随后，我们证明了该分子在人细胞和组织材料中的生物活性(附图S3)。与被扰乱的对照DNA酶ODNg3转染的细胞相比，hgd40转染的人极化CD+TH2细胞显著抑制GATA-3蛋白表达和随后的IL-13的产生(图S3A，S3B)。接下来，将从特应性哮喘获得的鼻组织外植体与hgd40 DNA酶一起孵育。如图3C和3D所示， hgd40被外植体内的CD3+和CD3-细胞摄取，并在6个小时内显著降低了GATA-3mRNA的水平(图S3E)，并伴随24小时内显著降低的LI-4产生(图S3F)。

补充附录表S1。用于过敏原激发的过敏原

过敏原由ALK-Abelló Arzneimittel GmbH,Germany提供，或AllergopharmaJoachim Ganzer KG,Germany，在链格孢菌属的情况下。

补充附图表S2。在治疗前和治疗后，过敏原激发后早期和晚期反应的变化—完整的肺功能数据集

图例表S2：在治疗前和治疗后，过敏原激发后早期和晚期反应的变化—完整的肺功能数据集

在用SB010或安慰剂治疗前和治疗28天后进行过敏原激发。表中示出的是晚期哮喘反应(LAR)和早期哮喘反应(EAR)的曲线下面积(AUC)的平均值。从治疗前到治疗后AUC值的下降反应出肺功能的改善。表中所给的为治疗前和治疗后的AUC值，接着是SB010组和安慰剂组各自肺功能的变化。这些变化用AUC的治疗前/治疗后的值和治疗前与治疗后之间的百分比变化来呈现。正值反映了肺功能的改善，负值对应于和治疗前相比的治疗后的更大的曲线下面积。组间差异显示出SB010组和安慰剂组之间相对变化的增量。通过ANCOVA 模型，可计算LAR/EAR值及LAR和EAR中最大FEV₁下降；通过Wilcoxon秩和检验可计算EAR AUC的P值。

补充附录表S3A。在治疗前和治疗后，过敏原激发后早期和晚期反应的变化—对血液嗜酸性粒细胞≥4％的患者的预先指定的组的分析

图例附录表S3A：在治疗前和治疗后，过敏原激发后早期和晚期反应的变化—对血液嗜酸性粒细胞≥4％的患者的预先指定的组的分析

在用SB010或安慰剂治疗前和治疗28天后进行过敏原激发。表中示出的是晚期哮喘反应(LAR)和早期哮喘反应(EAR)的曲线下面积(AUC)的平均值。从治疗前到治疗后AUC值的下降反应出肺功能的改善。表中所给的为治疗前和治疗后的AUC值，接着是SB010组和安慰剂组各自肺功能的变化。这些变化用AUC的治疗前/治疗后的值和治疗前与治疗后之间的百分比变化来呈现。正值反映了肺功能的改善，负值对应于和治疗前相比治疗后的更大的曲线下面积。组间差异显示出SB010组和安慰剂组之间相对变化的增量。通过ANCOVA模型，可计算LAR AUC的P值；通过Wilcoxon秩和检验可计算EAR AUC的P值以及LAR 和EAR中最大FEV₁下降。

补充附录表S3B。在治疗前和治疗后，过敏原激发后早期和晚期反应的变化—对FeNO≥40ppb的患者的预先指定的组的分析

附录表S3B：在治疗前和治疗后，过敏原激发后早期和晚期反应的变化—对FeNO≥40ppb 的患者的预先指定的组的分析

在用SB010或安慰剂治疗前和治疗28天后进行过敏原激发。表中示出的是晚期哮喘反应(LAR)和早期哮喘反应(EAR)的曲线下面积(AUC)的平均值。从治疗前到治疗后AUC值的下降反应出肺功能的改善。表中所给的为治疗前和治疗后的AUC值，接着是SB010组和安慰剂组各自肺功能的变化。这些变化用AUC的治疗前/治疗后的值和治疗前与治疗后之间的百分比变化来呈现。正值反映了肺功能的改善，负值对应于和治疗前相比治疗后的更大的曲线下面积。组间差异显示出SB010组和安慰剂组之间相对变化的增量。通过ANCOVA模型，可计算LAR AUC的P值及LAR和EAR中最大FEV₁下降；通过Wilcoxon秩和检验可计算EAR AUC的P值。

补充附录表S4A：晚期哮喘反应(LAR，3-7小时)个体对过敏原激发的反应

附录表S4B：早期哮喘反应(EAR，0-3小时)个体对过敏原激发的反应

补充附录表S5。SB010或安慰剂治疗28天后对激发后FeNO和PC20水平的影响

附录表S5：SB010或安慰剂治疗28天后对激发后FeNO和PC20水平的影响

用SB010或安慰剂治疗28天后对FeNO和PC20水平的影响。在用SB010或安慰剂治疗之前或治疗后的28天之后，在过敏原激发后，进行FeNO水平的测定和气道高反应性评估(PC20)。FeNO水平被表达为ppb，PC20倍表达为乙酰甲胆碱mg/dl。P值可通过Wilcoxon 秩和检验计算。

补充附录表S6。SB010或安慰剂治疗28天后对非激发的FeNO水平的影响

附录表S6：SB010或安慰剂治疗28天后对非激发的FeNO水平的影响

在随后的60天期间后期，在第88天测定后，在基线预过敏原激发和预治疗测定FeNO。表中所示出的是意向治疗研究人群的中值和四分位距(IQR)，以及预先指定的血液嗜酸性粒细胞≥4％及基线FeNO≥40ppb的人群。P值可通过Wilcoxon秩和检验计算。

补充附录表S7：安全生物标记

血液IL-4，IL-13和IFN-γ：大多数值低于定量下限；IL-5参见补充附录图S6。

补充附录表S8：痰液中差异细胞计数—表达为细胞×10⁶/g痰液

表中分别示出了治疗前和治疗后的平均值加标准偏差/后过敏原变化。

补充附录表S9：研究终点/端点列表

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Claims

1.一种GATA-3基于核酸的灭活剂在制备用于治疗患有TH2驱动型哮喘的患者的药物中的用途，其特征在于，所述患者特征在于(i)血液嗜酸性粒细胞计数为3％或以上，特别为4％或以上，更特别地为5％或以上；以及/或(ii)血液嗜酸性粒细胞计数为350×10⁶/L或以上，特别为450×10⁶/L或以上；以及/或(iii)呼气一氧化氮分值在40ppb或以上；

包括步骤向所述患者施用有效量的GATA-3基于核酸的灭活剂。

2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述基于核酸的灭活剂是一种指向GATA-3的DNA酶。

3.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述患者血液嗜酸性粒细胞计数为4％或以上，尤其为5％或以上。

4.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述患者血液嗜酸性粒细胞计数为350×10⁶/L或以上，尤其为450×10⁶/L或以上。

5.根据权利要求3所述的用途，其特征在于，所述血液嗜酸性粒细胞计数是由以下方法确定的：(i)血液细胞自动分类计数；或(ii)用常规血液涂片的手动显微细胞分化。

6.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述患者呼气一氧化氮分值在40ppb或以上。

7.根据权利要求6所述的用途，其特征在于，使用手持式NIOX

设备确定呼气一氧化氮分值。

8.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述GATA-3的基于核酸的灭活剂是DNA酶hgd40(SEQ ID NO:3)。

9.根据权利要求8所述的用途，其特征在于，所述hgd40被包含在用来吸入的制剂中。

10.根据权利要求9所述的用途，其特征在于，所述hgd40溶解于PBS。

11.根据权利要求10所述的用途，其特征在于，5至50mg之间的hgd40，尤其是5至20mg之间的hgd40，尤其是10mg的hgd40溶解于2ml PBS中。

12.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述GATA-3的基于核酸的灭活剂是每天施用一次，一天两次或一天三次，尤其是每天施用一次。

13.根据权利要求12所述的用途，其特征在于，所述GATA-3的基于核酸的灭活剂是在连续治疗中每天施用一次，特别是维持治疗。

14.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述基于核酸的灭活剂被用作用来治疗哮喘的一种或多种吸入或口服治疗的附加疗法，所述吸入或口服治疗选自：皮质类固醇，长效β受体激动剂(LABAs)，长效毒蕈碱性拮抗剂(LAMA)，抗白三烯，短效β受体激动剂(SABA)，抗胆碱能药和单克隆抗体。