CN115135651A

CN115135651A - 作为prmt5抑制剂的被取代的核苷类似物

Info

Publication number: CN115135651A
Application number: CN202080084064.8A
Authority: CN
Inventors: P·S·纳尔; G·B·古达德; S·B·巴哈瓦特; A·M·亚达夫; C·P·库尔卡尼; M·D·辛德克赫德卡; V·P·帕勒; R·K·卡布吉
Original assignee: Rupien GmbH
Current assignee: Rupien GmbH
Priority date: 2019-12-03
Filing date: 2020-12-02
Publication date: 2022-09-30
Also published as: BR112022010943A2; US20230066014A1; CA3163421A1; WO2021111322A1; ZA202205799B; MX2022006735A; EP4069698A1; JP2023504279A; AU2020394887A1

Abstract

本发明涉及用于治疗与PRMT5酶的过表达有关的疾病、障碍或病症的式(I)的被取代的核苷类似物、其药学上可接受的盐和药物组合物。本发明也涉及治疗与PRMT5酶的过表达有关的疾病、障碍或病症的方法。

Description

作为PRMT5抑制剂的被取代的核苷类似物

发明领域

本发明涉及用于治疗与PRMT5酶的过表达有关的疾病、障碍或病症的式(I)的被取代的核苷类似物、其药学上可接受的盐和药物组合物。本发明还涉及治疗与PRMT5酶的过表达有关的疾病、障碍或病症的方法。

相关申请的交叉引用

本申请要求2019年12月3日提交的印度临时专利申请号IN201921049775的权益，其公开内容通过引用整体并入本文用于所有目的。

发明背景

蛋白的甲基化是一种常见的翻译后修饰，其影响蛋白的活性及其与其它生物分子的相互作用。N-甲基化通常发生在精氨酸、赖氨酸和组氨酸残基的氮原子上，并且催化甲基化反应的酶有不同的家族，每种酶对将被甲基化的氨基酸残基是特异性的。

一个家族的9种酶，被称为蛋白精氨酸N-甲基转移酶(PRMT)，负责精氨酸的胍基的甲基化。精氨酸的胍基带有2个末端氮原子，其经历单甲基化或二甲基化。根据二甲基化的类型，所述酶进一步分类为I型或II型。I型PRMT催化单甲基化或不对称的二甲基化，而II型酶催化对称的二甲基化。一些经历甲基化的底物是组蛋白、Sm核糖核蛋白、MRE11和p53结合蛋白1。

精氨酸侧链的甲基化在多种细胞功能中起重要作用，所述细胞功能包括转录激活以及转录阻遏、mRNA翻译、前-mRNA剪接、蛋白运输和信号转导。它也发生在无数的底物上。因此，PRMT的酶活性影响细胞过程如细胞增殖、受损的DNA的修复以及细胞周期和细胞死亡。已经证实，PRMT酶介导的超甲基化导致某些疾病状况如癌症(Nature Reviews Cancer2013,13，第37页；Cellular and Molecular Life Sciences 2015,72，第2041页；Trendsin Biochemical Sciences 2011,36，第633页)。

目前，研究最多的II型酶是PRMT5，其在真核生物中是保守的。PRMT5的过表达与致癌作用有关，并且在几种人恶性肿瘤中会降低患者的存活率(Cell Mol Life Sci.,2015,72，第2041页)。PRMT5与癌症中经常失调或突变的蛋白直接相互作用，因此成为一种假定的癌基因(Mol Cell Biol,2008,28，第6262页)。PRMT5介导的肿瘤抑制基因如p53、RB-1、ST7的转录阻遏或细胞周期蛋白D1、CDK4、CDK6、eLF4E、MITF、FGFR3的上调与实体瘤和血液恶性肿瘤中的癌发生相关。PRMT5位于细胞核以及细胞质中，并且其过表达已经与多种癌症相关联，所述癌症包括、但不限于多形性胶质母细胞瘤(Oncogene,2017,36，第263页)、***癌(Oncogene,2017,36，第1223页)和胰腺癌(Science,2016,351，第1214页)、套细胞淋巴瘤(Nature Chemical Biology,2015,11，第432页)、非霍奇金淋巴瘤和弥漫性大B细胞性淋巴瘤(Journal of Biological Chemistry,2013,288，第35534页)、急性髓系白血病(Leukemia,2018,32，第499页)、急性淋巴母细胞白血病(AACR；Cancer Research 2017；77(13增刊):摘要号1128)、多发性骨髓瘤(Leukemia,2018,32，第996页)、非小细胞肺癌(TheBiochemical Journal,2012,446，第235页)、小细胞肺癌(AACR；Cancer Research 2017；77(13增刊):摘要号DDT02-04)、乳腺癌(Cell Reports,2017,21，第3498页)、三阴性乳腺癌(triple negative breast cancer)(AACR；Cancer Res 2015；75(15增刊):摘要号4786)、胃癌(International Journal of Oncology,2016,49，第1195页)、结肠直肠癌(Oncotarget,2015,6，第22799页)、卵巢癌(J Histochem Cytochem 2013,61，第206页)、膀胱癌(Clinical Cancer Research,2018,CCR-18-1270)、肝细胞癌(Oncology Reports,2018,40，第536页)、黑素瘤(PLoS One,2013,8,e74710；J Clin Invest.2018,128，第517页)、肉瘤(Oncology Letters,2018,16，第2161页)、口咽鳞状细胞癌(Oncotarget,2017,8，第14847页)、慢性髓细胞性白血病(J Clin Invest,2016,126，第3961页)、表皮鳞状细胞癌(Carcinogenesis,2017,38，第827页)、鼻咽癌(Oncology Reports,2016,35，第1703页)、神经母细胞瘤(Molecular Oncology,2015,9，第617页)、子宫内膜癌(Gynecol Oncol.,2016,140，第145页)、***(Pharmazie,2018,73，第269页)。这些发现已经导致了进一步研究，其表明抑制PRMT5会降低细胞增殖(Molecular and Cellular Biology 2008,28，第6262页,The Journal of Biological Chemistry 2013,288，第35534页)。

精氨酸甲基转移酶的抑制剂在2004年由Cheng等人首次在Journal ofBiological Chemistry-第279(23)卷,第23892页中公开。从那时起，已经公开了对I型或II型精氨酸甲基转移酶具有更大选择性的各种其它化合物和物质。公开了作为与PRMT5有关的抑制剂的小分子的其它出版物是：WO2011077133、WO2011079236、WO2014100695、WO2014100716、WO2014100719、WO2014100730、WO2014100734、WO2014128465、WO2014145214、WO2015200677、WO2015200680、WO2015198229、WO2016022605、WO2016034671、WO2016034673、WO2016034675、WO2016038550、WO2016135582、WO2016145150、WO2016178870、WO2017032840、WO2018160824、WO2018152501、WO2018085818、WO2018065365、WO2019116302A1、WO2020033288A1、WO2020205867A1和ACSMedicinal Chemistry Letters 2015,6，第408页。

发明概述

根据一个方面，本发明提供了通式(I)的化合物、其立体异构体、其互变异构形式或其药学上可接受的盐，

其中，

L₁选自-CR^aR^b-、-NR^a-、S和O；

R^a和R^b在每次出现时独立地选自氢、被取代的或未被取代的烷基和被取代的或未被取代的环烷基；

环A选自式(i)至(viii)，其中在环A上的取代基R³可以在环C原子中的任一个上被取代，

R^c和R^d是被取代的或未被取代的烷基或与R^c和R^d所连接的碳原子一起形成C₃-C₆环烷基环；

Hy选自式(a-1)至(d-1)，

R选自-NR⁴R⁵、被取代的或未被取代的烷基和环烷基；

R¹和R²与它们所连接的碳原子一起形成键以便形成-C＝C-；或R¹和R²与它们所连接的碳原子一起形成环丙烷环；

R^2’和R^2a可以相同或不同并且在每次出现时独立地选自氢和被取代的或未被取代的烷基；

R³在每次出现时独立地选自卤素、氰基、硝基、被取代的或未被取代的烷基、-OR⁶、-NR⁷R⁸、被取代的或未被取代的环烷基、-C(O)OH、-C(O)O-烷基、-C(O)R⁹、-C(O)NR⁷R⁸、-NR⁷C(O)R⁹、被取代的或未被取代的芳基、被取代的或未被取代的杂芳基、被取代的或未被取代的杂环基和卤代烷基；

R⁴和R⁵独立地选自氢、被取代的或未被取代的烷基和被取代的或未被取代的环烷基；

R⁶选自氢、被取代的或未被取代的烷基和被取代的或未被取代的环烷基；

R⁷和R⁸独立地选自氢、被取代的或未被取代的烷基和被取代的或未被取代的环烷基；

R⁹选自被取代的或未被取代的烷基和被取代的或未被取代的环烷基；

R¹⁰选自氢、卤素和被取代的或未被取代的烷基；

‘m’是在0-1范围内的整数，包括两端；

‘n’是在0-4范围内的整数，包括两端；

当烷基基团被取代时，它被1-4个取代基取代，所述取代基独立地选自氧代(＝O)、卤素、氰基、环烷基、芳基、杂芳基、杂环基、-OR^7a、-C(＝O)OH、-C(＝O)O(烷基)、-NR^8aR^8b、-NR^8aC(＝O)R^9a和-C(＝O)NR^8aR^8b；

当杂芳基基团被取代时，它被1-4个取代基取代，所述取代基独立地选自卤素、氰基、烷基、卤代烷基、全卤代烷基、环烷基、杂环基、-OR^7a、-NR^8aR^8b、-NR^7aC(＝O)R^9a、-C(＝O)NR^8aR^8b；

当芳基基团被取代时，它被1-4个取代基取代，所述取代基独立地选自卤素、氰基、烷基、卤代烷基、全卤代烷基、环烷基、杂环基、-OR^7a、-NR^8aR^8b、-NR^7aC(＝O)R^9a、-C(＝O)NR^8aR^8b；

当环烷基基团被取代时，它被1-4个取代基取代，所述取代基独立地选自卤素、氰基、烷基、卤代烷基、全卤代烷基、-OR^7a、-NR^8aR^8b、-NR^7aC(＝O)R^9a、-C(＝O)NR^8aR^8b；

R^7a选自氢、烷基、全卤代烷基和环烷基；

R^8a和R^8b各自独立地选自氢、烷基和环烷基；且

R^9a选自烷基和环烷基。

下面阐述的本发明的一个或多个实施方案的细节在性质上仅仅是示例性的，且无意限制本发明的范围。本发明的其它特征、目的和优点将从说明书和权利要求书中显而易见。

根据一个实施方案，本发明提供了具有式(II)的结构的化合物、其立体异构体或其药学上可接受的盐，

其中，

环A、Hy、L₁、R^2a、R^2’、R^a、R^b、R³和n如上文所定义。

根据另一个实施方案，本发明提供了具有式(III)的结构的化合物、其立体异构体或其药学上可接受的盐，

其中，L₁是-CR^aR^b-或O；

环A是

Hy选自式(a-1)、(b-1)和(d-1)，

R选自-NR⁴R⁵、被取代的或未被取代的烷基和环烷基；R⁴和R⁵独立地选自氢；R^2’是氢；R³在每次出现时独立地选自卤素、被取代的或未被取代的烷基、-OR⁶和-NR⁷R⁸；R⁷和R⁸独立地选自氢；R¹⁰是氢；‘m’是1；‘n’是在0-3范围内的整数，包括两端；

根据一个实施方案，提供了式(I)、(II)和(III)的化合物，其中所述化合物是呈游离碱的形式或是其药学上可接受的盐。

在以上实施方案中的任一个中，R是甲基。

根据另一个实施方案，提供了式(I)、(II)和(III)的化合物，其中Hy选自，

在本发明的另一个方面，提供了用于治疗与PRMT5酶有关的疾病、障碍、综合征或病症的式(I)、(II)和(III)的化合物或其药学上可接受的盐。

在本发明的一个实施方案中，提供了用于通过抑制PRMT5酶来治疗疾病、障碍、综合征或病症的式(I)、(II)和(III)的化合物或其药学上可接受的盐。

在本发明的另一个方面，提供了用于用作药物的式(I)、(II)和(III)的化合物或其药学上可接受的盐。

在本发明的另一个方面，提供了用于治疗与PRMT5有关的疾病、障碍、综合征或病症的式(I)、(II)和(III)的化合物或其药学上可接受的盐。

在本发明的一个实施方案中，提供了用于通过抑制PRMT5来治疗疾病、障碍、综合征或病症的式(I)、(II)和(III)的化合物或其药学上可接受的盐。

在本发明的另一个方面，提供了通过使用选自式(I)、(II)和(III)的化合物或其药学上可接受的盐来抑制PRMT5的方法。

在本发明的另一个方面，提供了通过使用选自式(I)、(II)和(III)的化合物来治疗与PRMT5有关的疾病、障碍或病症的方法。

在本发明的另一个方面，提供了通过使用选自式(I)、(II)和(III)的化合物来治疗疾病、障碍或病症的方法，所述疾病、障碍或病症选自多形性胶质母细胞瘤、***癌和胰腺癌、套细胞淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤和弥漫性大B细胞性淋巴瘤、急性髓系白血病、急性淋巴母细胞白血病、多发性骨髓瘤、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、乳腺癌、三阴性乳腺癌、胃癌、结肠直肠癌、卵巢癌、膀胱癌、肝细胞癌、黑素瘤、肉瘤、口咽鳞状细胞癌、慢性髓细胞性白血病、表皮鳞状细胞癌、鼻咽癌、神经母细胞瘤、子宫内膜癌和***。

在本发明的另一个方面，提供了一种选自式(I)、(II)和(III)的化合物或其药学上可接受的盐用于制备药物的用途，所述药物用于治疗与PRMT5有关的疾病、障碍或病症。

在另一个方面，本发明提供了一种药物组合物，其包含至少一种式(I)、(II)和(III)的化合物或其药学上可接受的盐和至少一种药学上可接受的赋形剂。

在另一个方面，本发明提供了一种用于通过施用给有此需要的受试者来治疗与PRMT5有关的疾病、障碍或病症的药物组合物，其包含治疗有效量的式(I)、(II)和(III)的化合物或其药学上可接受的盐。

在本发明的另一个方面，其中式(I)、(II)和(III)的化合物或其药学上可接受的盐用于通过抑制PRMT5来治疗与PRMT5有关的疾病、障碍、综合征或病症的用途，所述疾病、障碍、综合征或病症选自多形性胶质母细胞瘤、***癌和胰腺癌、套细胞淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤和弥漫性大B细胞性淋巴瘤、急性髓系白血病、急性淋巴母细胞白血病、多发性骨髓瘤、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、乳腺癌、三阴性乳腺癌、胃癌、结肠直肠癌、卵巢癌、膀胱癌、肝细胞癌、黑素瘤、肉瘤、口咽鳞状细胞癌、慢性髓细胞性白血病、表皮鳞状细胞癌、鼻咽癌、神经母细胞瘤、子宫内膜癌和***。

在本发明的另一个实施方案中，所述化合物、其立体异构体或其药学上可接受的盐是：

(1S,2R,5R)-3-(2-(2-氨基-3-氯-5-氟喹啉-7-基)乙基)-5-(2-氨基-4-甲基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)环戊-3-烯-1,2-二醇；

(1S,2R,5R)-3-(((2-氨基-3-氯-5-氟喹啉-7-基)氧基)甲基)-5-(2-氨基-4-甲基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)环戊-3-烯-1,2-二醇；

(1S,2R,5R)-5-(4-氨基-2-甲基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)-3-(((2-氨基-3-氯-5-氟喹啉-7-基)氧基)甲基)环戊-3-烯-1,2-二醇；

(1S,2R,5R)-3-(2-(2-氨基-3-氯-5-氟喹啉-7-基)乙基)-5-(6-氨基-4-甲基-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)环戊-3-烯-1,2-二醇；

(1S,2R,5R)-5-(4-氨基-2-甲基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)-3-(((6-(二氟甲基)-1,2,3,4-四氢异喹啉-8-基)氧基)甲基)环戊-3-烯-1,2-二醇；

(1S,2R,5R)-5-(4-氨基-2-甲基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)-3-(2-(6-(二氟甲基)-1,2,3,4-四氢异喹啉-8-基)乙基)环戊-3-烯-1,2-二醇；

(1S,2R,5R)-5-(4-氨基-2-甲基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)-3-(2-(2-氨基-3-氯-5-氟喹啉-7-基)乙基)环戊-3-烯-1,2-二醇，和

(1S,2R,5R)-5-(2-氨基-4-甲基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)-3-(2-(6-(二氟甲基)-5-氟-1,2,3,4-四氢异喹啉-8-基)乙基)环戊-3-烯-1,2-二醇。

发明详述：

除非另有说明，否则在说明书和权利要求书中使用的以下术语具有以下给出的含义。

为了解释说明书的目的，将应用以下定义，并且在适当时，以单数形式使用的术语也包括复数形式，反之亦然。

术语“卤素”或“卤”是指氟、氯、溴或碘。

术语“烷基”表示烷烃衍生的烃自由基，其在主链中仅包括碳和氢原子，不含不饱和度，具有1至6个碳原子，并且通过单键连接至分子的其余部分，例如(C₁-C₆)烷基或(C₁-C₄)烷基，代表性基团包括例如甲基、乙基、正丙基、1-甲基乙基(异丙基)、正丁基、正戊基等。除非有相反说明或叙述，否则本文描述的或要求保护的所有烷基基团可以是直链或支链。

术语“卤代烷基”表示被一个或多个如上定义的卤素原子取代的如上定义的烷基基团。例如(C₁-C₆)卤代烷基或(C₁-C₄)卤代烷基。适当地，卤代烷基可以是单卤代烷基、二卤代烷基或多卤代烷基，包括全卤代烷基。单卤代烷基可以具有一个碘、溴、氯或氟原子。二卤代烷基和多卤代烷基基团可以被两个或更多个相同的卤素原子或不同卤素原子的组合取代。适当地，多卤代烷基被至多12个卤素原子取代。卤代烷基的非限制性例子包括氟甲基、二氟甲基、三氟甲基、氯甲基、二氯甲基、三氯甲基、五氟乙基、七氟丙基、二氟氯甲基、二氯氟甲基、二氟乙基、二氟丙基、二氯乙基、二氯丙基等。全卤代烷基表示所有氢原子都被卤素原子替换的烷基。除非有相反说明或叙述，否则本文描述的或要求保护的所有卤代烷基基团可以是直链或支链。

术语“烷氧基”表示通过氧键连接至分子的其余部分的烷基基团。这样的基团的代表性例子是-OCH₃和-OC₂H₅。除非有相反说明或叙述，否则本文描述的或要求保护的所有烷氧基基团可以是直链或支链。

术语“烷氧基烷基”表示直接键合至如上定义的烷基基团的如上定义的烷氧基基团，例如，-CH₂-O-CH₃、-CH₂-O-CH₂CH₃、-CH₂CH₂-O-CH₃等。

术语“环烷基”表示具有3-12个碳原子的非芳族单环或多环环***，诸如(C₃-C₁₀)环烷基、(C₃-C₆)环烷基、环丙基、环丁基、环戊基、环己基等。多环环烷基基团的例子包括、但不限于全氢萘基、金刚烷基和降冰片基(norbornyl)基团、桥连的环状基团或螺二环基团，例如，螺(4,4)壬-2-基等。

术语“芳基”表示具有6-14个碳原子的芳族自由基，包括单环、二环和三环芳族***，诸如苯基、萘基、四氢萘基、茚满基和联苯基等。

除非另外指出，否则术语“杂环”或“杂环基环”或“杂环基”表示被取代的或未被取代的非芳族3-15元环，其由碳原子和一个或多个独立地选自N、O或S的杂原子组成。杂环可以是单环、双环或三环环***，其可以包括稠合的、桥连的或螺环***，并且杂环中的氮、碳、氧或硫原子可以任选地被氧化成各种氧化态。此外，氮原子可以任选地被季铵化，杂环或杂环基可以任选地含有一个或多个烯键，并且在杂环或杂环基中的一个或两个碳原子可以被-CF₂-、-C(O)-、-S(O)-、S(O)₂等隔开。另外，杂环也可以与芳族环稠合。杂环的非限制性例子包括氮杂环丁基、苯并吡喃基、色满基、十氢异喹啉基、吲哚啉基、异吲哚啉基、异色满基、异噻唑烷基、异噁唑烷基、吗啉基、噁唑啉基、噁唑烷基、2-氧代哌嗪基、2-氧代哌啶基、2-氧代吡咯烷基、2-氧代氮杂环庚三烯基、八氢吲哚基、八氢异吲哚基、全氢氮杂环庚三烯基、哌嗪基、4-哌啶酮基、吡咯烷基、哌啶基、吩噻嗪基、吩噁嗪基、奎宁环基、四氢异喹啉基、四氢呋喃基、四氢吡喃基、噻唑啉基、噻唑烷基、硫吗啉基、硫吗啉基亚砜、硫吗啉基砜吲哚啉、苯并二氧杂环戊二烯、四氢喹啉、四氢苯并吡喃等。杂环可以通过导致稳定结构产生的杂环的任何原子连接。

除非另外指出，否则术语“杂芳基”表示被取代的或未被取代的5-14元芳族杂环，其具有一个或多个独立地选自N、O或S的杂原子。所述杂芳基可以是单环、二环或三环环***。杂芳基环可以通过导致稳定结构产生的杂芳基环的任何原子连接。杂芳基环的非限制性例子包括噁唑基、异噁唑基、咪唑基、呋喃基、吲哚基、异吲哚基、吡咯基、***基、三嗪基、四唑基、噻吩基、噻唑基、异噻唑基、吡啶基、嘧啶基、吡嗪基、哒嗪基、苯并呋喃基、苯并噻唑基、苯并噁唑基、苯并咪唑基、苯并噻吩基、咔唑基、喹啉基、异喹啉基、喹唑啉基、噌啉基、萘啶基、喋啶基、嘌呤基、喹喔啉基、喹啉基、异喹啉基、噻二唑基、吲嗪基、吖啶基、吩嗪基、酞嗪基等。

本发明的化合物可以具有一个或多个手性中心。在每个手性中心处的绝对立体化学可以是‘R’或‘S’。本发明的化合物包括所有的非对映异构体和对映异构体及其混合物。除非另外特别提及，否则对一种立体异构体的提及适用于任何可能的立体异构体。每当未指明立体异构组成时，应当理解，包括所有可能的立体异构体。

术语“立体异构体”表示由相同原子通过相同键键合而组成的化合物，但具有不可互换的不同三维结构。三维结构被称为构型。本文中使用的术语“对映异构体”表示其分子为彼此的不可重叠镜像的两种立体异构体。术语“手性中心”表示连接有四个不同基团的碳原子。本文中使用的术语“非对映异构体”表示不是对映异构体的立体异构体。术语“外消旋体”或“外消旋混合物”表示等份对映异构体的混合物。

“互变异构体”表示经历从化合物的一个原子到化合物的另一个原子的快速质子转移的化合物。本文中所述的一些化合物可以作为具有不同氢连接点的互变异构体存在。式(I)的化合物包括各种互变异构体及其混合物。

术语“治疗”状态、障碍或病症包括：(a)预防或延缓在受试者中发展的所述状态、障碍或病症的临床症状的出现，所述受试者可能患有或易患所述状态、障碍或病症，但尚未经历或显示出所述状态、障碍或病症的临床或亚临床症状；(b)抑制所述状态、障碍或病症，即，阻止或减轻所述疾病或其至少一种临床或亚临床症状的发展；(c)减轻疾病、障碍或病症或其临床或亚临床症状中的至少一种；或(d)消除疾病，即，造成所述状态、障碍或病症或其临床或亚临床症状中的至少一种的消退。

术语“抑制剂”表示与酶结合以部分地或完全地抑制所述酶的活性的分子。

术语“受试者”包括哺乳动物(尤其是人类)和其它动物，诸如家养动物(例如，家庭宠物，包括猫和狗)和非家养动物(诸如野生生物)。

“治疗有效量”是指，当施用给受试者用于治疗疾病、障碍或病症时，足以在受试者中引起效果的化合物的量，所述效果是施用的目的。“治疗有效量”将根据化合物、疾病及其严重程度和待治疗受试者的年龄、体重、身体状况和应答性而变化。

药学上可接受的盐

本发明的化合物可以与酸或碱形成盐。本发明的化合物可以是足够碱性或酸性的，以形成稳定的无毒的酸或碱盐，化合物作为药学上可接受的盐的施用可能是适当的。药学上可接受的盐的非限制性例子是通过加入酸形成的无机、有机酸加成盐，包括盐酸盐。药学上可接受的盐的非限制性例子是通过加入碱形成的无机、有机碱加成盐。本发明的化合物还可以与氨基酸形成盐。药学上可接受的盐可以使用本领域众所周知的标准程序获得，例如通过使足够碱性的化合物如胺与合适的酸反应。

通过使用本文下文提及的各种体外和体内方案或本领域已知的方法，可以实现关于PRMT5抑制活性对本发明化合物的筛选。

药物组合物

本发明涉及含有本文公开的式(I)的化合物或其药学上可接受的盐的药物组合物。具体地，含有治疗有效量的至少一种本文所述的式(I)的化合物和至少一种药学上可接受的赋形剂(诸如载体或稀释剂)的药物组合物。优选地，所考虑的药物组合物包括一定量的本文所述的化合物，当施用给受试者时，所述一定量足以抑制PRMT5以治疗本文所述的疾病。

所考虑的受试者包括例如活细胞和哺乳动物，包括人。本发明的化合物可以与药学上可接受的赋形剂(诸如载体或稀释剂)结合，或被载体稀释，或被包封在载体内，其可以是胶囊、药囊、纸或其它容器的形式。药学上可接受的赋形剂包括其本身不诱导产生对接受组合物的个体有害的抗体并且其可以在没有不适当毒性的情况下施用的药学试剂。

合适的载体或赋形剂的例子包括、但不限于水、盐溶液、醇、聚乙二醇、聚羟基乙氧基化的蓖麻油、花生油、橄榄油、明胶、乳糖、石膏粉、蔗糖、糊精、碳酸镁、糖、环糊精、直链淀粉、硬脂酸镁、滑石粉、明胶、琼脂、果胶、***胶、硬脂酸或纤维素的低级烷基醚、水杨酸、脂肪酸、脂肪酸胺、脂肪酸甘油单酯和甘油二酯、季戊四醇脂肪酸酯、聚氧乙烯、羟基甲基纤维素和聚乙烯吡咯烷酮。

所述药物组合物还可以包括一种或多种药学上可接受的助剂、润湿剂、乳化剂、助悬剂、防腐剂、用于影响渗透压的盐、缓冲剂、甜味剂、矫味剂、着色剂或前述的任意组合。通过采用本领域已知的程序，可以配制本发明的药物组合物，从而在向受试者施用后提供活性成分的快速、持续或延迟释放。

通过本领域已知的常规技术，可以制备本文所述的药物组合物。例如，活性化合物可以与载体混合，或被载体稀释，或被包封在载体内，其可以是安瓿、胶囊、药囊、纸或其它容器的形式。当载体用作稀释剂时，其可以是固体、半固体或液体材料，所述材料充当活性化合物的媒介物、赋形剂或介质。活性化合物可以被吸附在颗粒状固体容器上，例如在药囊中。

药物组合物可以是常规形式，例如胶囊剂、片剂、胶囊形片剂、口腔崩解片剂、气雾剂、溶液、混悬剂或用于局部应用的产品。

施用途径可以是将本发明的活性化合物有效运输至适当的或期望的作用部位的任何途径。合适的施用途径包括、但不限于：口服、经口吸入、鼻、肺、含服、真皮下(subdermal)、皮内(intradermal)、透皮(transdermal)、胃肠外、直肠、储库、皮下(subcutaneous)、静脉内、尿道内、肌肉内、鼻内、眼(例如用眼用溶液)或局部(例如用局部软膏)。

固体口服制剂包括、但不限于片剂、胶囊形片剂、胶囊剂(软或硬明胶)、口腔崩解片剂、糖衣丸(含有粉末或丸剂形式的活性成分)、糖锭剂(troche)和锭剂。具有滑石粉和/或碳水化合物载体或粘合剂等的片剂、糖衣丸或胶囊特别适合于口服应用。液体制剂包括、但不限于糖浆剂、乳剂、混悬剂、溶液、软明胶和无菌可注射液体，诸如水性或非水性液体混悬剂或溶液。对于胃肠外应用而言，特别合适的是可注射溶液或混悬剂，优选含有溶解在多羟基化蓖麻油中的活性化合物的水溶液。

药物制备物优选地呈单位剂型。在这样的形式中，将该制备物细分成含有适当量的活性组分的单位剂量。单位剂型可以是包装的制备物，所述包装含有离散量的制备物，诸如袋装片剂、胶囊剂和在小瓶(vial)或安瓿中的粉末。单位剂型也可以是胶囊剂、片剂、胶囊形片剂、扁囊剂或锭剂本身，或者它可以是适当数目的处于包装形式的这些中的任一种。

对于施用给受试患者，本发明化合物的总日剂量当然取决于施用模式。例如，口服施用可能需要比静脉内(直接进入血液)更高的总日剂量。根据活性组分的效能或施用模式，单位剂量制备物中的活性组分的量可以在0.1mg至1000mg(通过口服施用)和1μg至5000μg(通过吸入)之间变化或调整。

相关领域的技术人员可以确定用于治疗本文描述的疾病和障碍的化合物的合适剂量。通常基于源自动物研究的初步证据通过在受试者中的剂量范围研究来确定治疗剂量。剂量必须足以产生期望的治疗益处，而不引起患者的不希望的副作用。例如，通过口服施用，PRMT5抑制剂的日剂量可以在从约0.1至约30.0mg/kg的范围内。本领域技术人员也可以熟练使用和调整施用模式、剂型、合适的药物赋形剂、稀释剂或载体。所预想的所有变化和修改都在本发明的范围内。

本发明提供了作为蛋白精氨酸甲基转移酶-5(PRMT5)抑制剂的式(I)的化合物及其药物组合物，其用于治疗与PRMT5的过表达相关的疾病、障碍或病症。本发明进一步提供了通过给受试者施用治疗有效量的本发明的化合物或药物组合物在有此需要的受试者中治疗与PRMT5的过表达相关的疾病、障碍或病症的方法。

在另一个方面，本发明涉及一种治疗与PRMT5的过表达有关的疾病、障碍或病症的方法。在该方法中，向需要这种治疗的受试者施用治疗有效量的如本文所述的式(I)的化合物或其药学上可接受的盐。

在本发明的一个实施方案中，与PRMT5的过表达有关的疾病、障碍或病症是癌症。

在另一个实施方案中，本发明提供了一种治疗癌症(具体地，多形性胶质母细胞瘤、***癌、胰腺癌、套细胞淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤和弥漫性大B细胞性淋巴瘤、急性髓系白血病、急性淋巴母细胞白血病、多发性骨髓瘤、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、乳腺癌、三阴性乳腺癌、胃癌、结肠直肠癌、卵巢癌、膀胱癌、肝细胞癌、黑素瘤、肉瘤、口咽鳞状细胞癌、慢性髓细胞性白血病、表皮鳞状细胞癌、鼻咽癌、神经母细胞瘤、子宫内膜癌和***)的方法。

应当理解，本发明包括用于治疗本文所述疾病或障碍的式(I)的化合物或其药学上可接受的盐。

应当理解，本发明包括式(I)的化合物或其药学上可接受的盐在制备药物中的用途，所述药物用于治疗本文所述疾病或障碍。

如上文中所述的化合物、其互变异构形式、其立体异构体、其药学上可接受的盐、其多晶型物、其溶剂化物、其与合适药物的组合、其药物组合物，其中通式(I)的化合物选自：

(1S,2R,5R)-5-(4-氨基-2-甲基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)-3-(2-(2-氨基-3-氯-5-氟喹啉-7-基)乙基)环戊-3-烯-1,2-二醇；和

(1S,2R,5R)-5-(2-氨基-4-甲基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)-3-(2-(6-(二氟甲基)-5-氟-1,2,3,4-四氢异喹啉-8-基)乙基)环戊-3-烯-1,2-二醇

或其药学上可接受的盐。

可以通过本领域已知的技术制备本文所述的式的化合物。此外，通过按照下面提供的方案中描述的反应顺序，可以制备本文所述的式的化合物。此外，在下列方案中，其中提及了具体的碱、酸、试剂、溶剂、偶联剂等，应当理解，本领域已知的其它碱、酸、试剂、溶剂、偶联剂等也可以被使用，并因此被包括在本发明的范围内。如本领域已知可以使用的反应条件(例如，温度和/或反应的持续时间)的变化也在本发明的范围内。除非另外指出，否则在这些方案中描述的式的化合物的所有异构体也被包括在本发明的范围内。

方案-1解释了式11的化合物的合成。按照在Purinergic Signaling(2015)11:371-387中描述的程序制备式1的化合物(其中PG＝保护基诸如但不限于TBDPS、TBDMS等)。在有膦诸如但不限于PPh₃存在下使用各种偶氮二羧酸酯试剂诸如但不限于DEAD或DIAD进行的式1的化合物与式2的化合物(X＝-Cl、-Br)的Mitsunobu反应产生式3的化合物。通常，这些反应在醚类(ethereal)溶剂诸如THF、MeTHF、二氧杂环己烷或类似溶剂中在从0℃至25℃范围内的温度下进行。在用氟离子诸如但不限于TBAF处理式3的化合物后，形成式4的化合物。通常，这些反应在醚类溶剂诸如THF、MeTHF、二氧杂环己烷或类似溶剂中在从0℃至40℃范围内的温度下完成。用各种氧化剂诸如但不限于戴斯-马丁过碘烷(Dess-Martinperiodinane)对式4的化合物的氧化可以提供式5的化合物。通常，这些反应可以在卤代溶剂诸如CH₂Cl₂、CHCl₃、二氯乙烷或类似溶剂中在从0℃至40℃范围内的温度下进行。试剂诸如但不限于甲基三苯基溴化鏻当在有碱诸如但不限于KO^tBu、NaO^tBu、LiHMDS、NaHMDS或KHMDS存在下用式5的化合物处理时提供式6的化合物。通常，这些反应在醚类溶剂诸如THF、MeTHF、二氧杂环己烷或类似溶剂中在从0℃至25℃范围内的温度下完成。可以如下合成式8的化合物：用合适的硼烷诸如但不限于9-BBN将式6的化合物硼氢化，随后在有Pd催化剂诸如但不限于Pd(dppf)Cl₂或Pd-118和式7的化合物(Y＝-Br、-I)存在下，添加无机碱诸如但不限于磷酸三钾或Cs₂CO₃，所述式7的化合物按照在Journal of the American ChemicalSociety,1949,第71卷,第6、7页中报道的程序合成。通常，这些反应在醚类溶剂诸如THF、MeTHF、二氧杂环己烷或类似溶剂中在从25℃至70℃范围内的温度下完成。

式9的化合物(其中R⁴和R⁵如上文所定义)在用式8的化合物处理后提供式10的化合物。用酸诸如但不限于HCl或TFA对式10的化合物的缩丙酮(acetonide)去保护提供式11的化合物。通常，这些反应在从25℃至50℃范围内的温度下进行。在每个步骤处的化合物可以通过标准技术诸如柱色谱法、结晶、反相HPLC或SFC进行纯化。

方案-2解释了式16的化合物的合成。用各种试剂诸如但不限于碘/PPh₃/咪唑对式4的化合物的碘化可以提供式12的化合物。通常，这些反应可以在卤代溶剂诸如但不限于CH₂Cl₂中在从0℃至25℃范围内的温度下进行约30分钟至3h。碱诸如但不限于Cs₂CO₃当在有式13的化合物(合成在下文方案-7中描述；PG₁＝-Boc)存在下用式12的化合物处理时提供式14的化合物。通常，这些反应在溶剂诸如DMF、DMAc或类似溶剂中在从0℃至25℃范围内的温度下进行约30分钟至3h。

式9的化合物(其中R⁴和R⁵如上文所定义)在用式14的化合物处理后提供式15的化合物。通常，这些反应在醚类溶剂诸如二氧杂环己烷或类似溶剂中在从100℃至140℃范围内的温度下进行约8-16h。用酸诸如但不限于HCl或TFA对式15的化合物的去保护提供式16的化合物。通常，这些反应在从25℃至50℃范围内的温度下进行约1-5h。在每个步骤处的化合物可以通过标准技术诸如柱色谱法、结晶、反相HPLC或SFC进行纯化。

方案-3解释了式20的化合物的合成。可以如下合成式18的化合物：用合适的硼烷诸如但不限于9-BBN将式6的化合物硼氢化，随后在有Pd催化剂诸如但不限于Pd(dppf)Cl₂或Pd-118和式17的化合物(合成在下文方案-7中描述；Y＝-Br、-I；PG₁＝-Boc)存在下添加无机碱诸如但不限于磷酸三钾。通常，这些反应在醚类溶剂诸如THF、MeTHF、二氧杂环己烷或类似溶剂中在从25℃至70℃范围内的温度下进行约1-8h。

式9的化合物(其中R⁴和R⁵如上文所定义)在用式18的化合物处理后提供式19的化合物。通常，这些反应在醚类溶剂诸如二氧杂环己烷或类似溶剂中在从100℃至140℃范围内的温度下进行约8-16h。用酸诸如但不限于HCl或TFA对式19的化合物的去保护提供式20的化合物。通常，这些反应在从25℃至50℃范围内的温度下进行约1-5h。在每个步骤处的化合物可以通过标准技术诸如柱色谱法、结晶、反相HPLC或SFC进行纯化。

方案-4解释了式28的化合物的合成。用各种氧化剂诸如但不限于戴斯-马丁过碘烷对式21的化合物(其合成描述在Bio-organic and medicinal Chemistry,1996,4(7),1077-1088)的氧化可以提供式22的化合物。通常，这些反应可以在卤代溶剂诸如CH₂Cl₂、CHCl₃、二氯乙烷或类似溶剂中在从0℃至25℃范围内的温度下进行约1-3h。试剂诸如但不限于甲基三苯基溴化鏻在有碱诸如但不限于n-BuLi存在下当用式22的化合物处理时提供式23的化合物。通常，这些反应在醚类溶剂诸如THF、MeTHF、二氧杂环己烷或类似溶剂中在从0℃至10℃范围内的温度下进行约10min至2h。可以如下合成式24的化合物：用合适的硼烷诸如但不限于9-BBN将式23的化合物硼氢化，随后在有Pd催化剂诸如但不限于Pd(dppf)Cl₂或Pd-118和式7的化合物(Y＝-Br、-I)存在下添加无机碱诸如但不限于磷酸三钾，所述式7的化合物按照在Journal of the American Chemical Society,1949,第71卷,第6、7页中报道的程序合成。通常，这些反应在醚类溶剂诸如THF、MeTHF、二氧杂环己烷或类似溶剂中在从0℃至25℃范围内的温度下进行约1h至4h。

用碱诸如但不限于K₂CO₃或Na₂CO₃对式24的化合物的去保护提供式25的化合物。通常，这些反应在质子溶剂诸如但不限于MeOH或EtOH中在从0℃至25℃范围内的温度下进行约1h至3h。在有膦诸如但不限于PPh₃存在下使用各种偶氮二羧酸酯试剂诸如但不限于DEAD或DIAD进行的式25的化合物与式26的化合物(PG₁＝-Boc)的Mitsunobu反应产生式27的化合物。通常，这些反应在醚类溶剂诸如THF、MeTHF、二氧杂环己烷或类似溶剂中在从0℃至25℃范围内的温度下进行约8h至48h。用酸诸如但不限于HCl或TFA对式27的化合物的去保护提供式28的化合物。通常，这些反应在从25℃至60℃范围内的温度下进行约1h至6h。在每个步骤处的化合物可以通过标准技术诸如柱色谱法、结晶、反相HPLC或SFC进行纯化。

方案-5解释了式33的化合物的合成。

在有膦诸如但不限于PPh₃存在下使用各种偶氮二羧酸酯试剂诸如但不限于DEAD或DIAD进行的式21的化合物与式29的化合物的Mitsunobu反应产生式30的化合物。通常，这些反应在醚类溶剂诸如THF、MeTHF、二氧杂环己烷或类似溶剂中在从0℃至25℃范围内的温度下进行约8h至16h。用碱诸如但不限于K₂CO₃或Na₂CO₃对式30的化合物的去保护提供式31的化合物。通常，这些反应在质子溶剂诸如但不限于MeOH或EtOH中在从0℃至25℃范围内的温度下进行约1h至3h。在有膦诸如但不限于PPh₃存在下使用各种偶氮二羧酸酯试剂诸如但不限于DEAD或DIAD进行的式31的化合物与式26的化合物(PG₁＝-Boc)的Mitsunobu反应产生式32的化合物。通常，这些反应在醚类溶剂诸如THF、MeTHF、二氧杂环己烷或类似溶剂中在从0℃至25℃范围内的温度下进行约8h至16h。用酸诸如但不限于HCl或TFA对式32的化合物的去保护提供式33的化合物。通常，这些反应在从25℃至60℃范围内的温度下进行约1h至6h。在每个步骤处的化合物可以通过标准技术诸如柱色谱法、结晶、反相HPLC或SFC进行纯化。

方案-6解释了式36的化合物的合成。

在有膦诸如但不限于PPh₃存在下使用各种偶氮二羧酸酯试剂诸如但不限于DEAD或DIAD进行的式31的化合物与式34的化合物(PG₁＝-Boc)的Mitsunobu反应产生式35的化合物。通常，这些反应在醚类溶剂诸如THF、MeTHF、二氧杂环己烷或类似溶剂中在从0℃至25℃范围内的温度下进行约8h至16h。用酸诸如但不限于HCl或TFA对式35的化合物的去保护提供式36的化合物。通常，这些反应在从25℃至60℃范围内的温度下进行约1h至6h。在每个步骤处的化合物可以通过标准技术诸如柱色谱法、结晶、反相HPLC或SFC进行纯化。

方案-7解释了式48的化合物的合成。用式37a的化合物处理式37的化合物提供式38的化合物。通常，这些反应在溶剂诸如但不限于甲苯中在从100℃至120℃范围内的温度下进行约1h至5h。

用还原剂诸如但不限于NaBH₄还原式38的化合物产生式39的化合物。通常，这些反应在质子溶剂诸如但不限于MeOH或EtOH中在从0℃至25℃范围内的温度下进行约1h至3h。用试剂诸如但不限于TsCl/吡啶将式39的化合物甲苯磺酰化，提供式40的化合物。通常，这些反应在卤代溶剂诸如但不限于CH₂Cl₂中在从0℃至25℃范围内的温度下进行约5h至16h。用试剂诸如但不限于AlCl₃环化式40的化合物，提供式41的化合物。通常，这些反应在卤代溶剂诸如但不限于CH₂Cl₂中在从0℃至25℃范围内的温度下进行约5h至16h。用氧化剂诸如但不限于二氧化硒氧化式41的化合物，产生式42的化合物。通常，这些反应在烃溶剂诸如但不限于1,2-二氯苯中在从150℃至180℃范围内的温度下进行约2h至8h。用氟化剂诸如但不限于DAST氟化式42的化合物，产生式43的化合物。通常，这些反应在卤代溶剂诸如但不限于CH₂Cl₂中在从0℃至25℃范围内的温度下进行约5h至16h。用还原剂诸如但不限于NaBH₄还原式43的化合物，产生式44的化合物。通常，这些反应在溶剂诸如但不限于乙酸中在从0℃至25℃范围内的温度下进行约1h至3h。用试剂诸如但不限于Boc-酸酐/NEt₃保护式44的化合物，产生式45的化合物。通常，这些反应在卤代溶剂诸如但不限于CH₂Cl₂中在从0℃至25℃范围内的温度下进行约1h至3h。可以如下合成式46的化合物：用合适的硼试剂诸如但不限于双频哪醇合二硼(bispinacoloto diboron)处理式45的化合物，随后在有Pd催化剂诸如但不限于Pd(dppf)Cl₂存在下添加无机碱诸如但不限于乙酸钾。通常，这些反应在醚类溶剂诸如二氧杂环己烷或类似溶剂中在从100℃至110℃范围内的温度下进行约1h至4h。可以如下合成式47的化合物：用合适的试剂诸如但不限于高碘酸钠处理式46的化合物，随后添加无机酸诸如但不限于HCl。通常，这些反应在溶剂诸如丙酮或类似溶剂中在从0℃至25℃范围内的温度下进行约1h至4h。在有酸诸如但不限于柠檬酸存在下用氧化剂诸如但不限于过氧化氢氧化式47的化合物，产生式48的化合物。通常，这些反应在从0℃至25℃范围内的温度下进行约1h至3h。

方案-8解释了式51的化合物的合成。在有受阻碱诸如但不限于LDA存在下式49的化合物与甲酰化剂诸如但不限于DMF的甲酰化反应产生式50的化合物。通常，这些反应在醚类溶剂诸如THF、MeTHF、二氧杂环己烷或类似溶剂中在从-78℃至0℃范围内的温度下进行。式50的化合物在用亲核氟化剂诸如但不限于DAST处理后可以产生式51的化合物。通常，这些反应可以在卤代溶剂诸如CH₂Cl₂、CHCl₃或类似溶剂中在从0℃至25℃范围内的温度下进行。

方案-9解释了式57的化合物的合成。在有膦诸如但不限于PPh₃存在下使用各种偶氮二羧酸酯试剂诸如但不限于DEAD或DIAD进行的式52的化合物与式26的化合物(PG₁＝-Boc)的Mitsunobu反应产生式53的化合物。通常，这些反应在醚类溶剂例如THF、MeTHF、二氧杂环己烷或类似溶剂中在从0℃至25℃范围内的温度下进行。可以如下合成式55的化合物：用合适的硼烷诸如但不限于9-BBN将式53的化合物硼氢化，随后在有Pd催化剂诸如但不限于Pd(dppf)Cl₂或Pd-118和式54的化合物(Y＝Br、-I)存在下，添加无机碱诸如但不限于磷酸三钾或Cs₂CO₃。通常，这些反应在醚类溶剂诸如THF、MeTHF、二氧杂环己烷或类似溶剂中进行，并在从25℃至70℃范围内的温度下进行。式55的化合物在用还原剂诸如但不限于NaBH₄处理后提供式56的化合物。通常，这些反应在酸性溶剂例如乙酸中在从0℃至25℃范围内的温度下进行。另外，用酸诸如但不限于HCl或TFA将式56的化合物去保护，提供式57的化合物。通常，这些反应在从25℃至50℃范围内的温度下进行。在每个步骤处的化合物可以通过标准技术诸如柱色谱法、结晶、反相HPLC或SFC进行纯化。

缩写

以下缩写可以用在本文中：

AcOH＝乙酸

Aq.＝含水的

9-BBN＝9-硼杂二环壬烷

Boc＝叔丁氧基羰基

t-Bu或tBu＝叔丁基

Cs₂CO₃＝碳酸铯

CHCl₃＝氯仿

DAST＝三氟化二乙基氨基硫

CH₂Cl₂或DCM＝二氯甲烷

DMP＝戴斯-马丁过碘烷

DEAD＝偶氮二羧酸二乙酯

DIAD＝偶氮二羧酸二异丙酯

DMAP＝4-二甲基氨基吡啶

DMF＝N,N-二甲基甲酰胺

DMSO＝二甲基亚砜

DMSO-d₆＝氘代二甲基亚砜

Et＝乙基

EtOH＝乙醇

EtOAc＝乙酸乙酯

g＝克

K₂CO₃＝碳酸钾

KOH＝氢氧化钾

KO^tBu＝叔丁醇钾

KHMDS＝双(三甲基甲硅烷基)氨基钾

LCMS＝液相色谱法质谱法

mg＝毫克

Me＝甲基

MeOH＝甲醇

MeOD＝氘代甲醇

MsCl＝甲磺酰氯

MgSO₄＝硫酸镁

NaH＝氢化钠

NaO^tBu＝叔丁醇钠

NaHCO₃＝碳酸氢钠

Na₂SO₄＝硫酸钠

Na₂S₂O₃＝硫代硫酸钠

Na₂SO₃＝亚硫酸钠

NaHMDS＝双(三甲基甲硅烷基)氨基钠

NMR＝核磁共振

Ph＝苯基

Pd-118＝[1,1′-双(二叔丁基膦基)二茂铁]二氯化钯(II)

PdCl₂(dppf)＝[1,1′-双(二苯基膦基)二茂铁]二氯化钯(II)

PCC＝吡啶鎓氯铬酸盐

PMB＝对甲氧基苄基

PTSA＝对甲苯磺酸

Rt＝保留时间

rt＝室温

Sat.＝饱和的

SFC＝超临界流体色谱法

TLC＝薄层色谱法

TBAF＝四丁基氟化铵

TsCl＝对甲苯磺酰氯

TBDMS＝叔丁基二甲基甲硅烷基

TBDPS＝叔丁基二苯基甲硅烷基

Et₃N或NEt₃或TEA＝三甲胺

TFA＝三氟乙酸

THF＝四氢呋喃

Ts＝对甲苯磺酰基

中间体

7-溴-3-氯-5-氟喹啉-2-胺

按照在WO2019/116302A1中描述的类似反应方案，制备标题化合物。

7-溴-3-氯-5-氟-N,N-双(4-甲氧基苄基)喹啉-2-胺

在0℃向7-溴-3-氯-5-氟喹啉-2-胺(7.0g,25.4mmol)在DMF(90mL)中的搅拌悬浮液中加入氢化钠(2.54g,63.5mmol)。将得到的混合物在0℃搅拌15min。在N₂气氛下逐滴加入1-(氯甲基)-4-甲氧基苯(8.27mL,61.0mmol)。然后将反应混合物在25℃搅拌5h。将得到的混合物倒在冰水(100mL)上。将沉淀出的固体过滤，用水(200ml)洗涤并在真空下干燥。将它进一步与甲苯一起共蒸发，并在真空中干燥以提供作为灰白色固体的7-溴-3-氯-5-氟-N,N-双(4-甲氧基苄基)喹啉-2-胺(13g,99％)。¹H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.39(d,J＝0.9Hz,1H),7.76(t,J＝1.3Hz,1H),7.52(dd,J＝9.4,1.7Hz,1H),7.29-7.23(m,4H),6.91-6.84(m,4H),4.60(s,4H),3.71(s,6H)；LCMS m/z＝514.68,516.68(M+,M+2；100％)。

3-氯-5-氟-N,N-双(4-甲氧基苄基)-7-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼杂环戊烷-2-基)喹啉-2-胺

将7-溴-3-氯-5-氟-N,N-双(4-甲氧基苄基)喹啉-2-胺(2.200g,4.27mmol)、PdCl₂(dppf)(0.312g,0.427mmol)、双频哪醇合二硼(1.3g,5.12mmol)、乙酸钾(0.712g,7.25mmol)和DMSO(5ml)的混合物在预热的油浴中在80℃加热30min。将得到的混合物缓慢地倒在冰冷水(50mL)上，并用乙酸乙酯(50ml)萃取。分离各层，并将有机层用盐水(50ml)洗涤并经无水Na₂SO₄干燥。将有机层过滤并在真空中浓缩以产生2.5g粗制化合物。将该残余物通过combiflash(R_f200,Teledyne/Isco)仪器在

柱上纯化，用乙酸乙酯在石油醚中的梯度(0-10％)洗脱，以提供作为灰白色固体的3-氯-5-氟-N,N-双(4-甲氧基苄基)-7-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼杂环戊烷-2-基)喹啉-2-胺(2g,83％)。¹H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.44(d,J＝0.9Hz,1H),7.81(t,J＝0.9Hz,1H),7.31-7.28(m,1H),7.27-7.23(m,4H),6.89-6.84(m,4H),4.59(d,J＝12.3Hz,4H),3.70(s,6H),1.17(s,12H)。

2-(双(4-甲氧基苄基)氨基)-3-氯-5-氟喹啉-7-醇

在0℃向3-氯-5-氟-N,N-双(4-甲氧基苄基)-7-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼杂环戊烷-2-基)喹啉-2-胺(1.6g,2.84mmol)在THF(35mL)中的搅拌溶液中逐滴加入冰醋酸(0.325ml,5.69mmol)。将混合物在0℃搅拌1h。缓慢地加入过氧化氢水溶液(1.742ml,17.06mmol)并将反应混合物在25℃搅拌16h。将反应混合物用乙酸乙酯(50ml)稀释并加入水(50ml)。分离各层，并将有机层用饱和Na₂SO₃水溶液(50ml)和盐水(50ml)相继地洗涤。将有机层经无水硫酸钠干燥，过滤，并在真空中浓缩以产生1.8g粗制化合物。将该粗残余物通过combiflash(R_f200,Teledyne/Isco)仪器在

柱上纯化，用乙酸乙酯在石油醚中的梯度(0-25％)洗脱，以提供作为灰白色固体的标题化合物(1g,78％)。

¹H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ10.46(d,J＝0.8Hz,1H),8.21(d,J＝0.7Hz,1H),7.29-7.22(m,4H),6.90-6.83(m,4H),6.82-6.75(m,2H),4.51(s,4H),3.71(s,6H).；LCMS m/z＝452.92(M+；50％)。

4-(双(叔丁氧基羰基)氨基)-2-甲基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-甲酸叔丁酯

在25℃向商购可得的2-甲基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-胺(0.400g,2.70mmol)在乙腈(10ml)和二氯甲烷(10mL)中的溶液中加入二碳酸二叔丁酯(6.27ml,27.0mmol)和DMAP(0.066g,0.540mmol)。将得到的混合物在25℃搅拌16h。将挥发物在真空中除去并将粗残余物通过combiflash(R_f200,Teledyne/Isco)仪器在

柱上纯化，用乙酸乙酯在石油醚中的梯度(0-20％)洗脱，以提供作为灰白色固体的标题化合物(0.7g,57.8％)。¹HNMR(400MHz,氯仿-d)δ7.61(d,J＝4.1Hz,1H),6.44(d,J＝4.1Hz,1H),2.86(s,3H),1.70(s,9H),1.43(s,18H).；LCMS m/z＝448.42(M+；50％)。

(叔丁氧基羰基)(2-甲基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)氨基甲酸叔丁酯

在25℃向4-(双(叔丁氧基羰基)氨基)-2-甲基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-甲酸叔丁酯(0.7g,1.561mmol)在MeOH(7ml)中的溶液中加入三乙胺(2.393ml,17.17mmol)。将得到的混合物在60℃搅拌18h。将挥发物在真空中除去并将粗残余物通过combiflash(R_f200,Teledyne/Isco)仪器在

柱上纯化，用乙酸乙酯在石油醚中的梯度(0-15％)洗脱，以提供作为灰白色固体的标题化合物(0.4g,73.6％)。¹H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ12.05(s,1H),7.49(dd,J＝3.6,2.2Hz,1H),6.27(dd,J＝3.6,1.7Hz,1H),2.59(s,3H),1.41(s,18H)；LCMS m/z＝349.41(M+1；10％)。

(E)-1-(2-溴-4-甲基苯基)-N-(2,2-二甲氧基乙基)甲烷亚胺

将2-溴-4-甲基苯甲醛(73g,367mmol)和2,2-二甲氧基乙烷-1-胺(47.9ml,440mmol)在甲苯(450ml)中的混合物用Dean-Stark设备加热至120℃保持4h。将挥发物在真空中除去，并将该粗制化合物不经进一步纯化用于下一步。¹H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.54(s,1H),7.83(d,J＝8.0Hz,1H),7.54(dd,J＝1.7,0.9Hz,1H),7.29-7.25(m,1H),4.64(t,J＝5.4Hz,1H),3.74(dd,J＝5.4,1.4Hz,2H),3.30(s,6H),2.34(s,3H)。

N-(2-溴-4-甲基苄基)-2,2-二甲氧基乙烷-1-胺

在0℃向(E)-1-(2-溴-4-甲基苯基)-N-(2,2-二甲氧基乙基)甲烷亚胺(105g,367mmol)在乙醇(820mL)中的溶液中逐份加入硼氢化钠(20.82g,550mmol)。将得到的混合物在25℃搅拌2h。缓慢地加入丙酮(100ml)以淬灭反应。将挥发物在真空中除去并将粗残余物通过combiflash(R_f200,Teledyne/Isco)仪器在

柱上纯化，用甲醇在二氯甲烷中的梯度(0-2％)洗脱，以提供作为灰白色固体的标题化合物(83g,78％)。¹H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.44-7.40(m,1H),7.36(d,J＝7.7Hz,1H),7.20-7.15(m,1H),4.41(t,J＝5.5Hz,1H),3.72(s,2H),3.25(s,6H),2.58(d,J＝5.5Hz,2H),2.28(s,3H)；LCMS m/z＝288.1(M+；100％)。

N-(2-溴-4-甲基苄基)-N-(2,2-二甲氧基乙基)-4-甲基苯磺酰胺

向N-(2-溴-4-甲基苄基)-2,2-二甲氧基乙烷-1-胺(83g,288mmol)在DCM(1000mL)中的搅拌溶液中加入吡啶(116ml,1440mmol)，随后在25℃逐滴加入对甲苯磺酰氯(93g,490mmol)在DCM(300ml)中的溶液。将得到的混合物搅拌16h。将反应混合物用水(1000mL)稀释，并用二氯甲烷(1000ml)萃取。分离各层并将有机层用盐水(500ml)洗涤。将有机层经无水硫酸钠干燥，过滤，并在真空中浓缩以产生130g粗制化合物。将该粗残余物通过combiflash(R_f200,Teledyne/Isco)仪器在

柱上纯化，用乙酸乙酯在石油醚中的梯度(0-25％)洗脱，以提供作为无色油的标题化合物(120g,94％)。¹H NMR(400MHz,氯仿-d)δ7.81-7.71(m,2H),7.42-7.27(m,4H),7.16-7.06(m,1H),4.52(s,2H),4.37(t,J＝5.3Hz,1H),3.31(d,J＝5.4Hz,2H),3.23(s,6H),2.45(s,3H),2.32(s,3H)；LCMS m/z＝507.05；10％)。

8-溴-6-甲基异喹啉

在0℃向氯化铝(217g,1628mmol)在DCM(1400ml)中的冰冷却的溶液中逐滴加入N-(2-溴-4-甲基苄基)-N-(2,2-二甲氧基乙基)-4-甲基苯磺酰胺(120g,271mmol)在DCM(600ml)中的溶液。将得到的混合物温热至25℃并在该温度搅拌16h。将反应混合物用冷水(2升)和500ml的DCM稀释并搅拌1h。分离各层，并将水层再次用DCM(500ml x 2)萃取。将合并的有机层用盐水(500mL)洗涤，经无水硫酸钠干燥，过滤，并在真空中浓缩以产生80g粗制化合物。将该粗残余物通过combiflash(R_f200,Teledyne/Isco)仪器在

柱上纯化，用乙酸乙酯在石油醚中的梯度(0-50％)洗脱，以提供作为灰白色固体的标题化合物(50g,83％)。¹H NMR(400MHz,氯仿-d)δ9.54(s,1H),8.57(d,J＝5.7Hz,1H),7.71(d,J＝1.5Hz,1H),7.61-7.51(m,2H),2.54(s,3H)；LCMS m/z＝222,224(M+,M+2；100％)。

8-溴异喹啉-6-甲醛

将二氧化硒(28.0g,252mmol)和8-溴-6-甲基异喹啉(20g,90mmol)在1,2-二氯苯(120ml)中的悬浮液在180℃加热7h。将反应混合物用25％的MeOH在DCM中的溶液(500ml)稀释并穿过赛力特(celite)床过滤，用25％的MeOH在DCM中的溶液(500ml)洗涤。将滤液在减压下浓缩并将残余物通过combiflash(R_f200,Teledyne/Isco)仪器在

柱上纯化，用乙酸乙酯在石油醚中的梯度(0-70％)洗脱，以提供作为灰白色固体的标题化合物(5.1g,23.99％)。¹H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ10.17(s,1H),9.57(d,J＝1.0Hz,1H),8.80(d,J＝5.6Hz,1H),8.68(t,J＝1.1Hz,1H),8.29(d,J＝1.4Hz,1H),8.15(dd,J＝5.6,0.9Hz,1H)；GCMS m/z＝235.07,237.07(M+,M+2；100％)。

8-溴-6-(二氟甲基)异喹啉

在0℃向8-溴异喹啉-6-甲醛(5g,21.18mmol)在DCM(120ml)中的搅拌溶液中缓慢地加入DAST(28.0ml,212mmol)。将得到的混合物在0℃搅拌15分钟并然后在25℃搅拌16h。将反应物用DCM(50ml)稀释并用冷的饱和NaHCO₃水溶液(100ml)淬灭。将反应混合物在25℃搅拌直到CO₂产生停止(约20分钟)。分离各层并将水层再次用DCM(50ml x2)萃取。将合并的有机层用盐水(50mL)洗涤，经无水硫酸钠干燥，过滤，并在真空中浓缩以产生5.1g粗制化合物。将该粗残余物通过combiflash(R_f200,Teledyne/Isco)仪器在

柱上纯化，用乙酸乙酯在石油醚中的梯度(0-30％)洗脱，以提供作为灰白色固体的标题化合物(3.3g,60.4％)。¹H NMR(400MHz,氯仿-d)δ9.70(s,1H),8.73(d,J＝5.7Hz,1H),8.04-7.96(m,2H),7.75(d,J＝5.8Hz,1H),6.81(t,J＝55.8Hz,1H)；GCMS m/z＝257.04,259.04(M+,M+2；100％)。

8-溴-6-(二氟甲基)-1,2,3,4-四氢异喹啉

在25℃向8-溴-6-(二氟甲基)异喹啉(2.22g,8.60mmol)在乙酸(50ml)中的搅拌溶液中逐份加入NaBH₄(1.139g,30.1mmol)。将反应物在25℃搅拌1.5h。将挥发物在真空中在40℃除去，并将粗残余物用DCM(50mL)稀释，并用饱和NaHCO₃水溶液(100ml)洗涤。分离各层并将有机层用盐水(50ml)洗涤。将有机层经无水硫酸钠干燥，过滤，并在真空中浓缩以产生2.2g粗制化合物，将其不经进一步纯化用于下一步。¹H NMR(400MHz,氯仿-d)δ7.54(s,1H),7.22(s,1H),6.58(t,J＝56.3Hz,1H),4.02(s,2H),3.13(t,J＝5.9Hz,2H),2.86(t,J＝5.9Hz,2H)。

8-溴-6-(二氟甲基)-3,4-二氢异喹啉-2(1H)-甲酸叔丁酯

在0℃向8-溴-6-(二氟甲基)-1,2,3,4-四氢异喹啉(5g,19.08mmol)在DCM(45ml)中的搅拌溶液中加入Et₃N(5.32ml,38.2mmol)和二碳酸二叔丁酯(5.32ml,22.89mmol)。将得到的混合物在25℃搅拌2h。将反应混合物用水(100mL)稀释，并用DCM(100ml x 2)萃取。分离各层并将有机层用盐水(100ml)洗涤。将有机层经无水硫酸钠干燥，过滤，并在真空中浓缩以产生6.2g粗制化合物。将该粗残余物通过combiflash(R_f200,Teledyne/Isco)仪器在

柱上纯化，用乙酸乙酯在石油醚中的梯度(0-7％)洗脱，以提供作为灰白色固体的标题化合物(5.8g,84％)。¹H NMR(400MHz,氯仿-d)δ7.59(s,1H),7.26(s,1H),6.59(t,J＝56.3Hz,1H),4.58(s,2H),3.67(t,J＝5.8Hz,2H),2.90(t,J＝5.9Hz,2H),1.53(s,9H)。

6-(二氟甲基)-8-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼杂环戊烷-2-基)-3,4-二氢异喹啉-2(1H)-甲酸叔丁酯

将[1,1′-双(二苯基膦基)二茂铁]二氯化钯(II)(0.586g,0.801mmol)一次性加入8-溴-6-(二氟甲基)-3,4-二氢异喹啉-2(1H)-甲酸叔丁酯(5.8g,16.01mmol)、双(频哪醇合)二硼(8.13g,32.0mmol)和乙酸钾(6.29g,64.1mmol)在二氧杂环己烷(60ml)中的脱气混合物中，并将反应混合物加热至100℃保持2h。然后将混合物冷却至25℃并穿过赛力特床过滤，用乙酸乙酯(25ml)洗涤。将滤液在真空中浓缩以产生6.8g粗制化合物。将该粗残余物通过combiflash(R_f200,Teledyne/Isco)仪器在

柱上纯化，用乙酸乙酯在石油醚中的梯度(0-5％)洗脱，以提供作为灰白色固体的标题化合物(6.5g,99％)。¹H NMR(400MHz,氯仿-d)δ7.81(s,1H),7.38(s,1H),6.62(t,J＝56.5Hz,1H),4.91(s,2H),3.66(t,J＝6.0Hz,2H),2.91(t,J＝6.0Hz,2H),1.37(s,9H),1.28(s,12H)；LCMS m/z＝410.23(M+1；20％)。

(2-(叔丁氧基羰基)-6-(二氟甲基)-1,2,3,4-四氢异喹啉-8-基)硼酸

在25℃将高碘酸钠(1.787g,8.36mmol)加入6-(二氟甲基)-8-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼杂环戊烷-2-基)-3,4-二氢异喹啉-2(1H)-甲酸叔丁酯(1.14g,2.79mmol)在水(2.5ml)和丙酮(12.50ml)中的混合物中。将得到的混合物在25℃搅拌1h。加入1N的HCl水溶液(2.79ml,2.79mmol)并将反应混合物搅拌另外4h。将反应混合物用乙酸乙酯(50mL)稀释，并用水(50ml)洗涤。分离各层，将有机层用盐水(50ml)洗涤并经无水硫酸钠干燥。将有机层过滤并在真空中浓缩以产生0.8g粗制化合物。将该粗残余物通过combiflash(R_f200,Teledyne/Isco)仪器在

柱上纯化，用甲醇在二氯甲烷中的梯度(0-10％)洗脱，以提供作为灰白色固体的标题化合物(0.61g,66.9％)。¹H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.29(s,2H),7.56(s,1H),7.35(s,1H),6.97(t,J＝56.0Hz,1H),4.71(s,2H),3.53(t,J＝6.1Hz,2H),2.84(t,J＝6.0Hz,2H),1.42(s,9H)。LCMS m/z＝328.34(M+1；10％)。

6-(二氟甲基)-8-羟基-3,4-二氢异喹啉-2(1H)-甲酸叔丁酯

在25℃向(2-(叔丁氧基羰基)-6-(二氟甲基)-1,2,3,4-四氢异喹啉-8-基)硼酸(1.5g,4.59mmol)在柠檬酸水溶液(36ml,0.459mmol)中的混合物中加入过氧化氢(0.468ml,4.59mmol)并搅拌3h。将反应混合物用乙酸乙酯(50mL)稀释，并用水(50ml)洗涤。分离各层，将有机层用盐水(50ml)洗涤并经无水硫酸钠干燥。将有机层过滤并在真空中浓缩以产生1.2g粗制化合物。将该粗残余物通过combiflash(R_f200,Teledyne/Isco)仪器在

柱上纯化，用甲醇在二氯甲烷中的梯度(0-20％)洗脱，以提供作为灰白色固体的标题化合物(0.92g,67％)。¹H NMR(400MHz,氯仿-d)δ6.82(s,1H),6.77(s,1H),6.53(t,J＝56.6Hz,1H),4.59(s,2H),3.67(t,J＝5.9Hz,2H),2.84(t,J＝5.9Hz,2H),1.53(s,9H)。

8-溴-5-氟异喹啉

按照在WO2018/167800A1中描述的相同反应方案制备标题化合物。

8-溴-5-氟异喹啉-6-甲醛

在-78℃向8-溴-5-氟异喹啉(1.7g,7.52mmol)在THF(15ml)中的搅拌溶液中加入LDA(2M在THF/庚烷/乙基苯中)(5.64ml,11.28mmol)并搅拌1h。在-78℃加入DMF(1.747ml,22.56mmol)并搅拌30min。将得到的混合物用冰水淬灭并温热至室温。将反应混合物用乙酸乙酯(20mL)稀释，并用水(20ml)洗涤。分离各层，并将有机层用盐水(20ml)洗涤并经无水Na₂SO₄干燥。将有机层过滤并在真空中浓缩以产生1g粗制化合物。将该残余物通过combiflash(R_f200,Teledyne/Isco)仪器在

柱上纯化，用乙酸乙酯在石油醚中的梯度(0-10％)洗脱，以提供标题化合物(0.467g,24.44％)。LCMS m/z＝254.14(M+；90％)。

8-溴-6-(二氟甲基)-5-氟异喹啉

在0℃向8-溴-5-氟异喹啉-6-甲醛(233mg,0.917mmol)在DCM(6ml)中的搅拌溶液中加入DAST(0.606ml,4.59mmol)并将反应混合物搅拌15min。将得到的混合物温热至室温并搅拌16h。将得到的混合物用二氯甲烷(10ml)稀释并用冷的饱和NaHCO₃水溶液(20ml)淬灭。将反应混合物在室温搅拌20分钟。分离各层，并将有机层用盐水(20ml)洗涤并经无水Na₂SO₄干燥。将有机层过滤并在真空中浓缩以产生0.8g粗制化合物。将该残余物通过combiflash(R_f200,Teledyne/Isco)仪器在

柱上纯化，用乙酸乙酯在石油醚中的梯度(0-10％)洗脱，以提供标题化合物(0.166g,65.6％)。LCMS m/z＝276.02(M+；100％)。

(3aS,4S,6aR)-6-甲酰基-2,2-二甲基-3a,6a-二氢-4H-环戊二烯并[d][1,3]二氧杂环戊烯-4-基乙酸酯

在N₂气氛下在0℃向如在Bio-organic and medicinal Chemistry,1996,4(7),1077-1088中所述合成的(3aS,4S,6aR)-6-(羟基甲基)-2,2-二甲基-3a,6a-二氢-4H-环戊二烯并[d][1,3]二氧杂环戊烯-4-基乙酸酯(18g,79mmol)在DCM(500ml)中的搅拌溶液中逐份加入戴斯-马丁过碘烷(66.9g,158mmol)。将反应混合物缓慢地温热至25℃并搅拌2h。将反应混合物用二氯甲烷(200mL)稀释，并用水(200ml)洗涤。分离各层，将有机层用盐水(100ml)洗涤并经无水硫酸钠干燥。将有机层过滤并在真空中浓缩以产生29g粗制化合物。将该粗残余物通过combiflash(R_f200,Teledyne/Isco)仪器在

柱上纯化，用乙酸乙酯在石油醚中的梯度(0-35％)洗脱，以提供作为淡黄色液体的标题化合物(15.5g,87％)。¹H NMR(400MHz,氯仿-d)δ9.92(s,1H),6.78(d,J＝2.1Hz,1H),5.55(dd,J＝5.6,2.1Hz,1H),5.28(d,J＝5.6Hz,1H),5.02(t,J＝5.6Hz,1H),2.19(s,3H),1.41(s,6H)。

(3aS,4S,6aR)-2,2-二甲基-6-乙烯基-3a,6a-二氢-4H-环戊二烯并[d][1,3]二氧杂环戊烯-4-基乙酸酯

在-15℃向甲基三苯基溴化鏻(6.16g,17.24mmol)在干燥THF(50ml)中的搅拌溶液中逐滴加入n-BuLi(2.5M在己烷中；6.37ml,15.91mmol)并在相同温度搅拌30min。在-15℃下在以上反应混合物中逐滴加入(3aS,4S,6aR)-6-甲酰基-2,2-二甲基-3a,6a-二氢-4H-环戊二烯并[d][1,3]二氧杂环戊烯-4-基乙酸酯(3.0g,13.26mmol)在干燥THF(15ml)中的溶液，并使其在1h内缓慢地达到0℃至10℃。将反应混合物用饱和氯化铵溶液(50mL)淬灭，用乙酸乙酯(70mL)稀释。分离各层，将合并的有机层用盐水(30mL)洗涤，经无水Na₂SO₄干燥，过滤并在真空中浓缩以产生4.5g粗制化合物。将该残余物通过combiflash(R_f200,Teledyne/Isco)仪器在

柱上纯化，用乙酸乙酯在石油醚中的梯度(4-6％)洗脱，以提供作为无色液体的标题化合物。¹H NMR(400MHz,氯仿-d)δ6.49(dd,J＝17.7,10.8Hz,1H),5.76-5.63(m,2H),5.45-5.35(m,2H),5.18(d,J＝5.8Hz,1H),4.93(t,J＝5.8Hz,1H),2.14(s,3H),1.44-1.39(m,6H)。

7-((3aS,4R,6aR)-6-(((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)甲基)-2,2-二甲基-3a,6a-二氢-4H-环戊二烯并[d][1,3]二氧杂环戊烯-4-基)-4-氯-2-甲基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶

在0℃向如在Kenneth A.Jacobson等人，Purinergic Signaling(2015)11:371-387中所述合成的(3aS,4S,6aR)-6-(((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)甲基)-2,2-二甲基-3a,6a-二氢-4H-环戊二烯并[d][1,3]二氧杂环戊烯-4-醇(0.1g,0.236mmol)在THF(5ml)中的搅拌溶液中加入商购可得的4-氯-2-甲基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶(0.079g,0.471mmol)、三苯基膦(0.247g,0.942mmol)。加入DIAD(0.183ml,0.942mmol)并搅拌10min。将反应物温热至25℃并搅拌12h。将挥发物在真空中除去并将粗残余物通过combiflash(R_f200,Teledyne/Isco)仪器在

柱上纯化，用乙酸乙酯在石油醚中的梯度(0-10％)洗脱，以提供作为无色油的标题化合物(0.1g,73.9％)。¹H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.65(ddd,J＝8.1,6.7,1.5Hz,4H),7.50-7.39(m,6H),7.33(d,J＝3.7Hz,1H),6.65(d,J＝3.6Hz,1H),5.77(s,2H),5.41(d,J＝5.6Hz,1H),4.65(d,J＝5.6Hz,1H),4.51(d,J＝15.8Hz,1H),4.39(d,J＝15.8Hz,1H),2.64(s,3H),1.34(s,3H),1.25(s,3H),1.02(s,9H)；LCMS m/z＝574.08(M+；100％)。

((3aS,4R,6aR)-4-(4-氯-2-甲基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)-2,2-二甲基-3a,6a-二氢-4H-环戊二烯并[d][1,3]二氧杂环戊烯-6-基)甲醇

向7-((3aS,4R,6aR)-6-(((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)甲基)-2,2-二甲基-3a,6a-二氢-4H-环戊二烯并[d][1,3]二氧杂环戊烯-4-基)-4-氯-2-甲基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶(2.1g,3.66mmol)在THF(20ml)中的搅拌溶液中缓慢地加入TBAF(5.12ml,5.12mmol)，并将反应混合物在25℃搅拌15h。将挥发物在真空中除去并将粗残余物通过combiflash(R_f200,Teledyne/Isco)仪器在

柱上纯化，用乙酸乙酯在石油醚中的梯度(0-30％)洗脱，以提供作为无色油的标题化合物(1g,81％)。¹H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.41(d,J＝3.7Hz,1H),6.63(d,J＝3.6Hz,1H),5.75-5.70(m,1H),5.65(d,J＝2.4Hz,1H),5.37(d,J＝5.7Hz,1H),5.09(t,J＝5.6Hz,1H),4.58(d,J＝5.7Hz,1H),4.17(dd,J＝5.1,2.5Hz,2H),2.67(s,3H),1.40(s,3H),1.28(s,3H)；LCMS m/z＝336.28(M+1；30％)。

4-氯-7-((3aS,4R,6aR)-6-(碘甲基)-2,2-二甲基-3a,6a-二氢-4H-环戊二烯并[d][1,3]二氧杂环戊烯-4-基)-2-甲基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶

在0℃向咪唑(0.223g,3.28mmol)和三苯基膦(0.508g,1.936mmol)在DCM(10ml)中的搅拌溶液中缓慢地加入碘(0.491g,1.936mmol)。向其中加入((3aS,4R,6aR)-4-(4-氯-2-甲基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)-2,2-二甲基-3a,6a-二氢-4H-环戊二烯并[d][1,3]二氧杂环戊烯-6-基)甲醇(0.5g,1.489mmol)溶解在DCM(10ml)中的溶液并搅拌10min。将得到的混合物在25℃搅拌3h。将反应混合物用二氯甲烷(50mL)稀释，并用水(50ml)洗涤。分离各层，将有机层用盐水(50ml)洗涤并经无水硫酸钠干燥。将有机层过滤并在真空中浓缩以产生0.6g粗制化合物。将该粗残余物通过combiflash(R_f200,Teledyne/Isco)仪器在

柱上纯化，用乙酸乙酯在石油醚中的梯度(0-6％)洗脱，以提供作为浅棕色油的标题化合物(0.34g,51.2％)。LCMS m/z＝446(M+；100％)。

(3aS,4R,6aR)-4-(4-氯-2-甲基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)-2,2-二甲基-3a,6a-二氢-4H-环戊二烯并[d][1,3]二氧杂环戊烯-6-甲醛

向((3aS,4R,6aR)-4-(4-氯-2-甲基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)-2,2-二甲基-3a,6a-二氢-4H-环戊二烯并[d][1,3]二氧杂环戊烯-6-基)甲醇(0.9g,2.68mmol)在DCM(50ml)中的***液(0℃)中逐份加入戴斯-马丁过碘烷(5.68g,13.40mmol)，并将反应混合物搅拌10min。将得到的混合物在25℃搅拌4h。将挥发物在真空中除去并将粗残余物通过combiflash(R_f200,Teledyne/Isco)仪器在

柱上纯化，用乙酸乙酯在石油醚中的梯度(0-20％)洗脱，以提供作为无色油的标题化合物(0.75g,84％)。¹H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.90(s,1H),7.58(d,J＝3.7Hz,1H),7.05(dd,J＝2.6,0.9Hz,1H),6.66(d,J＝3.7Hz,1H),6.0-5.96(m,1H),5.64(dd,J＝5.9,1.5Hz,1H),4.81-4.77(m,1H),2.65(s,3H),1.40(s,3H),1.29(s,3H)；LCMS m/z＝334.34(M+1；100％)。

4-氯-7-((3aS,4R,6aR)-2,2-二甲基-6-乙烯基-3a,6a-二氢-4H-环戊二烯并[d][1,3]二氧杂环戊烯-4-基)-2-甲基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶

在0℃向甲基三苯基溴化鏻(0.783g,2.193mmol)在THF(6ml)中的悬浮液中缓慢地加入KHMDS(2.193ml,2.193mmol)。5min以后，缓慢地加入(3aS,4R,6aR)-4-(4-氯-2-甲基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)-2,2-二甲基-3a,6a-二氢-4H-环戊二烯并[d][1,3]二氧杂环戊烯-6-甲醛(0.61g,1.828mmol)在THF(3ml)中的溶液，并将反应物在相同温度搅拌5min。将反应混合物用乙酸乙酯(5mL)稀释，并用水(2ml)洗涤。分离各层，将有机层用盐水(5ml)洗涤并经无水硫酸钠干燥。将有机层过滤并在真空中浓缩以产生0.36g粗制化合物。将该粗残余物通过combiflash(R_f200,Teledyne/Isco)仪器在

柱上纯化，用乙酸乙酯在石油醚中的梯度(0-10％)洗脱，以提供作为灰白色固体的标题化合物(0.28g,46.2％)。¹H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.43(d,J＝3.7Hz,1H),6.65-6.55(m,2H),5.85(d,J＝2.7Hz,1H),5.79(s,1H),5.64(d,J＝1.7Hz,1H),5.63-5.59(m,1H),5.42(dd,J＝10.8,1.7Hz,1H),4.68(dd,J＝5.9,1.0Hz,1H),2.66(s,3H),1.39(s,3H),1.32(s,3H)；LCMS m/z＝332.11(M+1；100％)。

(叔丁氧基羰基)(7-((3aS,4R,6aR)-2,2-二甲基-6-乙烯基-3a,6a-二氢-4H-环戊二烯并[d][1,3]二氧杂环戊烯-4-基)-4-甲基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-2-基)氨基甲酸叔丁酯

在0℃向(3aS,4S,6aR)-2,2-二甲基-6-乙烯基-3a,6a-二氢-4H-环戊二烯并[d][1,3]二氧杂环戊烯-4-醇(1g,5.49mmol)(其如在Organic Letters,2012,14,2134-2137中所述合成)、三苯基膦(3.6g,13.72mmol)、(叔丁氧基羰基)(4-甲基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-2-基)氨基甲酸叔丁酯(2.103g,6.04mmol)(其如在US2016/244475A1中所述合成)的溶液中缓慢地加入DIAD(2.67ml,13.72mmol)。搅拌10分钟以后，将反应混合物在25℃搅拌3h。将挥发物在真空中除去并将粗残余物通过combiflash(R_f200,Teledyne/Isco)仪器在

柱上纯化，用乙酸乙酯在石油醚中的梯度(0-30％)洗脱，以提供2g足够纯的期望的化合物。然后将该残余物通过反相制备型HPLC(YMC Triart C18 250x50mm,10μm)纯化，用流动相B在流动相A中的梯度(40:60流动相A:流动相B至20:80流动相A:流动相B；流动相A:水:CH₃CN(95:5,V/V)+0.1％NH₄OH,流动相B:CH₃CN:水(90:10,V/V)+0.1％NH₄OH；波长:220nm；流速:117ml/min；运行时间:20min)洗脱，以提供作为灰白色固体的标题化合物(0.61g,21.68％)。¹H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.39(d,J＝3.6Hz,1H),6.76(d,J＝3.6Hz,1H),6.61(dd,J＝17.6,10.8Hz,1H),5.89(d,J＝2.6Hz,1H),5.71(s,1H),5.65-5.55(m,2H),5.45-5.37(m,1H),4.59(d,J＝5.9Hz,1H),2.66(s,3H),1.40(s,18H),1.37(s,3H),1.30(s,3H)；LCMS m/z＝512.44(M+；50％)。

3-氯-7-(2-((3aS,4R,6aR)-4-(4-氯-2-甲基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)-2,2-二甲基-3a,6a-二氢-4H-环戊二烯并[d][1,3]二氧杂环戊烯-6-基)乙基)-5-氟喹啉-2-胺

将在9-BBN(6.75ml,3.38mmol)中的4-氯-7-((3aS,4R,6aR)-2,2-二甲基-6-乙烯基-3a,6a-二氢-4H-环戊二烯并[d][1,3]二氧杂环戊烯-4-基)-2-甲基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶(0.28g,0.844mmol)在N₂气氛下在70℃加热2h。将反应混合物冷却至25℃，然后加入在水(1ml)中的磷酸三钾(0.896g,4.22mmol)并搅拌30分钟。加入7-溴-3-氯-5-氟喹啉-2-胺(0.256g,0.928mmol)在THF(5ml)中的溶液，随后加入二氯[1,1'-双(二叔丁基膦基)二茂铁]钯(II)(0.055g,0.084mmol)。将得到的混合物在70℃搅拌3h。将反应混合物用乙酸乙酯(10mL)稀释，并用水(10ml)洗涤。分离各层，并将有机层用盐水(10ml)洗涤并经无水Na₂SO₄干燥。将有机层过滤并在真空中浓缩以产生0.25g粗制化合物。将该残余物通过combiflash(R_f200,Teledyne/Isco)仪器在

柱上纯化，用乙酸乙酯在石油醚中的梯度(0-20％)洗脱，以提供作为灰白色固体的标题化合物(0.17g,38.1％)。¹H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.18(s,1H),7.25(s,1H),7.04(dd,J＝11.0,1.4Hz,1H),6.97(s,2H),6.92(d,J＝3.7Hz,1H),6.36(d,J＝3.7Hz,1H),5.64(d,J＝3.6Hz,1H),5.49(s,1H),5.38(d,J＝5.6Hz,1H),4.49(d,J＝5.6Hz,1H),3.08-2.94(m,2H),2.71-2.65(m,2H),2.64(s,3H),1.38(s,3H),1.29(s,3H)；LCMS m/z＝528.1(M+；100％)。

7-(2-((3aS,4R,6aR)-4-(4-氨基-2-甲基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)-2,2-二甲基-3a,6a-二氢-4H-环戊二烯并[d][1,3]二氧杂环戊烯-6-基)乙基)-3-氯-5-氟喹啉-2-胺

在25℃向3-氯-7-(2-((3aS,4R,6aR)-4-(4-氯-2-甲基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)-2,2-二甲基-3a,6a-二氢-4H-环戊二烯并[d][1,3]二氧杂环戊烯-6-基)乙基)-5-氟喹啉-2-胺(0.170g,0.322mmol)在二氧杂环己烷(1mL)中的混合物中加入氨水溶液(2.089ml,97mmol)，并将反应混合物在钢瓶中在120℃搅拌16h。将挥发物在真空中除去并将粗残余物通过combiflash(R_f200,Teledyne/Isco)仪器在

柱上纯化，用甲醇在二氯甲烷中的梯度(0-2％)洗脱，以提供作为无色油的标题化合物(0.08g,48.9％)。LCMS m/z＝509.2(M+1；25％)。

(叔丁氧基羰基)(7-((3aS,4R,6aR)-6-(2-(6-(二氟甲基)-5-氟异喹啉-8-基)乙基)-2,2-二甲基-3a,6a-二氢-4H-环戊二烯并[d][1,3]二氧杂环戊烯-4-基)-4-甲基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-2-基)氨基甲酸叔丁酯

将在9-BBN(8.74ml,4.37mmol)中的(叔丁氧基羰基)(7-((3aS,4R,6aR)-2,2-二甲基-6-乙烯基-3a,6a-二氢-4H-环戊二烯并[d][1,3]二氧杂环戊烯-4-基)-4-甲基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-2-基)氨基甲酸叔丁酯(0.560g,1.092mmol)在N₂气氛下在65℃加热1.5h。将反应混合物冷却至25℃，然后加入在水(2ml)中的磷酸三钾(0.951g,5.46mmol)并搅拌30分钟。加入8-溴-6-(二氟甲基)-5-氟异喹啉(0.302g,1.092mmol)在THF(7ml)中的溶液，随后加入PdCl₂(dppf)(0.080g,0.109mmol)。将得到的混合物在65℃搅拌4h。将反应混合物用乙酸乙酯(15mL)稀释，并用水(15ml)洗涤。分离各层，并将有机层用盐水(10ml)洗涤并经无水Na₂SO₄干燥。将有机层过滤并在真空中浓缩以产生0.65g粗制化合物。将该残余物通过combiflash(R_f200,Teledyne/Isco)仪器在

柱上纯化，用乙酸乙酯在石油醚中的梯度(0-20％)洗脱，以提供作为灰白色固体的标题化合物(0.35g,45.1％)。LCMS m/z＝710.52(M+1；100％)。

(3aS,4S,6aR)-6-(((2-(双(4-甲氧基苄基)氨基)-3-氯-5-氟喹啉-7-基)氧基)甲基)-2,2-二甲基-3a,6a-二氢-4H-环戊二烯并[d][1,3]二氧杂环戊烯-4-基乙酸酯

向如在Bio-organic and medicinal Chemistry,1996,4(7),1077-1088中所述合成的(3aS,4S,6aR)-6-(羟基甲基)-2,2-二甲基-3a,6a-二氢-4H-环戊二烯并[d][1,3]二氧杂环戊烯-4-基乙酸酯(2g,8.76mmol)在THF(30ml)中的冷却溶液(0℃)中，缓慢地加入2-(双(4-甲氧基苄基)氨基)-3-氯-5-氟喹啉-7-醇(3.97g,8.76mmol)、三苯基膦(6.89g,26.3mmol)和DIAD(5.11ml,26.3mmol)。搅拌30分钟以后，将反应混合物在25℃搅拌15h。将挥发物在真空中除去并将粗残余物通过combiflash(R_f200,Teledyne/Isco)仪器在

柱上纯化，用乙酸乙酯在石油醚中的梯度(0-30％)洗脱，以提供作为橙色液体的标题化合物(3.8g,65.4％)。¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ8.28(d,J＝0.7Hz,1H),7.28-7.22(m,4H),7.09-6.97(m,2H),6.89-6.83(m,4H),5.88-5.84(m,1H),5.36-5.30(m,1H),5.04(d,J＝5.7Hz,1H),4.91-4.86(m,3H),4.55(s,4H),3.71(s,6H),2.03(s,3H),1.32(s,3H),1.30(s,3H)；LCMS m/z＝663.10(M+；100％)。

(3aS,4S,6aR)-6-(((2-(双(4-甲氧基苄基)氨基)-3-氯-5-氟喹啉-7-基)氧基)甲基)-2,2-二甲基-3a,6a-二氢-4H-环戊二烯并[d][1,3]二氧杂环戊烯-4-醇

在25℃向(3aS,4S,6aR)-6-(((2-(双(4-甲氧基苄基)氨基)-3-氯-5-氟喹啉-7-基)氧基)甲基)-2,2-二甲基-3a,6a-二氢-4H-环戊二烯并[d][1,3]二氧杂环戊烯-4-基乙酸酯(3.8g,5.73mmol)在甲醇(40ml)中的搅拌悬浮液中加入K₂CO₃(1.188g,8.60mmol)。将得到的混合物在N₂气氛下在25℃搅拌1h。将挥发物在真空中除去并将粗残余物通过combiflash(R_f200,Teledyne/Isco)仪器在

柱上纯化，用乙酸乙酯在石油醚中的梯度(0-50％)洗脱，以提供作为灰白色固体的标题化合物(2.6g,73.1％)。LCMS m/z＝620.96(M+；100％)。

(7-((3aS,4R,6aR)-6-(((2-(双(4-甲氧基苄基)氨基)-3-氯-5-氟喹啉-7-基)氧基)甲基)-2,2-二甲基-3a,6a-二氢-4H-环戊二烯并[d][1,3]二氧杂环戊烯-4-基)-2-甲基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)(叔丁氧基羰基)氨基甲酸叔丁酯

在0℃向(3aS,4S,6aR)-6-(((2-(双(4-甲氧基苄基)氨基)-3-氯-5-氟喹啉-7-基)氧基)甲基)-2,2-二甲基-3a,6a-二氢-4H-环戊二烯并[d][1,3]二氧杂环戊烯-4-醇(0.35g,0.564mmol)在THF(15ml)中的搅拌溶液中加入(叔丁氧基羰基)(2-甲基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)氨基甲酸叔丁酯(0.393g,1.127mmol)、三苯基膦(0.443g,1.691mmol)。缓慢地加入DEAD(0.268ml,1.691mmol)并搅拌30min。将得到的混合物在25℃搅拌16h。将挥发物在真空中除去并将粗残余物通过combiflash(R_f200,Teledyne/Isco)仪器在

柱上纯化，用乙酸乙酯在石油醚中的梯度(0-50％)洗脱，以提供作为灰白色固体的标题化合物(0.2g,37.3％)。¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ8.29(s,1H),7.27-7.24(m,4H),7.10(d,J＝2.3Hz,1H),7.04(dd,J＝11.3,2.2Hz,1H),6.90-6.82(m,4H),6.27(d,J＝3.7Hz,1H),5.85(s,1H),5.78(s,1H),5.52(d,J＝5.6Hz,1H),5.07-4.91(m,3H),4.65(d,J＝5.7Hz,1H),4.55(s,4H),3.71(s,6H),2.00(s,3H),1.44(s,3H),1.41(s,18H),1.31(s,3H)；LCMS m/z＝951.20(M+；100％)。

(7-((3aS,4R,6aR)-6-(((2-(双(4-甲氧基苄基)氨基)-3-氯-5-氟喹啉-7-基)氧基)甲基)-2,2-二甲基-3a,6a-二氢-4H-环戊二烯并[d][1,3]二氧杂环戊烯-4-基)-4-甲基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-2-基)(叔丁氧基羰基)氨基甲酸叔丁酯

在0℃向(3aS,4S,6aR)-6-(((2-(双(4-甲氧基苄基)氨基)-3-氯-5-氟喹啉-7-基)氧基)甲基)-2,2-二甲基-3a,6a-二氢-4H-环戊二烯并[d][1,3]二氧杂环戊烯-4-醇(0.400g,0.644mmol)在THF(15mL)中的搅拌溶液中加入如在US 2016/244475 A1中所述合成的(叔丁氧基羰基)(4-甲基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-2-基)氨基甲酸叔丁酯(0.449g,1.288mmol)、三苯基膦(0.507g,1.932mmol)。然后缓慢地加入DEAD(0.306ml,1.932mmol)并搅拌30min。将得到的混合物在25℃搅拌16h。将挥发物在真空中除去并将粗残余物通过combiflash(R_f200,Teledyne/Isco)仪器在

柱上纯化，用乙酸乙酯在石油醚中梯度(0-18％)洗脱，以提供作为灰白色固体的标题化合物(0.48g,78％)。¹H NMR(400MHz,氯仿-d)δ8.19(s,1H),7.28-7.24(m,4H),7.05-7.00(m,2H),6.91-6.83(m,4H),6.77(dd,J＝11.0,2.3Hz,1H),6.50(d,J＝3.6Hz,1H),5.92(s,1H),5.84(d,J＝2.6Hz,1H),5.46(d,J＝5.6Hz,1H),4.96-4.88(m,2H),4.65(d,J＝5.6Hz,1H),4.62(s,4H),3.81(s,6H),2.72(s,3H),1.52(s,3H),1.46(s,18H),1.36(s,3H)；LCMS m/z＝951.20(M+；100％)。

在25℃向(3aS,4S,6aR)-2,2-二甲基-6-乙烯基-3a,6a-二氢-4H-环戊二烯并[d][1,3]二氧杂环戊烯-4-基乙酸酯(2.000g,8.92mmol)在THF(20ml)中的搅拌溶液中加入0.5M 9-BBN(71.3ml,35.7mmol)。将得到的混合物在75℃加热1.5h。将反应混合物冷却至25℃，然后加入在水(15ml)中的磷酸三钾(9.47g,44.6mmol)，并搅拌20分钟。在25℃加入7-溴-3-氯-5-氟-N,N-双(4-甲氧基苄基)喹啉-2-胺(3.68g,7.13mmol)和[1,1'-双(二叔丁基膦基)二茂铁]二氯化钯(II)(0.291g,0.446mmol)，并将得到的混合物搅拌2h。将反应混合物用水(100mL)淬灭，并用乙酸乙酯(300ml)萃取。分离各层，并将有机层用盐水(100ml)洗涤并经无水Na₂SO₄干燥。将有机层过滤并在真空中浓缩以产生0.25g粗制化合物。将该残余物通过combiflash(R_f200,Teledyne/Isco)仪器在

柱上纯化，用乙酸乙酯在石油醚中的梯度(0-30％)洗脱，以提供作为无色半固体固体的标题化合物(1.7g,28.8％)。¹HNMR(400MHz,氯仿-d)δ8.25(d,J＝0.8Hz,1H),7.42(s,1H),7.29(d,J＝8.6Hz,4H),6.91(dd,J＝10.5,1.5Hz,1H),6.86(d,J＝8.6,Hz,4H),5.55(q,J＝1.7Hz,1H),5.39-5.34(m,1H),4.96-4.88(m,2H),4.60(s,4H),3.81(s,6H),3.05-2.95(m,2H),2.74-2.54(m,2H),2.14(s,3H),1.42(d,J＝7.2Hz,6H)。LCMS m/z＝661.10(M+；100％)；LCMS m/z＝661.22(M+；30％)。

(3aS,4S,6aR)-6-(2-(2-(双(4-甲氧基苄基)氨基)-3-氯-5-氟喹啉-7-基)乙基)-2,2-二甲基-3a,6a-二氢-4H-环戊二烯并[d][1,3]二氧杂环戊烯-4-醇

在25℃向(3aS,4S,6aR)-6-(2-(2-(双(4-甲氧基苄基)氨基)-3-氯-5-氟喹啉-7-基)乙基)-2,2-二甲基-3a,6a-二氢-4H-环戊二烯并[d][1,3]二氧杂环戊烯-4-基乙酸酯(3.4g,5.14mmol)在甲醇(60ml)中的搅拌溶液中加入K₂CO₃(1.066g,7.71mmol)。将得到的混合物在N₂气氛下在25℃搅拌1h。将反应混合物用水(100mL)淬灭，并用乙酸乙酯(300mL)萃取。分离各层，将合并的有机层用盐水(100mL)洗涤，经无水Na₂SO₄干燥，过滤并在真空中浓缩以产生4.1g粗制化合物。将该残余物通过combiflash(R_f200,Teledyne/Isco)仪器在

柱上纯化，用乙酸乙酯在石油醚中的梯度(0-35％)洗脱，以提供作为无色半固体的标题化合物(2.75g,86％)。¹H NMR(400MHz,氯仿-d)δ8.24(d,J＝0.8Hz,1H),7.42(s,1H),7.32-7.27(m,4H),6.91(dd,J＝10.5,1.5Hz,1H),6.88-6.83(m,4H),5.61-5.52(m,1H),4.90(d,J＝5.6Hz,1H),4.60(s,4H),4.53(t,J＝8.1Hz,1H),3.81(s,6H),3.04-2.91(m,2H),2.64-2.47(m,2H),1.44(d,J＝3.8Hz,6H)；LCMS m/z＝619.09(M+；100％)。

(7-((3aS,4R,6aR)-6-(2-(2-(双(4-甲氧基苄基)氨基)-3-氯-5-氟喹啉-7-基)乙基)-2,2-二甲基-3a,6a-二氢-4H-环戊二烯并[d][1,3]二氧杂环戊烯-4-基)-4-甲基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-2-基)(叔丁氧基羰基)氨基甲酸叔丁酯

在0℃向(3aS,4S,6aR)-6-(2-(2-(双(4-甲氧基苄基)氨基)-3-氯-5-氟喹啉-7-基)乙基)-2,2-二甲基-3a,6a-二氢-4H-环戊二烯并[d][1,3]二氧杂环戊烯-4-醇(2.70g,4.36mmol)在THF(50ml)中的搅拌溶液中加入(叔丁氧基羰基)(4-甲基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-2-基)氨基甲酸叔丁酯(2.279g,6.54mmol)(其如在US2016/244475A1中所述合成)、三苯基膦(3.43g,13.08mmol)。然后缓慢地加入DEAD(2.071ml,13.08mmol)并搅拌30min。将得到的混合物在25℃搅拌48h。将反应混合物用乙酸乙酯(300mL)稀释，并用水(100ml)洗涤。分离各层，并将有机层用盐水(10ml)洗涤并经无水Na₂SO₄干燥。将有机层过滤并在真空中浓缩以产生11g粗制化合物。将该残余物通过反相制备型HPLC纯化以提供作为灰白色固体的标题化合物(1.15g,27.8％)。¹H NMR(400MHz,氯仿-d)δ8.28(d,J＝0.8Hz,1H),7.50(s,1H),7.34-7.24(m,6H),6.96(dd,J＝10.5,1.4Hz,1H),6.87-6.80(m,4H),6.68(d,J＝3.6Hz,1H),6.34(d,J＝3.6Hz,1H),5.74(s,1H),5.54-5.47(m,1H),5.30(d,J＝5.6Hz,1H),4.63(s,4H),4.51(d,J＝5.6Hz,1H),3.78(s,6H),3.17-3.02(m,2H),2.73(s,3H),1.48(s,3H),1.46(s,18H),1.35(s,3H).；LCMS m/z＝949.20(M+；20％)。

8-(((3aS,4R,6aR)-4-(4-氯-2-甲基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)-2,2-二甲基-3a,6a-二氢-4H-环戊二烯并[d][1,3]二氧杂环戊烯-6-基)甲氧基)-6-(二氟甲基)-3,4-二氢异喹啉-2(1H)-甲酸叔丁酯

在25℃向6-(二氟甲基)-8-羟基-3,4-二氢异喹啉-2(1H)-甲酸叔丁酯(0.054g,0.179mmol)在DMF(2ml)中的溶液中加入Cs₂CO₃(0.066g,0.202mmol)并搅拌30min。在0℃缓慢地加入溶解在DMF(2ml)中的4-氯-7-((3aS,4R,6aR)-6-(碘甲基)-2,2-二甲基-3a,6a-二氢-4H-环戊二烯并[d][1,3]二氧杂环戊烯-4-基)-2-甲基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶(0.100g,0.224mmol)，并搅拌3h。将反应混合物用乙酸乙酯(25mL)稀释，并用水(25ml)洗涤。分离各层，并将有机层用盐水(10ml)洗涤并经无水Na₂SO₄干燥。将有机层过滤并在真空中浓缩以产生0.11g粗制化合物。将该残余物通过combiflash(R_f200,Teledyne/Isco)仪器在

柱上纯化，用乙酸乙酯在石油醚中的梯度(0-30％)洗脱，以提供作为灰白色固体的标题化合物(0.1g,72.2％)。¹H NMR(400MHz,氯仿-d)δ7.03(s,1H),6.91(d,J＝5.5Hz,2H),6.73-6.43(m,2H),5.87(s,2H),5.50(d,J＝5.5Hz,1H),4.97-4.85(m,2H),4.73(d,J＝5.7Hz,1H),4.59(s,2H),3.65(s,2H),2.89-2.81(m,5H),1.54(s,3H),1.48(s,9H),1.40(s,3H)；LCMS m/z＝616.96(M+；10％)。

8-(((3aS,4R,6aR)-4-(4-氨基-2-甲基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)-2,2-二甲基-3a,6a-二氢-4H-环戊二烯并[d][1,3]二氧杂环戊烯-6-基)甲氧基)-6-(二氟甲基)-3,4-二氢异喹啉-2(1H)-甲酸叔丁酯

在25℃向8-(((3aS,4R,6aR)-4-(4-氯-2-甲基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)-2,2-二甲基-3a,6a-二氢-4H-环戊二烯并[d][1,3]二氧杂环戊烯-6-基)甲氧基)-6-(二氟甲基)-3,4-二氢异喹啉-2(1H)-甲酸叔丁酯(0.100g,0.162mmol)在二氧杂环己烷(1ml)中的混合物中加入氨水溶液(0.701ml,32.4mmol)，并将反应混合物在钢瓶中在120℃搅拌16h。将挥发物在真空中除去并将粗残余物通过combiflash(R_f200,Teledyne/Isco)仪器在

柱上纯化，用甲醇在二氯甲烷中的梯度(0-2％)洗脱，以提供作为无色油的标题化合物(0.045g,46.5％)。LCMS m/z＝598.06(M+；100％)。

8-(2-((3aS,4R,6aR)-4-(4-氯-2-甲基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)-2,2-二甲基-3a,6a-二氢-4H-环戊二烯并[d][1,3]二氧杂环戊烯-6-基)乙基)-6-(二氟甲基)-3,4-二氢异喹啉-2(1H)-甲酸叔丁酯

将在9-BBN(1.808ml,0.904mmol)中的4-氯-7-((3aS,4R,6aR)-2,2-二甲基-6-乙烯基-3a,6a-二氢-4H-环戊二烯并[d][1,3]二氧杂环戊烯-4-基)-2-甲基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶(0.100g,0.301mmol)在N₂气氛下在60℃加热1h。将反应混合物冷却至25℃，然后加入在水(0.2ml)中的磷酸三钾(0.192g,0.904mmol)并搅拌15分钟。加入8-溴-6-(二氟甲基)-3,4-二氢异喹啉-2(1H)-甲酸叔丁酯(0.109g,0.301mmol)在THF(1ml)中的溶液，随后加入PdCl₂(dppf)-CH₂Cl₂加合物(8.61mg,10.55μmol)。将得到的混合物在60℃搅拌4h。将反应混合物用乙酸乙酯(10mL)稀释，并用水(10ml)洗涤。分离各层，并将有机层用盐水(10ml)洗涤并经无水Na₂SO₄干燥。将有机层过滤并在真空中浓缩以产生0.11g粗制化合物。将该残余物通过combiflash(R_f200,Teledyne/Isco)仪器在

柱上纯化，用乙酸乙酯在石油醚中的梯度(0-20％)洗脱，以提供作为灰白色固体的标题化合物(0.034g,18.34％)。¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ7.34(s,1H),7.23(d,J＝23.4Hz,2H),6.96(t,J＝56.0Hz,1H),6.57(d,J＝3.7Hz,1H),5.69(s,1H),5.59(d,J＝2.4Hz,1H),5.43(d,J＝5.6Hz,1H),4.57(s,3H),3.55(s,2H),2.97-2.78(m,4H),2.66(s,3H),2.60-2.54(m,2H),1.43-1.36(m,12H),1.30(s,3H)。LCMS m/z＝614.95(M+；90％)。

8-(2-((3aS,4R,6aR)-4-(4-氨基-2-甲基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)-2,2-二甲基-3a,6a-二氢-4H-环戊二烯并[d][1,3]二氧杂环戊烯-6-基)乙基)-6-(二氟甲基)-3,4-二氢异喹啉-2(1H)-甲酸叔丁酯

在25℃向8-(2-((3aS,4R,6aR)-4-(4-氯-2-甲基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)-2,2-二甲基-3a,6a-二氢-4H-环戊二烯并[d][1,3]二氧杂环戊烯-6-基)乙基)-6-(二氟甲基)-3,4-二氢异喹啉-2(1H)-甲酸叔丁酯(0.250g,0.406mmol)在二氧杂环己烷(2ml)中的混合物中加入氨水溶液(1.759ml,81mmol)，并将反应混合物在钢瓶中在120℃搅拌16h。将挥发物在真空中除去并将粗残余物通过combiflash(R_f200,Teledyne/Isco)仪器在

柱上纯化，用甲醇在二氯甲烷中的梯度(0-2％)洗脱，以提供作为无色油的标题化合物(0.21g,87％)。LCMS m/z＝496.3(M-100；50％)。

(叔丁氧基羰基)(7-((3aS,4R,6aR)-6-(2-(6-(二氟甲基)-5-氟-1,2,3,4-四氢异喹啉-8-基)乙基)-2,2-二甲基-3a,6a-二氢-4H-环戊二烯并[d][1,3]二氧杂环戊烯-4-基)-4-甲基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-2-基)氨基甲酸叔丁酯

在25℃向(叔丁氧基羰基)(7-((3aS,4R,6aR)-6-(2-(6-(二氟甲基)-5-氟异喹啉-8-基)乙基)-2,2-二甲基-3a,6a-二氢-4H-环戊二烯并[d][1,3]二氧杂环戊烯-4-基)-4-甲基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-2-基)氨基甲酸叔丁酯(0.350g,0.493mmol)在乙酸(7ml)中的搅拌溶液中逐份加入NaBH₄(0.065g,1.726mmol)并搅拌2h。将挥发物在真空中除去并将残余物溶解在二氯甲烷(15ml)中并用饱和NaHCO₃水溶液碱化。分离各层，将有机层用盐水(10ml)洗涤并经无水Na₂SO₄干燥。将有机层过滤并在真空中浓缩以产生粗制化合物(0.25g,71％)。LCMS m/z＝714.52(M+；100％)。

实施例

实施例-1:(1S,2R,5R)-3-(2-(2-氨基-3-氯-5-氟喹啉-7-基)乙基)-5-(2-氨基-4-甲基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)环戊-3-烯-1,2-二醇

将二boc-7-(2-((3aS,4R,6aR)-4-(2-氨基-4-甲基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)-2,2-二甲基-3a,6a-二氢-4H-环戊二烯并[d][1,3]二氧杂环戊烯-6-基)乙基)-3-氯-5-氟-N,N-双(4-甲氧基苄基)喹啉-2-胺(1.10g,1.158mmol)在TFA(8.93ml,116mmol)中的搅拌溶液在N₂气氛下在60℃搅拌5h。将挥发物在真空中除去并将残余物用MeOH(15ml)稀释，随后添加K₂CO₃(0.801g,5.79mmol)。将得到的混合物在N₂气氛下在60℃搅拌1.5h。将挥发物在真空中除去并将粗残余物通过反相制备型HPLC(YMC Triart C18 250x50mm,10μm)纯化，用流动相B在流动相A中的梯度(100％流动相A至50:50流动相A:流动相B；流动相A:水:CH₃CN(95:5,V/V)+0.1％NH₄OH,流动相B:CH₃CN:水(90:10,V/V)+0.1％NH₄OH；波长:220nm；流速:117ml/min；运行时间:20min)洗脱，以提供作为灰白色固体的标题化合物(0.101g,18.59％)。¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ8.18(s,1H),7.21(s,1H),7.00(dd,J＝11.1,1.4Hz,1H),6.96(s,2H),6.48(d,J＝3.7Hz,1H),6.20(d,J＝3.6Hz,1H),6.07(s,2H),5.40(d,J＝7.2Hz,2H),4.93(dd,J＝25.6,6.2Hz,2H),4.45(t,J＝6.0Hz,1H),3.98-3.89(m,1H),3.02-2.85(m,2H),2.57-2.52(m,2H),2.38(s,3H).；LCMS m/z＝469.23(M+；50％)。

使用适当的起始原料，按照与用于制备(1S,2R,5R)-3-(2-(2-氨基-3-氯-5-氟喹啉-7-基)乙基)-5-(2-氨基-4-甲基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)环戊-3-烯-1,2-二醇的方案类似的反应方案，合成在表-1中的实施例。

表-1

实施例-5:(1S,2R,5R)-5-(4-氨基-2-甲基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)-3-(((6-(二氟甲基)-1,2,3,4-四氢异喹啉-8-基)氧基)甲基)环戊-3-烯-1,2-二醇

在0℃向8-(((3aS,4R,6aR)-4-(4-氨基-2-甲基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)-2,2-二甲基-3a,6a-二氢-4H-环戊二烯并[d][1,3]二氧杂环戊烯-6-基)甲氧基)-6-(二氟甲基)-3,4-二氢异喹啉-2(1H)-甲酸叔丁酯(0.190g,0.318mmol)在二氧杂环己烷(3ml)中的搅拌溶液中加入二氧杂环己烷HCl(1.590ml,6.36mmol)，并将反应混合物在25℃搅拌3h。将挥发物在真空中除去并用氨的甲醇溶液(methanolic ammonia)(7N)碱化。将挥发物在真空中除去至干燥，并将粗残余物通过反相制备型HPLC(YMC Triart C18 250x50mm,10μm)纯化，用流动相B在流动相A中的梯度(100％流动相A至20:80流动相A:流动相B；流动相A:水:CH₃CN(95:5,V/V)+0.1％NH₄OH,流动相B:CH₃CN:水(90:10,V/V)+0.1％NH₄OH；波长:220nm；流速:117ml/min；运行时间:25min)洗脱，以提供作为灰白色固体的标题化合物(0.021g,14.44％)。¹H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ6.99(s,1H),6.92(s,1H),6.90(s,1H),6.86(d,J＝3.6Hz,3H),6.49(d,J＝3.5Hz,1H),5.73(d,J＝1.9Hz,1H),5.62(d,J＝4.1Hz,1H),5.11(dd,J＝13.4,6.6Hz,2H),4.78(s,2H),4.56(t,J＝6.0Hz,1H),4.12-4.08(m,1H),3.79(s,2H),2.88(t,J＝5.7Hz,2H),2.70-2.65(m,2H),2.55(s,3H)；LCMS m/z＝458.17(M+；20％)。

使用适当的起始原料，按照与用于制备(1S,2R,5R)-5-(4-氨基-2-甲基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)-3-(((6-(二氟甲基)-1,2,3,4-四氢异喹啉-8-基)氧基)甲基)环戊-3-烯-1,2-二醇的方案类似的反应方案，合成表-2中的实施例。

实施例-7:(1S,2R,5R)-5-(4-氨基-2-甲基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)-3-(2-(2-氨基-3-氯-5-氟喹啉-7-基)乙基)环戊-3-烯-1,2-二醇

将7-(2-((3aS,4R,6aR)-4-(4-氨基-2-甲基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)-2,2-二甲基-3a,6a-二氢-4H-环戊二烯并[d][1,3]二氧杂环戊烯-6-基)乙基)-3-氯-5-氟喹啉-2-胺(0.040g,0.079mmol)和TFA(0.605ml,7.86mmol)的混合物在25℃搅拌1h。将挥发物在真空中除去并用7N的氨的甲醇溶液碱化。再次将挥发物在真空中除去至干燥，并将粗残余物通过combiflash(R_f200,Teledyne/Isco)仪器在

柱上纯化，用甲醇在二氯甲烷中的梯度(0-7％)洗脱，以提供作为灰白色固体的标题化合物(0.033g,90％)。¹H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.17(s,1H),7.21(s,1H),7.01(dd,J＝11.0,1.4Hz,1H),6.96(s,2H),6.84(s,2H),6.54(d,J＝3.5Hz,1H),6.36(d,J＝3.5Hz,1H),5.54-5.47(m,1H),5.43-5.38(m,1H),4.98(d,J＝6.3Hz,1H),4.94(d,J＝6.6Hz,1H),4.45(t,J＝6.1Hz,1H),3.97-3.89(m,1H),2.99-2.89(m,2H),2.60-2.54(m,2H),2.35(s,3H).；LCMS m/z＝469.17(M+；20％)。

实施例-8:(1S,2R,5R)-5-(2-氨基-4-甲基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)-3-(2-(6-(二氟甲基)-5-氟-1,2,3,4-四氢异喹啉-8-基)乙基)环戊-3-烯-1,2-二醇

将(叔丁氧基羰基)(7-((3aS,4R,6aR)-6-(2-(6-(二氟甲基)-5-氟-1,2,3,4-四氢异喹啉-8-基)乙基)-2,2-二甲基-3a,6a-二氢-4H-环戊二烯并[d][1,3]二氧杂环戊烯-4-基)-4-甲基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-2-基)氨基甲酸叔丁酯(0.250g,0.350mmol)和TFA(1.349ml,17.51mmol)的混合物在室温搅拌15h。将挥发物在真空中除去并用7N的氨的甲醇溶液碱化。将该粗残余物通过反相制备型HPLC(YMC Triart C18 250x50mm,10μm)纯化，用流动相B在流动相A中的梯度(100％流动相A至20:80流动相A:流动相B；流动相A:水:CH₃CN(95:5,V/V)+0.1％NH₄OH,流动相B:CH₃CN:水(90:10,V/V)+0.1％NH₄OH；波长:220nm；流速:117ml/min；运行时间:24min)洗脱，以提供作为淡黄色固体的标题化合物(0.047g,28.3％)。¹H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.33-6.99(m,2H),6.72(d,J＝3.7Hz,1H),6.36(d,J＝3.6Hz,1H),6.08(s,2H),5.50-5.42(m,2H),4.95(dd,J＝15.8,6.2Hz,2H),4.47(t,J＝5.8Hz,1H),3.99(s,3H),3.17(d,J＝3.5Hz,1H),3.05-3.00(m,1H),2.87-2.63(m,5H),2.56(s,1H),2.41(s,3H)。LCMS m/z＝474.36(M+；20％)。

生物学实施例

生化测定方案1

在生化测定中使用HTRF检测技术评估化合物对PRMT5的抑制作用。将生物素化的H4R3(残基1-21)用作底物。将化合物与384孔平板的每孔15-25ng PRMT5:MEP50一起在含有20mM N-二(羟乙基)甘氨酸(pH 7.6)、25mM NaCl、2mM DTT、0.01％鸡白蛋白和0.01％吐温-20的测定缓冲液中在室温预温育30分钟。通过加入1μM的SAM和50nM生物素化的H4R3，引发反应。总测定体积为15μL。在室温继续反应120分钟。然后加入含有链霉抗生素蛋白-Eu穴状化合物、抗-兔IgG-XL-665、组蛋白H4R3二甲基对称性(H4R3me2s)多克隆抗体的检测溶液(都在HTRF检测缓冲液中制备)，并在室温进一步温育30分钟。在PHERAStar微量培养板读数器(microplate reader)中记录HTRF信号。将在665nm和620nm获得的信号比率用于如下计算化合物的抑制百分比：

％抑制＝100-((试验比率-阴性对照比率)/(阳性对照比率-阴性对照比率)*100)，其中

阳性对照＝PRMT5+SAM+H4R3

阴性对照＝PRMT5+H4R3

生化测定方案2

在生化测定中使用HTRF检测技术评估化合物对PRMT5的抑制作用。将生物素化的H4R3(残基1-21)用作底物。将化合物与384孔平板的每孔2.5ng PRMT5:MEP50一起在含有20mM N-二(羟乙基)甘氨酸(pH 7.6)、25mM NaCl、2mM DTT、0.01％鸡白蛋白和0.01％吐温-20的测定缓冲液中在室温预温育30分钟。通过加入1μM的SAM和50nM生物素化的H4R3，引发反应。总测定体积为15μL。在室温继续反应4小时。然后加入含有链霉抗生素蛋白-Eu穴状化合物、抗-兔IgG-XL-665、组蛋白H4R3二甲基对称性(H4R3me2s)多克隆抗体的检测溶液(都在HTRF检测缓冲液中制备)，并在室温进一步温育30分钟。在PHERAStar微量培养板读数器中记录HTRF信号。将在665nm和620nm获得的信号比率用于如下计算化合物的抑制百分比：

阳性对照＝PRMT5+SAM+H4R3

阴性对照＝PRMT5+H4R3

SDMA抑制测定

方案

将Z-138细胞(ATCC,CRL-3001^TM)以1百万个细胞/孔的密度接种在透明平底组织培养级48孔平板中。将细胞用各种浓度的试验化合物处理48小时的阶段。使用1X CST裂解缓冲液(Cell Signaling Technology,美国)制备细胞裂解物，并将500ng/孔/50μL的在pH9.6碳酸盐缓冲液中的裂解物包被在96孔Maxisorb平板上，并在4℃温育过夜。将平板在含有0.05％吐温20的1x PBS中洗涤两次，并在环境温度在1％BSA中封闭1小时。此外，将平板首先与一级抗体(抗-SDMA抗体；CST#13222s)一起在环境温度温育2小时，并然后与HRP-缀合的二级抗体一起在环境温度温育1小时，其间进行2个间歇洗涤步骤。

对于基于发光的检测，加入HRP底物(以1:1比例的底物A+底物B)，随后在30分钟后在Synergy^TM2读数器(Biotek,美国)中进行发光读取。

对于基于吸光度的检测，加入TMB底物，随后在显色后添加终止(STOP)溶液(2NH₂SO₄)，并在Synergy^TM2读数器(Biotek,美国)中测量吸光度(激发450nm和发射540nm)。

按照下式相对于含有介质与仅0.1％DMSO的媒介物对照样品计算SDMA抑制百分比。

(未经处理的对照的平均值-试验的平均值)X 100

未经处理的对照的平均值

使用Graph Pad Prism(Graph Pad Software,Inc,美国)，通过非线性回归分析计算各种化合物的IC₅₀值。

抗癌活性测定

将Z-138细胞以每孔2000-3000个细胞的密度接种在培养基(IMDM+10％FBS)中。将PANC-1(ATCC,CRL-1469^TM)和MIA PaCa-2(ATCC,CRL-1420^TM)细胞以每孔200-300个细胞的密度接种在培养基(DMEM+10％FBS)中。将细胞接种在不透明的平底组织培养级96孔平板中，将Z-138细胞(悬浮液)接种，并在同一天用各种浓度的试验化合物处理。将贴壁的PANC-1和MIA PaCa-2细胞在标准细胞培养条件(37℃、5％CO₂)下保持以过夜沉降。第二天，用各种浓度的试验化合物处理细胞。对于Z-138细胞、PANC-1细胞和MIA PaCa-2细胞，分别用试验化合物处理细胞96小时、7天和10天。按照生产商的说明书，使用CellTiterGlo^TM(Promega,美国)评估细胞生存力。在Synergy^TM 2读数器(Biotek,美国)中读取相对光单位(RLU)。该测定测量细胞ATP作为细胞生存力的指标。RLU与相应孔中的活细胞的数目成比例。

按照下式相对于含有介质与仅0.1％DMSO的媒介物对照样品计算细胞生存力抑制百分比。

(未经处理的对照的平均值-试验的平均值)X 100

未经处理的对照的平均值

使用Graph Pad Prism(Graph Pad Software,Inc,美国)通过非线性回归分析计算各种化合物的IC₅₀值。

活性范围	实施例编号
		IC<sub>50</sub> 1pM至1nM	1、2、3、4、7
IC<sub>50</sub>>1nM	5、6、8

抗癌测定(MIA PaCa-2)

体内效力实验

通过将细胞注射到购自美国杰克逊实验室(The Jackson Laboratory,USA)的7-11周龄的雌性NOD.CB17-Prkdc<scid>/J小鼠的右侧胁腹中，建立套细胞淋巴瘤的肿瘤异种移植物。在实验开始之前，所有动物研究计划都经过机构动物伦理委员会(IAEC)评审和批准。

Z-138异种移植物

对于Z-138异种移植物小鼠模型，使Z-138细胞(

-3001^TM)在补充有10％FBS的IMDM培养基中生长。在标准条件下在37℃和5％CO₂下温育细胞。为了产生肿瘤，将IMDM培养基中的Z-138细胞与Matrigel(

基底膜基质)以1:1的比率混合。将200μL体积中10×10⁶个细胞皮下注射进每只小鼠中以建立肿瘤。一旦肿瘤达到100-120mm³之间的平均体积，将小鼠随机分入8-10只小鼠的治疗组。在随机化当天开始治疗，并持续至研究结束。使用管饲法管，以每只小鼠每天两次10mL/kg的应用体积，给媒介物和试验化合物治疗组口服施用相应治疗。

在22±3℃的室温、50±20％湿度和12/12h光照/黑暗周期，将小鼠圈养在独立通风笼(IVC)中。所有实验活动均在生物安全柜内进行以确保无菌。

当肿瘤变得可触知时，用Digimatic游标卡尺(Mitutoyo,日本)测量肿瘤尺寸。使用以下公式计算肿瘤体积(T.V.)：

肿瘤体积(mm3)＝(L×W2)/2

其中，L：肿瘤长度，W：肿瘤宽度，以毫米为单位

使用以下公式计算肿瘤生长抑制百分比(％TGI)：

％TGI＝[1-(Tf-Ti)/(Cf-Ci)]×100

其中，Tf和Ti分别是最终和初始肿瘤体积(试验化合物)，且Cf和Ci分别是最终和初始平均肿瘤体积(媒介物组)。

将肿瘤消退百分比计算为：

％TR:(Ti-Tf)/(Ti)×100

其中，Tf和Ti分别是最终和初始肿瘤体积。

MIA PaCa-2异种移植物

通过将30-45mm³的肿瘤碎片皮下植入购自美国杰克逊实验室(The JacksonLaboratory,USA)的10-11周龄的雌性无胸腺裸FOXn1<nu>/J/小家鼠(musculus)小鼠的右侧胁腹中，建立胰腺癌细胞系MIA PaCa-2的肿瘤碎片异种移植物。在实验开始之前，所有动物研究计划都经过机构动物伦理委员会(IAEC)评审和批准。

使用上面给出的测定程序，在亚慢性MIA PaCa-2异种移植物模型中试验实施例编号1的肿瘤生长抑制；发现2mg/kg剂量的肿瘤生长抑制百分比为57％。

Claims

1.通式(I)的化合物、其立体异构体或其药学上可接受的盐，

其中，

L₁选自-CR^aR^b-、-NR^a-、S和O；

Hy选自式(a-1)至(d-1)，

R选自-NR⁴R⁵、被取代的或未被取代的烷基和环烷基；

R¹⁰选自氢、卤素和被取代的或未被取代的烷基；

‘m’是在0-1范围内的整数，包括两端；

‘n’是在0-4范围内的整数，包括两端；

R^7a选自氢、烷基、全卤代烷基和环烷基；

R^8a和R^8b各自独立地选自氢、烷基和环烷基；且

R^9a选自烷基和环烷基。

2.具有式(II)的结构的根据权利要求1所述的化合物、其立体异构体或其药学上可接受的盐，

其中，

环A、Hy、L₁、R^2a、R^2’、R^a、R^b、R³和n如上文所定义。

3.具有式(III)的结构的根据权利要求1所述的化合物、其立体异构体或其药学上可接受的盐，

其中，L₁是-CR^aR^b-或O；

环A是

Hy选自式(a-1)、(b-1)和(d-1)，

R选自-NR⁴R⁵、被取代的或未被取代的烷基和环烷基；R⁴和R⁵独立地选自氢；R^2’是氢；R³在每次出现时独立地选自卤素、被取代的或未被取代的烷基、-OR⁶和-NR⁷R⁸；R⁷和R⁸独立地选自氢；R¹⁰是氢；‘m’是1；‘n’是在0-3范围内的整数，包括两端。

4.根据权利要求1-3所述的化合物，其中R是甲基。

5.在权利要求1中要求保护的式(I)的化合物、其立体异构体或其药学上可接受的盐，其中所述化合物选自：

6.一种药物组合物，其包含至少一种根据权利要求1-5中的任一项所述的化合物、其立体异构体或其药学上可接受的盐和药学上可接受的载体。

7.一种用于治疗与PRMT5酶有关的疾病、障碍、综合征或病症的方法，其包括给有此需要的受试者施用有效量的在权利要求1-5中要求保护的化合物。

8.在权利要求7中要求保护的方法，其中所述与PRMT5酶有关的疾病、障碍、综合征或病症是多形性胶质母细胞瘤、***癌、胰腺癌、套细胞淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤和弥漫性大B细胞性淋巴瘤、急性髓系白血病、急性淋巴母细胞白血病、多发性骨髓瘤、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、乳腺癌、三阴性乳腺癌、胃癌、结肠直肠癌、卵巢癌、膀胱癌、肝细胞癌、黑素瘤、肉瘤、口咽鳞状细胞癌、慢性髓细胞性白血病、表皮鳞状细胞癌、鼻咽癌、神经母细胞瘤、子宫内膜癌和***。

9.在权利要求7中要求保护的方法，其中所述与PRMT5酶有关的疾病、障碍、综合征或病症是癌症。

10.根据权利要求1-5中的任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐在制备药物中的用途，所述药物用于治疗与PRMT5有关的疾病、障碍、综合征或病症。

11.在权利要求10中要求保护的用途，其中所述与PRMT5有关的疾病、障碍、综合征或病症选自多形性胶质母细胞瘤、***癌、胰腺癌、套细胞淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤和弥漫性大B细胞性淋巴瘤、急性髓系白血病、急性淋巴母细胞白血病、多发性骨髓瘤、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、乳腺癌、三阴性乳腺癌、胃癌、结肠直肠癌、卵巢癌、膀胱癌、肝细胞癌、黑素瘤、肉瘤、口咽鳞状细胞癌、慢性髓细胞性白血病、表皮鳞状细胞癌、鼻咽癌、神经母细胞瘤、子宫内膜癌和***。

12.在权利要求10中要求保护的用途，其中所述与PRMT5有关的疾病、障碍、综合征或病症是癌症。