CN115109742A - 一种临床级高纯度血液或尿液中外泌体分离纯化试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种临床级高纯度血液或尿液中外泌体分离纯化试剂盒，选用差速离心和超滤离心相结合，增加稀释和超滤浓缩步骤分离纯化外泌体，以大幅度提高其纯度且减少外泌体的损耗。还包括该试剂盒胃癌诊断中的应用。本发明与现有技术相比，获得大量高纯度稳定的外泌体，平均尺寸为30‑150 nm，完整的茶杯托样结构，粒径分布均匀，且表面携带标志性蛋白CD9、CD81、CD63，克服了现有制备技术存在纯度低，产量低，表征蛋白表达量低等不足，本发明获得的外泌体可以直接用于后续的检测，安全系数高，不会引起外泌体功能的缺失，既可以用于科学研究，又可以用于外泌体中标志物如miRNA的检测，可用于筛查与诊断早期胃癌。
Description
技术领域
本发明属于纳米生物技术领域，具体涉及一种临床级高纯度血液或尿液中外泌体分离纯化试剂盒。
背景技术
外泌体（exosome）是由很多类型细胞分泌的30-150 nm的“杯托状”磷脂双分子层囊泡，密度为1.13-1.19 g/mL，携带多种蛋白质、脂质和核酸，功能复杂，参与免疫调节、调控细胞外基质重构、激活细胞的信号通路等。分离出的外泌体，进行进一步检测肿瘤标志物，如miRNA, 可以用于肿瘤的筛查及早期诊断。到目前为止，外泌体分离的方法已有一些报道，但存在一些问题，传统的超速离心得到的外泌体纯度尚可，但其产量不高；根据外泌体尺寸原理设计的超滤，透析等方法又不能很好的去除与外泌体尺寸一致的杂蛋白；而采用聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）沉淀法和免疫磁珠法都不同程度地引入不适合临床治疗的外源性物质。研发新型的高纯度外泌体分离试剂盒，具有巨大的临床需求。
发明内容
本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种临床级高纯度血液或尿液中外泌体分离纯化试剂盒，以产生大量临床级高纯度外泌体。
进一步的，本发明再一目的在于，提供一种上述试剂盒的应用。
本发明目的通过以下技术方案来实现：一种临床级高纯度血液或尿液中外泌体分离纯化试剂盒，选用差速离心和超滤离心相结合，增加稀释和超滤浓缩步骤分离纯化外泌体，以大幅度提高其纯度且减少外泌体的损耗，包括以下步骤：
（1）收集患者的血液样本至少2ml, 离心分离出上清，转移到另一个离心管中，用4℃条件下磷酸盐缓冲液对收集的上清液进行稀释,得稀释液；和/或
收集患者的尿液样本至少2ml, 离心分离出上清，转移到另一个离心管中，采用4℃条件下磷酸盐缓冲液对收集的上清液进行稀释,得稀释液；
（2）将步骤（1）制得的稀释液在4℃条件下以2000-3000 rpm的转速离心，留取上清液，弃沉淀；
（3） 将步骤（2）得到的上清液在4℃条件下以8000-12000 rpm的转速离心，留取上清液，弃沉淀；
（4）用4℃条件下磷酸盐缓冲液稀释步骤（3）中得到的上清液的，继续用100 kDa-150 kDa超滤管以3000-4000 rpm的速度离心10min，去除小分子杂质的同时得到浓缩上清液，以减少接下来的超速离心工作量及成本；
（5）将步骤（4）得到的浓缩上清液以4℃条件下8000 g 的转速离心60 min，离心结束后，弃上清，保留沉淀；
（6）将步骤（5）得到的沉淀用磷酸盐缓冲液重悬转移至透析袋中，透析3h即可得到所需的高纯度血清或尿液中外泌体的目标液。
其中，所述的磷酸盐缓冲液配方：KCL 200 mg/L；NaCL 8g/L；KH2PO4 240 mg/L；Na2HPO4 1.44 g/L。
在上述方案基础上，所述步骤（1）中磷酸盐缓冲液与上清的稀释体积比是1：1。
进一步的，所述步骤(2)中离心时间为8-10 min；步骤(3)中离心时间为15-25min。
在上述方案基础上，步骤（6）采用磷酸盐缓冲液量是1 mL-4 mL，透析袋孔径是30nm-35 nm，透析液是磷酸盐缓冲液。
较优的，步骤（6）中采用1 mL-4 mL磷酸盐缓冲液重悬转移至透析袋中，透析袋孔径是30 nm-35 nm，磷酸盐缓冲液作为透析液，透析3-8h即可得到所需的高纯度血清或尿液中外泌体的目标液。
步骤（6）中得到的目标液可用 0.22μm无菌过滤器滤菌。
本发明还提供了上述试剂盒在胃癌相关标志物检测中的应用，采用流式细胞仪进行CD9、CD81、CD63标志物的检测，用于胃癌相关的标志物如miRNA标志物的检测。
具体的，从制备的外泌体中取出5μl 液体，加入PI 染料混匀后，加入去离子水至100μl总体积，加入流式细胞仪，进行分析，确认外泌体表面存在CD9、CD81、CD63抗原标志物。
与现有技术相比，本发明获得了大量高纯度稳定的外泌体，平均尺寸为30-150nm，完整的茶杯托样结构，粒径分布均匀，且表面携带标志性蛋白CD9、CD81、CD63，克服了现有制备技术存在纯度低，产量低，表征蛋白表达量低等不足，本发明获得的外泌体可以直接用于后续的检测，安全系数高，不会引起外泌体功能的缺失，既可以用于科学研究，又可以用于外泌体中标志物如miRNA的检测，可用于筛查与诊断早期胃癌。
附图说明
图1，获得的外泌体透射电子显微镜(TEM)照片。
图2，Western Blot检测，高表达外泌体标志蛋白CD9、CD81、CD63。
图3，纳米颗粒跟踪分析（Nanoparticle Tracking Analysis，NTA）检测，NTA检测外泌体粒径分析，获得的外泌体，平均粒径为113nm± 20nm，外泌体数量高达 6*107。
具体实施方式
实施例1：血清中外泌体的分离纯化
一种临床级高纯度血液或尿液中外泌体分离纯化试剂盒，包括盒体，选用差速离心和超滤离心相结合，增加稀释和超滤浓缩步骤分离纯化外泌体，以大幅度提高其纯度且减少外泌体的损耗，按以下步骤：
（1）采集胃癌患者的血液样本2ml, 离心分离出上清，转移到另一个离心管中，4℃条件下用磷酸盐缓冲液对收集的上清液进行稀释,得稀释液；
（2）将步骤（1）制得的稀释液在4℃条件下以3000 rpm的转速离心8 min，沉淀为细胞，留取上清液，弃沉淀；
（3） 将步骤（2）得到的上清液在4℃条件下以9000 rpm的转速离心15min，留取上清液，弃沉淀；
（4）用4℃条件下磷酸盐缓冲液稀释步骤（3）中得到的上清液的，继续用110 kDa超滤管以3000-4000 rpm的速度离心5min，去除小分子杂质的同时得到浓缩上清液，以减少接下来的超速离心工作量及成本；
（5）将步骤（4）得到的浓缩上清液以4℃条件下100,000g的转速离心60 min，离心结束后，弃上清，保留沉淀；
（6）将步骤（5）得到的沉淀用磷酸盐缓冲液重悬转移至透析袋中，透析8h即可得到所需的高纯度大量的外泌体的目标液。
本发明使用透射电子显微镜(TEM)、蛋白质印迹法（Western Blot）、纳米颗粒跟踪分析（Nanoparticle Tracking Analysis）对获得的外泌体进行表征，具体表征结果分别如下：
图1：透射电子显微镜(TEM)照片：外泌体纯度的表征手段主要是TEM电镜，如果外泌体纯度不够的话会有很多杂质，看不清外泌体。对本实施例获得的外泌体拍摄TEM图片，如图1所示，在其视野范围内，外泌体清晰完整，这说明通过本方法获得外泌体纯度高，且外泌体结构完整。
图2：Western Blot检测：本实施例获得的外泌体生物活性主要表征手段是Western Blot检测，从图2中可以得知，外泌体高表达外泌体标志蛋白CD9、CD81、CD63。
图3：NTA检测外泌体粒径分析：本实施例获得的外泌体细胞数量表征是NTA，从图3中可以看出本发明获得的外泌体，平均粒径为113nm± 20nm，外泌体数量高达 6*107 。
实施例2
一种临床级高纯度血液或尿液中外泌体分离纯化试剂盒，包括盒体，选用差速离心和超滤离心相结合，增加稀释和超滤浓缩步骤分离纯化外泌体，以大幅度提高其纯度且减少外泌体的损耗，按以下步骤：
（1）收集患者的尿液样本至少2ml, 离心分离出上清，转移到另一个离心管中，采用4℃条件下磷酸盐缓冲液对收集的上清液进行稀释,得稀释液；
（2）将步骤（1）制得的磷酸盐缓冲液在4℃条件下以3000 rpm的转速离心9min，留取上清液，弃沉淀；
（3）将步骤（2）得到的上清液在4℃条件下以10000 rpm的转速离心20min，留取上清液，弃沉淀；
（4）用4℃条件下磷酸盐缓冲液稀释步骤（3）中得到的上清液的，继续用110 kDa超滤管以3500 rpm的速度离心5min，去除小分子杂质的同时得到浓缩上清液，以减少接下来的超速离心工作量及成本；
（5）将步骤（4）得到的浓缩上清液以4℃条件下100,000g的转速离心60 min，离心结束后，弃上清，保留沉淀；
（6）将步骤（5）得到的沉淀用磷酸盐缓冲液重悬转移至透析袋中，透析7h即可得到所需的高纯度大量的外泌体的目标液。
从制备的外泌体中取出5μl 目标液，加入PI 染料标记的抗CD9、CD81、CD63的单克隆抗体，混匀后，加入去离子水至100μl总体积，加入流式细胞仪，进行分析，确认了外泌体表面存在CD9、CD81、CD63抗原标志物。
以上详细描述了本发明的二个具体实施方式，仅为了说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让本领域技术人员能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。应当理解，本领域的普通技术人员无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。
Claims (10)
1. 一种临床级高纯度血液或尿液中外泌体分离纯化试剂盒，其特征在于，选用差速离心和超滤离心相结合，增加稀释和超滤浓缩步骤分离纯化外泌体，以大幅度提高其纯度且减少外泌体的损耗，包括以下步骤：
（1）收集患者的血液样本至少2ml, 离心分离出上清，转移到另一个离心管中，用4 ℃条件下磷酸盐缓冲液对收集的上清液进行稀释,得稀释液；和/或
收集患者的尿液样本至少2ml, 离心分离出上清，转移到另一个离心管中，采用4℃条件下磷酸盐缓冲液对收集的上清液进行稀释,得稀释液；
（2）将步骤（1）制得的稀释液在4℃条件下以2000-3000 rpm的转速离心，留取上清液，弃沉淀；
（3） 将步骤（2）得到的上清液在4℃条件下以8000-12000 rpm的转速离心，留取上清液，弃沉淀；
（4）用4℃条件下磷酸盐缓冲液稀释步骤（3）中得到的上清液的，继续用100 kDa-150kDa超滤管以3000-4000 rpm的速度离心5-10min，去除小分子杂质的同时得到浓缩上清液，以减少接下来的超速离心工作量及成本；
（5）将步骤（4）得到的浓缩上清液以4℃条件下8000 -100,000g 的转速离心60 min，离心结束后，弃上清，保留沉淀；
（6）将步骤（5）得到的沉淀用磷酸盐缓冲液重悬转移至透析袋中，透析3h即可得到所需的高纯度血清或尿液中外泌体的目标液。
2. 根据权利要求1所述的一种临床级高纯度血液或尿液中外泌体分离纯化试剂盒，其特征在于，所述的磷酸盐缓冲液配方：KCL 200 mg/L；NaCL 8g/L；KH2PO4 240 mg/L；Na2HPO41.44 g/L。
3.根据权利要求1或2所述的一种临床级高纯度血液或尿液中外泌体分离纯化试剂盒，其特征在于，所述步骤（1）中磷酸盐缓冲液与上清的稀释体积比是1：1。
4. 根据权利要求1所述的一种临床级高纯度血液或尿液中外泌体分离纯化试剂盒，其特征在于，所述步骤(2)中离心时间为8-10 min；述步骤(3)中离心时间为15-25 min。
5.根据权利要求1或2所述的一种临床级高纯度血液或尿液中外泌体分离纯化试剂盒，其特征在于，步骤（6）中采用1 mL-4 mL磷酸盐缓冲液重悬转移至透析袋中，透析袋孔径是30 nm-35 nm，磷酸盐缓冲液作为透析液，透析3-8h即可得到所需的高纯度血清或尿液中外泌体的目标液。
6.根据权利要求1或2所述的一种临床级高纯度血液或尿液中外泌体分离纯化试剂盒，其特征在于，按以下步骤：
（1）采集胃癌患者的血液样本2ml, 离心分离出上清，转移到另一个离心管中，4℃条件下用磷酸盐缓冲液对收集的上清液进行稀释,得稀释液；
（2）将步骤（1）制得的稀释液在4℃条件下以3000 rpm的转速离心8 min，沉淀为细胞，留取上清液，弃沉淀；
（3） 将步骤（2）得到的上清液在4℃条件下以9000 rpm的转速离心15min，留取上清液，弃沉淀；
（4）用4℃条件下磷酸盐缓冲液稀释步骤（3）中得到的上清液的，继续用110 kDa超滤管以3000-4000 rpm的速度离心5min，去除小分子杂质的同时得到浓缩上清液，以减少接下来的超速离心工作量及成本；
（5）将步骤（4）得到的浓缩上清液以4℃条件下100,000g的转速离心60 min，离心结束后，弃上清，保留沉淀；
（6）将步骤（5）得到的沉淀用磷酸盐缓冲液重悬转移至透析袋中，透析8h即可得到所需的高纯度大量的外泌体的目标液。
7.根据权利要求1或2所述的一种临床级高纯度血液或尿液中外泌体分离纯化试剂盒，其特征在于，按以下步骤：
（1）收集患者的尿液样本至少2ml, 离心分离出上清，转移到另一个离心管中，采用4℃条件下磷酸盐缓冲液对收集的上清液进行稀释,得稀释液；
（2）将步骤（1）制得的磷酸盐缓冲液在4℃条件下以3000 rpm的转速离心9min，留取上清液，弃沉淀；
（3）将步骤（2）得到的上清液在4℃条件下以10000 rpm的转速离心20min，留取上清液，弃沉淀；
（4）用4℃条件下磷酸盐缓冲液稀释步骤（3）中得到的上清液的，继续用110 kDa超滤管以3500 rpm的速度离心5min，去除小分子杂质的同时得到浓缩上清液，以减少接下来的超速离心工作量及成本；
（5）将步骤（4）得到的浓缩上清液以4℃条件下100,000g的转速离心60 min，离心结束后，弃上清，保留沉淀；
（6）将步骤（5）得到的沉淀用磷酸盐缓冲液重悬转移至透析袋中，透析7h即可得到所需的高纯度大量的外泌体的目标液。
8. 根据权利要求1所述的一种临床级高纯度血液或尿液中外泌体分离纯化试剂盒，其特征在于，步骤（6）中得到的目标液用 0.22μm无菌过滤器滤菌。
9.一种根据上述权利要求1至8任一项所述试剂盒在胃癌相关标志物检测中的应用，采用流式细胞仪进行CD9、CD81、CD63标志物的检测，用于胃癌相关的标志物如miRNA标志物的检测。
10. 据上述权利要求9所述的应用，其特征在于：采用流式细胞仪进行CD9、CD81、CD63标志物的检测按下述步骤：从制备的外泌体中取出5μl 目标液，加入PI 染料标记的抗CD9、CD81、CD63的单克隆抗体，混匀后，加入去离子水至100μl总体积，加入流式细胞仪，进行分析，确认外泌体表面是否存在CD9、CD81、CD63抗原标志物。
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