CN109576206A - 一种基于联合法分离外泌体的方法 - Google Patents

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战琦
赵瑾
侯信
李学平
韩冬琳
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Abstract

本发明提供一种基于联合法分离外泌体的方法，包括使用微孔滤膜过滤的方法除去样品中的大尺寸微泡，使用超滤的方法除去样品中的小尺寸杂蛋白，得到纯度较高的外泌体并可通过超顺磁纳米颗粒和配体的复合物予以分离配合。本发明所制备的外泌体尺寸在50‑100nm，符合外泌体的理论尺寸，且膜结构完整。该方法操作简单，成本低，耗时少。

Description

一种基于联合法分离外泌体的方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，更具体地说涉及一种基于联合法分离外泌体的方法。
背景技术
外泌体是一类直径在40-100nm的膜囊泡，其由大多数细胞从多泡体(MVB)释放到细胞外空间中，包含着各种生物分子，如DNA、RNA、蛋白质等。近几年，外泌体在细胞通讯中的重要作用已经引起了广泛的关注。例如，源自间充质干细胞的外泌体对心肌缺血/再灌注的损伤具有一定保护作用{Lai,Ruenn Chai,et al."Exosome secreted by MSC reducesmyocardial ischemia/reperfusion injury."Stem cell research 4.3(2010)}。由于外泌体源自细胞并且可以在细胞间传递各类生物分子，它们也被预测为新一代具有良好的生物相容性和高效转染效率的药物投递载体。
为了实现更高效的药物投递，快速有效的获得高纯度，高产量，结构完整的外泌体成为目前急需解决的一大问题。目前，外泌体的主要来源为细胞培养基，包括肿瘤细胞培养基以及各类正常组织细胞培养基。然而，众所周知，真核细胞将许多膜状囊泡释放到微环境中，这些包括外泌体，微泡，凋亡小泡及一些细胞碎屑等。在目前使用的从培养基中分离纯化外来体的方法中，大多数采用差速超速离心法，首先通过低速离心(如500g，2000g)以除去完整的细胞，大块细胞碎片和一些大尺寸囊泡，然后用高速离心(例如，100,000g)来沉淀外泌体。该方法污染风险低，且可以收集大量外泌体{Ohno,Shin-ichiro,et al."Systemically injected exosomes targeted to EGFR deliver antitumor microRNA tobreast cancer cells."Molecular Therapy 21.1(2013)}。然而，高速的离心力可能会破坏外泌体的膜结构，使外泌体上所携带的遗传信息分子流失。磷脂双分子层的破坏也会影响外泌体作为投递载体的药物负载及释放能力。
健康动物的体液如血液，唾液，尿液，***，母乳等是另一优选的外泌体来源，因为其生物安全性较高且数量较多。差速超速离心的方法也同样适用于分离体液来源的外泌体。然而体液中的复杂成分如各类小分子杂蛋白，可在高速离心下导致蛋白质聚集体和外泌体的共沉淀，降低了外泌体纯度。最近，已经开发了一种免疫磁性分离的方法，通过将磁珠与配体偶联，然后特异性结合外泌体表面的受体进而在磁场作用下实现外泌体的分离{Qi,Hongzhao,et al."Blood exosomes endowed with magnetic and targetingproperties for cancer therapy."ACS nano 10.3(2016)}。该方法虽然提高了外泌体的纯度，但体液中游离的小分子配体会与与磁珠-配体复合物形成竞争关系，影响了磁珠-配体复合物与外泌体的结合，从而降低了磁分离的效率。
发明内容
本发明的目的克服现有技术中的不足，提供了一种基于联合法分离外泌体的方法，具体而言，本发明使用微孔滤膜除去样品中的大尺寸囊泡，使用超滤的方法除去样品中的小分子杂蛋白，以简单易行的方法得到纯度较高的外泌体，并可通过与超顺磁纳米颗粒和配体的复合物进一步提升分离效果。
本发明的技术目的通过下述技术方案予以实现
一种基于联合法分离外泌体的方法，采用微孔过滤和超滤离心相结合的方式进行：
采用微孔滤膜对待分离样品进行过滤处理，以去除大尺寸微泡，控制微孔滤膜的孔径为大于0.1μm；
在微孔过滤中，待分离样品为肿瘤细胞培养基、正常组织细胞培养基、各种生物体液，如血液(血清)、唾液、尿液、***、母乳。
在微孔过滤中，微孔滤膜的材质为纤维树脂膜或尼龙膜，微孔滤膜的孔径大于0.12μm，优选大于0.15μm，如0.1μm-10μm，微孔过滤次数为1-100次，优选10—80次。
将微孔过滤得到的滤液进行超滤离心处理，以去除小尺寸杂蛋白，得到含有外泌体的上清液，超滤管的截留分子量为1kDa-400kDa，在3-5℃离心10-20min，离心速度为80×g-12000×g。
在超滤离心中，小尺寸杂蛋白的尺寸为30nm一下，如10—30nm。
在超滤离心中，超滤管的截留分子量3kDa-300kDa(数均)，超滤条件为4℃，12-18min，离心速度为100×g-10000×g；超滤过滤次数为1-100次，优选10—60次。
也可先进行超滤离心处理待分离样品，以去除小尺寸杂蛋白，再进行微孔滤膜过滤，以去除大尺寸微泡，得到含有外泌体的上清液。
在经过采用微孔过滤和超滤离心相结合的方式进行外泌体分离后，可选择加入超顺磁纳米颗粒和配体的复合物进一步提升分离效果，
超顺磁纳米颗粒和配体的复合物为超顺磁纳米颗粒-配体复合物(SPMN-配体)，选择超顺磁纳米颗粒与激活的硫醇基配体反应制备，配体与2-亚氨基四氢噻吩反应得到激活的硫醇基配体，参考文献Qi,Hongzhao,et al."Blood exosomes endowed with magneticand targeting properties for cancer therapy."ACS nano 10.3(2016)或者超顺磁纳米颗粒-聚乙二醇-配体复合物(SPMN-PEG-配体)，选择聚乙二醇化的超顺磁纳米颗粒与激活的硫醇基配体反应制备，氨基官能化的超顺磁性Fe3O4纳米颗粒与活性酯聚乙二醇马来酰亚胺进行反应，以实现超顺磁纳米颗粒的聚乙二醇化；配体与2-亚氨基四氢噻吩反应得到激活的硫醇基配体，具体来说：
将氨基官能化的超顺磁性Fe3O4纳米颗粒溶液与活性酯聚乙二醇马来酰亚胺(NHS-PEG-MAL)在硼酸盐缓冲液中混合将混合物在室温(20-25℃)下孵育1-3h，以实现超顺磁纳米颗粒的聚乙二醇化；将配体与2-亚氨基四氢噻吩在硼酸盐缓冲液中混合，在室温(20-25℃)下孵育1-3h，以得到激活的硫醇基配体，使用含EDTA的硼酸盐缓冲液透析3-5h；最后将聚乙二醇化超顺磁纳米颗粒和活化的配体均匀分散在硼酸盐缓冲液中并在室温(20-25℃)下孵育1-3h后，得到SPMN-PEG-配体复合物，或者在分离得到聚乙二醇化超顺磁纳米颗粒和活化的配体后，直接将两者重新均匀分散在水溶液或者硼酸盐缓冲液中，得到两者的溶液后进行混合孵育反应。
配体采用CD63抗体、CD9抗体、CD81抗体、CD82抗体、ALIX抗体、Tsg101抗体或者转铁蛋白中的一种。
在超顺磁纳米颗粒的聚乙二醇化中，活性酯聚乙二醇马来酰亚胺的数均分子量为1000-100000，磁分离时间为10-5000min；优选活性酯聚乙二醇马来酰亚胺的数均分子量为4000-10000，磁分离时间为60-200min。
配体与2-亚氨基四氢噻吩以摩尔比为(1-10000)：(1-10000)，优选(10-1000)：(10-1000)，更加优选(10—100)：(600—1000)，直接根据配体和2-亚氨基四氢噻吩的质量和分子质量计算两者的摩尔数。
氨基官能化的超顺磁性Fe3O4纳米颗粒与活性酯聚乙二醇马来酰亚胺的摩尔比为(1-10000)：(1-10000)，优选(10-1000)：(10-1000)，更加优选(10—100)：(500—1000)，根据活性酯聚乙二醇马来酰亚胺的质量和分子质量计算其摩尔数，根据氨基官能化的超顺磁性Fe3O4纳米颗粒的浓度和体积，计算氨基官能化的超顺磁性Fe3O4纳米颗粒的个数，再除以NA。
与现有技术相比，本发明所分离的外泌体纯度较高，无蛋白聚集体和其他颗粒的污染，且对外泌体的膜结构损伤较小，完整地保护了其中的生物分子，并有利于后续以外泌体为药物载体的药物负载及释放；制备所得的外泌体纯度较高且膜结构完整，携带大量的遗传信息分子，并且可作为治疗性药物、治疗性蛋白、治疗性基因等一系列治疗剂的载体(即采用微孔过滤和超滤离心相结合的方式得到的外泌体在制备治疗剂载体中的应用)，在各类癌症、帕金森病、皮肤损伤、肝脏类疾病、肥胖症、糖尿病等各种疾病中起重要作用。为进一步提高外泌体分离效果，选择使用超顺磁纳米颗粒和配体的复合物，能够快速有效的从血清中分离外泌体，缩短了外泌体制备的时间，由于分离得到的外泌体携带有超顺磁性纳米颗粒(即SMNC-EXOs)，能够作为靶向治疗的药物载体，即依照本发明方法分离得到的外泌体在制备靶向治疗药物载体中的应用。
附图说明
图1为使用本发明微孔过滤和超滤离心相结合方式分离得到的外泌体的粒径尺寸表征结果示意图。
图2为使用本发明微孔过滤和超滤离心相结合方式分离得到的外泌体的透射电子显微镜照片(1)。
图3为使用本发明微孔过滤和超滤离心相结合方式分离得到的外泌体的透射电子显微镜照片(2)。
图4为使用蛋白质印迹法对所分离的外泌体进行特异性蛋白的表征示意图。
图5为使用本发明微孔过滤和超滤离心相结合方式并配合使用超顺磁纳米颗粒和配体的复合物进行分离得到的SMNC-EXOs的透射电子显微镜照片。
图6为经不同时间的超滤或透析后，测量血清中游离(残余)配体浓度的对比测试曲线图。
图7为SPMN-配体和SPMN-PEG-配体对超滤血清的外泌体的分离速度对比测试曲线图。
图8为使用本发明微孔过滤和超滤离心相结合方式并配合使用超顺磁纳米颗粒和配体的复合物进行分离得到的SMNC-EXOs的粒径分布表征图。
具体实施方式
下面结合具体实施例进一步说明本发明的实施例。
实施例中使用的主要仪器及试剂：氨基官能化超顺磁性Fe3O4纳米颗粒(南京纳米生物科技有限公司)；CD63抗体、CD9抗体、CD81抗体、CD82抗体、ALIX抗体、Tsg101抗体和转铁蛋白(Sigma-Aldrich公司)；微孔滤膜(Merck Millipore)；超滤管(Merck Millipore)；TG16-WS台式高速离心机(湖南湘仪实验室仪器有限公司)；动态光散射粒度仪(美国布鲁克海文有限公司)；透射电子显微镜(日本电子株式会社)。
实施例1
1.采用微孔滤膜对MCF-7细胞培养基进行过滤处理
将100mL的MCF-7细胞培养基经孔径为0.1μm的微孔滤膜过滤，重复1次，取滤液。
2.将步骤1得到的滤液进行超滤处理
取上述步骤1所得滤液加入超滤管中(截留分子量为3kDa)中，在4℃离心15min，离心速度为500×g，重复1次。
3.将上述步骤2得到的上清液重悬，得到外泌体。
实施例2
1.对RAW264.7细胞培养基进行超滤处理
将100mL的RAW264.7细胞培养基加入超滤管中(截留分子量为400kDa)中，在3℃离心20min，离心速度为2000×g，重复20次，重悬，取上清液。
2.采用微孔滤膜对步骤1得到的上清液进行过滤处理
将步骤1得到的上清液经孔径为0.05μm的微孔滤膜过滤，重复10次，取滤液。
3.收集滤液，得到外泌体。
实施例3
1.对血清进行超滤处理
将1mL的血清加入超滤管中(截留分子量为10kDa)中，在5℃离心10min，离心速度为5000×g，重复30次，重悬取上清液。
2.采用微孔滤膜对步骤1得到的上清液进行过滤处理
将步骤1得到的上清液经孔径为12μm的微孔滤膜过滤，重复50次，取滤液。
3.收集滤液，得到外泌体。
实施例4
1.对母乳进行超滤处理
将1mL的母乳加入超滤管中(截留分子量为1kDa)中，在4℃离心20min，离心速度为100×g，重复100次，重悬取上清液。
2.采用微孔滤膜对步骤1得到的上清液进行过滤处理
将步骤1得到的上清液经孔径为10μm的微孔滤膜过滤，重复20次，取滤液。
3.收集滤液，得到外泌体。
实施例5
1.对尿液进行超滤处理
将1mL的尿液加入超滤管中(截留分子量为150kDa)中，在5℃离心12min，离心速度为12000×g，重复70次，重悬取上清液。
2.采用微孔滤膜对步骤1得到的上清液进行过滤处理
将步骤1得到的上清液经孔径为0.05μm的微孔滤膜过滤，重复90次，取滤液。
3.收集滤液，得到外泌体。
实施例6
1.对唾液进行超滤处理
将1mL的唾液加入超滤管中(截留分子量为18kDa)中，在5℃离心10min，离心速度为80×g，重复10次，重悬取上清液。
2.采用微孔滤膜对步骤1得到的上清液进行过滤处理
将步骤1得到的上清液经孔径为5μm的微孔滤膜过滤，重复40次，取滤液。
3.收集滤液，得到外泌体。
使用透射电子显微镜对上述实施例制备的外泌体进行形貌表征，外泌体的粒径和形貌基本保持一致，结果如图1—3所示，所制备的外泌体的流体动力学直径为40-100nm，该尺寸符合外泌体的理论尺，且粒径较均一，无大尺寸囊泡和小分子杂蛋白的污染，表明所制备的外泌体纯度较高，无大分子囊泡和小分子杂蛋白的污染，且外泌体的膜结构保持的较完整。所制备的外泌体在透射电子显微镜下呈白色圆球状，是具有磷脂双分子层膜结构的纳米级囊泡，直径在40-100nm，粒径较均一。这表面本发明所制备的外泌体纯度较高，无大分子囊泡和小分子杂蛋白的污染，且外泌体的膜结构保持得较完整。如图4所示，在所制备的外泌体表面检测到两种特异性蛋白CD63(约32KDa)和转铁蛋白(约60KDa)，这表明所制备的产物是外泌体。
在本发明实施例基础上使用两者配体进行配合处理，使用动态光散射粒度仪对分离产物进行尺寸的表征。结果如图8所示，所制备的外泌体的流体动力学直径表现一直，均为50-150nm，粒径较均一，纯度较高，无大尺寸囊泡和小分子杂蛋白的污染，且该尺寸符合SMNC-EXOs的理论尺寸。使用透射电子显微镜对所得产物进行尺寸的表征。结果如图5所示，所制备的SMNC-EXOs的形态是黑点包围的圆形囊泡，超顺磁性纳米颗粒以辐射状分布在外泌体周围。这种辐射状分布增加了瞄定在外泌体上的超顺磁性纳米颗粒的数目，由原来的6-8增加到了12-16，这赋予了SMNC-EXOs更高的磁响应性。
为表征本发明中超滤离心和SPMN-PEG-配体的效率，进行如下测试：(1)经不同时间的超滤或透析后，测量血清中游离配体的浓度，即血清中残余配体的浓度，未与SPMN-PEG进行功能化的配体，其会在分离外泌体时，对SPMN-PEG-配体产生干扰，残余量越少越好；超滤离心后，通过BCA测定试剂盒测定滞留物中配体蛋白的浓度；透析后，滞留物中配体蛋白的浓度也通过BCA测定试剂盒进行测定。结果图6所示，超滤30分钟后，血清中游离配体的浓度降至～0.08mg/mL，远远低于透析30分钟的浓度。为了达到相同的浓度，透析需要的时间远远大于超滤，表明超滤可以显着加速血清中游离配体的消除，这可缩短外泌体的分离时间；(2)将SPMN-配体(课题组之前现有技术)和SPMN-PEG-配体(本发明制备)分别与超滤血清混合，孵育相同时间。孵育后，将混合物置于磁场中不同时间段。然后丢弃上清液，用PBS将磁性分离的样品洗涤三次。最后，将样品分别重悬在PBS中，并通过BCA测定试剂盒测定所得溶液的蛋白质浓度。比较了SPMN-配体和SPMN-PEG-配体对超滤血清的外泌体的分离速度，蛋白质浓度用于表示外泌体的数量。结果如图7所示，40分钟后SPMN-PEG-配体分离的外泌体蛋白质浓度达到3000μg/mL。然而，为了达到类似的效果，SPMN-配体需要100分钟，表明SPMN-PEG-配体对外泌体的磁分离效率要高得多。
根据本发明内容进行制备参数的调整，均可实现外泌体的分离，经测试性能与上述实施例基本一致。以上对本发明做了示例性的描述，应该说明的是，在不脱离本发明的核心的情况下，任何简单的变形、修改或者其他本领域技术人员能够不花费创造性劳动的等同替换均落入本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种基于联合法分离外泌体的方法，其特征在于，采用微孔过滤和超滤离心相结合的方式进行：采用微孔滤膜对待分离样品进行过滤处理，以去除大尺寸微泡，控制微孔滤膜的孔径为大于0.1μm；将微孔过滤得到的滤液进行超滤离心处理，以去除小尺寸杂蛋白，得到含有外泌体的上清液，超滤管的截留分子量为1kDa-400kDa，在3-5℃离心10-20min，离心速度为80×g-12000×g。
2.根据权利要求1所述的一种基于联合法分离外泌体的方法，其特征在于，先进行超滤离心处理待分离样品，以去除小尺寸杂蛋白，再进行微孔滤膜过滤，以去除大尺寸微泡，得到含有外泌体的上清液。
3.根据权利要求1所述的一种基于联合法分离外泌体的方法，其特征在于，在微孔过滤中，待分离样品为肿瘤细胞培养基、正常组织细胞培养基、各种生物体液，如血液(血清)、唾液、尿液、***、母乳。
4.根据权利要求1所述的一种基于联合法分离外泌体的方法，其特征在于，在微孔过滤中，微孔滤膜的材质为纤维树脂膜或尼龙膜，微孔滤膜的孔径大于0.12μm，优选大于0.15μm，如0.1μm-10μm，微孔过滤次数为1-100次，优选10—80次。
5.根据权利要求1所述的一种基于联合法分离外泌体的方法，其特征在于，在超滤离心中，小尺寸杂蛋白的尺寸为30nm一下，如10—30nm。
6.根据权利要求1所述的一种基于联合法分离外泌体的方法，其特征在于，在超滤离心中，超滤管的截留分子量3kDa-300kDa(数均)，超滤条件为4℃，12-18min，离心速度为100×g-10000×g；超滤过滤次数为1-100次，优选10—60次。
7.根据权利要求1所述的一种基于联合法分离外泌体的方法，其特征在于，选择加入超顺磁纳米颗粒和配体的复合物进一步提升分离效果，超顺磁纳米颗粒和配体的复合物为超顺磁纳米颗粒-配体复合物，选择超顺磁纳米颗粒与激活的硫醇基配体反应制备，配体与2-亚氨基四氢噻吩反应得到激活的硫醇基配体，或者超顺磁纳米颗粒-聚乙二醇-配体复合物，选择聚乙二醇化的超顺磁纳米颗粒与激活的硫醇基配体反应制备，氨基官能化的超顺磁性Fe3O4纳米颗粒与活性酯聚乙二醇马来酰亚胺进行反应，以实现超顺磁纳米颗粒的聚乙二醇化；配体与2-亚氨基四氢噻吩反应得到激活的硫醇基配体。
8.根据权利要求7所述的一种基于联合法分离外泌体的方法，其特征在于，配体采用CD63抗体、CD9抗体、CD81抗体、CD82抗体、ALIX抗体、Tsg101抗体或者转铁蛋白中的一种；在超顺磁纳米颗粒的聚乙二醇化中，活性酯聚乙二醇马来酰亚胺的数均分子量为1000-100000，磁分离时间为10-5000min；优选活性酯聚乙二醇马来酰亚胺的数均分子量为4000-10000，磁分离时间为60-200min；配体与2-亚氨基四氢噻吩以摩尔比为(1-10000)：(1-10000)，优选(10-1000)：(10-1000)，更加优选(10—100)：(600—1000)；氨基官能化的超顺磁性Fe3O4纳米颗粒与活性酯聚乙二醇马来酰亚胺的摩尔比为(1-10000)：(1-10000)，优选(10-1000)：(10-1000)，更加优选(10—100)：(500—1000)。
9.如权利要求1所述的方法得到的外泌体在制备治疗剂载体中的应用。
10.如权利要求7所述的方法得到的外泌体在制备靶向治疗药物载体中的应用。
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