CN115108865A - 一种绿色复合生物刺激素及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物刺激素领域，具体涉及一种绿色复合生物刺激素及其制备方法。采用温和无刺激的酶解法从渔业废弃物中提取寡肽，壳寡糖和虾青素，通过喷雾干燥的方法得到配比均衡，品质稳定的复合生物刺激素。其中寡肽和壳寡糖均可作为螯合剂，与不同微量元素如铁，锌，铜等不同微量元素进行螯合，能够针对性地解决植物生长问题。本发明中所用原料均通过渔业废弃物所得，具有安全环保，绿色可降解等特点。本发明中的生物刺激素是一种能够迅速完全溶解于水中的全营养复合生物制剂，可以通过被喷施或冲施作用于植物体，具有提高植物抗逆性，保水保湿，促进营养吸收，并在提高植物品质的同时改善土壤理化性质。

Description

一种绿色复合生物刺激素及其制备方法

技术领域

本发明属于生物刺激素领域，具体涉及一种绿色复合生物刺激素及其制备方法。

背景技术

作为农业生产大国，在农业种植中化肥、农药等广泛使用，在保障了农业生产需求的同时，造成了生态环境及食品安全等问题。过量使用化肥农药会造成土壤性状恶化，产品品质下降，环境污染和产收比差距大。生物刺激素是从天然或生物来源提取的，可以通过提高植物营养物质的吸收，减少养分流失；或者作为土壤改良剂以改善土壤的结构或功能，从而刺激植物响应，促进植物生长发育，具有增产，改善植物品质。增强植物抗逆性等功效。

常见的生物刺激素包括氨基酸和蛋白质水解物，甲壳素和壳聚糖衍生物，腐殖酸，海藻提取物和微生物代谢产物等几大类。根据其不同的作用机制及应用方式，在农业中应用广泛。其中，氨基酸和蛋白质水解物类生物刺激素来源广泛，主要应用于植物叶片，能够起到促进植物光合作用的效果。例如谷氨酸和赖氨酸可以通过增加叶绿素合成的方式促进植物生长发育，提高作物的含糖量；赖氨酸能够加快叶绿素合成，提高作物的抗旱性；而丝氨酸则能够通过参与细胞组织分化，起到促进种子萌芽的作用。除了对植物生长起到积极促进作用，氨基酸类生物刺激素还可以作用于土壤，改善作物的生态环境，抑制病虫害。甲壳素和壳聚糖衍生物广泛存在于虾蟹及甲壳动物中，是一种可再生的天然高分子聚合物。壳聚糖是甲壳素的脱乙酰基、脱钙、脱蛋白质产物，其衍生物——壳寡糖因水溶性好、易吸收常被用于叶面喷施。目前甲壳素和壳聚糖衍生物类的生物刺激素主要用来调节土壤菌落平衡，促进有益微生物的生长，对多种真菌、细菌和病毒产生免疫和杀灭作用，并且能够诱导植物的抗病性，提高植物对非生物胁迫的耐受性。虾青素作为一种非维生素A原的类胡萝卜素，虾青素在动物体内不能转变为维生素A，但具有与类胡萝卜素相同的抗氧化作用，它淬灭单线态氧和捕捉自由基的能力比β-胡萝卜素高10余倍，比维生素E强100多倍，人们又称其“超级维生素E”，虾青素提取方式便利，广泛存在于虾、蟹、鱼、鸟、某些藻类及真菌等生物中。施用于农作物具有抗氧化，防植株早衰增色膨果等效用。

目前对于生物刺激素的研究尚浅，并未实现稳定地商业化发展，主要原因是其影响因素复杂，一定程度上阻碍了生物刺激素大量的研发与应用。而不同的生物刺激素功能性大不相同，各自具有不同的优势，因此采用复合的方式能够最大化地利用其各自的功能和优势。

作为一个农业大国，新型生物刺激素由于其制作工艺节能低碳、无化学品添加、且由全生物有机物质复配而成等优势，将从根本上减少能源消耗，成为一种低碳环保的新兴产品。但产品还不够普及，市场产量较少。

CN201610660041.2公开了一种生物刺激素含氨基酸水溶肥的制备方法：将松土剂，润湿渗透剂，生根剂和生物刺激素加入含氨基酸水溶肥，在提高肥料利用率的同时刺激根系生长。

CN201910153885.1公开了一种果树花卉蔬菜专用的新型生物肥料及其制备方法：茶粕 1-20份；无患子果肉1-20份；野鸦椿种子粕1-20份；家畜粪便1-20份；食用菌下脚料1-20 份。利用微生物下脚料与植物果实相结合制备的生物肥料具有解磷、解钾、固氮的作用，促进土壤中微量元素的释放及螯合，可提高肥料利用率10％～30％。在一定的条件下，还能参与腐殖质形成，有利于提高土壤肥力。

CN201910763188.8公开了一种适于棉花的生物刺激素复配剂及制备方法和应用：生物刺激素复配剂由氨基酸、聚谷氨酸、腐植酸钾和水组成，其制备步骤是：1)发酵制备聚谷氨酸发酵液，然后对进行紫外灭活；2)制备可溶解于水的腐植酸钾；3)将氨基酸粉加入到聚谷氨酸溶液中；4)将制备的腐植酸钾加入到3中的溶液中，超声振荡器乳化，形成悬浮的生物刺激素复配剂。

以上现有技术涉及生物刺激素，存在缺点如下：1、单一的生物刺激素营养作用以及螯合作用有限；2、不够绿色环保；3、生物刺激素与生根剂等营养素复合确实能够提升其利用效率，但仅针对生根效用，且液体水溶肥的产品形式对储存与运输均带来一定限制。

发明内容

为解决上述现有技术存在的问题，本发明提供一种绿色复合生物刺激素的制备方法，包括如下步骤：

S1：制备寡肽、壳寡糖和虾青素；

所述寡肽由预处理后的鱼鳞经碱性蛋白酶酶解得到；

所述壳寡糖由溶解后的壳聚糖中加入果胶酶，微波辐射后进行加热反应后得到；

所述虾青素由虾壳经蛋白酶水解后除杂后得到；

S2：将所述寡肽、壳聚糖和虾青素按照1-40：1-30：1-30的质量比混合，得到混合刺激素；

S3：将所述混合刺激素、助剂和水混合，得到绿色复合生物刺激素溶液；

S4：将所述绿色复合生物刺激素溶液雾化，得到所述绿色复合生物刺激素。

所述碱性蛋白酶的CAS号为9014-01-1，果胶酶的CAS号为9032-75-1，蛋白酶的CAS号为9001-73-4，上述产品均购自嘉兴德尔塔生物技术有限公司。

优选的，所述助剂为表面活性剂，如Tween 80。

优选的，所述步骤S1中，寡肽的制备过程中，酶解的时间为1-2h，pH为6.5-8.5。

优选的，所述步骤S1中，壳寡糖的制备过程中，微波辐射的功率为500-520W，时间为 1-3min。

优选的，所述步骤S1中，壳寡糖的制备过程中，壳聚糖溶解于乙酸－乙酸钠缓冲溶液中。

优选的，所述步骤S1中，壳寡糖的制备过程中，反应的时间为1-2h，温度为45-55℃， pH为4.3-4.5。

优选的，所述步骤S1中，壳寡糖的制备过程中，反应后将溶液加热至90-100℃，保持 8-12min后过滤。

优选的，所述步骤S1中，虾青素的制备过程中，水解的时间为1-2h，温度为30-40℃。

进一步地，所述步骤S1中，虾青素的制备过程中，除杂的方法为：将水解后的虾壳过滤，得到的沉淀物用水清洗。

优选的，所述步骤S3中，混合刺激素、助剂和水的质量比为0.5-5：0.1-2：100。

优选的，所述步骤S3中，混合的温度为30-60℃。

进一步地，所述步骤S4中，雾化的方法为喷雾干燥法。

本发明还提供一种上述制备方法制备得到的绿色复合生物刺激素。

针对上述问题，本项目积极加以创新，采用温和有效的酶解法从渔业废弃物中提取的新型营养素寡肽、壳寡素和虾青素，利用喷雾干燥技术制备成成分功效稳定，能够完全迅速溶解于水中的全营养复合生物制剂。不同于液体水溶肥，共混均匀、配比精确的生物刺激素粉体复合肥在储存，运输和使用方面均更加方便。

本产品在技术与性能上较同类产品比有较大优势，且深度契合低碳环保概念，因此具有极大的市场前景和发展空间。

本发明的技术方案相比现有技术具有以下优点：

与已经在市场上销售的化肥相比具有绿色天然，无有害化学成分等特点。本技术中的复合生物刺激素是一种能够迅速完全溶解于水中的全营养复合生物制剂，无任何残留，养分能够被作物方便快捷地吸收且利用率很高，具有施用简单、见效迅速、作物吸收利用率高、安全性好和适用性广等优点。在农业生产中的技术效果包括：

(1)提高光合作用速率，促进作物生长；

(2)充分调动作物固有的潜在抗逆能力；

(3)调动作物本身的再生能力和修复功能；

(4)增加作物的抗氧化活性物含量，提高作物抗早衰能力等一系列作用。

同普通的生物刺激素相比，本发明技术制备得到的绿色复合生物刺激素具有以下优势：

1、将氨基酸，多糖以及强抗氧化剂相结合，使得复合生物刺激素营养价值更加全面；

2、其中寡肽和壳寡糖均可作为螯合剂，与虾青素中的不同微量元素如铁，锌，铜等进行螯合，能够更加有针对性地解决植物生长问题。且螯合状态更加稳定，能够长效且多样化地给植物供给营养。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。

实施例1

1)寡肽提取：将鱼鳞洗净，去除杂质，称重后加入3倍量的水浸泡2h，后加入50％工业级盐酸反应10h。清洗干净，调节pH至7.5，加入0.3％碱性蛋白酶酶解2h，过滤后得到小分子胶原蛋白肽溶液。取1ml小分子胶原蛋白肽溶液至于小安培瓶中，加入12mol/L的盐酸1ml，于喷灯火焰上封口，置于110℃的干燥箱内水解20h。将安培瓶中的水解液倒入蒸发皿，置于沸水浴上加热以去除盐酸。将水解液蒸干后的残留物溶解于1ml 10％的异丙醇中，用氨基酸自动分析仪进行测定，标准参照GB/T 17419-1998中4.1的相关规定。根据氨基酸测定结果，将小分子胶原蛋白肽溶液稀释到适当浓度，使其分子量在3000左右，调节pH 至7.5左右。

2)壳寡糖的制备：准确称取0.1g壳聚糖，溶解于0.2mol/L的乙酸－乙酸钠缓冲溶液中，配制成浓度2％(w/v)的胶体溶液，加入2100U/g的果胶酶，采用510W的微波辐射2 min后，酶解反应1h，酶解温度为50℃，反应体系pH为4.4。反应完成后将反应液煮沸 10min后过滤。

3)虾青素提取：从渔业废弃物中取虾壳，加入缓冲液混合，在恒温水浴中用蛋白酶水解 1h，过滤后将沉淀物反复用水清洗，去除矿物质。沉淀物中加入丙酮，经过超声波清洗10min，常温振荡1h后，使用冷冻离心机离心10min，取上清液进行理化测定。

4)将寡肽、壳寡糖和虾青素加入到含有助剂的水中，助剂和水的质量比为1：100，复合生物刺激素与含有助剂的水的质量比为3：100，加热至45℃，使其完全溶解，得到复合生物刺激素溶液。

5)用喷雾干燥法处理以上制备所得的复合生物刺激素溶液，通过雾化，干燥和物料收集等步骤制备成复合生物刺激素粉末后封装销售。

实施例2

1)寡肽提取：将鱼鳞洗净，去除杂质，称重后加入3倍量的水浸泡2h，后加入50％工业级盐酸反应10h。清洗干净，调节pH至7.5，加入0.3％碱性蛋白酶酶解2h，过滤后得到小分子胶原蛋白肽溶液。取1ml小分子胶原蛋白肽溶液至于小安培瓶中，加入12mol/L的盐酸1ml，于喷灯火焰上封口，置于110℃的干燥箱内水解20h。将安培瓶中的水解液倒入蒸发皿，置于沸水浴上加热以去除盐酸。将水解液蒸干后的残留物溶解于1ml 10％的异丙醇中，用氨基酸自动分析仪进行测定，标准参照GB/T 17419-1998中4.1的相关规定。根据氨基酸测定结果，将小分子胶原蛋白肽溶液稀释到适当浓度，使其分子量在1000左右，调节pH 至6.5。

2)壳寡糖的制备：准确称取0.1g壳聚糖，溶解于0.2mol/L的乙酸－乙酸钠缓冲溶液中，配制成浓度2％(w/v)的胶体溶液，加入2100U/g的果胶酶，采用510W的微波辐射2 min后，酶解反应1h，酶解温度为50℃，反应体系pH为4.4。反应完成后将反应液煮沸 10min后过滤。

3)虾青素提取：从渔业废弃物中取虾壳，加入缓冲液混合，在恒温水浴中用蛋白酶水解 1h，过滤后将沉淀物反复用水清洗，去除矿物质。沉淀物中加入丙酮，经过超声波清洗10min，常温振荡1h后，使用冷冻离心机离心10min，取上清液进行理化测定。

4)将寡肽、壳寡糖和虾青素加入到含有助剂的水中，助剂和水的质量比为0.1：100，复合生物刺激素与含有助剂的水的质量比为0.5：100，加热至30℃，使其完全溶解，得到复合生物刺激素溶液。

5)用喷雾干燥法处理以上制备所得的复合生物刺激素溶液，通过雾化，干燥和物料收集等步骤制备成复合生物刺激素粉末后封装销售。

实施例3

1)寡肽提取：将鱼鳞洗净，去除杂质，称重后加入3倍量的水浸泡2h，后加入50％工业级盐酸反应10h。清洗干净，调节pH至7.5，加入0.3％碱性蛋白酶酶解1.5h，过滤后得到小分子胶原蛋白肽溶液。取1ml小分子胶原蛋白肽溶液至于小安培瓶中，加入12mol/L的盐酸1ml，于喷灯火焰上封口，置于110℃的干燥箱内水解20h。将安培瓶中的水解液倒入蒸发皿，置于沸水浴上加热以去除盐酸。将水解液蒸干后的残留物溶解于1ml 10％的异丙醇中，用氨基酸自动分析仪进行测定，标准参照GB/T 17419-1998中4.1的相关规定。根据氨基酸测定结果，将小分子胶原蛋白肽溶液稀释到适当浓度，使其分子量在1000-5000之间，调节pH至6.5至8.5之间。

2)壳寡糖的制备：准确称取0.1g壳聚糖，溶解于0.2mol/L的乙酸－乙酸钠缓冲溶液中，配制成浓度2％(w/v)的胶体溶液，加入2100U/g的果胶酶，采用505W的微波辐射3min后，酶解反应1.5h，酶解温度为55℃，反应体系pH为4.5。反应完成后将反应液煮沸12min 后过滤。

3)虾青素提取：从渔业废弃物中取虾壳，加入缓冲液混合，在恒温水浴中用蛋白酶水解1h，过滤后将沉淀物反复用水清洗，去除矿物质。沉淀物中加入丙酮，经过超声波清洗10min，常温振荡1h后，使用冷冻离心机离心10min，取上清液进行理化测定。

4)将寡肽、壳寡糖和虾青素加入到含有助剂的水中，助剂和水的质量比为2：100，复合生物刺激素与含有助剂的水的质量比为5：100，加热至62℃，使其完全溶解，得到复合生物刺激素溶液。

5)用喷雾干燥法处理以上制备所得的复合生物刺激素溶液，通过雾化，干燥和物料收集等步骤制备成复合生物刺激素粉末后封装销售。

实施例4

1)寡肽提取：将鱼鳞洗净，去除杂质，称重后加入3倍量的水浸泡2h，后加入50％工业级盐酸反应10h。清洗干净，调节pH至7.5，加入0.3％碱性蛋白酶酶解1.8h，过滤后得到小分子胶原蛋白肽溶液。取1ml小分子胶原蛋白肽溶液至于小安培瓶中，加入12mol/L的盐酸1ml，于喷灯火焰上封口，置于110℃的干燥箱内水解20h。将安培瓶中的水解液倒入蒸发皿，置于沸水浴上加热以去除盐酸。将水解液蒸干后的残留物溶解于1ml 10％的异丙醇中，用氨基酸自动分析仪进行测定，标准参照GB/T 17419-1998中4.1的相关规定。根据氨基酸测定结果，将小分子胶原蛋白肽溶液稀释到适当浓度，使其分子量在1000-5000之间，调节pH至6.5至8.5之间。

2)壳寡糖的制备：准确称取0.1g壳聚糖，溶解于0.2mol/L的乙酸-乙酸钠缓冲溶液中，配制成浓度2％(w/v)的胶体溶液，加入2100U/g的果胶酶，采用518W的微波辐射2min后，酶解反应1h，酶解温度为52℃，反应体系pH为4.5。反应完成后将反应液煮沸10min 后过滤。

3)虾青素提取：从渔业废弃物中取虾壳，加入缓冲液混合，在35℃恒温水浴中用蛋白酶水解1h，过滤后将沉淀物反复用水清洗，去除矿物质。沉淀物中加入丙酮，经过超声波清洗10min，常温振荡1h后，使用冷冻离心机离心10min，取上清液进行理化测定。

4)将寡肽、壳寡糖和虾青素加入到含有助剂的水中，助剂和水的质量比为2：100，复合生物刺激素与含有助剂的水的质量比为5：100，加热至61℃，使其完全溶解，得到复合生物刺激素溶液。

5)用喷雾干燥法处理以上制备所得的复合生物刺激素溶液，通过雾化，干燥和物料收集等步骤制备成复合生物刺激素粉末后封装销售。

实施例5

1)寡肽提取：将鱼鳞洗净，去除杂质，称重后加入3倍量的水浸泡2h，后加入50％工业级盐酸反应10h。清洗干净，调节pH至7.5，加入0.3％碱性蛋白酶酶解2h，过滤后得到小分子胶原蛋白肽溶液。取1ml小分子胶原蛋白肽溶液至于小安培瓶中，加入12mol/L的盐酸1ml，于喷灯火焰上封口，置于110℃的干燥箱内水解20h。将安培瓶中的水解液倒入蒸发皿，置于沸水浴上加热以去除盐酸。将水解液蒸干后的残留物溶解于1ml 10％的异丙醇中，用氨基酸自动分析仪进行测定，标准参照GB/T 17419-1998中4.1的相关规定。根据氨基酸测定结果，将小分子胶原蛋白肽溶液稀释到适当浓度，使其分子量在1000-5000之间，调节pH至6.5至8.5之间。

2)壳寡糖的制备：准确称取0.1g壳聚糖，溶解于0.2mol/L的乙酸－乙酸钠缓冲溶液中，配制成浓度2％(w/v)的胶体溶液，加入2100U/g的果胶酶，采用510W的微波辐射2 min后，酶解反应1h，酶解温度为48℃，反应体系pH为4.4。反应完成后将反应液煮沸10 min后过滤。

3)虾青素提取：从渔业废弃物中取虾壳，加入缓冲液混合，在40℃恒温水浴中用蛋白酶水解1h，过滤后将沉淀物反复用水清洗，去除矿物质。沉淀物中加入丙酮，经过超声波清洗10min，常温振荡1h后，使用冷冻离心机离心10min，取上清液进行理化测定。

4)将寡肽、壳寡糖和虾青素加入到含有助剂的水中，助剂和水的质量比为2：100，复合生物刺激素与含有助剂的水的质量比为5：100，加热至55℃，使其完全溶解，得到复合生物刺激素溶液。

5)用喷雾干燥法处理以上制备所得的复合生物刺激素溶液，通过雾化，干燥和物料收集等步骤制备成复合生物刺激素粉末后封装销售。

实施例6

在生长期对油菜进行复合生物刺激素叶面肥喷施，稀释约1000倍后每周喷施一次，对照组为市售肥。

种植试验结果表明：与对照组相比，使用实施例1-2的复合生物刺激素能够对生长期的油菜在株重方面提升200％左右，平均根长提升约30％左右。

显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

Claims (10)

1.一种绿色复合生物刺激素的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1：制备寡肽、壳寡糖和虾青素；

所述寡肽由预处理后的鱼鳞经碱性蛋白酶酶解得到；

所述壳寡糖由溶解后的壳聚糖中加入果胶酶，微波辐射后进行加热反应后得到；

所述虾青素由虾壳经蛋白酶水解后除杂后得到；

S2：将所述寡肽、壳聚糖和虾青素按照1-40：1-30：1-30的质量比混合，得到混合刺激素；

S3：将所述混合刺激素、助剂和水混合，得到绿色复合生物刺激素溶液；

S4：将所述绿色复合生物刺激素溶液雾化，得到所述绿色复合生物刺激素。

2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤S1中，寡肽的制备过程中，酶解的时间为1-2h。

3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤S1中，壳寡糖的制备过程中，微波辐射的功率为500-520W，时间为1-3min。

4.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤S1中，壳寡糖的制备过程中，壳聚糖溶解于乙酸－乙酸钠缓冲溶液中。

5.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤S1中，壳寡糖的制备过程中，加热反应的时间为1-2h，温度为45-55℃，pH为4.3-4.5。

6.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤S1中，壳寡糖的制备过程中，反应后将溶液加热至90-100℃，保持8-12min后过滤。

7.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤S1中，虾青素的制备过程中，水解的时间为1-2h，温度为30-40℃。

8.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤S3中，混合刺激素、助剂和水的质量比为0.5-5：0.1-2：100。

9.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤S4中，雾化的方法为喷雾干燥法。

10.一种由权利要求1-9中任一项所述的制备方法制备得到的绿色复合生物刺激素。