CN115105523B - 芜菁中性多糖brnp对细胞的氧化损伤保护作用 - Google Patents

Abstract

本发明属于芜菁中性多糖应用技术领域，具体涉及一种芜菁中性多糖BRNP对细胞的氧化损伤保护作用。具体表现为所述芜菁中性多糖BRNP用于抑制H₂O₂的抗氧化作用，保护细胞形态，减少氧化应激损伤导致的细胞凋亡，降低细胞中乳酸脱氢酶含量，调节Bax、Bcl‑2、caspase‑3的表达水平，抗衰老。本发明的研究结果表明芜菁中性多糖在制备抗氧化相关产品中具有很好的应用价值。

Description

芜菁中性多糖BRNP对细胞的氧化损伤保护作用

技术领域

本发明属于芜菁中性多糖应用技术领域，具体涉及一种芜菁中性多糖BRNP对细胞的氧化损伤保护作用。

背景技术

芜菁(Brassica rapa L.)，是药食兼用碱性植物，属十字花科芸蔓属(Brassica)芸蔓种芜菁，以块根入药。临床使用具有滋阴润肺、健胃消食、软便利尿、排除多余体液的功能，对肺部和胃病有保健和预防作用，增强体质等功效。近代药理研究还发现，芜菁具有抗氧化、抗辐射、预防心血管疾病等功效。

多糖具有装载丰富生物信息的能力，是天然产物中含量最丰富的物质。研究表明，多糖具有提高机体免疫力、抗炎、抗病毒、抗肿瘤等作用，且多糖类药物副反应小，具有一定的靶向性，而且可以明显降低使用剂量，已被广泛用于基础医药和保健食品，在疾病研究以及新药研发等方面极具吸引力，具有广阔的发展空间。

我们前期研究了芜菁中性多糖在制备抗氧化药物中的应用，具体的，我们研究的是芜菁中性多糖在提高血清、肝脏组织和脑组织中超氧化物歧化酶活性的用途，以及芜菁中性多糖在提高过氧化氢酶活性、谷胱甘肽活性以及谷胱甘肽过氧化物酶活性方面的应用，可以显著降低丙二醛的含量。这些研究证明了芜菁中性多糖可以提高某些物质的活性，但是其仅限于对血清、肝脏组织以及脑组织方面的抗氧化用途，应用范围仍较窄，需要进一步扩大芜菁中性多糖的用途。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明提供了一种芜菁中性多糖BRNP对细胞的氧化损伤保护作用。

本发明的目的是提供一种芜菁中性多糖BRNP对细胞的氧化损伤保护作用，

优选的，上述芜菁中性多糖BRNP对细胞的氧化损伤保护作用，所述细胞为PC12细胞。

优选的，上述芜菁中性多糖BRNP对细胞的氧化损伤保护作用，所述芜菁中性多糖BRNP用于制备抑制H₂O₂的抗氧化作用的产品。

优选的，上述芜菁中性多糖BRNP对细胞的氧化损伤保护作用，所述芜菁中性多糖BRNP用于制备保护细胞形态的产品。

优选的，上述芜菁中性多糖BRNP对细胞的氧化损伤保护作用，所述芜菁中性多糖BRNP用于制备减少氧化应激损伤导致的细胞凋亡的产品。

优选的，上述芜菁中性多糖BRNP对细胞的氧化损伤保护作用，所述芜菁中性多糖BRNP用于制备降低细胞中乳酸脱氢酶含量的产品。

优选的，上述芜菁中性多糖BRNP对细胞的氧化损伤保护作用，所述芜菁中性多糖BRNP用于制备调节Bax、Bcl-2、caspase-3的表达水平的产品。

优选的，上述芜菁中性多糖BRNP对细胞的氧化损伤保护作用，所述芜菁中性多糖BRNP用于制备降低Bax、caspase-3表达水平的产品。

优选的，上述芜菁中性多糖BRNP对细胞的氧化损伤保护作用，所述芜菁中性多糖BRNP用于制备提高Bcl-2表达水平的产品。

优选的，上述芜菁中性多糖BRNP对细胞的氧化损伤保护作用，所述芜菁中性多糖BRNP用于制备抗衰老的产品。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明选用CCK8法对H₂O₂建立细胞衰老模型的条件进行探索，同时考察BRNP对PC12细胞衰老模型的保护作用。CCK8实验结果表明随着H₂O₂浓度的增加，PC12细胞存活率显著下降，并呈剂量依赖性。当H₂O₂浓度为300μM作用4h时细胞存活率为60％，此时PC12细胞受到一定程度的损伤，但还没达到不可逆转的状态，故选择300μM作用4h作为PC12细胞氧化损伤浓度。

本发明的研究发现芜菁中性多糖BRNP对细胞的氧化损伤保护作用，具体表现为所述芜菁中性多糖BRNP用于抑制H₂O₂的抗氧化作用，保护细胞形态，减少氧化应激损伤导致的细胞凋亡，降低细胞中乳酸脱氢酶含量，调节Bax、Bcl-2、caspase-3的表达水平，抗衰老。结果表明芜菁中性多糖在制备抗氧化相关产品中具有很好的应用价值。

附图说明

图1为不同浓度BRNP对PC12细胞的细胞毒性作用(x±s，n＝3)；

图2为不同浓度的H₂O₂处理4h对PC12细胞活性的影响(x±s，n＝3)；

图3为不同浓度的H₂O₂处理6h对PC12细胞活性的影响(x±s，n＝3)；

图4为不同浓度BRNP对H₂O₂诱导的PC12的保护作用(x±s，n＝3)；

图2-4中，与正常对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与模型组比较，#P＜0.05，##P＜0.01；

图5为不同浓度BRNP对PC12细胞中LDH含量的影响；

图6为芜菁中性多糖BRNP(浓度为250μg·mL^-1)对PC12细胞线粒体膜电位的影响；

图7为不同浓度BRNP对PC12细胞内凋亡靶标蛋白表达的影响；

图5和图7中，A：正常组(正常细胞)；B：模型组(BRNP浓度为0)；C：低剂量组(BRNP浓度为62.5μg·mL^-1)；D：中剂量组(BRNP浓度为125μg·mL^-1)；E：高剂量组(BRNP浓度为250μg·mL^-1)；

图8为不同剂量BRNP对PC12细胞内凋亡靶标蛋白表达的影响；

对于Bax、Bcl-2、Caspase-3，从左到右的柱形代表的样品均依次为正常组(正常细胞)、模型组(BRNP浓度为0)、低剂量组(BRNP浓度为62.5μg·mL^-1)、中剂量组(BRNP浓度为125μg·mL^-1)、高剂量组(BRNP浓度为250μg·mL^-1)。

具体实施方式

为了使本领域技术人员更好地理解本发明的技术方案能予以实施，下面结合具体实施例和附图对本发明作进一步说明。

在本发明的描述中，如未特殊说明，所用试剂均为市售，所用方法均为本领域常规技术。

实施例1芜菁中性多糖BRNP对PC12细胞的氧化损伤保护作用

1、实验材料与仪器

1.1实验材料

芜菁中性多糖：制备方法参照“陈卓尔.维药恰***多糖结构特征及其免疫活性的初步研究[D].新疆医科大学,2017”。

DMEM高糖培养基(Hyclone，批号SH30023.01)、胎牛血清(gibco，批号1802677)、PBS(普诺赛，批号WH01122009XP02)、双抗(Hyclone，批号SV30010)、胰蛋白酶(gibco，批号25200-056)、Hoechst染料(碧云天公司，批号C0003)、CCK-8(bioshap公司，批号BS350B)、乳酸脱氢酶(LDH)试剂盒(南京建成生物工程研究所，批号A020-2-2)、JC-1试剂盒(碧云天公司，批号C2006)；4×蛋白上样缓冲液(Solarbio，批号P1016)；BCA蛋白浓度检测试剂盒(Thermo，批号23235)；三羟甲基氨基甲烷Tris(Biofroxx，批号1115GR500)；甘氨酸(Biofroxx，批号1175GR500)；十二烷基硫酸钠SDS(Biofroxx，批号3250GR500)；10％SDS-PAGE凝胶快速制备试剂盒(北京博泰斯生物技术有限公司，批号WB2103)；预染蛋白(北京博泰斯生物技术有限公司，批号WB1902)；脱脂奶粉(Biofroxx，批号1172GR100)；20×TBST缓冲液(Solarbio，批号T1082)；聚偏二氟乙烯(PVDF)膜(millpore，批号ISEQ00010 PORE)；超信号显色剂(biosharp，批号BL520A)；凝胶成像仪(proteinsimple,型号FluroChem E)；无水乙醇、甲醇(天津市富宇精细化工有限公司，均为分析纯)。

1.2仪器

高速低温离心机(德国Eppendorf，型号Centrifuge 5424R)；电泳槽(美国BIORAD，型号MININTRANS-BL01)；水平摇床(北京六一仪器，型号WD-9405B)；电泳仪(美国BIORAD，型号1645058powerpac HC)；恒温水浴锅(上海，型号HWS-11)；凝胶成像仪(美国BIO-RAD，型号geldoc EZ)。

2、试验方法

2.1溶液的配制

细胞培养液的配制：在培养基中加入体积分数10％的血清和体积分数1％的双抗(血清和双抗提前无菌分装，避免反复冻融，影响活性)。

2.2 PC12细胞的复苏、培养、传代、冻存

PC12细胞用完全培养基复苏后，于温度为37℃、含5％CO₂的培养箱培养。24h后在显微镜下观察细胞贴壁状态，待其贴壁50％以上时，于超净台内吸弃培养瓶内液体，换入新鲜的完全培养基，继续在温度为37℃、含5％CO₂的培养箱培养。

待细胞长满瓶底90％左右时，在超净台内吸弃液体，加入0.5mL 0.25％的胰蛋白酶消化1min，待细胞些许脱落后，加入1mL完全培养基，用移液枪吸头轻轻吹打至细胞完全脱落，并转移至无菌离心管，于1000r·min^-1离心5min后，吸弃上清液，加入3mL完全培养基，吹打均匀后，分别以1mL每瓶转移至培养瓶内，再分别加入3mL完全培养基后，完成细胞传代，并于温度为37℃、含5％CO₂的培养箱培养。

将细胞消化离心后，吸弃上清液，加入适量冻存液(冻存液的配制：完全培养液：FBS：DMSO＝6:3:1，v/v/v)，吹打均匀后，以每管1mL转移至冻存管内，标注后用封口膜封口，放入4℃冰箱25min，转移至-20℃冰箱冷冻1.5h，再转移至-80℃冰箱冷冻过夜，于第二日放入液氮罐内储存备用。

3、实验方法

3.1 BRNP对PC12细胞的毒性影响

取对数生长期的PC12细胞，按照常规步骤消化、离心、重悬，加完全培养基制成细胞混悬液后，计数，调整细胞浓度为1×10⁵个·mL^-1，按照100μL每孔分别接种96孔板，共设11组，每组5复孔，其中1组为正常对照组，9组分别为7.8、15.6、31.2、62.5、125、250、500、1000、2000μg·mL^-1的多糖药物干预组，再设1组作为空白调零组只含培养基，置于培养箱孵育24h(细胞悬液要垂直加入孔中央，避免边缘聚集；应用PBS填充边缘孔，减少培养基蒸发)。待细胞完全贴壁，吸出旧培养基，将上述浓度多糖药物以100μL每孔加入到96孔板多糖药物干预组中，其余组加入新的培养基，继续培养24h。于第二日该时间段加入含10％的CCK-8稀释液100μL每孔，避光孵育1h，在450nm检测各孔OD值。计算各组吸光度值的平均值，并按公式“细胞活力＝(给药组平均OD值-调零组平均OD值)/(对照组平均OD值-调零组平均OD值)×100％”计算细胞存活率，以芜菁中性多糖BRNP浓度为横轴，细胞活力为纵轴绘制出曲线。

3.2过氧化氢损伤PC12细胞模型的构建

PC12细胞培养至贴壁80％后，收集状态良好的细胞，按照“2.2”实验步骤常规消化、重悬、计数。调整细胞悬液中细胞密度为1×10⁵/ml，按照每孔100μl的培养体系，接种于96孔板。分为调零组、对照组、H₂O₂实验组，调零组每组加入100μl完全培养基。对照组及H₂O₂组均加入100μl细胞悬液，每组5个复孔。然后放入培养箱中接近水源处。注意：每次加细胞悬液时都要垂直加入孔中央，避免边缘聚集；边缘孔要用PBS填充，减少培养液蒸发。24h后观察，细胞贴壁生长，状态良好，调零组和对照组每孔加入100μl PBS，H₂O₂实验组分别加入终浓度为50μM、100μM、150μM、200μM的H₂O₂稀释液100μl/孔。然后，继续放入培养箱中培养2h。相应损伤时间后，在倒置相差显微镜下观察细胞状态，并拍下各组PC12细胞的生长形态。弃去旧培养液，用PBS轻轻清洗2次，分别加入10％CCK-8稀释液100μl/孔，培养箱中接着孵育2h后，在酶标仪450nm波长处检测吸光度值。求出各组吸光度值的平均值。并以H₂O₂浓度为横轴OD值为纵轴绘制曲线。

3.3芜菁中性多糖对过氧化氢诱导的PC12细胞的影响

依据细胞建模实验所得到的结果，本实验选用300μM H₂O₂稀释液作用于PC12细胞4h从而建立氧化应激细胞模型。采用96孔板培养细胞。为了探讨芜菁中性多糖对过氧化氢诱导的PC12细胞的影响，我们收集处于对数生长期的PC12细胞，以1×10⁵/ml的密度接种到96孔板中。观察细胞生长情况，待细胞铺满瓶底70％左右时，弃去旧培养液，对照组不做特殊处理。处理组每组分别加入不同浓度的多糖溶液预处理24h，再加入300μM H₂O₂稀释液共同孵育4h。处理结束后进行CCK-8实验，CCK-8实验具体方法同“3.2”。

3.4乳酸脱氢酶(LDH)含量测定

当细胞受损时，细胞内的乳酸脱氢酶(LDH)便会透过细胞膜释放到培养液中，且LDH比较稳定，因此被广泛用于评估组织和细胞的损伤程度。将PC12细胞(1×10⁵个·mL^-1)接种到6孔板中，进行分组处理(参见表1)。根据试剂盒的说明书进行操作，用酶标仪在450nm波长下测定各孔的吸光度，计算LDH的漏出率。

表1乳酸脱氢酶(LDH)含量测定操作表

各组按照表1的配方混匀，室温放置5min，波长450nm，酶标仪测定吸光度。

3.5芜菁中性多糖BRNP对PC12细胞线粒体膜电位的影响

按“3.3”方法接种并药物干预PC12细胞并同法处理细胞后，按试剂盒说明书配制1×JC-1染色缓冲液，每管分别加入0.5mL 1×JC-1染色缓冲液，混合均匀后，在37℃培养箱避光孵育30min，孵育后以1200r·min^-1离心4min，弃去上清液，分别加入预先在冰上配好的缓冲液1mL，混匀后，以1200r·min^-1离心3min，如此洗涤细胞2-3次，洗去多余染色液，最后加入0.5mL 1×JC-1缓冲液混匀后，300目细胞筛过滤，激光共聚焦显微镜下细胞测定线粒体膜电位损失荧光强弱。

3.6 Western blot法检测BRNP对PC12细胞凋亡蛋白靶标

3.6.1样品中蛋白的提取及浓度测定

按“3.3”方法接种并药物干预PC12细胞后，每孔加入预冷的PBS 1mL洗一遍，加入胰酶消化后，再各加培养液0.5mL终止消化，转移至2mL EP管，1000r·min^-1离心5min，弃去上清液，各加100μL细胞裂解液(蛋白酶抑制：1×RIPA缓冲液＝1:100，v/v)，迅速混匀后置于冰盒中在摇床轻摇10min，后在4℃以15000r·min^-1离心15min，并取上层清液于无菌无酶的2mL EP管中，置于冰上备用。取BCA蛋白浓度检测试剂盒中的A试剂与B试剂配制混合工作液适量(VA:VB＝50:1)，再取蛋白浓度测定标准品按下述方法操作配制标准品系列浓度：

3.6.2胶板制备：(1)制胶：选用SDS-PAGE凝胶制备试剂盒，按所用目的蛋白分子量选择10％分离胶进行制胶工作。先将制胶板及玻璃板用洗洁精清洗干净后，用ddH₂O吹洗再使其自然晾干，夹好玻璃板备用。(2)分离胶：取3.3mL ddH₂O至干净小烧杯内，再分别加入30％丙烯酰胺(29：1)4mL摇匀、1.5M Tris-HCL(pH8.8)2.5mL摇匀、10％SDS100μL摇匀、10％过硫酸铵100μL摇匀，最后加8μL的TEMED，迅速摇匀后，用1mL吸头快速吹入制胶板内约10cm，再吹入1mL无水乙醇去气泡定胶，室温置20min。(3)浓缩胶：取3.42mL ddH₂O至干净小烧杯内，再分别加入30％丙烯酰胺(29：1)0.83mL摇匀，1.0M的Tris-HCL(pH6.8)0.625mL摇匀，10％SDS 50μL摇匀，10％过硫酸铵75μL摇匀，最后加TEMED 6μL，迅速摇匀后，轻轻倒出分离胶上层的无水乙醇，再用1mL吸头将制好的浓缩胶快速吹入制胶板内，至溢出，再***15孔梳，固定后室温置20min。

3.6.3电泳：将制胶玻璃板缓缓取出制胶架，在电泳槽装置内固定好，倒入适量电泳液到胶板槽内至溢出，确定胶板无漏液后，轻轻拔出孔梳，梳孔内不宜有气泡，用10μL吸头将稀释好的样品蛋白各取6μL缓缓注入胶孔内，并在胶孔最外两侧分别注入同体积的预染蛋白Marker，将电泳槽盖好后以80V电压电泳30min，再以100V电压电泳1h。

3.6.4电转：将电泳后的胶板取出后置于有电转液的托盘内，用拨胶铲将上层玻璃缓缓拨开，再讲胶轻轻置于托盘内转膜夹三层滤纸上，不可使胶干，再用干净尺子量胶长宽，并裁取等长宽的PVDF膜，并泡在甲醇中活化膜30s后，将PVDF膜置于胶上，并用玻璃棒驱赶膜内气泡，再在膜上放三层滤纸，夹好转膜夹，置于转膜槽内，将槽放在冰盒中，通电在100V电压转膜1h。

3.6.5封闭：电转结束后，从转膜夹中取出膜，按上面预染蛋白Marker条带位置剪取所需目的蛋白(切记该过程中膜不可以干)，置于倒有5％脱脂奶粉(脱脂奶粉：1×TBST＝1g：20mL现用现配)的皿中，室温摇床2h，再将封闭后的膜用1×TBST溶液在摇床摇洗3次，1次10min。

3.6.6抗体孵育：本试验一抗、二抗均购自abcam公司。将一抗及二抗按下表2比例分别用1×TBST稀释。

表2抗体稀释

将目的蛋白所在的膜，加入对应的一抗溶液，在4℃摇床孵育过夜。过夜后，用1×TBST室温摇床摇洗3次，每次20-30min，并加入对应的二抗溶液，避光室温摇床孵育2h，再用1×TBST室温摇床摇洗3次，每次30min。

3.6.7显色：洗膜结束后，在避光处配制显色剂(A液：B液＝1：1，v/v)适量，并用吸头轻轻吹至膜上，并在黑暗处室温孵育5min(膜不可以干)，并用Bio-RAD凝胶成像仪对目的蛋白进行曝光60s拍照，拍照结果用Image Lab进行灰度分析。目的蛋白表达水平＝(目的蛋白/内参蛋白)。

3.7统计方法

所有试验平行操作3次。对试验中所有计量和计数资料均用SPSS 21.0进行统计分析。对于计量数据符合正态性且方差齐性者多组间用单因素方差分析进行总体差异比较。若总体有差异选用Tukey法进行组间比较；若符合正态性但方差不齐则采用Brown-Forsythe法检验总体差异，若有差异，则用Games-Howell法进行组间比较；若数据无正态性则用Kruskal-Wallis H法进行非参数的多组差异的检验。检验水准α均选用0.05，P<0.05为差异有统计学意义。计量资料均用表示，试验中柱形图均由Graphpad Prism 7.0绘制。

4、结果与分析

4.1 BRNP对PC12细胞的毒性影响

表3不同浓度BRNP对PC12细胞的细胞毒性作用(n＝3)

结合图1和表3的数据可以看出，不同浓度BRNP干预PC12细胞24h后对细胞无明显毒性作用。与正常对照组相比，随着BRNP浓度的增加，细胞存活率未见明显变化，差异不明显无统计学意义(P＞0.05)。因此不同浓度的BRNP预处理对PC12细胞活力没有明显的细胞毒性作用，并且对PC12细胞存活率的影响不大。

4.2 H₂O₂对PC12细胞的影响

给予PC12细胞不同剂量的H₂O₂分别处理4h和6h后进行CCK8检测，结果如图2-3和表4-5，显示PC12细胞存活率显著下降，并呈剂量依赖性，即随着药物浓度的增加细胞活性的下降程度也随之明显。300μM时细胞存活率为60％，此时PC12细胞受到一定程度的损伤，但还没达到不可逆转的状态，故选择300μM作用4h作为PC12细胞氧化损伤浓度。

表4不同浓度的H₂O₂处理4h对PC12细胞活性的影响(n＝3)

注：**P＜0.01。

表5不同浓度的H₂O₂处理6h对PC12细胞活性的影响(n＝3)

注：**P＜0.01。

4.3 BRNP对H₂O₂诱导的PC12细胞的保护作用

由图4和表6可知，与对照组相比，H₂O₂显著降低了PC12细胞的存活率(P＜0.01)。在BRNP浓度为62.5-500μg·mL^-1时，对PC12细胞具有较好地增殖作用(P＜0.01或0.05)。当BRNP浓度为250μg·mL^-1时，细胞存活率达到最高为84.35±3.93％，差异显著有统计学意义(##P＜0.01)。结果显示，随着BRNP浓度的增加对PC12细胞的保护作用逐渐增加，当浓度达到250μg·mL^-1时，保护作用最强。所以，在后续实验中BRNP以62.5μg·mL^-1，125μg·mL^-1，250μg·mL^-1为预保护给药剂量。

表6 BRNP对H₂O₂诱导的PC12的保护作用(n＝3)

注：**P＜0.01；与模型组比较，#P＜0.05，##P＜0.01。

4.4乳酸脱氢酶的测定结果

乳酸脱氢酶(LDH)常作为细胞氧化能力的指标，文献报道，神经细胞损伤程度与LDH释放量成正比。图5和表7的实验结果显示，与正常组相比，模型组细胞培养液中LDH明显升高，差异有统计意义(P＜0.01)；与模型组相比，BRNP明显降低LDH含量，差异有统计学意义(P＜0.01或0.05)

表7 BRNP对PC12细胞中LDH含量的影响

注：**P＜0.01；与模型组比较，##P＜0.01。

4.5芜菁中性多糖BRNP对H₂O₂诱导的PC12细胞线粒体膜电位的影响

线粒体膜电位(MMP)的下降是细胞凋亡早期的一个标志性事件。通过JC-1从红色荧光过渡到绿色荧光，可以很容易地检测到细胞膜电位的下降，这也可以作为细胞凋亡早期的一个检测指标。如图6所示，与正常组相比，给予H₂O₂处理，细胞中红色荧光显著减少，MMP显著下降。与模型组相比，预先给予的芜菁中性多糖BRNP处理以后，细胞的红色荧光显著增多，MMP显著上升。表明芜菁中性多糖BRNP显著抑制H₂O₂诱导的PC12细胞的早期凋亡而起到保护作用。

4.6 WB实验结果

由图7-8和表8可知，芜菁中性多糖BRNP以不同剂量干预PC12细胞时，可不同程度改变细胞内Bax、Bcl-2、caspase-3的表达水平，其中Bax、caspase-3作为促凋亡蛋白和抑癌蛋白，其表达水平均有明显降低，且与正常对照组相比具有显著性差异(P<0.05)；而抗凋亡蛋白Bcl-2与正常对照组相比，蛋白表达水平明显升高(P<0.05)。说明芜菁中性多糖BRNP可通过影响凋亡蛋白的表达水平来实现最终的抗衰老作用

表8 BRNP干预后PC12细胞内凋亡靶标蛋白表达量分析(n＝3)

注：与正常对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与模型组比较，#P＜0.05，##P＜0.01。

5、结论

PC12细胞是大鼠肾上腺嗜铬细胞，具有神经细胞元特征，因此可选用PC12细胞为研究对象，通过氧化诱导处理建立PC12细胞衰老模型，进行相关的衰老研究。很多化学药物处理都可导致细胞氧化进而衰老，H₂O₂是一种氧化应激药物，是体外衰老研究的良好工具，广泛用于短时期内获得细胞衰老模型。因此，我们选用CCK8法对H₂O₂建立细胞衰老模型的条件进行探索，同时考察BRNP对PC12细胞衰老模型的保护作用。CCK8实验结果表明随着H₂O₂浓度的增加，PC12细胞存活率显著下降，并呈剂量依赖性。当H H₂O₂浓度为300μM作用4h时细胞存活率为60％，此时PC12细胞受到一定程度的损伤，但还没达到不可逆转的状态，故选择300μM作用4h作为PC12细胞氧化损伤浓度。

需要说明的是，本发明中涉及数值范围时，应理解为每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用，由于采用的步骤方法与实施例相同，为了防止赘述，本发明描述了优选的实施例。尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例做出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。

显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。

Claims (5)

1.芜菁中性多糖BRNP在制备细胞的氧化损伤保护作用药物的应用，其特征在于，所述细胞为PC12细胞，所述芜菁中性多糖BRNP能够保护细胞形态和减少氧化应激损伤导致的细胞凋亡，所述细胞的氧化损伤是由H₂O₂诱导的。

2.根据权利要求1所述的芜菁中性多糖BRNP在制备细胞的氧化损伤保护作用药物的应用，其特征在于，所述芜菁中性多糖BRNP能够降低细胞中乳酸脱氢酶含量。

3.根据权利要求1所述的芜菁中性多糖BRNP在制备细胞的氧化损伤保护作用药物的应用，其特征在于，所述芜菁中性多糖BRNP能够调节Bax、Bcl-2、caspase-3的表达水平。

4.根据权利要求3所述的芜菁中性多糖BRNP在制备细胞的氧化损伤保护作用药物的应用，其特征在于，所述芜菁中性多糖BRNP能够降低Bax、caspase-3表达水平。

5.根据权利要求3所述的芜菁中性多糖BRNP在制备细胞的氧化损伤保护作用药物的应用，其特征在于，所述芜菁中性多糖BRNP能够提高Bcl-2表达水平。