CN115104481A - 一种液体培养皇簇菌菌种的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种液体培养皇簇菌菌种的方法，包括以下步骤：准备新鲜竹屑、去皮土豆、蘑菇、桑枝放入容器中，其后向容器中加纯净水，其后煮沸，其后对容器内的物质进行过滤，取滤液备用；取滤液10L于干净的容器内，其后向容器中加玉米粉、磷酸二氢钾、硫酸镁、红糖、葡萄糖、蜂蜜、维生素C和牛肉膏后搅拌均匀；其后将装有搅拌均匀的液体的新容器进行灭菌，其后冷却；其后向灭菌冷却后的容器中接种皇簇菌菌种；其后将接种后的容器在22℃的条件下静置培养48h；其后将静置后的容器放在摇床上培养后得到液体菌种；本发明涉及的培养方法适用于规模生产；有效提升皇簇菌菌丝的产量；缩短皇簇菌的生长周期；降低皇簇菌栽培的需求量。
Description
技术领域
本发明涉及微生物领域，具体是一种液体培养皇簇菌菌种的方法。
背景技术
田头菇别名春生田头菇或早生田头菇，在我国华南、华北广泛分布，在北美、欧洲各地亦较为常见。田头菇是一个由至少5种以上的生物学类型组成的种群，包括草腐型、针叶木腐型、阔叶木腐型和城市生境型等。新鲜田头菇蛋白质含量为2.05%，折合干重后蛋白质百分含量约为27.5%。脂肪含量低于0.05g/100g，粗纤维和多糖含量较高，粗纤维含量为4%，总糖含量为8%，其中多糖占比为80%。
本申请人日前培育研发了一种皇簇菇（申请号：）营养价值高，含有丰富的维生素、氨基酸及微量元素，尤其是维生素D及钙含量特别高，维生素D含量达44.1μg/100g，钙含量高达78.5mg/kg；且重金属含量符合GB 3762-2017食品安全国家标准食品中污染物限量。
目前培育的田头菇含有较丰富的氨基酸及维生素等，现有的田头菇的培养方法多为固体培养，液体培养较少，固体培养对比液体培养而言有成本较高、发育时间较长、产量较低等缺陷，而现有的田头菇液体培养的方法并不适用于本发明所述的皇簇菇，如一种茶树菇液体菌种培养液及茶树菇液体菌种的培养方法（申请号201310599166 .5），会导致皇簇菇生长速度较慢，培育过程中易导致杂菌污染。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种液体培养皇簇菌菌种的方法，以至少达到获得生命力强、病害少的皇簇菌菌种，且便于规模生产，大大缩短皇簇菌的发育时间以及缩短发菌周期，提高皇簇菌产量，降低杂菌污染。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：一种液体培养皇簇菌菌种的方法，其液体培养方法培养所述皇簇菌菌种，所述皇簇菌（Agrocybesmithii ZOZO-XW-B皇簇菌）菌株已进行保藏，保藏单位是中国典型培养物保藏中心；保藏地址位于中国武汉的武汉大学；保藏日期为2021年6月11日；保藏编号为CCTCC NO：M2021715，液体培养方法包括以下步骤：
S1、准备新鲜竹屑、去皮土豆、蘑菇、桑枝放入容器中，其后向容器中加纯净水至没过所述新鲜竹屑、去皮土豆、蘑菇、桑枝，其后煮沸，续沸腾状态0.5h后对容器内的物质进行过滤，取滤液备用；
S2、取步骤S1中的滤液于干净的容器内，其后向容器中添加玉米粉、磷酸二氢钾、硫酸镁、红糖、葡萄糖、蜂蜜、维生素C和牛肉膏后搅拌均匀，得到培育液；
S3、向所述培育液中接种皇簇菌菌种，并进行培育。
进一步的，所述步骤S3包括如下步骤：
S31、将所述培养液置于培育容器中；
S32、其后将培育容器进行灭菌；
S33、其后向灭菌后的培育容器中接种皇簇菌菌种；
S34、其后将接种后的培育容器进行静置培养；
S35、其后将静置后的培育容器放在摇床上培养后得到液体菌。
进一步的，按重量份计，所述新鲜竹屑为100份、去皮土豆为100份、蘑菇为50份、桑枝为50份。
进一步的，所述步骤S2中取用的滤液为10L，所述玉米粉为1克、磷酸二氢钾为1克、硫酸镁为1克、红糖为14克、葡萄糖为9克、蜂蜜为3克、维生素C为0.1克和牛肉膏为1克
进一步的，步骤S3中的容器中盛放的液体为所述容器体积的65%。
进一步的，步骤S4中灭菌操作为在温度为122-125℃的条件下进行灭菌，灭菌时间为1h，其后冷却至25℃。
进一步的，所述步骤S33中，接种皇簇菌菌种前培育容器需冷却至25℃
进一步的，步骤S6中的培养温度为22℃，培养时间为48h。
进一步的，步骤S7中摇床的转速控制在180r/min。
所述竹屑代替了木屑，降低的种植过程中的林木消耗，降低成本，同时能降低皇簇菇培育过程中的杂菌感染率以及提高皇簇菇的生长速率；所述土豆、玉米粉、红糖、葡萄糖、蜂蜜、牛肉膏提供丰富的碳源和氮源等物质；所述蘑菇中含有的氮元素与碳酸氢铵、硫酸镁协同使用，栽培皇簇菌能促进皇簇菌的生长，菌丝吃料萌发时间提前、发菌速度快，有利于皇簇菌产品提前上市，蘑菇中的蛋白质、纤维素等养分能促进皇簇菌提早成熟，使出菇期提前；蘑菇中含有的磷元素与提供氮源和碳源等物质一起使用产生协同作用，增加皇簇菌的抗病虫害和抵抗能力，增加皇簇菌的产量，蘑菇中的钾元素与磷酸二氢钾协同使用，能增强白蘑菇的抗寒抗旱能力，采菇期延长，并延长冬季出菇时间发菌用时；降低生产成本，并使得皇簇菌生长健壮且出菇密度高；所述桑树枝的药用特性为皇簇菌的生长提供一个良好的生长环境用，且其作为栽培皇簇菌的原料，使资源得到充分利用，降低了生产成本；所述磷酸二氢钾可促进所述皇簇菌对氮、磷的吸收，快速补磷，提高所述皇簇菌的产量；所述硫酸镁促进碳水化合物的新陈代谢和磷酸盐的转化等，进一步促进所述皇簇菌的生长发育；所述维生素C能提高所述皇簇菌的营养价值。
所述皇簇菌菌种由田头菇经过试管培养基斜面培养得到，具体的培养方法包括以下步骤：
A1：选取一株七成熟的田头菇属菌株，其后用无菌水冲洗3次后备用；
A2：将步骤A1中清洗后的菌株用75%的酒精浸泡7S；
A3：用无菌纱布擦干步骤A2中浸泡后的菌株表面的酒精及水分；
A4：将步骤A3中擦干后的菌株通过烟雾灭菌剂灭菌15min；
A5：取出步骤A4中灭菌后的菌株置于超净工作台上，用解剖刀剖开菌株，在菌柄与菌盖的交界处挑出0.1mm的菌块；
A61：选取新鲜土豆去皮洗净后切片，向切好的200g土豆片中加入50g任意一种或多种蘑菇，同时加入500g桑树枝，将所述土豆片、蘑菇和桑树枝加入容器中；
A62：向步骤A61中所述的容器中加纯净水直至淹没所述土豆片、蘑菇和桑树枝，其后进行加热，煮沸后继续保持煮沸状态0.5h；
A63：将步骤A62最终得到的产物过滤，取1L滤液备用；
A64：向步骤A63中所述滤液中加入20g琼脂、20g蜂蜜、10g葡萄糖、1个鸡蛋黄、0.5g磷酸二氢钾和0.5g硫酸镁；
A65：将步骤A64中得到的最终产物装入20（mm）×200（mm）的试管中，灭菌后得到试管培养基；
A7：选取无污染的步骤A65中试管培养基培养后得到的菌株连续纯化3次，得到皇簇菌菌种。
进一步的，每一个试管内培养的菌种经过捣碎后，分别接种于两个灭菌冷却后的装有650ml培养液的容器中。
本发明的有益效果是：本发明涉及的培养方法适用于规模生产；能有效提升皇簇菌菌丝的产量，增强生命力；加快所述皇簇菌的生长速度，缩短所述皇簇菌菌丝的发育生长周期；所述皇簇菌菌种培育的皇簇菌病害少，降低皇簇菌栽培的需求量；提高所述皇簇菌的生物产量；相对于固体培养，成本降低。
具体实施方式
下面结合实施例进一步详细描述本发明的技术方案，但本发明的保护范围不局限于以下所述。
实施例中，一种液体培养皇簇菌菌种的培养基的制备包括以下步骤：
S1、称取新鲜竹屑100份、去皮土豆100份、蘑菇50份、桑枝50份放入容器中，其后向容器中加纯净水至没过所述新鲜竹屑、去皮土豆、蘑菇、桑枝，其后煮沸后持续0.5h，其后对容器内的物质进行过滤，取滤液备用；
S2、取步骤S1中的滤液10L于干净的容器内，其后向容器中添加玉米粉1g、磷酸二氢钾1g、硫酸镁1g、红糖14g、葡萄糖9g、蜂蜜3g、维生素C0.1g和牛肉膏1g后搅拌均匀；
S3、其后取搅拌均匀后的液体于三角瓶中，每1000ml三角瓶中装650ml步骤S2中搅拌均匀后的液体，得到液体培养基。
每个液体培养基接种的皇簇菇菌种量为：每一个试管内培养的菌种经过捣碎后，平均接种于两个培养基中。
实施例1
一种液体培养皇簇菌菌种的方法，包括以下步骤：
S1、将液体培养基置于温度为122℃的条件下进行灭菌1h，其后冷却至25℃；
S2、其后向冷却后的三角瓶中接种皇簇菌菌种；
S3、其后将接种后的三角瓶在22℃的条件下静置培养48h；
S4、其后将静置后的三角瓶放在摇床上培养后得到液体菌种，摇床的转速控制在180r/min。
实施例2
一种液体培养皇簇菌菌种的方法，包括以下步骤：
S1、将液体培养基置于温度为124℃的条件下进行灭菌1h，其后冷却至25℃；
S2、其后向冷却后的三角瓶中接种皇簇菌菌种；
S3、其后将接种后的三角瓶在22℃的条件下静置培养48h；
S4、其后将静置后的三角瓶放在摇床上培养后得到液体菌种，摇床的转速控制在180r/min。
实施例3
一种液体培养皇簇菌菌种的方法，包括以下步骤：
S1、将液体培养基置于温度为125℃的条件下进行灭菌1h，其后冷却至25℃；
S2、其后向冷却后的三角瓶中接种皇簇菌菌种；
S3、其后将接种后的三角瓶在22℃的条件下静置培养48h；
S4、其后将静置后的三角瓶放在摇床上培养后得到液体菌种，摇床的转速控制在180r/min。
实施例4
将实施例2中培养液中使用的所述竹屑替换为木屑，其余条件不变对所述皇簇菌进行培养。
实施例5
将实施例2中步骤S6的培养温度替换为18℃，其余条件不变对所述皇簇菌进行培养。
实施例6
将实施例2中步骤S6的培养温度替换为20℃，其余条件不变对所述皇簇菌进行培养.
实施例7
将实施例2中步骤S6的培养温度替换为24℃，其余条件不变对所述皇簇菌进行培养。
实施例8
去掉实施例2中的步骤S6中的静置培养步骤，其余条件不变对所述皇簇菌进行培养。
对比例
采用现有的如一种茶树菇液体菌种培养液及茶树菇液体菌种的培养方法（申请号201310599166 .5）中涉及的液体培养方法培养所述皇簇菌。
记录所有实施例及对比例中培育的皇簇菌液体菌种的菌丝生长速率（通过显微镜进行检测）、杂菌感染率记录结果见表1。
表1
由表1可知，实施例2的抑菌效果虽然低于实施1和实施例8，但是其菌丝生长速率高于实施例2和实施例8的生长速率，所以实施例2的培养条件为最佳培养条件；对比实施例3和实施例4，培养基原料中使用竹屑更利于所述皇簇菇菌丝的生长，且能有效降低杂菌感染率；对比实施例3和实施例5-7，需要严格控制培养温度，才能有效加快所述皇簇菌的菌丝生长速度，降低其杂菌感染率；实施例与对比例比较，现有的液体菌种的培养方法不太适宜于本发明所述的皇簇菌的培养。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当理解本发明并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、修改和环境，并能够在本文所述构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离本发明的精神和范围，则都应在本发明所附权利要求的保护范围内。
Claims (9)
1.一种液体培养皇簇菌菌种的方法，其特征在于，用于培育所述皇簇菌，所述皇簇菌（Agrocybe smithii ZOZO-XW-B皇簇菌）菌株已进行保藏，保藏单位是中国典型培养物保藏中心；保藏地址位于中国武汉的武汉大学；保藏日期为2021年6月18日；保藏编号为CCTCCNO：M2021715，液体培养方法包括以下步骤：
S1、准备新鲜竹屑、去皮土豆、蘑菇、桑枝放入容器中，其后向容器中加纯净水至没过所述新鲜竹屑、去皮土豆、蘑菇、桑枝，其后煮沸，续沸腾状态0.5h后对容器内的物质进行过滤，取滤液备用；
S2、取步骤S1中的滤液于干净的容器内，其后向容器中添加玉米粉、磷酸二氢钾、硫酸镁、红糖、葡萄糖、蜂蜜、维生素C和牛肉膏后搅拌均匀，得到培育液；
S3、向所述培育液中接种皇簇菌菌种，并进行培育。
2.根据权利要求1所述的一种液体培养皇簇菌菌种的方法，其特征在于：所述步骤S3包括如下步骤：
S31、将所述培养液置于培育容器中；
S32、其后将培育容器进行灭菌；
S33、其后向灭菌后的培育容器中接种皇簇菌菌种；
S34、其后将接种后的培育容器进行静置培养；
S35、其后将静置后的培育容器放在摇床上培养后得到液体菌。
3.根据权利要求1或2所述的一种液体培养皇簇菌菌种的方法，其特征在于：按重量份计，所述新鲜竹屑为100份、去皮土豆为100份、蘑菇为50份、桑枝为50份。
4.根据权利要求3所述的一种液体培养皇簇菌菌种的方法，其特征在于：所述步骤S2中取用的滤液为10L，所述玉米粉为1克、磷酸二氢钾为1克、硫酸镁为1克、红糖为14克、葡萄糖为9克、蜂蜜为3克、维生素C为0.1克和牛肉膏为1克。
5.根据权利要求2所述的一种液体培养皇簇菌菌种的方法，其特征在于：步骤S31中的容器中盛放的液体为所述容器体积的65%。
6.根据权利要求2所述的一种液体培养皇簇菌菌种的方法，其特征在于：步骤S32中灭菌温度为122-125℃，灭菌时间1h。
7.根据权利要求6所述的一种液体培养皇簇菌菌种的方法，其特征在于：所述步骤S33中，接种皇簇菌菌种前培育容器需冷却至25℃。
8.根据权利要求2所述的一种液体培养皇簇菌菌种的方法，其特征在于：步骤S34中的培养温度为22℃，培养时间为48h。
9.根据权利要求2所述的一种液体培养皇簇菌菌种的方法，其特征在于：步骤S7中摇床的转速控制在180r/min。
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