CN115078726A - 一种用于卵巢癌诊断的生物标志物及检测试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明属于医药生物技术领域，具体公开了用于卵巢癌诊断的生物标志物及检测试剂盒。本发明提供的用于卵巢癌诊断的生物标志物为抗肿瘤相关抗原GGT5、VCL、TRIM21的自身抗体的组合。本发明提供的用于卵巢癌诊断的试剂盒含有用于检测上述生物标志物的试剂，该试剂为通过酶联免疫吸附、蛋白芯片、免疫印迹或微流控免疫检测样本中所述生物标志物的试剂。本发明通过检测人血清中抗肿瘤相关抗原GGT5、VCL、TRIM21的自身抗体的表达水平，可以有效区分卵巢癌患者和健康人，可用于卵巢癌的辅助诊断。

Description

一种用于卵巢癌诊断的生物标志物及检测试剂盒

技术领域

本发明属于医药生物技术领域，具体公开了一种用于卵巢癌诊断的生物标志物及检测试剂盒。

背景技术

卵巢癌是世界范围内最致命的妇科恶性肿瘤之一，严重威胁女性的生命健康，由于卵巢癌起病隐匿，早期阶段临床症状不明显，且缺乏有效的筛查和早期诊断方法，导致约75％的患者就诊时已处于晚期，治疗效果和预后相对较差，总体治愈率约为30％。当患者处于临床I或II期时，通过常规的手术和化疗，患者的5年生存率可达50％以上，而患者处于临床III或IV期时，长期生存率仅约20％或者更低。计算机模拟研究表明，在疾病处于临床前的早期阶段中被确诊，可使患者生存率提高10％-30％，而且更具有成本效益。

目前，临床上常用的卵巢癌早期筛查方法包括盆腔检查、妇科超声成像和肿瘤标志物等，由于卵巢深居盆腔，且体积较小，而盆腔检查只能在有明显的较大病灶时才能发现，妇科超声成像对卵巢癌和卵巢良性肿瘤缺乏鉴别区分能力，容易导致假阳性率的出现，且价格昂贵。常用的血清肿瘤标志物包括CA125和HE4，但两种标志物在卵巢癌早期诊断方面其灵敏度和特异度仍存在一定的局限性，不能满足临床大规模的人群筛检试验。因此，为了提高卵巢癌患者的5年生存率，迫切需要寻找有效且经济实用的卵巢癌早期诊断方法。

肿瘤的发生发展过程中常常伴随着蛋白质的异常表达，这些异常表达且与肿瘤发生相关的蛋白质被称为肿瘤相关抗原(tumor associated antigens，TAAs)，它可以在癌症的早期阶段进入血液循环被免疫***识别，从而诱发宿主免疫反应产生抗肿瘤相关抗原自身抗体(autoantibody against tumor associated antigen，TAAb)，抗-TAA自身抗体在癌症患者血液中稳定，高滴度的存在使得其作为癌症早期诊断的标志物比肿瘤相关抗原更具备吸引力，为早期肿瘤标志物的研究带来了全新的途径。由于单个自身抗体进行癌症早期检测时，灵敏度较低，研究发现通过使用一组特定的抗-TAA自身抗体组合能在一定程度上提高检测的灵敏度。因此，筛选一组较优的标志物组合对卵巢癌早期诊断的具有重要的现实意义。

过去寻找潜在肿瘤标志物的研究方法多聚焦于重组cDNA表达文库血清学分析(serological analysis of recombinant cDNA expression libraries，SEREX)、血清学蛋白质组分析，但上述筛选方法的实验技术繁琐复杂且结果难以重复和存在一定的假阳性和假阴性，而且低丰度的蛋白无法得到有效的检测。近年来，蛋白质芯片技术具备高通量，用量少，快速检测等优点，已逐渐发展成为蛋白质组学研究的主流工具。人类全蛋白质组芯片是由表面排列的大量重组蛋白组成，包括激酶，膜蛋白，核蛋白，分泌蛋白，转录因子以及涉及功能通路上的蛋白，如代谢，信号转导，细胞死亡，能够以高通量的方式用于疾病背景下的生物标志物发现。因此，应用人类全蛋白质组芯片筛选大量潜在，新颖且灵敏度更高的卵巢癌相关抗原及其相应的自身抗体用于卵巢癌的大规模的人群筛查是目前急待需要解决的临床需求。

发明内容

针对现有技术中存在的问题和不足，本发明的目的之一是提供一种用于卵巢癌诊断的生物标志物，本发明的目的之二旨在提供一种用于检测上述生物标志物的试剂在制备用于卵巢癌诊断的产品中的应用，本发明的目的之三在于提供一种用于卵巢癌诊断的试剂盒。

基于上述目的，本发明采用的技术方案如下：

本发明第一方面提供了一种用于卵巢癌诊断的生物标志物，所述生物标志物为抗肿瘤相关抗原GGT5自身抗体、抗肿瘤相关抗原VCL自身抗体、抗肿瘤相关抗原TRIM21自身抗体的组合。抗肿瘤相关抗原GGT5自身抗体、抗肿瘤相关抗原VCL自身抗体、抗肿瘤相关抗原TRIM21自身抗体在卵巢癌患者血清中的表达水平均高于健康人，且差异具有统计学意义。

根据上述的生物标志物，优选地，抗肿瘤相关抗原GGT5自身抗体、抗肿瘤相关抗原VCL自身抗体、抗肿瘤相关抗原TRIM21自身抗体均为受试者血清、血浆、组织间隙液或尿液中相应的抗肿瘤相关抗原自身抗体。

根据上述的生物标志物，优选地，抗肿瘤相关抗原GGT5自身抗体、抗肿瘤相关抗原VCL自身抗体、抗肿瘤相关抗原TRIM21自身抗体为受试者接受肿瘤治疗之前血清、血浆、组织间隙液或尿液中的抗肿瘤相关抗原自身抗体。更加优选地，所述肿瘤治疗为化疗、放疗或肿瘤手术切除。

根据上述的生物标志物，优选地，所述受试者为哺乳动物，更加优选地，所述受试者为灵长类哺乳动物；最优选地，所述受试者为人。

本发明第二方面提供了用于检测上述第一方面所述生物标志物的试剂在制备用于卵巢癌诊断的产品中的应用。

根据上述的应用，优选地，所述试剂为通过酶联免疫吸附、蛋白芯片、免疫印迹或微流控免疫检测样本中所述生物标志物的试剂。

根据上述的应用，优选地，所述样本为血清、血浆、组织间隙液或尿液。

根据上述的应用，优选地，所述试剂为检测所述生物标志物的抗原。更加优选地，所述试剂为GGT5蛋白、VCL蛋白、TRIM21蛋白的组合。

根据上述的应用，优选地，所述产品为蛋白芯片、试剂盒或制剂。

根据上述的应用，优选地，所述产品预测卵巢癌的概率计算公式为：

PRE＝1/(1+EXP(-(-3.919+15.112×GGT5+6.002×VCL+4.169×TRIM21)))，其中，PRE表示概率，GGT5表示抗肿瘤相关抗原GGT5自身抗体的表达量，VCL表示抗肿瘤相关抗原VCL自身抗体表达量，TRIM21表示抗肿瘤相关抗原TRIM21自身抗体表达量。当预测的概率PRE≥0.5时，初步判定受试者为卵巢癌患者；当预测的概率PRE＜0.5时，初步判定受试者为健康人。

本发明第三方面提供了一种用于卵巢癌诊断的试剂盒，所述试剂盒包含用于检测上述第一方面所述生物标志物的试剂。

根据上述的试剂盒，优选地，所述试剂盒通过酶联免疫吸附、蛋白芯片、免疫印迹或微流控免疫检测样本中的所述生物标志物。更加优选地，所述试剂盒通过抗原抗体反应对样本中的所述生物标志物进行检测。

根据上述的试剂盒，优选地，所述试剂盒预测卵巢癌的概率计算公式为：

PRE＝1/(1+EXP(-(-3.919+15.112×GGT5+6.002×VCL+4.169×TRIM21)))，其中，PRE表示概率，GGT5表示抗肿瘤相关抗原GGT5自身抗体的表达量，VCL表示抗肿瘤相关抗原VCL自身抗体表达量，TRIM21表示抗肿瘤相关抗原TRIM21自身抗体表达量。当预测的概率PRE≥0.5时，初步判定受试者为卵巢癌患者；当预测的概率PRE＜0.5时，初步判定受试者为健康人。

根据上述的试剂盒，优选地，所述试剂盒为ELISA检测试剂盒。更加优选地，所述ELISA检测试剂盒包括固相载体和包被在固相载体上的抗原；所述抗原为GGT5蛋白、VCL蛋白和TRIM21蛋白。

根据上述的试剂盒，优选地，所述样本为血清、血浆、组织间隙液或尿液。

根据上述的试剂盒，优选地，所述ELISA检测试剂盒还包括样品稀释液、第二抗体、抗体稀释液、洗涤液、显色液和终止液。

本发明中肿瘤相关抗原GGT5、VCL、TRIM21的基本信息为：

GGT5为谷氨酰转移酶，是γ-谷氨酰转肽酶基因家族的成员，具有裂解谷胱甘肽的γ-谷氨酰部分的能力，参与体内的氧化还原调节、药物代谢、免疫功能等多个过程。VCL是一种肌动蛋白丝状结合蛋白，参与细胞基质粘附和细胞-细胞粘附，调节细胞表面E-钙粘素的表达促进肿瘤的发生。TRIM21是E3泛素连接酶TRIM蛋白的家族成员，在调节细胞周期进程方面起着重要的作用，TRIM21能够负调节NFKB信号通路，为一种重要的抑癌基因。在NCBI中GGT5蛋白的序列号为：NP_004112.2；VCL蛋白的序列号为：NP_054706.1；TRIM21蛋白的序列号为：NP_003132.2。

与现有技术相比，本发明取得的积极有益效果为：

(1)本发明首次发现抗肿瘤相关抗原GGT5、VCL、TRIM21的自身抗体在卵巢癌患者血清中的表达水平均显著高于健康人，且差异具有统计学意义，通过检测人血清中抗肿瘤相关抗原GGT5、VCL、TRIM21的自身抗体的表达水平，可以有效检测卵巢癌；经验证，本发明单独采用抗肿瘤相关抗原GGT5、VCL、TRIM21的自身抗体中任意一个标志物进行卵巢癌诊断时，其ROC曲线的AUC值均在0.60以上；多个标志物联合使用时，ROC曲线的AUC值比单个指标更接近于1，区分效果好，诊断效果好。因此，本发明用于卵巢癌诊断的标志物可用于卵巢癌的辅助诊断。

(2)本发明将抗肿瘤相关抗原GGT5自身抗体、抗肿瘤相关抗原VCL自身抗体、抗肿瘤相关抗原TRIM21自身抗体这三种标志物作为一个组合用于卵巢癌诊断检测时，其ROC曲线的AUC为0.79(95％CI:0.74-0.84)，检测灵敏度高达66.2％(即卵巢癌患者中应用这三个标志物进行诊断时被正确的诊断为卵巢癌的比率为66.2％)，特异度达到了77.2％(即健康对照中应用这三个标志物进行诊断时确定为健康者的比率为77.2％，因此，本发明的标志物具有较高的灵敏度和特异度，极大地提高了卵巢癌的检出率，有利于卵巢癌的筛查和早期发现，从而大大降低了卵巢癌患者的死亡率，为卵巢癌患者和家庭带来极大的福祉。

(3)本发明的试剂盒通过间接ELISA的方法检测人血清中抗肿瘤相关抗原GGT5自身抗体、抗肿瘤相关抗原VCL自身抗体、抗肿瘤相关抗原TRIM21自身抗体的表达水平，可以较准确地将卵巢癌患者和健康对照诊断区分开来，为临床医生对卵巢癌的诊断提供了新的参考依据。

(4)本发明的试剂盒的检测样本为血清，可避免侵入性诊断，通过微创方式获取血清并进行检测即可获得卵巢癌的患病风险，需血量少，被检测人员痛苦小、依从性高；而且，操作简单，检测出结果时间短，具有广阔的市场前景和社会效益。

附图说明

图1为本发明实施例1中采用人类蛋白质组芯片筛选用于卵巢癌诊断的标志物的原理示意图；

图2为实施例2中卵巢癌组和健康对照组血清样本中3种抗肿瘤相关抗原自身抗体的表达水平结果图；其中，C表示卵巢癌组，N表示健康对照组；

图3为实施例2中3种抗肿瘤相关抗原自身抗体单独诊断区分卵巢癌组和健康对照组的ROC曲线图；

图4为实施例3中卵巢癌组和健康对照组血清样本中3种抗肿瘤相关抗原自身抗体的表达水平结果图；其中，C表示卵巢癌组，N表示健康对照组；

图5为实施例3中3种抗肿瘤相关抗原自身抗体单独诊断区分卵巢癌组和健康对照组的ROC曲线图；

图6为实施例4训练集中不同抗肿瘤相关抗原自身抗体组合诊断区分卵巢癌组和健康对照组的ROC曲线图；

图7为实施例4验证集中三种抗肿瘤相关抗原自身抗体组合诊断区分卵巢癌组和健康对照组的ROC曲线图。

具体实施方式

以下详细说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、部件和/或它们的组合。

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，均采用本技术领域常规技术，或按照生产厂商所建议的条件；所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本发明的技术方案。

实施例1：采用人类蛋白质组芯片筛选用于卵巢癌诊断的标志物

1、实验样本：

收集20例来自河南省肿瘤医院、郑州大学第三附属医院的卵巢癌患者血清样本(卵巢癌组)和20例来自广州博翀实验室的健康对照血清样本(健康对照组)；其中，20例卵巢癌患者血清来源于经病理组学确诊且未经任何治疗的卵巢癌患者；20例正常人血清来源于健康受试者，健康受试者的入组标准为：无心血管、呼吸、肝脏、肾脏、胃肠道、内分泌、血液、精神、或神经***疾病以及上述疾病病史，无急性或者慢性疾病，无自身免疫性疾病，无任何肿瘤相关的证据；而且，20例卵巢癌患者和20例健康受试者在年龄之间的差异没有统计学意义。本研究获得郑州大学伦理委员会批准，所有的研究对象均已签署知情同意书。

将20例卵巢癌患者血清中每2例血清混合为1例混合卵巢癌血清样本，共得到10例混合卵巢癌血清样本；将20例健康对照血清中每2例混合为1例混合健康对照血清样本，共得到10例混合健康对照血清样本。

血清采集：采集研究对象在空腹状态时的外周血液5ml于无抗凝剂的采血管中，室温静置1h后置于离心机中，设定为4℃，3000rpm离心10min。然后将采血管上层的血清吸出并分装至1.5ml的EP管中，在EP管的顶部和侧面均标记样本编号，放于-80℃冰箱进行冷冻保存，记录采血日期以及储存位置。在使用之前，取出血清放于4℃冰箱解冻并分装，避免反复冻融血清。

2、人类蛋白质组芯片检测

使用HuProt^TM人类全蛋白质组芯片(购自广州博翀生物科技有限公司)检测10例混合卵巢癌血清样本、10例混合健康对照血清样本中自身抗体的表达水平(采用人类蛋白质组芯片检测的原理示意图如图1所示)。每张芯片可以同时检测14个血清样本，固定在芯片上的蛋白与血清中的特异性自身抗体相互作用以结合。

(1)实验方法：

1)复温：将HuProt^TM人类蛋白质组芯片从-80℃冰箱中取出，放置4℃冰箱复温30min，随后室温继续复温15min；

2)封闭：将已复温的芯片正面朝上置于芯片孵育盒中，并加入10mL封闭液(3ml10％BSA，加入7ml 1×PBST溶液)，放置于侧摆摇床中，50-60rpm，室温封闭1h；

3)血清样本孵育：封闭完成后，弃去封闭液，迅速加入预先稀释好的血清孵育液(用稀释液将血清样本按1:200的比例进行稀释，得到稀释后的血清孵育液，稀释液的成分组成为：1ml 10％BSA加入9ml 1×PBST溶液中制备而成)，放置于侧摆摇床中，20rpm，4℃过夜孵育；

4)清洗：待孵育完成后，取出芯片放置于含有清洗液的芯片清洗盒，水平摇床，室温80rpm，清洗3次，每次10min；

5)二抗孵育：待清洗结束后，将芯片转移至孵育盒中，并加入按1：1000比例稀释的二抗孵育液(二抗为cy3标记的抗人IgM、IgG抗体，稀释液成分组成为：1g BSA，100ml1×PBST溶液，将二抗用稀释液按1：1000比例进行稀释得到二抗孵育液)3mL，置于侧摆摇床40rpm，避光，室温孵育1h；

6)清洗：将芯片取出(注意不能触及或划破芯片的上表面)，置于芯片清洗盒，并加入芯片清洗液(1×PBST溶液)，放置水平摇床上，80rpm，清洗3次，每次10min。完成后用ddH₂O重复清洗2次，每次10min；

7)干燥：待清洗完成后，将芯片放置于芯片干燥机进行离心干燥；

8)扫描：按照扫描仪的使用说明对干燥后的芯片进行规范性荧光扫描并记录荧光信号(荧光信号的强弱与相应抗体的亲和力以及数量具有正相关关系)；

9)数据提取：打开对应的GAL文件，将GAL文件上的每个阵列与芯片图像整体对齐后，点击自动对齐按钮，提取数据并保存为GPR。

(2)数据处理：

F532 Median是指在532nm通道下的信号点前景值的中位数，B532 Median是指在532nm通道下的信号点背景值的中位数。为消除同一张芯片内不同蛋白点之间由于背景值不一致导致的信号不均一的情况，故通过背景归一化方法进行处理，即定义信噪比(signal-noise ratio，SNR)＝F532 Median/B532 Median，按照SNR的计算公式进行计算，分别得到10例混合卵巢癌血清样本、10例混合健康对照血清样本的SNR值。对10例混合卵巢癌血清样本、10例混合健康对照血清样本的SNR值进行中位值线性归一化处理，对于任意一个自身抗体，计算卵巢癌组与健康对照组的差异倍数(差异倍数＝卵巢癌组中位值线性归一化后的SNR均值/健康对照组中位值线性归一化后的SNR均值)，用以表示卵巢癌组高于健康对照组的程度，进一步设置筛选条件：差异倍数>1.2、卵巢癌组与健康对照中的阳性率差值大于60％，从中筛选出符合条件的抗肿瘤相关抗原自身抗体。

(3)实验结果：

经过筛选，最终筛选出了3种抗肿瘤相关抗原自身抗体，分别为抗肿瘤相关抗原GGT5自身抗体、抗肿瘤相关抗原VCL自身抗体和抗肿瘤相关抗原TRIM21自身抗体；其中，抗肿瘤相关抗原GGT5自身抗体的差异倍数为1.60，在卵巢癌组中的阳性率为80％，在健康对照组中的阳性率为10％，其两者阳性率差值为70％；抗肿瘤相关抗原VCL自身抗体的差异倍数为4.22，在卵巢癌组中的阳性率为60％，在健康对照组中的阳性率为0％，其两者阳性率差值为60％；抗肿瘤相关抗原TRIM21自身抗体的差异倍数为3.21，在卵巢癌组中的阳性率为100％，在健康对照组中的阳性率为10％，其两者阳性率差值为90％。

而且，抗肿瘤相关抗原GGT5自身抗体、抗肿瘤相关抗原VCL自身抗体、抗肿瘤相关抗原TRIM21自身抗体在卵巢癌组血清中的表达水平均高于健康对照组，且差异具有统计学意义。

实施例2：ELISA检测抗肿瘤相关抗原GGT5、VCL、TRIM21的自身抗体的血清表达水平，评估三种抗肿瘤相关抗原自身抗体用于卵巢癌诊断的价值

采用间接酶联免疫吸附实验(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)检测实施例1筛选出的三种抗肿瘤相关抗原自身抗体在人体血清中的表达水平，评估四种抗肿瘤相关抗原自身抗体用于卵巢癌诊断的价值。

1、实验样本：

收集60例来自河南省肿瘤医院的卵巢癌患者血清样本(卵巢癌组)和60例来自郑州大学第三附属医院正常体检的健康对照血清样本(健康对照组)；其中，60例卵巢癌患者血清来源于经病理组学确诊且未经任何治疗的卵巢癌患者；60例健康对照血清来源于健康受试者，健康受试者的入组标准为：无心血管、呼吸、肝脏、肾脏、胃肠道、内分泌、血液、精神、或神经***疾病以及上述疾病病史，无急性或者慢性疾病，无任何肿瘤相关的证据；而且，60例卵巢癌患者和60例健康受试者在年龄之间的差异没有统计学意义。本研究获得郑州大学伦理委员会批准，所有的研究对象均已签署知情同意书。

血清采集：采集研究对象在空腹状态时的外周血液5ml于无抗凝剂的采血管中，室温静置1h后置于离心机中，设定为4℃，3000rpm离心10min。然后将采血管上层的血清吸出并分装至1.5ml的EP管中，在EP管的顶部和侧面均标记样本编号，放于-80℃冰箱进行冷冻保存，记录采血日期以及储存位置。在使用之前，取出血清放于4℃冰箱解冻并分装，避免反复冻融血清。

2、实验材料及试剂：

(1)3种肿瘤相关抗原蛋白：GGT5重组蛋白、VCL重组蛋白、TRIM21重组蛋白购买于武汉华美生物工程有限公司

(2)96孔酶标板(8行×12列)；

(3)包被液：含0.15％碳酸钠(Na₂CO₃)和0.29％碳酸氢钠(NaHCO₃)的水溶液；

(4)封闭液：含2％(v/v)牛血清白蛋白(BSA)的0.2％(v/v)吐温20的PBST缓冲液；

(5)血清样本稀释液：含有1％(w/v)BSA的PBST缓冲液；

(6)酶标第二抗体：辣根过氧化物酶(HRP)标记小鼠抗人免疫球蛋白抗体(以下简称HRP标记小鼠抗人IgG抗体)；

(7)抗体稀释液：含有1％(w/v)BSA的PBST缓冲液；

(8)洗涤液：含0.2％(v/v)吐温20的PBST缓冲液；

(9)显色液：显色液由显色液A和显色液B组成，其中，显色液A为20％四甲基联苯胺二盐酸的水溶液，显色液B由0.92g柠檬酸、3.7g Na₂HPO₄·12H₂O和800μL 0.75％H₂O₂溶于100mL去离子水中配制而成)；使用时将显色液A和显色液B按照1:1等体积混合均匀，现用现配；

(10)终止液：10％的硫酸。

3、实验方法：

(1)制备3种肿瘤相关抗原包被的酶标板：

分别制备肿瘤相关抗原GGT5包被的酶标板、肿瘤相关抗原VCL包被的酶标板和肿瘤相关抗原TRIM21包被的酶标板。

以制备肿瘤相关抗原GGT5包被的酶标板为例，其具体操作步骤如下：

1)制备肿瘤相关抗原GGT5蛋白溶液：将GGT5蛋白溶解于包被液中，配制成浓度为0.25μg/mL的GGT5蛋白溶液。

2)包被酶标板：将步骤1)制备的GGT5蛋白溶液加入到96孔酶标板的每个反应孔中，加样量为50μL/孔，在4℃下包被过夜，然后将剩余的包被液甩出并拍干。

3)封闭：向包被后的96孔酶标板的反应孔中加入封闭液，加样量为100μL/孔，在37℃水浴中封闭2h，然后去除封闭液，用洗涤液洗涤(加样量为300μl/孔)3次并拍干，得到肿瘤相关抗原GGT5包被的酶标板。

肿瘤相关抗原VCL包被的酶标板和肿瘤相关抗原TRIM21包被的酶标板制备的操作步骤与肿瘤相关抗原GGT5包被的酶标板基本相同，其不同之处在于：步骤1)采用的肿瘤相关抗原不同，制备的肿瘤相关抗原溶液的浓度不同。其中，制备肿瘤相关抗原VCL包被的酶标板时，步骤1)中采用的肿瘤相关抗原为VCL重组蛋白，制备的肿瘤相关抗原VCL溶液的浓度为0.125μg/mL；制备肿瘤相关抗原TRIM21包被的酶标板时，步骤1)中采用的肿瘤相关抗原为TRIM21重组蛋白，肿瘤相关抗原TRIM21溶液的浓度为0.25μg/mL。

(2)血清样本中3种抗肿瘤相关抗原的自身抗体表达水平的检测：

同一血清样本，分别采用上述制备的3种肿瘤相关抗原包被的酶标板通过ELISA方法检测血清样本中抗肿瘤相关抗原GGT5、VCL、TRIM21的自身抗体表达水平。

以检测抗肿瘤相关抗原GGT5自身抗体表达水平为例，其具体操作步骤如下：

1)血清样本孵育：

将待检测的血清样本用血清样本稀释液按体积比1:100的比例进行稀释。将稀释后的血清样本加入上述步骤(1)制备的已包被GGT5蛋白的96孔酶标板第1～11列的反应孔中，加样量为50μl/孔；在已包被GGT5蛋白的96孔酶标板的第12列的第1-6反应孔加入按照1:100稀释的质控血清，加样量为50μl/孔，质控血清是作为质控，以进行不同酶标板之间的标化；在已包被GGT5蛋白的96孔酶标板第12列的第7-8反应孔加入不含血清的抗体稀释液(加样量为50μl/孔)，作为空白对照；然后将96孔酶标置于37℃水浴孵育1h，然后弃去反应孔中液体，用洗涤液(加样量为300μl/孔)洗涤5次并拍干。

2)二抗孵育：

将HRP标记小鼠抗人IgG抗体用抗体稀释液按1:10000(v/v)的比例进行稀释，然后将稀释后的HRP标记小鼠抗人IgG抗体加入96孔酶标板对应的反应孔中，加样量为50μl/孔，置于37℃水浴孵育1h，然后弃去反应孔中液体，用洗涤液洗涤(加样量为300μl/孔)5次并拍干。

3)显色及终止反应：

将显色液A和显色液B按照1:1等体积混合均匀，然后将混合后的显色液迅速加入96孔酶标板的反应孔中，加样量为50μl/孔，室温避光显色反应5-15min，然后向每个反应孔中再加入25μl终止液，终止显色反应。使用酶标仪分别读取其在450nm和620nm波长处的吸光度OD₄₅₀、OD₆₂₀，其中，620nm波长的吸光度OD₆₂₀为背景值，以OD₄₅₀与OD₆₂₀的差值作为检测的吸光度值结果，并用空白对照孔调零。

检测血清样本中抗肿瘤相关抗原VCL、TRIM21自身抗体表达水平的具体操作步骤与上述检测抗肿瘤相关抗原GGT5自身抗体基本相同，其不同之处在于：步骤1)中检测时采用的酶标板不同。其中，检测血清样本中抗肿瘤相关抗原VCL自身抗体表达水平时，步骤1)中采用的酶标板为肿瘤相关抗原VCL蛋白包被的酶标板；检测血清样本中抗肿瘤相关抗原TRIM21自身抗体表达水平时，步骤1)中采用的酶标板为肿瘤相关抗原TRIM21蛋白包被的酶标板。

4、数据处理

对卵巢癌组和健康对照组血清样本的吸光度值进行非参数检验(Mann-WhitneyU)，比较卵巢癌组和健康对照组中自身抗体的表达水平是否有差异。

进一步根据测得卵巢癌组和健康对照组中抗肿瘤相关抗原自身抗体的表达水平(表达水平以最终检测的吸光度值结果表示)，使用GraphPad Prism 8.0分别绘制3种抗肿瘤相关抗原自身抗体单独诊断区分卵巢癌的ROC曲线；以特异度大于90％时，约登指数最大时对应的OD值为截断值，高于此值判定为阳性，低于此值判定为阴性，同时计算相应的AUC以及95％置信区间、灵敏度和特异度，分析3种抗肿瘤相关抗原自身抗体单独用于卵巢癌诊断的价值。所有统计分析使用SPSS 26.0软件进行，P<0.05为统计判断标准。

5、实验结果

卵巢癌组和健康对照组血清样本中3种抗肿瘤相关抗原自身抗体的表达水平分布如图2所示。由图2可知，抗肿瘤相关抗原GGT5自身抗体、抗肿瘤相关抗原VCL自身抗体、抗肿瘤相关抗原TRIM21自身抗体在卵巢癌组血清样本中表达水平均明显高于健康对照组，而且差异具有统计学意义(P<0.05)。由此说明，3种抗肿瘤相关抗原自身抗体可以用于卵巢癌的辅助诊断。

图3为3种抗肿瘤相关抗原自身抗体单独诊断区分卵巢癌组和健康对照组的ROC曲线图。由图3可知，采用抗肿瘤相关抗原GGT5自身抗体诊断卵巢癌时，其AUC为0.71(95％CI:0.62-0.8)；采用抗肿瘤相关抗原VCL自身抗体诊断卵巢癌时，其AUC为0.69(95％CI:0.59-0.78)；采用抗肿瘤相关抗原TRIM21自身抗体诊断卵巢癌时，其AUC为0.62(95％CI:0.52-0.72)。由此说明，抗肿瘤相关抗原GGT5、VCL、TRIM21自身抗体均能够用于辅助诊断区分卵巢癌患者和健康人。

实施例3：在大样本人群血清中采用ELISA检测抗肿瘤相关抗原GGT5、VCL、TRIM21自身抗体的血清表达水平，评估3种抗肿瘤相关抗原自身抗体用于卵巢癌诊断的价值

采用间接ELISA方法进一步在大样本人群血清中检测3种抗肿瘤相关抗原自身抗体的表达水平，验证这3种抗肿瘤相关抗原自身抗体区分卵巢癌患者和健康对照的能力。

1、实验样本：

收集145例来自河南省肿瘤医院的卵巢癌患者血清样本(卵巢癌组)和145例来自郑州大学第三附属医院正常体检的健康对照血清样本(健康对照组)；其中，145例卵巢癌患者血清来源于经病理组学确诊且未经任何治疗的卵巢癌患者；145例健康对照血清来源于健康受试者，健康受试者的入组标准为：无心血管、呼吸、肝脏、肾脏、胃肠道、内分泌、血液、精神、或神经***疾病以及上述疾病病史，无急性或者慢性疾病，无任何肿瘤相关的证据；而且，145例卵巢癌患者和145例健康受试者在年龄之间的差异无统计学意义。本研究获得郑州大学伦理委员会批准，所有的研究对象均已签署知情同意书。

血清采集：血清采集的具体方法与实施例2相同，在此不再赘述。

2、实验材料及试剂：

实验材料和具体试剂与实施例2相同，在此不再赘述。

3、实验方法：

实验方法与实施例2相同，在此不再赘述。

4、数据处理

数据分析方法与实施例2相同，在此不再赘述。

5、实验结果

卵巢癌组和健康对照组血清样本中3种抗肿瘤相关抗原自身抗体的表达水平分布如图4所示。由图4可知，抗肿瘤相关抗原GGT5自身抗体、抗肿瘤相关抗原VCL自身抗体、抗肿瘤相关抗原TRIM21自身抗体在卵巢癌组血清样本中表达水平均明显高于健康对照组，而且差异具有统计学意义(P<0.05)。由此说明，3种抗肿瘤相关抗原自身抗体可以用于卵巢癌的辅助诊断。

图5为3种抗肿瘤相关抗原自身抗体单独诊断区分卵巢癌组和健康对照组的ROC曲线图。由图5可知，采用抗肿瘤相关抗原GGT5自身抗体诊断卵巢癌时，其AUC为0.76(95％CI:0.70-0.81)；采用抗肿瘤相关抗原VCL自身抗体诊断卵巢癌时，其AUC为0.71(95％CI:0.65-0.77)；采用抗肿瘤相关抗原TRIM21自身抗体诊断卵巢癌时，其AUC为0.62(95％CI:0.55-0.68)。由此说明，抗肿瘤相关抗原GGT5、VCL、TRIM21自身抗体均能够用于辅助诊断区分卵巢癌患者和健康人。

实施例4：3种抗肿瘤相关抗原自身抗体组合对卵巢癌的诊断价值

由于单独一种抗肿瘤相关抗原自身抗体用于诊断区分卵巢癌患者和健康对照时，诊断的灵敏度相对偏低，为了提高诊断的灵敏度，以实施例3中纳入的145例卵巢癌患者和145例健康对照血清为训练集样本，本发明将抗肿瘤相关抗原GGT5自身抗体(记作抗GGT5自身抗体)、抗肿瘤相关抗原VCL自身抗体(记作抗VCL自身抗体)、抗肿瘤相关抗原TRIM21自身抗体(记作抗TRIM21自身抗体)中的两种或三种进行组合，根据训练集各血清样本中抗肿瘤相关抗原GGT5、VCL、TRIM21自身抗体的表达水平结果来分析不同抗肿瘤相关抗原自身抗体组合对卵巢癌的诊断价值。

1、两种抗肿瘤相关抗原自身抗体组合诊断区分卵巢癌患者和健康人的能力：

(1)抗GGT5自身抗体和抗VCL自身抗体组合诊断区分卵巢癌患者和健康人

以实施例3中145例卵巢癌患者(卵巢癌组)和145例健康对照血清(健康对照组)中抗GGT5自身抗体和抗VCL自身抗体的表达水平(表达水平以最终检测的吸光度值结果表示)为自变量，是否为卵巢癌事件作为因变量，对抗GGT5自身抗体和抗VCL自身抗体在卵巢癌组和健康对照组血清样本中的表达水平进行Logistic回归分析，构建诊断区分卵巢癌患者和健康对照的诊断模型，该诊断模型为：PRE(P＝OC)＝1/(1+EXP(-(-3.203+15.806×GGT5+5.980×VCL)))，该诊断模型中：PRE表示预测概率，GGT5表示抗GGT5自身抗体在受试者血清中的表达水平，VCL表示抗VCL自身抗体在受试者血清中的表达水平。再将各血清样本中抗GGT5自身抗体和抗VCL自身抗体的表达水平带入该诊断模型，即可得到各个血清样本的预测概率(即PRE值)，以预测概率PRE＝0.5为诊断区分卵巢癌患者和健康人的最佳截断值(当预测的概率PRE≥0.5时，判定受试者为卵巢癌患者；当预测的概率PRE＜0.5时，判定受试者为健康人)，并计算对应的灵敏度和特异度。根据预测概率绘制ROC曲线，ROC曲线如图6中A所示。

由图6中A可知，抗GGT5自身抗体和抗VCL自身抗体组合诊断区分卵巢癌患者和健康人的ROC曲线下面积AUC为0.77，对应的灵敏度为61.4％，特异度为75.2％。

(2)抗GGT5自身抗体和抗TRIM21自身抗体组合诊断区分卵巢癌患者和健康人

以实施例3中145例卵巢癌患者(卵巢癌组)和145例健康对照血清(健康对照组)中抗GGT5自身抗体和抗TRIM21自身抗体的表达水平(表达水平以最终检测的吸光度值结果表示)为自变量，是否为卵巢癌事件作为因变量，对抗GGT5自身抗体和抗TRIM21自身抗体在卵巢癌组和健康对照组血清样本中的表达水平进行Logistic回归分析，构建诊断区分卵巢癌患者和健康对照的诊断模型，该诊断模型为：PRE(P＝OC)＝1/(1+EXP(-(-3.194+19.350×GGT5+4.167×TRIM21)))，该诊断模型中：PRE表示预测概率，GGT5表示抗GGT5自身抗体在受试者血清中的表达水平，TRIM21表示抗TRIM21自身抗体在受试者血清中的表达水平。再将各血清样本中抗GGT5自身抗体和抗TRIM21自身抗体的表达水平带入该诊断模型，即可得到各个血清样本的预测概率(即PRE值)，以预测概率PRE＝0.5为诊断区分卵巢癌患者和健康人的最佳截断值(当预测的概率PRE≥0.5时，判定受试者为卵巢癌患者；当预测的概率PRE＜0.5时，判定受试者为健康人)，并计算对应的灵敏度和特异度。根据预测概率绘制ROC曲线，ROC曲线如图6中B所示。

由图6中B可知，抗GGT5自身抗体和抗TRIM21自身抗体组合诊断区分卵巢癌患者和健康人的ROC曲线下面积AUC为0.78，对应的灵敏度为64.1％，特异度为77.2％。

(3)抗VCL自身抗体和抗TRIM21自身抗体组合诊断区分卵巢癌患者和健康人

以实施例3中145例卵巢癌患者(卵巢癌组)和145例健康对照血清(健康对照组)中抗VCL自身抗体和抗TRIM21自身抗体的表达水平(表达水平以最终检测的吸光度值结果表示)为自变量，是否为卵巢癌事件作为因变量，对抗VCL自身抗体和抗TRIM21自身抗体在卵巢癌组和健康对照组血清样本中的表达水平进行Logistic回归分析，构建诊断区分卵巢癌患者和健康对照的诊断模型，该诊断模型为：PRE(P＝OC)＝1/(1+EXP(-(-2.799+9.344×VCL+4.500×TRIM21)))，该诊断模型中：PRE表示预测概率，VCL表示抗VCL自身抗体在受试者血清中的表达水平，TRIM21表示抗TRIM21自身抗体在受试者血清中的表达水平。再将各血清样本中抗VCL自身抗体和抗TRIM21自身抗体的表达水平带入该诊断模型，即可得到各个血清样本的预测概率(即PRE值)，以预测概率PRE＝0.5为诊断区分卵巢癌患者和健康人的最佳截断值(当预测的概率PRE≥0.5时，判定受试者为卵巢癌患者；当预测的概率PRE＜0.5时，判定受试者为健康人)，并计算对应的灵敏度和特异度。根据预测概率绘制ROC曲线，ROC曲线如图6中C所示。

由图6中C可知，抗VCL自身抗体和抗TRIM21自身抗体组合诊断区分卵巢癌患者和健康人的ROC曲线下面积AUC为0.74，对应的灵敏度为62.8％，特异度为76.6％。

2、三种抗肿瘤相关抗原自身抗体组合诊断区分卵巢癌患者和健康人的能力：

以实施例3中145例卵巢癌患者(卵巢癌组)和145例健康对照血清(健康对照组)中抗GGT5自身抗体、抗VCL自身抗体和抗TRIM21自身抗体的表达水平(表达水平以最终检测的吸光度值结果表示)为自变量，是否为卵巢癌事件作为因变量，对抗GGT5自身抗体、抗VCL自身抗体和抗TRIM21自身抗体在卵巢癌组和健康对照组血清样本中的表达水平进行Logistic回归分析，构建诊断区分卵巢癌患者和健康对照的诊断模型，该诊断模型为：PRE(P＝OC)＝1/(1+EXP(-(-3.919+15.112×GGT5+6.002×VCL+4.169×TRIM21)))，该诊断模型中：PRE表示预测概率，GGT5表示抗GGT5自身抗体在受试者血清中的表达水平，VCL表示抗VCL自身抗体在受试者血清中的表达水平，TRIM21表示抗TRIM21自身抗体在受试者血清中的表达水平。再将各血清样本中抗GGT5自身抗体、抗VCL自身抗体和抗TRIM21自身抗体的表达水平带入该诊断模型，即可得到各个血清样本的预测概率(即PRE值)，以预测概率PRE＝0.5为诊断区分卵巢癌患者和健康人的最佳截断值(当预测的概率PRE≥0.5时，判定受试者为卵巢癌患者；当预测的概率PRE＜0.5时，判定受试者为健康人)，并计算对应的灵敏度和特异度。根据预测概率绘制ROC曲线，ROC曲线如图6中D所示。

由图6中D可知，抗GGT5自身抗体、抗VCL自身抗体和抗TRIM21自身抗体组合诊断区分卵巢癌患者和健康人的ROC曲线下面积AUC为0.79(95％CI:0.74-0.84)，对应的灵敏度为66.2％，特异度为77.2％。

为了便于对比，将上述单个抗肿瘤相关抗原自身抗体或多个抗肿瘤相关抗原自身抗体组合诊断区分卵巢癌和健康人的ROC曲线AUC、灵敏度和特异度进行统计，结果如表1所示。

表1三种抗肿瘤相关抗原自身抗体诊断区分卵巢癌患者和健康人的评价结果

由表1可知，与单一抗肿瘤相关抗原自身抗体相比，任意两种抗肿瘤相关抗原自身抗体组合诊断区分卵巢癌患者和健康人时，其ROC曲线的AUC均能达到0.7以上，明显高于单一抗肿瘤相关抗原自身抗体；而且，当三种抗肿瘤相关抗原自身抗体组合诊断区分卵巢癌患者和健康人时，其ROC曲线的AUC达到了最大，为0.79；其诊断的灵敏度和特异度都达到了最高，分别为66.2％，77.2％。由此说明三种抗肿瘤相关抗原自身抗体联合诊断效果最佳。

3、采用验证集验证三种抗肿瘤相关抗原自身抗体组合诊断区分卵巢癌患者和健康人的能力

以实施例2纳入的60例卵巢癌患者血清样本(卵巢癌组)和60例健康对照血清样本(健康对照组)作为验证集样本，验证抗GGT5自身抗体、抗VCL自身抗体、抗TRIM21自身抗体组合诊断区分卵巢癌患者和健康对照的能力。

以实施例2中60例卵巢癌患者(卵巢癌组)和60例健康对照血清(健康对照组)中抗GGT5自身抗体、抗VCL自身抗体和抗TRIM21自身抗体的表达水平(表达水平以最终检测的吸光度值结果表示)带入上述步骤2构建的诊断模型PRE(P＝OC)＝1/(1+EXP(-(-3.919+15.112×GGT5+6.002×VCL+4.169×TRIM21)))中，即可得到各个血清样本的预测概率，以预测概率PRE＝0.5为诊断区分卵巢癌患者和健康对照的最佳截断值(当预测的概率PRE≥0.5时，判定受试者为卵巢癌患者；当预测的概率PRE＜0.5时，判定受试者为健康人)，并计算对应的灵敏度和特异度。根据预测概率绘制ROC曲线，ROC曲线如图7所示。

由图7可知，抗GGT5自身抗体、抗VCL自身抗体和抗TRIM21自身抗体组合诊断区分卵巢癌患者和健康人的ROC曲线下面积AUC为0.76(95％CI:0.68-0.85)，对应的灵敏度为63.3％，特异度为76.7％。

经验证发现，验证集中抗GGT5自身抗体、抗VCL自身抗体和抗TRIM21自身抗体诊断区分卵巢癌的能力与训练集基本一致，由此说明，本发明构建的三种抗肿瘤相关抗原自身抗体组合诊断卵巢癌的模型具有较好的稳定性。

上述实施例的作用在于说明本发明的实质性内容，但并不以此限定本发明的保护范围。本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和保护范围。

Claims (10)

1.一种用于卵巢癌诊断的生物标志物，其特征在于，所述生物标志物为抗肿瘤相关抗原GGT5自身抗体、抗肿瘤相关抗原VCL自身抗体、抗肿瘤相关抗原TRIM21自身抗体的组合。

2.根据权利要求1所述的生物标志物，其特征在于，抗肿瘤相关抗原GGT5自身抗体、抗肿瘤相关抗原VCL自身抗体、抗肿瘤相关抗原TRIM21自身抗体均为受试者血清、血浆、组织间隙液或尿液中对应的抗肿瘤相关抗原自身抗体。

3.用于检测权利要求1或2所述生物标志物的试剂在制备用于卵巢癌诊断的产品中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述试剂为通过酶联免疫吸附、蛋白芯片、免疫印迹或微流控免疫检测样本中所述生物标志物的试剂。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述样本为血清、血浆、组织间隙液或尿液。

6.根据权利要求5述的应用，其特征在于，所述试剂为检测所述生物标志物的抗原。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述产品为蛋白芯片、试剂盒或制剂。

8.一种用于卵巢癌诊断的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含用于检测权利要求1或2所述生物标志物的试剂。

9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒通过酶联免疫吸附、蛋白芯片、免疫印迹或微流控免疫检测样本中的所述生物标志物。

10.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒预测卵巢癌的概率计算公式为：

PRE =1 / (1 + EXP (- (-3.919 + 15.112 ×GGT5 + 6.002 ×VCL + 4.169 ×TRIM21)))，其中，PRE表示概率，GGT5表示抗肿瘤相关抗原GGT5自身抗体的表达量，VCL表示抗肿瘤相关抗原VCL自身抗体表达量，TRIM21表示抗肿瘤相关抗原TRIM21自身抗体表达量。

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