CN115074253A - 一种玉米白斑病的接种方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种玉米白斑病的接种方法，该方法为：采集发病典型玉米白斑病病叶，分离纯化病原菌，通过液体培养得到菌丝段和分生孢子混合液，在玉米的小喇叭口期，在菌丝段和分生孢子混合液中加入20％吐温溶液，对玉米叶片进行喷雾接种，接种后遮阴，第二天喷雾保湿，保持相对湿度在90％以上，第三天，在人工气候培养箱中培养，每天在20℃光照12h，16℃黑暗12h，交替进行，湿度在90％至玉米白斑病发病稳定。本发明以菌丝段和分生孢子混合液对玉米植株进行喷雾接种，发病均匀、发病快、效果显著、可操作性强、致病性测试周期短，不受季节、外部环境和地域等因素的限制，提高了玉米白斑病人工接种的成功率。

Description

一种玉米白斑病的接种方法
技术领域
本发明属于玉米白斑病技术领域，具体涉及一种玉米白斑病的接种方法。
背景技术
玉米白斑病(Epicoccum spp.)病斑最初较小，淡绿色，散生于叶片表面；病斑圆形、长形至长方形，0.3～2.0厘米，随着时间推移，病斑变白、变干，在叶片正反面大小和颜色完全一致，或者几近一致，类似百草枯除草剂引起的药害斑点；病斑边缘整齐清晰，有或无深褐色边缘，无放射状或不清晰的延伸线或延伸状斑；病斑有突然下陷的症状，严重时，病斑逐渐合并成不规则的大病斑，长达10厘米至整个叶片枯死，后期会出现破裂穿孔。该病可导致玉米果穗畸形、出籽率低，严重降低玉米产量和品质，损失率达到10％～70％。据报道，玉米白斑病广泛分布于中南美洲、亚洲和非洲雨水充足、温度适中的热带、亚热带高原地区，该病在中国已有较长的发生史，前期主要集中在西南地区，发病线逐渐呈北移趋势。但目前国内针对玉米白斑病的研究还比较少。
接种方法的确定对评价玉米抗玉米白斑病的抗性、防治玉米白斑病药剂的筛选、玉米白斑病发生扩展规律研究等具有重要作用。目前，关于玉米白斑病的接种方法报道较少，目前只有一种刮伤接种法，该方法需要使用刀片刮伤玉米叶片和茎秆，然后在受伤部位喷雾接种分生孢子悬浮液，保湿培养促进接种部位发病。该方法能在玉米的具***置进行接种，但是该方法存在明显的不足：(1)人为造成的伤口由于个体差异受伤严重度的不同，导致在进行玉米的抗病鉴定时，发病程度会造成人为误差；(2)人为造成伤口进行接种的方法，发病症状由于伤口愈合后组织变色的干扰，导致无法准确全部描述发病病斑症状的扩散过程，发病症状不典型；(3)人为造成伤口进行接种的方法，与病菌在自然环境中通过接触玉米表皮、然后附着在叶片、茎秆表面，进而侵入组织的侵染过程不同，造成在筛选防治玉米白斑病的防治药剂，研究病原菌侵染过程等时，无法完全模拟自然发病，对试验结果具有较大的干扰；(4)人为造成伤口接种，在保湿培养过程中杂菌会通过伤口侵染，干扰试验结果。所以，刮伤法虽然能够保证玉米植株在受伤部位发生白斑症状，但完全无法模拟自然状态下的发病过程，无法满足玉米抗病性鉴定工作及防治工作的要求。
因此，为了能够最大限度模拟白斑病菌自然侵染玉米的过程，开展玉米抗病性鉴定方面的试验，开展玉米白斑病的防治工作，建立一种针对玉米白斑病的无损且能够有效侵染的接种方法，是当前丞待解决的科学技术问题。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于针对上述现有技术的不足，提供一种玉米白斑病的接种方法，该方法通过人工气候培养室真实模拟出玉米白斑病发病所需要的适宜接种环境条件，以菌丝段和分生孢子混合液对玉米植株进行喷雾接种，接种后发病均匀、发病快、效果显著、可操作性强、致病性测试周期短，不受季节、外部环境和地域等因素的限制，有效地提高了玉米白斑病人工接种的成功率，有利于观察玉米白斑病菌侵染玉米植株的侵染动态变化，有利于对不同玉米材料进行抗病性鉴定。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种玉米白斑病的接种方法，该方法为：
S1、采集发病典型玉米白斑病病叶，分离纯化玉米白斑病病原菌(Epicoccumsorghinum)，通过液体培养得到菌丝段和分生孢子混合液；
分离纯化的玉米白斑病菌为高粱附球孢菌(Epicoccum sorghinum)，Epicoccumsorghinum作为玉米白斑病病原菌已被Tangmin(2021)等和邹成佳(2021)等报道)；
所述菌丝段和分生孢子混合液的分离纯化方法为：
在病健交界处切取若干尺寸为3mm×3mm小块，用质量分数为75％酒精溶液表面消毒30s，无菌水冲洗3次，再用质量分数为5％的NaClO溶液消毒60s，无菌水冲洗3次，晾干后，置于PDA培养基上，在温度为28℃的黑暗条件下培养，直至长出菌丝，挑取所述菌丝尖端移于新鲜PDA培基上培养，连续多次转接直至菌落形态一致后，挑取所述菌落，转移到PDA斜面上，在温度为4℃的条件下保存，通过致病性测定和形态学、分生生物学手段鉴定其为玉米白斑病病原菌，将病原菌株在PDA培养基上活化培养7天后，从菌落边缘取直径5mm的菌饼，取7块，置于装有300mL的PDB培养基中，在温度为28℃、160rpm的摇床上，黑暗的条件下震荡培养10天后，用破壁机打碎处理40s，经4层灭菌纱布过滤后，得到菌丝段和分生孢子混合液；
S2、在玉米的小喇叭口期，在S1中得到的菌丝段和分生孢子混合液中加入20％吐温溶液，对玉米叶片进行喷雾接种；
S3、接种后的玉米植株保持遮阴，接种当晚不进行喷水保湿，第二天进行喷雾保湿，保持相对湿度在90％以上，得到保湿处理后的玉米植株，第三天，将保湿处理后的玉米植株在人工气候培养箱中培养，至玉米白斑病发病稳定；
所述人工气候培养箱中培养的培养条件为：每天在温度为20℃的条件下光照培养12h，然后在温度为16℃的条件下黑暗培养12h，光照和黑暗交替进行，且保持相对湿度在90％以上。
优选地，S2中所述喷雾接种喷雾均匀，叶片均匀打湿。
优选地，S3中玉米白斑病发病稳定后，根据玉米白斑病叶片发病症状进行发病严重度描述：发病重、适中、轻和不发病等，统计病株率和病叶率，病叶率调查所有叶片。
优选地，S2中所述菌丝段和分生孢子混合液和20％吐温溶液的体积比为2000：1。
本发明与现有技术相比具有以下优点：
1、本发明能够最大限度的模拟自然条件下玉米白斑病的发病过程，进行批量的玉米材料的白斑病抗性测定及防治工作，满足后续试验的不同要求。
2、本发明采用菌丝段和分生孢子混合液喷雾接种无损伤玉米植株，接种效果均匀、发病快、显著、可操作性强、致病性测试周期短，不受季节、外部环境和地域等因素的限制，有效地提高了玉米白斑病人工接种的成功率。本发明摸清了玉米白斑病事宜发病的温度条件，在温度较低时(16℃～20℃)，有利于玉米白斑病的发病，不受季节、外部环境和地域等因素的限制，在人工气候室也能很好诱导玉米白斑病发病，有利于玉米白斑病菌侵染机制和不同玉米材料抗病性鉴定工作的研究。
3、本发明通过人工气候培养室真实模拟出玉米白斑病发病所需要的适宜接种环境条件，以菌丝段和分生孢子混合液对玉米植株进行喷雾接种，接种后发病均匀、发病快、效果显著、可操作性强、致病性测试周期短，不受季节、外部环境和地域等因素的限制，有效地提高了玉米白斑病人工接种的成功率，有利于观察玉米白斑病菌侵染玉米植株的侵染动态变化，有利于对不同玉米材料进行抗病性鉴定。通过本发明的方法玉米白斑病病株率可达96.30％，病叶率可达到75.35％。
下面结合实施例对本发明作进一步详细说明。
具体实施方式
实施例1
玉米白斑病(Epicoccum sorghinum)(Epicoccum sorghinum作为玉米白斑病病原菌已被Tangmin(2021)等和邹成佳(2021)等报道)
本实施例的玉米白斑病的接种方法，该方法为：
S1、采集发病典型玉米白斑病病叶，分离纯化玉米白斑病病原菌(Epicoccumsorghinum)，通过液体培养得到菌丝段和分生孢子混合液；
所述菌丝段和分生孢子混合液的分离纯化方法为：
在病健交界处切取若干尺寸为3mm×3mm小块，用质量分数为75％酒精溶液表面消毒30s，无菌水冲洗3次，再用质量分数为5％的NaClO溶液消毒60s，无菌水冲洗3次，晾干后，置于PDA培养基上，在温度为28℃的黑暗条件下培养，直至长出菌丝，挑取所述菌丝尖端移于新鲜PDA培基上培养，连续多次转接直至菌落形态一致后，挑取所述菌落，转移到PDA斜面上，在温度为4℃的条件下保存，通过致病性测定和形态学、分生生物学手段鉴定其为玉米白斑病病原菌，将病原菌株在PDA培养基上活化培养7天后，从菌落边缘取直径5mm的菌饼，置于装有300mL的PDB培养基中，在温度为28℃、160rpm的摇床上，黑暗的条件下震荡培养10天后，用破壁机打碎处理40s，经4层灭菌纱布过滤后，得到菌丝段和分生孢子混合液；
S2、在玉米的小喇叭口期，在S1中得到的菌丝段和分生孢子混合液中加入20％吐温溶液，对玉米叶片进行喷雾接种，喷雾均匀，叶片均匀打湿；
S3、接种后的玉米植株保持遮阴，接种当晚不进行喷水保湿，第二天进行喷雾保湿，保持相对湿度在90％以上，得到保湿处理后的玉米植株，第三天，将保湿处理后的玉米植株在人工气候培养箱中培养，至玉米白斑病发病稳定；玉米白斑病发病稳定后，根据玉米白斑病叶片发病症状进行发病严重度描述：发病重、适中、轻和不发病等，统计病株率和病叶率，病叶率调查所有叶片；
所述人工气候培养箱中培养的培养条件为：每天在温度为20℃的条件下光照培养12h，然后在温度为16℃的条件下黑暗培养12h，光照和黑暗交替进行，且保持相对湿度在90％以上。
本实施例同时对玉米白斑病的接种方法试验条件优化：
(一)不同接种方法接种效果
接种体制备：
方法一：将玉米白斑病(Epicoccum sorghinum)病原菌株在PDA培养基上活化培养7天后，从菌落边缘取直径5mm的菌饼(7块)置于装有300mL的PDB液体培养基的500mL三角瓶中，于摇床28℃、160rpm黑暗震荡培养10天，用破壁机打碎处理40s，4层灭菌纱布过滤获得菌丝段和分生孢子混合液，作为接种体备用。
方法二：将玉米白斑病(Epicoccum sorghinum)病原菌株在PDA培养基上活化培养7天后，之后将病原菌接种于经高温灭菌的高粱粒上(高粱粒培养基制备方法为：高粱粒煮30～40min，装入三角瓶中121℃灭菌1h，冷却后备用)，23℃～25℃条件下培养5～7天，待菌丝布满高粱粒，向三角瓶中加入少量无菌水，用灭菌玻璃棒搅拌打断菌丝，摇匀，放在23℃～25℃具有较高湿度的环境中黑光灯照射培养5～7天，镜检大量产孢后备用。
接种：选取种植于人工气候室的处于小喇叭口期的玉米若干盆待用，每盆种植3株玉米。试验设置3个处理：
1、喷雾接种法：直接在玉米叶片上喷雾菌丝段和分生孢子混合液，喷雾时加入少许20％吐温溶液，喷雾直至叶面湿润为止；喷雾菌丝段和分生孢子混合液和20％吐温溶液的体积比为2000：1(本实施例的方法)；
2、带菌高粱粒投芯接种法：将制备好的带菌高粱粒直接投入玉米叶芯内，每株投掷10粒左右；
3、带菌高粱粒叶鞘嵌入法：将带菌高粱粒直接嵌入到玉米叶鞘根部，每叶鞘10粒左右，每片叶鞘都镶嵌。
以上各处理重复3次，每重复3盆，每盆3株植株。接种后的植株保持遮阴，接种当晚不进行喷水保湿，次日开始喷雾保湿，保持相对湿度在90％以上，1天后放入20℃12h光照、16℃12h黑暗人工气候室内培养，直至发病充分后调查病害发生情况。
病害调查：发病稳定后，根据玉米白斑病叶片发病症状进行发病严重度描述，统计病株率和病叶率。试验结果得到，3种接种方法中，喷雾接种方法发病效果较明显，发病较重，病斑分布均匀，症状典型(与田间发病症状一致)，病株率能够达到96.30％，病叶率可达到75.35％；带菌高粱粒投芯接种方法，虽然病株率较高，毁灭性强，但是其发病症状、发病部位不具有代表性，病叶率仅达到44.45％；带菌高粱粒叶鞘嵌入接种方法病株率、病叶率和发病症状均较轻(表1)。综合试验结果得到：玉米白斑病最佳接种方法为：菌丝段+分生孢子混合液喷雾接种。
玉米白斑病发病稳定后，根据玉米白斑病叶片发病症状进行发病严重度描述：发病重、适中、轻和不发病等，统计病株率和病叶率，病叶率调查所有叶片。
表1不同接种方法处理对玉米白斑病发病情况的影响
Figure BDA0003709106400000071
注：同列数据后字母不同代表差异显著(P＜0.05)
(二)不同人工气候室条件发病效果
接种方法选择菌丝段和分生孢子混合液喷雾接种法，方法步骤同本实施例的接种方法。接种后的植株保持遮阴，接种当晚不进行喷水保湿，次日开始喷雾保湿，保持相对湿度在90％以上，1天后植株放入不同条件人工气候室内培养，试验设置3个人工气候室条件处理：
1、20℃12h光照、16℃12h黑暗处理；(本实施例的方法)
2、24℃12h光照、20℃12h黑暗处理；
3、28℃12h光照、24℃12h黑暗处理。
各处理重复3次，每重复3盆，每盆3株植株。直至发病充分后调查病害发生情况。调查方法同实施例1。
结果得到：各处理之间病株率均存在显著差异性，20℃12h光照、16℃12h黑暗处理病株率、病叶率均较高，病株率和病叶率分别为96.30％和75.35％；其次是24℃12h光照、20℃12h黑暗处理，病株率和病叶率分别为78.95％和65.47；处理28℃12h光照、24℃12h黑暗病株率和病叶率均较低，分别为42.63％和25.42(表2)。说明温度对玉米白斑病发病影响较大，在温度较低时(16℃～20℃)，有利于玉米白斑病的发病。
玉米白斑病发病稳定后，根据玉米白斑病叶片发病症状进行发病严重度描述：发病重、适中、轻和不发病等，统计病株率和病叶率，病叶率调查所有叶片。
Figure BDA0003709106400000081
Figure BDA0003709106400000082
表2不同人工气候室条件处理对玉米白斑病发病情况的影响
Figure BDA0003709106400000083
Figure BDA0003709106400000091
注：同列数据后字母不同代表差异显著(P＜0.05)
以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何限制。凡是根据发明技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、变更以及等效变化，均仍属于本发明技术方案的保护范围内。

Claims (3)

1.一种玉米白斑病的接种方法，其特征在于，该方法为：
S1、采集发病典型玉米白斑病病叶，分离纯化玉米白斑病病原菌Epicoccumsorghinum，通过液体培养得到菌丝段和分生孢子混合液；
所述菌丝段和分生孢子混合液的分离纯化方法为：
在病健交界处切取若干尺寸为3mm×3mm小块，用质量分数为75％酒精溶液表面消毒30s，无菌水冲洗3次，再用质量分数为5％的NaClO溶液消毒60s，无菌水冲洗3次，晾干后，置于PDA培养基上，在温度为28℃的黑暗条件下培养，直至长出菌丝，挑取所述菌丝尖端移于新鲜PDA培基上培养，连续多次转接直至菌落形态一致后，挑取所述菌落，转移到PDA斜面上，在温度为4℃的条件下保存，通过致病性测定和形态学、分生生物学手段鉴定其为玉米白斑病病原菌，将病原菌株在PDA培养基上活化培养7天后，从菌落边缘取直径5mm的菌饼，取7块，置于装有300mL的PDB培养基中，在温度为28℃、160rpm的摇床上，黑暗的条件下震荡培养10天后，用破壁机打碎处理40s，经4层灭菌纱布过滤后，得到菌丝段和分生孢子混合液；
S2、在玉米的小喇叭口期，在S1中得到的菌丝段和分生孢子混合液中加入20％吐温溶液，对玉米叶片进行喷雾接种；
S3、接种后的玉米植株保持遮阴，接种当晚不进行喷水保湿，第二天进行喷雾保湿，保持相对湿度在90％以上，得到保湿处理后的玉米植株，第三天，将保湿处理后的玉米植株在人工气候培养箱中培养，至玉米白斑病发病稳定；
所述人工气候培养箱中培养的培养条件为：每天在温度为20℃的条件下光照培养12h，然后在温度为16℃的条件下黑暗培养12h，光照和黑暗交替进行，且湿度保持在90％。
2.根据权利要求1所述的一种玉米白斑病得到接种方法，其特征在于，S2中所述喷雾接种喷雾均匀，叶片均匀打湿。
3.根据权利要求1所述的一种玉米白斑病得到接种方法，其特征在于，S2中所述菌丝段和分生孢子混合液和20％吐温溶液的体积比为2000：1。
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