CN115073566A - 幽门螺杆菌特异性免疫原性肽段 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种幽门螺杆菌特异性免疫原性肽段，其包含如SEQ ID No.1所示的氨基酸序列。本发明的抗原可用于制备新的H.pylori疫苗以及其他用于H.pylori治疗的主动或被动性免疫学疗法，对于H.pylori感染的防治具有重要意义。

Description

幽门螺杆菌特异性免疫原性肽段
技术领域
本发明涉及一种幽门螺杆菌特异性免疫原性肽段。
背景技术
全球约有超过50%的人口感染幽门螺杆菌（H. pylori），其中以亚洲和非洲等发展中国家多见。几乎所有H. pylori感染患者都会有慢性胃炎，其中约10%发展为消化性溃疡，有1%在未来十几年到几十年内进展为胃癌。在我国，幽门螺杆菌感染率为40%~90%，平均59%。因此，预防和治疗H. pylori感染是防治消化道溃疡和慢性胃炎以及防止胃癌发生的重要手段。
临床上针对H. pylori感染的治疗主要依靠以抗生素为主的三联或四联疗法，但存在许多问题，如费用昂贵、耐药菌株不断增加、破坏肠道正常菌群、停药后易复发与再次感染等。尤其是耐药性上升的问题，导致幽门螺杆菌感染的治疗越来越困难。
在H. pylori感染过程中，部分膜蛋白或菌体蛋白可引起人体免疫反应，与H.pylori的黏附定植、持续感染以及疾病的严重程度密切相关。目前，除抗生素治疗之外，以膜蛋白和/或其他菌体蛋白为靶标，制备相关疫苗的免疫治疗方法也被用于治疗H. pylori感染。如利用H. pylori重组尿素酶及其亚单位、细胞毒素相关蛋白（CagA）、空泡毒素相关蛋白（VacA）、黏附素A（HpaA）等制备的H. pylori疫苗研究均已有部分进展。
然而，目前已有的H. pylori疫苗都不能起到根除H. pylori的作用，迫切需要探寻新的免疫原性蛋白靶点，为制备有效的H. pylori疫苗提供基础。
发明内容
本发明的目的是提供一种新的具有免疫源性的幽门螺杆菌特异性免疫原性肽段。
本发明采用如下技术方案：
一种幽门螺杆菌特异性免疫原性肽段，其包含如SEQ ID No.1所示的氨基酸序列。
一种编码上述幽门螺杆菌特异性免疫原性肽段的核酸分子，其包含如SEQ IDNo.2所示的核苷酸序列。
一种包含上述核酸分子的载体。
一种利用上述幽门螺杆菌特异性免疫原性肽段制备的单克隆抗体。
一种利用上述幽门螺杆菌特异性免疫原性肽段制备的疫苗，所述疫苗用于刺激宿主生物的免疫应答反应。
一种幽门螺杆菌特异性免疫原性蛋白，其包含如SEQ ID No.1所示的氨基酸序列的膜蛋白。
进一步的，所述幽门螺杆菌特异性免疫原性蛋白为包含如SEQ ID No.3所示氨基酸序列的膜蛋白pgbB。
本发明的有益效果在于：本发明的抗原可用于制备新的H. pylori疫苗以及其他用于H. pylori治疗的主动或被动性免疫学疗法，对于H. pylori感染的防治具有重要意义。
附图说明
图1为双向电泳和免疫印迹检测H. pylori牛奶抗体免疫膜蛋白靶点。
图2为免疫琼脂双向扩散试验H. pylori牛奶抗体免疫膜蛋白靶点。
图3为IP试验检测H. pylori牛奶抗体免疫膜蛋白靶点。
图4为ELISA验证抗原性实验。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
一、幽门螺杆菌的培养
将幽门螺杆菌临床分离株HP435接种在直径9 cm的含有10%脱纤维羊血的改良弯曲菌培养基（Campy-BAP），37 ℃，微需氧（5% O2，10% CO2，85% N2，湿度95%）培养3~4天。
二、提取幽门螺杆菌膜蛋白
使用无菌的0.1 mol/L磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤H. pylori菌细胞3次，并悬于20%甘油肉汤中冻存-80 ℃备用。对于制备膜蛋白的菌株，应该无菌0.1 mol/L PBS洗涤H.pylori细胞3次。配制浓度为250 μg/ml的EZ-Link Sulfo-NHS-SS-biotin生物素反应液，标记新鲜洗涤的H. pylori细胞膜蛋白。将标记的菌体细胞超声破碎（3s on/7s off，强度20%，5 min）。4 ℃条件下，12,000 g离心30 min，收集富含H. pylori膜蛋白的上清液。而后，使用亲和素蛋白层析柱纯化膜蛋白。
三、奶牛免疫和制备抗体
3.1 奶牛免疫
挑选3-4岁龄，孕6-7个月，健康荷斯坦牛。配制5 mg膜蛋白加4×109个全菌细胞，用0.1 mol/L PBS定容至5 ml，与氢氧化铝佐剂（明矾佐剂）5 ml 震荡混匀，对奶牛进行5次颈部皮下和肋骨髂下***皮下注射免疫免疫。其中第一次和第二次免疫间隔20天，之后第10天免疫一次至奶牛产犊前10天结束。
3.2制备抗体
收集奶牛产犊后一周内的初乳，3500 g 4 ℃离心20 min，加入适量盐酸调节pH至4.6，12000 rpm 4 ℃离心30 min去除酪蛋白沉淀，留取澄清上清（乳清）。使用GE蛋白纯化仪，连接Hitrap Protein G HP 1 ml纯化柱，对提取的富含抗体的乳清进行抗体纯化。使用ELISA方法，对获得的纯化抗体进行抗体效价检测。获得抗体效价为1:15000的纯化抗体。
四、使用三种方法，鉴定免疫原性膜蛋白
4.1二维电泳和免疫印迹法检测与牛奶抗体免疫原性阳性的H. pylori膜蛋白
用同一种Cy染料标记两份（各150 μg蛋白）HP435菌株膜蛋白样本，同时进行二维电泳。使用Typhoon多色荧光成像扫描仪对两板二维电泳后的PAGE胶均进行成像定位。而后，使用本发明制备的纯化抗体作为一抗，用Cy5或Cy3标记（与标记蛋白样本的染料区别开）的羊抗牛二抗，对其中一板PAGE胶进行免疫印迹试验。检测免疫原性蛋白点。
结果发现，可鉴定到6~8个免疫反应阳性蛋白点（见图1）。对应免疫印迹试验结果和免疫反应阳性蛋白点在原胶上的位置，挖下另一板PAGE胶上对应位置的蛋白胶点，进行蛋白质谱鉴定。结果发现可鉴定得到112种蛋白。
4.2 免疫琼脂双向扩散法检测与牛奶抗体免疫原性阳性的H. pylori膜蛋白
将HP435菌株的全菌悬液分别与空白组抗体和免疫后的纯化抗体进行免疫琼脂双向扩散试验（见图2）。
结果发现，纯化抗体和全菌悬液之间出现了明显的抗原抗体沉淀线。沉淀线切下，与5×蛋白上样缓冲液煮沸变性后，进行SDS-PAGE电泳。电泳后将PAGE胶进行考马斯亮蓝染色，将显色的蛋白条带切下，胶内酶解后进行质谱鉴定。结果发现可以鉴定得到501种蛋白。
4.3 IP试验及蛋白质谱鉴定
将提取H. pylori膜蛋白与纯化抗体进行IP试验。将IP后的蛋白进行SDS-PAGE电泳，考马斯亮蓝染色，并将显色的蛋白条带进行胶内酶解和质谱鉴定（见图3）。结果发现可鉴定得到403种蛋白。
五、对鉴定结果的进一步分析
5.1 对三种免疫学鉴定方法检测得到的蛋白鉴定结果进行交集分析，发现13种共同蛋白。其中，氨基酸序列如SEQ ID No.3所示的pgbB为新发现的具有免疫原性膜蛋白。
SEQ ID No.3：
MNKPFLILLIALIVFSGCNMKKYFKPAKHQIKGEAYFPNHLQESIVSSNRYGAILKNGAVIGDKGLTQLRIGKNFNYESSFLNESQGFFILAQDCLNKIDKKTSKSKVAKTEETELKLKGVEAEVQDKVCHQVELISNNPNASQQSIIIPLETFALSASVKGNLLAVVLADNSANLYDITSQKLLFSEKGSPSTTINSLMAMPIFMDTVVVFPMLDGRLLVVDYVHGNPTPIRNIVISSDKFFNNITYLIVDGNNMIASTGKRILSVVSGQEFNYDGDIVDLLYDKGTLYVLTLDGQILQMDKSLRELNSVKLPFASLNTIVLNHNKLYSLEKRGYVIEVDLNDFNSYNVYKTPTIGSFKFFSSNRLDKGVFYDKNRVYYDRYYLDYNNFKPKLYPVVEKPASKKSQKGEKGNAPIYLQERHKAKEKPLEENKVKPRNSGFEEDEVKANQRGMEPINNQNNANDENKVGNENNAIQRGENKNAPVSKESNAFKEAPKLSPKEEKRRLKEEKKKAKAEQRAREFEQRAREQQERDEKELEERRKALKTK。
5.2 使用Bepipred Linear Epitope Prediction 2.0对上述膜蛋白进行免疫原性序列分析，发现其中的SEQ ID No.1（QERHKAKEKPLE）是强免疫原性的肽段（评分最高），其对应的核苷酸序列为SEQ ID No.2：CAAGAAAGGCATAAAGCTAAAGAAAAGCCTTTAGAA。
5.3 为了进一步验证该肽段的免疫原性，通过多肽合成公司，合成SEQ ID No.1所示多肽5mg（纯度98%）；合成非免疫原性的肽段5mg做对照。
5.4 ELISA验证
（1）多肽预处理：首先将100mg BSA溶于5mL水，100mg EDC 溶于3mL水，然后将BSA溶液搅拌着逐滴加入EDC，室温搅拌反应10min，将5mg合成多肽溶解在200μL DMSO中，再加入800 μL PBS混匀，逐滴加入活化的BSA（搅拌状态），室温反应1h，然后将混合好的溶液加入透析袋中，4℃透析过夜，第二天将多肽从透析袋中取出。
（2）ELISA包板：首先用紫外线照射聚苯乙烯板2h，然后用包被缓冲液（coatingbuffer：Na2CO3和NaHCO3缓冲液）将合成多肽稀释至0.1mg/ml，在每个聚苯乙烯板的反应孔中加50μL，4℃过夜，次日，弃去孔内溶液，用1×TBST洗涤缓冲液以每孔180μL洗1次。
（3）封闭：每孔加60μL的1% BSA（TBST配制）进行封闭，置37℃孵育1小时。之后弃封闭液。
（4）加样：把收集的免疫乳清（见步骤3.2）梯度稀释后，50μL/孔，置37℃ 孵育1小时，之后弃封闭液，用1×TBST洗涤缓冲液以每孔180μL洗2次。
（5）加酶标抗体：将新鲜稀释的羊抗牛二抗-HRP（用1%BSA进行稀释至1∶5000），以50μL/孔加入酶标板孔中，置37℃孵育45min，之后弃封闭液，用1×TBST缓冲液以每孔180μL洗3次。
（6）加底物液显色：于各反应孔中加入临时配制的TMB底物溶液100μL，置37℃反应5min，如图4所示。
（7）终止反应：于各反应孔中加入2M硫酸90μL。
（8）在酶标仪上测450nm 波长的吸光度值，以OD450 0.5的最大稀释倍数为抗体效价（是阴性孔OD值的2.1倍以上）。强免疫原性肽段的抗体效价（1∶15000）是对照肽段抗体效价（1∶6000）的2.5倍。
5.4小鼠验证
将SEQ ID No.1所示多肽+BSA+弗氏完全佐剂充分乳化，BALB/c 小鼠四肢及背部皮下多点注射多肽50μg/只；2周后进行第2次免疫，将SEQ ID No.1所示多肽+BSA+弗氏不完全佐剂充分混合，四肢及背部皮下多点注射25μg/只，2周后第3次免疫，同第2次。第3次免疫后7-10 d眼球取血用间接ELISA测血清抗体效价（1:4000）（实验方法同前牛奶抗体）。对照组用PBS注射。
SEQUENCE LISTING
<110> 河北医科大学第四医院，河北医科大学
<120> 幽门螺杆菌特异性免疫原性肽段
<130> 2021
<160> 3
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 1
Gln Glu Arg His Lys Ala Lys Glu Lys Pro Leu Glu
1 5 10
<210> 2
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 2
caagaaaggc ataaagctaa agaaaagcct ttagaa 36
<210> 3
<211> 548
<212> PRT
<213> Helicobacter pylori
<400> 3
Met Asn Lys Pro Phe Leu Ile Leu Leu Ile Ala Leu Ile Val Phe Ser
1 5 10 15
Gly Cys Asn Met Lys Lys Tyr Phe Lys Pro Ala Lys His Gln Ile Lys
20 25 30
Gly Glu Ala Tyr Phe Pro Asn His Leu Gln Glu Ser Ile Val Ser Ser
35 40 45
Asn Arg Tyr Gly Ala Ile Leu Lys Asn Gly Ala Val Ile Gly Asp Lys
50 55 60
Gly Leu Thr Gln Leu Arg Ile Gly Lys Asn Phe Asn Tyr Glu Ser Ser
65 70 75 80
Phe Leu Asn Glu Ser Gln Gly Phe Phe Ile Leu Ala Gln Asp Cys Leu
85 90 95
Asn Lys Ile Asp Lys Lys Thr Ser Lys Ser Lys Val Ala Lys Thr Glu
100 105 110
Glu Thr Glu Leu Lys Leu Lys Gly Val Glu Ala Glu Val Gln Asp Lys
115 120 125
Val Cys His Gln Val Glu Leu Ile Ser Asn Asn Pro Asn Ala Ser Gln
130 135 140
Gln Ser Ile Ile Ile Pro Leu Glu Thr Phe Ala Leu Ser Ala Ser Val
145 150 155 160
Lys Gly Asn Leu Leu Ala Val Val Leu Ala Asp Asn Ser Ala Asn Leu
165 170 175
Tyr Asp Ile Thr Ser Gln Lys Leu Leu Phe Ser Glu Lys Gly Ser Pro
180 185 190
Ser Thr Thr Ile Asn Ser Leu Met Ala Met Pro Ile Phe Met Asp Thr
195 200 205
Val Val Val Phe Pro Met Leu Asp Gly Arg Leu Leu Val Val Asp Tyr
210 215 220
Val His Gly Asn Pro Thr Pro Ile Arg Asn Ile Val Ile Ser Ser Asp
225 230 235 240
Lys Phe Phe Asn Asn Ile Thr Tyr Leu Ile Val Asp Gly Asn Asn Met
245 250 255
Ile Ala Ser Thr Gly Lys Arg Ile Leu Ser Val Val Ser Gly Gln Glu
260 265 270
Phe Asn Tyr Asp Gly Asp Ile Val Asp Leu Leu Tyr Asp Lys Gly Thr
275 280 285
Leu Tyr Val Leu Thr Leu Asp Gly Gln Ile Leu Gln Met Asp Lys Ser
290 295 300
Leu Arg Glu Leu Asn Ser Val Lys Leu Pro Phe Ala Ser Leu Asn Thr
305 310 315 320
Ile Val Leu Asn His Asn Lys Leu Tyr Ser Leu Glu Lys Arg Gly Tyr
325 330 335
Val Ile Glu Val Asp Leu Asn Asp Phe Asn Ser Tyr Asn Val Tyr Lys
340 345 350
Thr Pro Thr Ile Gly Ser Phe Lys Phe Phe Ser Ser Asn Arg Leu Asp
355 360 365
Lys Gly Val Phe Tyr Asp Lys Asn Arg Val Tyr Tyr Asp Arg Tyr Tyr
370 375 380
Leu Asp Tyr Asn Asn Phe Lys Pro Lys Leu Tyr Pro Val Val Glu Lys
385 390 395 400
Pro Ala Ser Lys Lys Ser Gln Lys Gly Glu Lys Gly Asn Ala Pro Ile
405 410 415
Tyr Leu Gln Glu Arg His Lys Ala Lys Glu Lys Pro Leu Glu Glu Asn
420 425 430
Lys Val Lys Pro Arg Asn Ser Gly Phe Glu Glu Asp Glu Val Lys Ala
435 440 445
Asn Gln Arg Gly Met Glu Pro Ile Asn Asn Gln Asn Asn Ala Asn Asp
450 455 460
Glu Asn Lys Val Gly Asn Glu Asn Asn Ala Ile Gln Arg Gly Glu Asn
465 470 475 480
Lys Asn Ala Pro Val Ser Lys Glu Ser Asn Ala Phe Lys Glu Ala Pro
485 490 495
Lys Leu Ser Pro Lys Glu Glu Lys Arg Arg Leu Lys Glu Glu Lys Lys
500 505 510
Lys Ala Lys Ala Glu Gln Arg Ala Arg Glu Phe Glu Gln Arg Ala Arg
515 520 525
Glu Gln Gln Glu Arg Asp Glu Lys Glu Leu Glu Glu Arg Arg Lys Ala
530 535 540
Leu Lys Thr Lys
545

Claims (7)

1.一种幽门螺杆菌特异性免疫原性肽段，其特征在于，其包含如SEQ ID No.1所示的氨基酸序列。
2.一种编码如权利要求1所述的幽门螺杆菌特异性免疫原性肽段的核酸分子，其特征在于，其包含如SEQ ID No.2所示的核苷酸序列。
3.一种包含如权利要求2所述的核酸分子的载体。
4.一种利用如权利要求1所述的幽门螺杆菌特异性免疫原性肽段制备的单克隆抗体。
5.一种利用如权利要求1所述的幽门螺杆菌特异性免疫原性肽段制备的疫苗，所述疫苗用于刺激宿主生物的免疫应答反应。
6.一种幽门螺杆菌特异性免疫原性蛋白，其特征在于，其包含如SEQ ID No.1所示的氨基酸序列的膜蛋白。
7.根据权利要求6所述的幽门螺杆菌特异性免疫原性蛋白，其特征在于，其为包含如SEQ ID No.3所示氨基酸序列的膜蛋白pgbB。
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