CN115068480A - 细胞***周期蛋白42小分子抑制剂在制备治疗慢性肾脏病药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种提供了细胞***周期蛋白42小分子抑制剂在制备治疗慢性肾脏病药物中的应用，该治疗慢性肾脏病的药物包括细胞***周期蛋白42小分子抑制剂ZCL‑278和可接受的载体。本发明首次发现ZCL‑278具有很好的生物利用度，在肾脏组织中可以稳定沉积，ZCL‑278可以作为CKD的治疗药物。实验结果显示，给予ZCL‑278药物灌胃后，能够显著降低血浆中的血肌酐、尿素氮水平，还能显著减轻肾脏炎性损伤和肾脏纤维化的形成，ZCL‑278具有很好的慢性肾脏病治疗效果，且在实验过程中并未表现出副作用等不良反应，有望开发成为新一代安全有效、用于治疗慢性肾脏病的药物，具有重要的指导意义。

Description

细胞***周期蛋白42小分子抑制剂在制备治疗慢性肾脏病药 物中的应用

技术领域

本发明涉及肾脏病药物的研究领域，尤其是涉及细胞***周期蛋白42小分子抑制剂在制备治疗慢性肾脏病药物中的应用。

背景技术

慢性肾脏病（Chronic kidney disease，CKD）是指各种原因引起的慢性肾脏结构和功能障碍（病程时间≥3个月），包括肾小球滤过率正常和不正常的病理损伤、血液或尿液成分异常，影像学检查异常，或不明原因肾小球滤过率下降超过3个月。引起CKD的疾病包括各种原发的、继发的肾小球肾炎、肾小管损伤和肾血管的病变等。目前，在世界范围内，CKD的患病率为11%-13%，大约有7亿患者，超过了糖尿病、慢性阻塞性肺疾病等疾病的患病率。预估计，到2040年CKD将成为全球第五大死亡原因。据中华医学会肾脏病学分会公布的数据显示，我国CKD的患病率为10.8%，总人数超过了1亿。CKD已成为一项全世界公共的健康问题，发病率、患病率和医疗花销不断走高但预后不佳，给个人和社会都造成了沉重的负担。

CKD若得不到早期、有效的治疗干预，则会逐渐发展为终末期肾脏病（End stagerenal disease, ESRD），需要进行血液透析、腹膜透析或肾脏移植治疗，医疗开销更大、治愈率低。因此，对已有的肾脏疾病或可能引起肾脏损害的疾病进行有效的治疗，对预防慢性肾衰竭的发生至关重要。因而，迫切需要开发新颖、有效的CKD治疗药物。

细胞***周期蛋白（Cell devision cycle 42, Cdc42）是Rho鸟嘌呤三核苷酸酶（Rho-guanosine triphosphatase，Rho-GTPase）家族重要成员之一，可通过失活（与鸟苷二磷酸GDP结合）与活化（与GTP结合）状态的转换对细胞外信号作出应答，发挥分子开关作用。Cdc42主要通过影响细胞骨架和膜转运来调节细胞增殖、运动、极性、***和生长等生物过程，在多种疾病的病理生理改变中发挥关键调控作用。恶性肿瘤作为目前对人类健康造成威胁的最大的一类疾病，其生长、转移依赖于肿瘤细胞的生长、繁殖和迁移。

目前关于Cdc42相关研究主要聚焦于其在恶性肿瘤中的信号通路调控作用，包括肺癌、***癌、***、皮肤黑色素瘤、胰腺癌等。Cdc42通过影响细胞形态、细胞迁移，以及细胞周期进展、基因转录调节、生长和增殖对肿瘤起调控作用。Cdc42在肿瘤中的异常表达是判断疾病预后的重要指标，具有潜在的临床意义，其信号途径有望成为肿瘤治疗的新靶点。

小分子抑制剂是一类分子量小于1000道尔顿的有机化合物分子，能够靶向作用于目标蛋白，降低蛋白活性或阻碍蛋白-蛋白之间相互作用。小分子抑制剂的结构往往具有良好的空间分散性，其物理结构和化学性质决定了其良好的成药潜能，这些特点使得针对确定靶点而设计合成的小分子抑制剂在药物研发过程表现出巨大优势，逐渐受到市场青睐。

靶向蛋白-蛋白相互作用（PPI）是一种极具吸引力的小分子抑制剂设计策略，通过该设计策略筛选出的具备良好稳定性、口服生物利用度和跨膜能力的小分子抑制剂已成为多种疾病领域的候选药物。ZCL-278是一种高效的、可较好渗透细胞膜的Cdc42靶向小分子抑制剂，可通过抑制Cdc42与Intersectin-1（ITSN1）的蛋白-蛋白相互作用，抑制基于肌动蛋白的细胞功能，进而调节下游信号通路。然而，目前并没有将小分子抑制剂ZCL-278用于CKD治疗药物的相关报道。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了细胞***周期蛋白42小分子抑制剂在制备治疗慢性肾脏病药物中的应用，是在细胞***周期蛋白42小分子抑制剂原有功效的基础上进行的新的用途的开发。实验结果显示，细胞***周期蛋白42小分子抑制剂ZCL-278具有很好的治疗慢性肾脏病的作用，且无不良反应。

为实现本发明目的，本发明采用以下技术方案：

本发明提供了细胞***周期蛋白42小分子抑制剂在制备治疗慢性肾脏病药物中的应用，细胞***周期蛋白42小分子抑制剂为ZCL-278，其化学式为：

。

在本发明中，上述用于治疗慢性肾脏病的药物包括ZCL-278和可接受的载体，药物中ZCL-278的给药量至少为2mg/kg。

在本发明中，上述治疗慢性肾脏病药物包括ZCL-278，该药物为口服制剂和/或注射剂。其中，口服制剂为片剂、丸剂、口服液剂、胶囊剂、糖浆剂、滴丸剂或颗粒剂；注射剂包括注射粉针剂或注射液。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明首次发现ZCL-278具有很好的生物利用度，在肾脏组织中可以稳定沉积，ZCL-278可以作为CKD的治疗药物。实验结果显示，给予ZCL-278药物灌胃后，能够显著降低血浆中的血肌酐、尿素氮水平，还能显著减轻肾脏炎性损伤和肾脏纤维化的形成，ZCL-278具有很好的慢性肾脏病治疗效果，且在实验过程中并未表现出副作用等不良反应，有望开发成为新一代安全有效、用于治疗慢性肾脏病的药物，具有重要的指导意义。

附图说明

图1是本发明实施例1中ZCL-278的合成路线图。

图2是本发明实施例1中ZCL-278-C13内标物的合成路线图。

图3是本发明实施例2中ZCL-278在雄性大鼠模型各组织中的分布图。

图4是本发明实施例2中ZCL-278在雌性大鼠模型各组织中的分布图。

图5是本发明实施例2中肾脏组织Cdc42-GTP的Westernblot检测结果（图中，*P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001; NS, 无统计学差异）。

图6是本发明实施例2中肾脏组织Cdc42-GTP免疫组化检测结果（图中，*P<0.05,**P<0.01, ***P<0.001; NS, 无统计学差异）。

图7是本发明实施例5中ZCL-278对小鼠模型血浆中肌酐的影响。

图8是本发明实施例5中ZCL-278对小鼠模型血浆中尿素氮的影响。

图9是本发明实施例5中ZCL-278对小鼠模型体重的影响。

其中，在图7-9中：CKD+HD组与CKD组：*P<0.05, **P<0.01；CKD+LD组与 CKD组：^# P<0.05, ^## P<0.01；NS，无统计学差异。

图10是本发明实施例5中各组小鼠模型的肾组织染色结果图。

其中：A图为苏木精-伊红染色；B图为过碘酸六胺银染色；C图为马松染色；D图为天狼猩红染色。

图11是本发明实施例5中各组小鼠模型肾组织的免疫组织化染色结果。

其中：A图为脏组织炎性细胞标志物F4/80免疫组化染色；B图为肾脏组织纤维化指标α-SMA免疫组化染色；C图为肾脏组织纤维化指标Collagen I免疫组化染色；D图为肾脏组织纤维化指标Fibronectin免疫组化染色。

在上图中，*P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001; NS，无统计学差异。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明做更加详细的说明，以便于本领域技术人员的理解。如无特殊说明，本发明所用的试剂均为常规试剂，采用的仪器和方法也为本领域常规仪器和方法。

实施例1 ZCL-278以及ZCL-278内标物的合成

第一，Cdc42小分子抑制剂ZCL-278的合成

ZCL-278的合成路线见图1，具体步骤如下：

步骤S1，将20.70 g（100.0 mmol ）4-溴-2-氯苯酚和20.0g（120.0 mmol）2-溴乙酸乙酯加入到250mL二甲基甲酰胺溶液中，再向溶液中加入34.50g（250.0mmol）无水碳酸钾，于70℃恒温搅拌过夜，将反应后的混合物倒入500mL超纯水中，用150mL乙酸乙酯提取4次。将提取得到的有机层混合，用100mL化工卤水洗涤3次，干燥，真空浓缩，得到淡棕色的油性化合物2；

步骤S2，将30.10g（100.0mmol）油性化合物2加入250mL二恶烷中，再加入250mL 1M氢氧化钠溶液；室温搅拌过夜；用1M盐酸调节反应体系的pH至3.0，再用乙酸乙酯（每次用量150mL）萃取4次，将萃取得到的有机层合并后用化工卤水洗涤4次，干燥，真空浓缩，得到白色粉末状的固体化合物3；

步骤S3，称取5.39g（20.0mmol）化合物3于圆底烧瓶中，然后依次加入50mL二氯亚砜和5滴二甲基甲酰胺，加热回流3h，蒸馏脱除二氯亚砜，真空干燥30min，得到羟基被氯取代的油状化合物4；

步骤S4，将6.50g（20.0mmol）油状化合物4加入100mL干丙酮中，再在0℃下滴加100mL硫氰酸钠的丙酮溶液（硫氰酸钠的加入量为3.27g，即40.0mmol），将混合液于30℃恒温搅拌3h；搅拌结束后冷却至0℃，在0℃下加入5.56 g（20.0mmol） 4-氨基-N-(4,6-二甲基-2-嘧啶基)苯磺酰胺钠盐；0℃搅拌过夜，过滤，过滤过程中用超纯水反复清洗，利用层析柱（二氯甲烷DCM:四氢呋喃THF=2:1）纯化过滤，得到黄色粉末状的目标化合物ZCL-278，回收率约47%。其中，ZCL-278的具体合成路线见图1。

第二、内标物ZCL-278-C13的合成

ZCL-278内标物的合成方法与ZCL-278的合成方法相同，不同之处在于ZCL-278内标物用2-溴乙酸乙酯-1-C13替代2-溴乙酸乙酯，以及每个步骤中的试剂用量不同，其合成路线如图2所示。具体合成步骤如下：

步骤S1，将1.03g（5.0mmol ）4-溴-2-氯苯酚和1.00g（6.0mmol）2-溴乙酸乙酯加入到10mL二甲基甲酰胺溶液中，再向溶液中加入0.90g（6.5mmol）无水碳酸钾，70℃恒温搅拌过夜，将反应后的混合物倒入50mL超纯水中，用15mL乙酸乙酯提取4次。将提取得到的有机层混合，用20mL化工卤水洗涤3次，干燥，真空浓缩，得到淡棕色的油性化合物2；

步骤S2，将1.45g（5.0mmol）油性化合物2加入25mL二恶烷中，再加入25mL 1M氢氧化钠溶液；室温搅拌过夜，用1M盐酸将反应体系pH调节至3.0，再用25mL乙酸乙酯萃取4次，将萃取得到的有机层合并后用化工卤水洗涤4次，干燥，真空浓缩，得到白色粉末状的固体化合物3；

步骤S3，称取1.30g（5.0mmol）化合物3于圆底烧瓶中，然后依次加入10mL二氯亚砜和1滴二甲基甲酰胺，加热回流3h，蒸馏脱除二氯亚砜，真空干燥30min，得到羟基被氯取代的褐色油状化合物4；

步骤S4，将1.50g（5.0mmol）油状化合物4加入10mL干丙酮中，再在0℃下滴加100mL硫氰酸钠的丙酮溶液（硫氰酸钠的含量为10.0mmol），将混合液于30℃恒温搅拌3h；搅拌结束后冷却至0℃，在0℃下加入1.39 g、 5.0mmol 4-氨基-N-(4,6-二甲基-2-嘧啶基)苯磺酰胺钠盐；0℃搅拌过夜，用超纯水清洗过滤，然后利用层析柱（二氯甲烷DCM:四氢呋喃THF=2:1）纯化过滤，得到黄色粉末状的内标物ZCL-278-C13，回收率约20%。

实施例2 Cdc42小分子抑制剂ZCL-278的成药性分析

（1）建立大鼠模型

将雌雄各半的大鼠（体重均在180-220g）随机分为三组，分别记作A组、B组和C组（每组6只），实验前12h各组大鼠禁食不禁水；

（2）对大鼠给药并获取血液样品

对A组大鼠静脉注射ZCL-278，给药量为1mg/kg；对B组大鼠腹腔注射ZCL-278，给药量为1mg/kg；对C组大鼠进行灌胃给药，ZCL-278的给药量为10mg/kg；其中，ZCL-278溶于DMSO，并用生理盐水稀释至2 mg/ml；

给药后，A组大鼠和B组大鼠分别于0、0.083、0.25、0.5、0.75、l、1.5、2、4、6、8、10h取血，将取得的全血样本分别置于肝素EP管内，1500g/min离心10min，取上层血浆于-80℃保存，待用；

对C组大鼠分别于0、0.083、0.25、0.5、0.75、l、1.5、2、4、6、8、12h取血；将每个时间点的全血样本分别置于肝素EP管内，1500g/min离心10min，取上层血浆于-80℃保存，得到三组大鼠模型的血浆样本，待用；

（3）采用LC-MS/MS结合内标检测法对血浆样本进行定量检测

（3.1）绘制标准曲线

首先，配制内标液和标准液：将浓度为1mg/ml的ZCL-278储备液（溶剂为DMSO）用乙腈进行逐级稀释，使其终浓度为10000、8000、3000、1000、300、100、30和10ng/ml，分别标记为工作液1，工作液2，工作液3，工作液4，工作液5，工作液6、工作液7和工作液8；将浓度为1mg/ml的ZCL-278-C13储备液（溶剂为DMSO）用乙腈稀释，使其成为终浓度为10µg/ml的内标液；

其次，分别取上述工作液1-8各50µL，向其中均加入50µL ZCL-278-C13内标液，挥干后依次加入50µL空白血浆样本和400µL乙酸乙酯，涡旋震荡10min，15000rpm/min离心10min，取上清350µL挥干，用乙腈复溶；采用LC-MS/MS进行定量检测，LC-MS/MS的检测条件为：

质谱条件：离子源为API，正离子化方式检测，离子源电压为5.5kV；加热毛细管温度为450℃；CAD为4；气帘气为10；GS1（N2）为45；GS2（N2）为45；去簇电压为60V；碰撞能量为20-50eV（ZCL-278），20-50eV（ZCL-278-C13）；扫描方式为多级反应监测（MRM）。

色谱柱：ACQUITY UPLC BEH Amide Column (2.1mmⅹ100mm, 3μm particlesize)；柱温40℃；流动相A为水相（0.1%甲酸，0.1%三氟乙酸），流动相B为有机相（乙腈），梯度洗脱0-0.5min，B:10%；0.5-4.5min，B:10%-95%；4.5-5.5min，B:95%；5.5-8min，B:95%-10%；8.0-8.5min，B:10%；流速为0.3ml/min。

采用内标法计算得到每个 ZCL-278-C13标准液的检测浓度。以加入浓度作为横坐标，以检测浓度作为纵坐标，绘制标准曲线。其中，加入浓度和检测浓度的线性回归方程为y = 1.1247x - 11.504（R ² =0.9961）。本发明的内标检测方法可靠性高，可以用来准确定量检测血浆样本中的ZCL-278。

（3.2）采用内标检测法定量检测血浆样本中的ZCL-278

对血浆样本进行预处理：向EP管内加入50µL、10µg/ml ZCL-278-C13内标液，挥干后依次加入50µL血浆样本和400µL乙酸乙酯，涡旋震荡10min，15000rpm/min离心10min，取上清350µL挥干，用乙腈复溶，待测；

采用LC-MS/MS对各样本进行定量检测，检测条件同本实施例中的（3.1），得到每组大鼠模型的血浆样本的每个取血时间点时的ZCL-278浓度；

（4）数据处理和分析

（4.1）将血药浓度-时间数据用DAS 2.1.1拟合，并利用统计距法计算药动学参数。其中C _max 和T _max 为实测值；c-t曲线尾段相消除速率常数k是由ln _c-t 直线回归所得，AUC _0-t 值采用梯形面积法计算所得； AUC _0-∞ 时间的曲线下面积AUC=AUC _0-t +C _t /k（式中C _t 为试验中最后一时间点的血药浓度，k为血药浓度尾段相消除速率常数），结果见表1；

（4.2）绝对生物利用度的计算方法：绝对生物利用度分别由灌胃给药和静注给药的AUC _0-t 相比而得，计算公式如下：

使用IBM SPSS Statistics 22统计分析，若如果0.01<P值<0.05，则认为两总体存在统计学差异；如果P值<0.01，则认为两总体存在显著性差异；如果P值>0.05，则认为两总体不存在显著性差异。

（4.3）半衰期是指药物自体内消除一半所需的时间。即血药浓度下降一半所需的时间，ZCL-278在三组大鼠中的半衰期见表1。

表1 ZCL-278的药代动力学参数

由表1可知，灌胃组大鼠模型（即C组）经口服给药后的数据如下：雄性大鼠和雌性大鼠的平均生物利用度分别为13.19%和21.47%，雄性大鼠和雌性大鼠的半衰期分别为4.35h和3.03h。结果表明，ZCL-278的生物利用度良好，半衰期较长，具有成药性，具备进一步研究成为治疗型药物的特性。

实施例3 ZCL-278在大鼠模型各组织中的分布情况

步骤一，将清洁级SD大鼠（雌雄各半）分为空白组（雌雄各一只）和实验组（共三组，每组6只且雌雄各半），得到大鼠实验模型；

步骤二，在实验前12h对SD大鼠禁食但不禁水；按10mg /kg给实验组大鼠灌胃给予ZCL-278注射液，分别于0.5h、2.0h和4.0h将实验组大鼠依次放血处死，获得大鼠实验模型的心、肝、脾、肺、肾、胃、小肠、脑、肌肉、脂肪、睾丸、卵巢组织，用滤纸吸干表面血液后称重，-80°C冷冻保存；

步骤三，将步骤二获得的各组织分别磨碎、匀浆得到各组织的匀浆液，待用；向EP管内加入ZCL-278内标物的乙腈溶液，待乙腈挥发后，向EP管内加入50µL组织匀浆液，再加入400µL乙酸乙酯，涡旋震荡10min，15000rpm/min离心10min，取上清350µL并挥干，实现各组织的前处理；

步骤四，采用LC-MS/MS，按实施例2中（3.1）的检测条件分别定量检测步骤每组大鼠各组织中的ZCL-278。其中，雄性SD大鼠各组织中ZCL-278的分布情况见图3，雌性SD大鼠各组织中ZCL-278的分布情况见图4。

从图3-4可知，经口服给药后，2h后ZCL-278在每组大鼠的肾脏组织有良好分布，到4h后肾脏中的ZCL-278消除完全。结果表明，ZCL-278在肾脏组织中可以稳定沉积，为其发挥药效提供了良好的物质基础。

实施例4 Cdc42小分子抑制剂ZCL-278对Cdc42蛋白表达的影响

（1）建立小鼠CKD模型

选取8周龄雄性SPF级C57BL/6小鼠24只，随机均分为对照组、CKD组、CKD+LD组（即ZCL-278低剂量）和CKD+HD组（即ZCL-278高剂量），适应性喂养4周（即将小鼠喂养至12周龄）。其中：

在喂养过程中，对照组喂食正常饲料；CKD组喂养含0.25%腺嘌呤饲料；CKD+LD组喂养0.25%腺嘌呤饲料，且每天固定时间按20mg/kg的给药量灌胃给药（将ZCL-278溶于DMSO，用生理盐水稀释至2mg/ml）；CKD+HD组喂养0.25%腺嘌呤饲料，且每天固定时间按60mg/kg的给药量灌胃给药（将ZCL-278溶于DMSO，用生理盐水稀释至6mg/ml）；

喂养4周后，用2.5%水合氯醛（0.1ml/10g体重）麻醉，心脏取血后并将全血置于肝素EP管中，1500g/min离心10min，取上层血浆于-80℃保存；心脏灌注20ml生理盐水后，取肾组织，将每组大鼠模型的肾组织分开保存，一部分浸泡于4%多聚甲醛中，以便于病理学检测和免疫组化检测；将另一部分上于液氮中保存，以便于Western blot检测。

（2）采用Western blot检测肾脏组织活性Cdc42-GTP蛋白表达水平

本步骤中的试剂：抗GAPDH兔单克隆抗体、HRP标记山羊抗小鼠IgG抗体、HRP标记山羊抗兔IgG抗体均购于Cell Signaling Technology公司。抗Cdc42-GTP小鼠单克隆抗体购于NewEast Biosciences公司。

将冻存的肾脏组织并称重；按10ul/mg 的比例加入RIPA裂解液，然后按比例加入100×PMSF，冰上裂解40min，在裂解时每隔10min摇晃混匀一次；4℃ 12,000rpm离心10min，取上清液，得到样品（即蛋白匀浆）；将样品按1:30稀释，用BCA法测蛋白浓度。30μg总蛋白加上样缓冲液煮沸5min后上凝胶电泳；电泳；转移至PVDF膜；将PVDF膜TBST室温封闭1h，加入一抗于4℃过夜孵育（抗Cdc42-GTP小鼠单克隆抗体，稀释倍数1:2000；抗GAPDH兔单克隆抗体，稀释倍数1:1000），TBST摇床上洗膜10min×3次；然后分别对应加入HRP标记山羊抗小鼠IgG抗体和HRP标记山羊抗兔IgG抗体，室温孵育1h；TBST摇床上洗膜10min×3次；最后显影、定影、拍照，并用GAPDH为内参矫正相对蛋白表达量，结果见图5。

（3）采用免疫组化法（IHC）检测肾脏组织Cdc42-GTP蛋白表达水平

步骤1：将浸泡于4%多聚甲醛的肾脏组织取出，放入包埋模具中加入液态石蜡，将待包埋的组织样本放入石蜡中，确保组织位置规整；

将肾组织按如下工序浸泡和浸蜡：70%乙醇3h→75%乙醇2h→95%乙醇1h→95%乙醇1h→100%乙醇1h→100%乙醇30min→二甲苯30min→二甲苯30min→液态石蜡1h→液态石蜡1h；浸蜡后冷凝；切片（厚度3μm）；用42℃水展片；载玻片捞片、贴片；65℃烤片，备用；

步骤2，按以下工序对65℃烘烤后的样品片进行脱蜡处理：二甲苯（I）浸泡7min；二甲苯（II）浸泡7min；梯度酒精脱除二甲苯：无水乙醇（I）10min；无水乙醇（II）10min；95%乙醇（I）10min；95%乙醇（II）10min；75%乙醇（I）10min；75%乙醇（II）10min；

步骤3，脱蜡处理后用PBS浸泡：PBS浸泡5min×2次；浸入10mM pH=6.0的柠檬酸缓冲液中，加热至98℃并保温10min，室温冷却30min；浸入0.1%Triton X-100，室温浸泡30min；PBS浸泡5min×3次；

步骤4，用5%BSA室温封闭30min；滴加抗Cdc42-GTP小鼠单克隆抗体（稀释倍数1:500），4℃孵育过夜；孵育结束后，回收抗体，PBS浸泡5min×3次；然后滴加HRP标记山羊抗兔IgG抗体（稀释倍数1：200），室温孵育1h，PBS浸泡5min×3次；

步骤5，用苏木精复染2min，盐酸酒精分化2s，PBS浸泡5min×3次；再用95%乙醇2min，100%乙醇5min×2次，二甲苯5min×2次分别浸泡；中性树胶封固，每张组化切片拍摄10张400倍视野下照片，计算每张照片积分光密度（IOD）并求得每张组化切片的平均IOD值，结果如图6所示。

由图4可以看出，在对小鼠给予喂养0.25%腺嘌呤后，肾脏组织中Cdc42的活性蛋白增加，即Cdc42-GTP表达量显著增高；在给予ZCL-278灌胃后，小鼠模型肾脏组织中Cdc42-GTP的蛋白表达显著降低。结果表明，ZCL-278可以显著抑制小鼠模型的肾组织中的Cdc42-GTP表达。

实施例5 Cdc42小分子抑制剂ZCL-278CL-278可显著降低肾脏损伤

第一，采用内标法定量检测小鼠模型血浆中的肌酐和尿素氮

步骤1，将实施例4中小鼠模型中的对照组、CKD组、CKD+LD组、CKD+HD组中的血浆解冻；向EP管中加入50µl肌酐-C13和50µl尿素氮-N15，挥干，然后加入10µl小鼠模型的血浆样本，再加入150µl的甲醇溶液，涡旋震荡10min；15000rpm/min离心10min；取上清以备LC-MS/MS测定；

步骤2，肌酐及其内标溶液的配制：将1mg/ml的肌酐储备液用甲醇逐级稀释，使其终浓度为10000、8000、3000、1000、300、100、30ng/ml；将100mM的肌酐内标储备液用甲醇进行稀释，使其终浓度为100nM；

尿素氮及其内标溶液的配制方法和浓度梯度同肌酐及其内标溶液；

步骤3，分别以肌酐-C13和尿素氮-N15为同位素内标，采用LC-MS/MS对血浆中的肌酐和尿素氮分别进行定量检测。具体检测条件如下：

离子源为API，正离子化方式检测，离子源电压为5.5kV；加热毛细管温度为450℃；CAD为4；气帘气为10；GS1（N2）为50；GS2（N2）为50；去簇电压为60V；碰撞能量为20-50eV（肌酐），20-50eV（肌酐-C13），20-50eV（尿素氮），20-50eV（尿素氮-N15）。扫描方式为多级反应监测（MRM）；

色谱柱：ACQUITY UPLC BEH Amide Column (2.1mmⅹ100mm, 3μm particlesize)；柱温40℃；流动相A为0.1%甲酸+0.1%三氟乙酸，流动相B为甲醇，梯度洗脱0-0.5min，B:10%；0.5-4.5min，B:10%-95%；4.5-5.5min，B:95%；5.5-8min，B:95%-10%；8.0-8.5min，B:10%；流速为0.3ml/min。

在检测时，绘制肌酐和尿素氮标准曲线，根据标准曲线确定每个血浆样本中肌酐和尿素氮的含量，结果如图7-8所示。

由图7-8可知，小鼠模型在给予喂养0.25%腺嘌呤行CKD造模后，CKD组的肾脏损伤标志物血浆肌酐、尿素氮水平显著升高；给予ZCL-278药物灌胃后，小鼠模型的的血浆肌酐、尿素氮水平显著低于CKD组。

在实施例4的小鼠模型饲养过程中，记录了每组小鼠模型每天的体重数据，其结果见图9。由图9可知，小鼠模型在给予喂养0.25%腺嘌呤行CKD造模后，小鼠模型的体重显著降低；给予ZCL-278药物灌胃后，CKD+LD组和CKD+HD组的体重降低趋势有所改善。

第二，ZCL-278对慢性肾脏病小鼠模型的病理损伤研究

按照实施例4（3）中的步骤一将各组小鼠模型的肾组织切片，然后分别进行木精-伊红（H&E）染色、过碘酸六胺银（PASM）染色、马松（Masson）染色、天狼猩红（Sirus red）染色，光镜下观察肾组织，结果如图10所示。

图10中A为H&E染色结果。结果显示，喂养0.25%腺嘌呤小鼠模型（即CKD组）出现明显的肾小管损伤，表现为肾小管上皮细胞重度空泡、颗粒变性，细胞扁平，管腔扩张；给予ZCL-278药物灌胃后小鼠模型的肾小管损伤得到了显著改善，特别是CKD+HD组。

图10中B是PASM染色结果。结果显示，CKD组的肾小球系膜、基底膜未见明显病理改变，给予ZCL-278药物后未见明显肾小球异常病理改变。

图10中C和D分别是Masson染色染色、天狼猩红染色。结果显示，CKD组小鼠模型的肾小管管腔内可见明显尿蛋白管型，给予ZCL-278药物后肾小管内蛋白管型显著减少；此外，CKD组的肾小球、肾小管或间质内未出现显著胶原沉积，给予ZCL-278后也未出现明显胶原沉积。

第三，ZCL-278显著减轻CKD小鼠模型的肾脏炎症损伤和纤维化形成

用肾脏组织炎性细胞标志物F4/80、肾脏组织纤维化指标α-SMA、肾脏组织纤维化指标Collagen I和肾脏组织纤维化指标Fibronectin对各组小鼠模型进行免疫组化染色，免疫组化染色方法同实施例4（3）。其中，染色过程中用到的抗F4/80兔单克隆抗体、抗α-SMA兔单克隆抗体、抗Fibronectin兔单克隆抗体和HRP标记山羊抗兔IgG抗体均购自CellSignalling Technology公司。抗Collagen I兔单克隆抗体购自Abcam公司。

四组小鼠模型的免疫组化染色结果见如图11。其中，图11中的A是肾脏组织炎性细胞标志物F4/80免疫组化染色；图11中的B是肾脏组织纤维化指标α-SMA免疫组化染色；图11中的C是肾脏组织纤维化指标Collagen I免疫组化染色；图11中的D是肾脏组织纤维化指标Fibronectin免疫组化染色。

由图11中的A可知，在给予喂养0.25%腺嘌呤行CKD造模后，CKD组的肾脏组织炎性细胞标志物F4/80的表达量显著增多，而给予ZCL-278药物灌胃后，CKD+LD和CKD+HD组的肾脏组织F4/80表达量均显著降低，表明ZCL-278可以显著减轻CKD肾脏炎性损伤。

由图11中B、C和D可知，在喂养0.25%腺嘌呤行CKD造模后，CKD组的α-SMA、CollagenI和Fibronectin表达量均显著增多；而在给予ZCL-278药物灌胃后，CKD+LD和CKD+HD组的肾脏组织纤维化标志物表达量均显著降低，说明ZCL-278可以显著减轻CKD肾脏纤维化的形成。

Claims (3)

1.细胞***周期蛋白42小分子抑制剂在制备治疗慢性肾脏病药物中的应用，其中，所述细胞***周期蛋白42小分子抑制剂为ZCL-278，其化学式如下：

。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述慢性肾脏病药物中所述ZCL-278的给药量至少为2mg/kg。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述慢性肾脏病药物为口服制剂和/或注射剂。

Images