CN115058377B - 一株生产高纯度l-乳酸的植物乳杆菌工程菌株及其构建和应用 - Google Patents

一株生产高纯度l-乳酸的植物乳杆菌工程菌株及其构建和应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一株生产高纯度L‑乳酸的植物乳杆菌工程菌株及其构建和应用,所述植物乳杆菌工程菌株保藏于中国典型培养物保藏中心,保藏编号为CCTCC No.M 2022751,保藏日期为2022年5月30日,利用***载体同源重组双交换方法敲除了D‑乳酸脱氢酶基因ldhD和乳酸消旋酶基因larA,利用本发明所述方法构建的菌株可生产纯度为99.84%的L‑乳酸。本发明提供了通过代谢通路改造使植物乳杆菌生产高纯度L‑乳酸的有效方法,适用于开发植物乳杆菌作为高纯度L‑乳酸生产菌种。

Description

一株生产高纯度L-乳酸的植物乳杆菌工程菌株及其构建和 应用
技术领域
本发明属于生物技术和基因工程技术领域,具体涉及到一株生产高纯度 L-乳酸的植物乳杆菌工程菌株及其构建和应用。
背景技术
L-乳酸作为酸味剂、pH调节剂、抑菌剂及保鲜剂等广泛应用于食品行业。同时,以L-乳酸为原料合成聚L乳酸是理想的石油基塑料替代品,具有良好的生物相容性,在食品包装、农业和医疗领域都有良好的应用前景。而L-乳酸的纯度是合成聚L乳酸的关键因素,L-乳酸的生成成本直接影响聚L-乳酸的价格和应用潜力。我国农产品加工业每年产生大量诸如秸秆、薯渣的复杂生物质废渣,可作为发酵法生产L-乳酸的廉价原料,降低其生产成本。
植物乳杆菌在自然界生态位广泛、环境适应性强,是最有潜力利用复杂生物质废渣生产乳酸的菌种之一。然而大多数植物乳杆菌菌株产生D-乳酸和 L-乳酸两种构型的乳酸,与市场对高纯度L-乳酸的需求相悖。
因此,如何能够低成本的获得高纯度L-乳酸,是一个需要解决的问题。
发明内容
为了克服现有技术的问题,本发明提出了一株生产高纯度L-乳酸的植物乳杆菌工程菌株及其构建和应用。所述植物乳杆菌工程菌株可以淀粉类生物质废料为底物生产L-乳酸,可同时达到提高淀粉类生物质废料处理经济效益和降低L-乳酸生产成本的效果。
本发明的目的是这样实现的:
一株生产高纯度L-乳酸的植物乳杆菌Lactiplantibacillus plantarum工程菌株CAUH2-2,所述工程菌株保藏于中国典型培养物保藏中心,保藏编号为 CCTCC No.M2022751,保藏日期为2022年5月30日。
进一步的,所述植物乳杆菌工程菌株为敲除了D-乳酸脱氢酶基因ldhD和乳酸消旋酶基因larA的植物乳杆菌。
进一步的,所述D-乳酸脱氢酶基因ldhD的基因序列为 NCBI-A1F92_08525,所述乳酸消旋酶基因larA的基因序列为NCBI-A1F92_00415。
本发明的另一方面:
所述生产高纯度L-乳酸的植物乳杆菌工程菌株的构建方法,利用***载体同源重组双交换方法敲除D-乳酸脱氢酶基因ldhD和乳酸消旋酶基因larA,并且基因敲除过程中,在筛选与培养用培养基中补充D-乳酸。
进一步的,所述生产高纯度L-乳酸的植物乳杆菌工程菌株的构建方法,步骤如下:
步骤1,D型乳酸脱氢酶基因ldhD敲除突变体的构建:
S11,构建携带有ldhD基因敲除同源臂的***载体
从植物乳杆菌的基因组中扩增ldhD基因敲除所需两段同源臂armA1和 armB1,两段同源臂armA1和armB1的特异性引物,armA1上游、下游引物序列分别如SEQ ID No.1和SEQID No.2所示,armB1上游、下游引物序列分别如SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示;两端同源臂分别通过PCR进行扩增,再使用SOE PCR方法将同源交换臂片段armA1和armB1连接,形成ldhD基因融合同源臂片段;
使用EcoRI和BamHI对质粒pUC19e进行双酶切,形成粘性末端,与经过同样双酶切的ldhD基因融合同源臂片段连接,形成重组质粒pUCldhD;
S12,制备发生一次同源重组的植物乳杆菌工程菌株
利用S11构建的重组质粒pUCldhD,电转化植物乳杆菌感受态细胞,获得发生一次同源重组的植物乳杆菌工程菌株;
S13,制备ldhD基因缺失型植物乳杆菌
将S12制备得到的发生一次同源重组的植物乳杆菌工程菌株,于含有D- 乳酸的培养基中红反复传代,通过影印法筛选发生两次同源重组的植物乳杆菌;
将发生两次同源重组的植物乳杆菌在含有D-乳酸培养基中培养,获得的菌落以PCR方法鉴定,从而获得ldhD基因缺失型植物乳杆菌;
步骤2,ldhD基因、larA基因双基因敲除型突变体的构建
S21,构建携带有larA基因敲除同源臂的***载体
从植物乳杆菌的基因组中扩增larA基因敲除所需两段同源臂armA2和 armB2,两段同源臂armA2和armB2的特异性引物,armA2上游、下游引物序列分别如SEQ ID No.5和SEQID No.6所示,armB2上游、下游引物序列分别如SEQ ID No.7和SEQ ID No.8所示;两端同源臂分别通过PCR进行扩增,再使用SOE PCR方法将同源交换臂片段armA2和armB2连接,形成larA基因融合同源臂片段;
使用EcoRI和BamHI对质粒pUC19e进行双酶切,形成粘性末端,与经过同样双酶切的larA基因融合同源臂片段连接,形成重组质粒pUClarA;
S22,制备发生一次同源重组的植物乳杆菌工程菌株
利用S21构建的重组质粒pUClarA,电转化植物乳杆菌感受态细胞,获得发生一次同源重组的植物乳杆菌工程菌株;
S23,制备ldhD基因、larA基因双基因敲除型突变体
将S22制备得到的发生一次同源重组的植物乳杆菌工程菌株,于含有D- 乳酸的培养基中红反复传代,通过影印法筛选发生两次同源重组的植物乳杆菌;
将发生两次同源重组的植物乳杆菌在含有D-乳酸培养基中培养,获得的菌落以PCR方法鉴定,从而获得ldhD基因、larA基因双基因敲除型植物乳杆菌。
进一步的,通过向培养基中添加D-乳酸工作液来补充D-乳酸,所述D- 乳酸工作液配比为:4.5mL去离子水和4.5mL D-乳酸母液混匀,0.22μm滤膜除菌后4℃保存;各培养基中D-乳酸工作液的添加量为10mL/L。
进一步的,步骤S13中,鉴定ldhD基因缺失型植物乳杆菌的特异性引物序列分别为:arm1-up-F上游引物、arm1-down-R下游引物,如SEQ ID No.9 和SEQ ID No.10所示。
进一步的,步骤S23中,鉴定ldhD基因、larA基因双基因缺失型植物乳杆菌的特异性引物序列分别为:arm2-up-F上游引物、arm2-down-R下游引物,如SEQ ID No.11和SEQ IDNo.12所示。
本发明的另一方面:
所述的植物乳杆菌工程菌株在L-乳酸生产中的应用。
本发明运用PCR方法从植物乳杆菌基因组中扩增出D-乳酸脱氢酶基因上游和下游两段同源臂,设计重叠互补引物,运用SOE PCR方法融合两段同源臂,设计特定的限制性酶切位点,构建到无法在植物乳杆菌中独立复制的的***载体上。含有D-乳酸脱氢酶基因同源臂的重组质粒通过热击法转化至大肠杆菌DH5α,在大肠杆菌内大量复制,用质粒小提试剂盒提取重组质粒,然后通过电穿孔方法转化受体植物乳杆菌。重组植物乳杆菌在补充了D-乳酸的 MRS培养基中反复传代,传至30代开始使用影印法筛选失去红霉素抗性的菌株,然后使用PCR方法鉴定D-乳酸脱氢酶基因敲除型突变体。
以D-乳酸脱氢酶基因敲除型突变体为受体植物乳杆菌,运用上述方法敲除乳酸消旋酶基因,最终获得D-乳酸脱氢酶基因与乳酸消旋酶基因共敲除的植物乳杆菌。
研究发现在乳酸乳球菌中异源表达植物乳杆菌larA–E操纵子,并删除表达质粒中larA–E操纵子的每个基因,检测乳酸乳球菌中乳酸消旋酶活性,结果证明除乳酸转运体编码基因larA是必须的,larA的缺失导致乳酸消旋酶丧失活性。植物乳杆菌中larA基因为1275bp,larA–E操纵子长达4854bp。因此,本申请针对larA基因的单基因敲除更为高效。
本发明的优点和有益效果是:
本发明利用同源重组双交换原理,敲除植物乳杆菌的D-乳酸脱氢酶基因 ldhD和乳酸消旋酶基因larA,构建得到的工程菌株Lactiplantibacillus plantarumCAUH2-2可生产纯度为99.84%的L-乳酸。
生物保藏说明
植物乳杆菌Lactiplantibacillus plantarumCAUH2-2,于2022年5月30日保藏于中国典型培养物保藏中心,地址为:中国,武汉,武汉大学,保藏编号为CCTCC No.M2022751。
附图说明
下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明:
图1是本发明实施例重组质粒pUCldhD和pUClarA的构建结构图;其中, A:***载体pUC19e;B:含有ldhD基因敲除同源臂arm1的重组质粒 pUCldhD;C:含有larA基因敲除同源臂arm2的重组质粒pUClarA;
图2是本发明实施例影印法筛选发生两次同源重组双交换菌株图;其中, A:无抗平板;B-红霉素抗性平板;
图3是本发明实施例评价D-乳酸合成缺陷型突变体生长情况结果图;其中,A:D-乳酸合成缺陷型突变体在MRS中生长受到一定影响,与野生型相比达到稳定期速度慢;B:D-乳酸合成缺陷型突变体在补充D-乳酸的MRS中生长状态与野生型相同;
图4是评价突变体生产L-乳酸情况结果图;其中,A:葡萄糖发酵过程中,D-乳酸合成缺陷型突变体仅在发酵前24h葡萄糖利用率较野生型稍低, 24h之后葡萄糖利用率与野生型一致;B:葡萄糖发酵过程中,D-乳酸合成缺陷型突变体仅在发酵前24h乳酸产率较野生型稍低,24h之后乳酸产率与野生型一致。
具体实施方式
实施例1生产高纯度L-乳酸的植物乳杆菌工程菌株的构建
本实施例提供了一株生产高纯度L-乳酸的植物乳杆菌工程菌株的构建方法,可以利用包括植物乳杆菌WCFS1、ATCC 8014、AS1.2986、CICC 23941 在内的多种市售植物乳杆菌为出发菌,或本实验室保藏的植物乳杆菌S2-16 作为出发菌。其中,植物乳杆菌S2-16是L.plantarumCAUH2的太空诱变株, CAUH2为本实验室(中国农业大学食品科学与营养工程学院乳酸菌遗传与代谢工程实验室)分离自泡菜的植物乳杆菌,此前已对CAUH2进行了全基因组测序,基因在NCBI数据库的编号是NZ_CP015126.1。对S2-16的改造皆可参考L.plantarumCAUH2的全基因组序列设计。
具体构建方法包括如下步骤:
步骤1,D型乳酸脱氢酶基因ldhD敲除突变体的构建:
S11,构建携带有ldhD基因敲除同源臂的***载体
从植物乳杆菌的基因组中扩增ldhD基因敲除所需两段同源臂armA1和 armB1,两段同源臂armA1和armB1的特异性引物,引物序列如下:
armA1上游引物:5'CCGGAATTCCATGATTTTAATGACCGTACCT 3';
armA1下游引物:5'ATTTTTGTATTTGAAGCGTTAACCCCAAG 3';
armB1上游引物:5'CGCTTCAAATACAAAAATTCCTCCTATATATTG 3';
armB1下游引物:5'CGCGGATCCGTGGATACCGTCTTGTGTAAC 3'。
两端同源臂分别通过PCR进行扩增,PCR程序如下:
98℃预变性5min,98℃变性30s,55℃退火30s,72℃延伸30s, 72℃终延伸10min,共30个循环。
再使用SOE PCR方法将同源交换臂片段armA1和armB1连接,形成ldhD 基因融合同源臂片段;两段同源臂融合SOE PCR体系中armA1、armB1分别为100ng,程序如下:
98℃预变性30s,98℃变性20s,55℃退火30s,72℃延伸1min, 72℃终延伸10min,共30个循环。
使用EcoRI和BamHI对质粒pUC19e进行双酶切(37℃,4h),形成粘性末端,与经过同样双酶切的ldhD基因融合同源臂片段连接,形成重组质粒 pUCldhD;如图1所示(B)。
S12,制备发生一次同源重组的植物乳杆菌工程菌株
(1)重组质粒在大肠杆菌中的大量复制
取大肠杆菌DH5α感受态细胞,冰上融化,吸取40μl感受态细胞与5μl 连接产物混合,冰浴30min,42℃热击90s,立即冰浴2min,加入1ml新鲜LB培养基,37℃复苏培养1.5h,之后取适量菌液涂布于含有氨苄青霉素 (100μg/ml)的LB平板,培养24h后挑取单菌落,鉴定重组子,提取重组质粒 pUCldhD。
(2)制备植物乳杆菌的感受态细胞
用MRSS(MRS,0.3M蔗糖,1%甘氨酸)培养基培养植物乳杆菌,生长至OD600=0.4~0.6,取10ml菌液,于6000rpm,4℃离心10min,收集菌体;加入2ml Washing buffer(0.3M蔗糖,1mM MgCl2)重悬2次,6000rpm, 4℃离心10min,弃去上清;加入2ml 30%PEG-1500重悬菌体,6000rpm,4℃离心10min,弃去上清,用200μl 30%PEG-1500重悬,40μl分装备用。
(3)重组质粒电转化植物乳杆菌
取植物乳杆菌感受态细胞40μl,与2μl重组质粒pUCldhD混合,转移至 2mm电转杯中,使用Bio-Rad Gene Pulser XcellTM型电转化仪,电转化条件为: 1.5kv/cm,9ms。电击后加入1ml复苏培养基(MRS,0.3M蔗糖,0.1M MgCl2) 于37℃培养2h,取适量菌液涂布于含有红霉素(5μg/ml)、D-乳酸(10mM) 的MRS平板,于37℃培养48h后筛选重组子,即为发生一次同源重组的植物乳杆菌工程菌株。
S13,制备ldhD基因缺失型植物乳杆菌
(1)制备发生两次同源重组的植物乳杆菌
将发生一次同源重组的植物乳杆菌于含有D-乳酸(10mM)的MRS液体培养基中反复传代,每一代接种量1%,37℃培养12h。
反复传代至30代开始影印法(图2)筛选发生两次同源重组的植物乳杆菌:培养12h的新鲜菌液稀释涂布于含有D-乳酸(10mM)的MRS平板,37℃培养48h,直径90mm的平板上均匀分散菌落约100个。利用影印布将含有 D-乳酸(10mM)的MRS平板上的菌落转印至含有红霉素(5μg/ml)、D-乳酸(10mM)的MRS平板上,37℃培养48h。比对原始平板与转印平板,失去红霉素抗性仅在原始平板上生长的单菌落,即为发生两次同源重组的植物乳杆菌。
(2)ldhD基因缺失型植物乳杆菌的鉴定
将发生两次同源重组的植物乳杆菌在含有D-乳酸(10mM)的MRS平板上划线纯化,37℃培养48h。菌落PCR方法鉴定ldhD基因缺失型植物乳杆菌,设计特异性引物序列如下:
arm1-up-F上游引物:5'CTTTGAGCAGCACTGAATTG 3';
arm1-dowm-R下游引物:5'CAACGCAGTGTTATTTTGAAC 3'。
步骤2,ldhD基因、larA基因双基因敲除型突变体的构建
S21,构建携带有larA基因敲除同源臂的***载体
从植物乳杆菌的基因组中扩增larA基因敲除所需两段同源臂armA2和 armB2,两段同源臂armA2和armB2的特异性引物,引物序列如下:
armA2上游引物:5'CCGGAATTCCGTCTGTTCGTAATTCCTTG 3';
armA2下游引物:5'AATATTTCTTTTTACATGCACGTTTTGTTAT 3';
armB2上游引物:5'CATGTAAAAAGAAATATTACAACAAGTGGCG 3';
armB2下游引物:5'CGCGGATCCTAATCCCCGAAAAAGCGTC 3'。
两端同源臂分别通过PCR进行扩增,PCR程序如下:
98℃预变性5min,98℃变性30s,55℃退火30s,72℃延伸30s, 72℃终延伸10min,共30个循环。
再使用SOE PCR方法将同源交换臂片段armA2和armB2连接,形成larA 基因融合同源臂片段;两段同源臂融合SOE PCR体系中armA2、armB2分别为100ng,程序如下:
98℃预变性30s,98℃变性20s,55℃退火30s,72℃延伸1min, 72℃终延伸10min,共30个循环。
使用EcoRI和BamHI对质粒pUC19e进行双酶切,形成粘性末端,与经过同样双酶切的larA基因融合同源臂片段连接,形成重组质粒pUClarA;如图1所示(C)。
S22,制备发生一次同源重组的植物乳杆菌工程菌株
(1)重组质粒在大肠杆菌中的大量复制
取大肠杆菌DH5α感受态细胞,冰上融化,吸取40μl感受态细胞与5μl 连接产物混合,冰浴30min,42℃热击90s,立即冰浴2min,加入1ml新鲜LB培养基,37℃复苏培养1.5h,之后取适量菌液涂布于含有氨苄青霉素 (100μg/ml)的LB平板,培养24h后挑取单菌落,鉴定重组子,提取重组质粒 pUClarA。
(2)制备ldhD基因缺失突变体的感受态细胞
用含有D-乳酸(10mM)的MRSS(MRS,0.3M蔗糖,1%甘氨酸)培养基培养植物乳杆菌,生长至OD600=0.4~0.6,取10ml菌液,于6000rpm,4℃离心10min,收集菌体;加入2mlWashing buffer(0.3M蔗糖,1mM MgCl2) 重悬2次,6000rpm,4℃离心10min,弃去上清;加入2ml 30%PEG-1500 重悬菌体,6000rpm,4℃离心10min,弃去上清,用200μl 30%PEG-1500重悬,40μl分装备用。
(3)重组质粒pUClarA电转化ldhD基因缺失突变体
取植物乳杆菌感受态细胞40μl,与2μl重组质粒pUClarA混合,转移至 2mm电转杯中,使用Bio-Rad Gene Pulser XcellTM型电转化仪,电转化条件为: 1.5kv/cm,9ms。电击后加入1ml复苏培养基(MRS,0.3M蔗糖,0.1M MgCl2) 于37℃培养2h,取适量菌液涂布于含有红霉素(5μg/ml)、D-乳酸(10mM) 的MRS平板,于37℃培养48h后筛选重组子,即为发生一次同源重组的植物乳杆菌工程菌株。
S23,制备ldhD基因、larA基因双基因敲除型突变体
(1)制备发生两次同源重组的植物乳杆菌
将发生一次同源重组的植物乳杆菌于含有D-乳酸(10mM)的MRS液体培养基中反复传代,每一代接种量1%,37℃培养12h。
反复传代至30代开始影印法筛选发生两次同源重组的植物乳杆菌:培养 12h的新鲜菌液稀释涂布于含有D-乳酸(10mM)的MRS平板,37℃培养48h,直径90mm的平板上均匀分散菌落约100个。利用影印布将含有D-乳酸 (10mM)的MRS平板上的菌落转印至含有红霉素(5μg/ml)、D-乳酸(10mM) 的MRS平板上,37℃培养48h。比对原始平板与转印平板,失去红霉素抗性仅在原始平板上生长的单菌落,即为发生两次同源重组的植物乳杆菌。
(2)ldhD基因、larA基因双基因敲除型突变体的鉴定
将发生两次同源重组的植物乳杆菌在含有D-乳酸(10mM)的MRS平板上划线纯化,37℃培养48h。菌落PCR方法鉴定ldhD基因、larA基因双基因敲除型植物乳杆菌,设计特异性引物序列如下:
arm2-up-F上游引物:5'GAATATGCACGGATGAGC 3';
arm2-down-R下游引物:5'AGCTCGTGCCATAGATGC 3'。
最终获得敲除ldhD基因、larA基因的植物乳杆菌LactiplantibacillusplantarumCAUH2-2,保藏于中国典型培养物保藏中心(保藏单位的缩写为CCTCC),保藏编号为CCTCC No.M 2022751,保藏日期为2022年5月30 日。
实施例二——生产高纯度L-乳酸的植物乳杆菌工程菌株的功能性评价
本实施例针对实施例一所构建的生产高纯度L-乳酸的植物乳杆菌工程菌株Lactiplantibacillus plantarumCAUH2-2进行功能性评价,包括D-乳酸合成缺陷型突变体生长情况评价和D-乳酸合成缺陷型突变体生产L-乳酸能力评价。
一、D-乳酸合成缺陷型突变体生长情况评价
将活化两次的野生型植物乳杆菌与D-乳酸合成缺陷型突变体新鲜菌液以 1%接种量接种至MRS液体培养基与含有D-乳酸(10mM)的MRS液体培养基,37℃培养24h,每1h测定菌液600nm处吸光值。绘制野生型植物乳杆菌与D-乳酸合成缺陷型突变体在MRS液体培养基与含有D-乳酸(10mM)的 MRS液体培养基中生长曲线,生长曲线见图3。D-乳酸合成缺陷型突变体在 MRS中生长受到一定影响,与野生型相比达到稳定期速度慢;在含有D-乳酸 (10mM)的MRS中生长状态与野生型相同。
二、D-乳酸合成缺陷型突变体生产L-乳酸能力评价
1、HPLC测定植物乳杆菌葡萄糖发酵乳酸产量
(1)葡萄糖发酵培养基的配制
将容量为100mL的发酵瓶洗净烘干,配制发酵体系20mL(酵母提取物30g/L,碳酸钙27.75g/L)注入发酵瓶,发酵瓶加盖橡胶塞,使用压盖器将配套铝制盖压紧,121℃高压灭菌15min,冷却备用。称取10g葡萄糖溶于50mL超纯水,转移到100mL容量瓶使用超纯水定容;葡萄糖溶液在无菌超净台里滤膜除菌后,使用无菌注射器吸取20mL注入发酵瓶,即为40mL 的葡萄糖发酵培养基(葡萄糖50g/L、酵母提取物15g/L)。
(2)接种与葡萄糖发酵实验
在无菌超净台中使用无菌注射器接种3mL在MRS培养基中培养至稳定期的菌液于发酵瓶中,于37℃,150rpm培养至72h。在0h、6h、12h、 24h、36h、48h、72h使用1mL无菌注射器采集0.6mL发酵液,保存于2 mL离心管中待用。取样完成后样品即刻10000rpm离心3min,取上清200 μL加入超纯水1mL得到稀释6倍的发酵上清液,过0.22μm滤膜于液相上样瓶,4℃保存。
2、葡萄糖和乳酸浓度液相谱法分析
(1)葡萄糖和乳酸标准品的制备及标准曲线的绘制
将葡萄糖标准液用超纯水稀释为10、5、2.5、1.25、0.75g/L的标准溶液。将乳酸标准溶液用超纯水稀释为18.016、10.01、6.06、3.03、2.02g/L的标准溶液。
(2)色谱条件
液相分析采用的是美国Waters公司e2695液相色谱仪。色谱柱: Bio-Rad AminexHPX-87H(300mm×7.8mm),示差检测器:Waters 2414;柱温为55℃;流动相为0.005M的硫酸水溶液;流速为0.6mL/min;进样量为20μL。
(3)液相色谱数据处理
使用软件Empower输出峰面积,峰面积代入标准曲线计算得到样品葡萄糖和乳酸浓度;72h乳酸浓度与0h葡萄糖浓度比值即为发酵至72h葡萄糖- 乳酸转化率。
结果见图4。葡萄糖发酵过程中,D-乳酸合成缺陷型突变体仅在发酵前 24h葡萄糖利用率、乳酸产率较野生型稍低,24h之后葡萄糖利用率、乳酸产率与野生型一致。发酵至72h D-乳酸合成缺陷型突变体与野生型葡萄糖-乳酸转化率皆为81%,D-乳酸合成缺陷并不影响植物乳杆菌发酵生产乳酸的能力。
3、D-乳酸合成缺陷型突变体生产L-乳酸占比测定
使用爱尔兰Magazyme公司生产的D-Lactic Acid Rapid Assay Kit、 L-LacticAcid Rapid Assay Kit测定葡萄糖发酵液D-乳酸与L-乳酸浓度,计算 D-乳酸合成缺陷型突变体生产L-乳酸占比为99.61%。
最后应说明的是,以上仅用以说明本发明的技术方案而非限制,尽管参照较佳布置方案对本发明进行了详细说明,本领域的普通技术人员应当理解,可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换,而不脱离本发明技术方案的精神和范围。
序列表
<110> 中国农业大学
<120> 一株生产高纯度L-乳酸的植物乳杆菌工程菌株及其构建和应用
<130> MP22018360Z
<160> 12
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ccggaattcc atgattttaa tgaccgtacc t 31
<210> 2
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
atttttgtat ttgaagcgtt aaccccaag 29
<210> 3
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
cgcttcaaat acaaaaattc ctcctatata ttg 33
<210> 4
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
cgcggatccg tggataccgt cttgtgtaac 30
<210> 5
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ccggaattcc gtctgttcgt aattccttg 29
<210> 6
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
aatatttctt tttacatgca cgttttgtta t 31
<210> 7
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
catgtaaaaa gaaatattac aacaagtggc g 31
<210> 8
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
cgcggatcct aatccccgaa aaagcgtc 28
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
ctttgagcag cactgaattg 20
<210> 10
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
caacgcagtg ttattttgaa c 21
<210> 11
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
gaatatgcac ggatgagc 18
<210> 12
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
agctcgtgcc atagatgc 18

Claims (2)

1.一株生产高纯度L-乳酸的植物乳杆菌Lactiplantibacillus plantarum工程菌株,其特征在于,所述植物乳杆菌工程菌株为敲除了D-乳酸脱氢酶基因ldhD和乳酸消旋酶基因larA的植物乳杆菌;所述D-乳酸脱氢酶基因ldhD的基因序列为NCBI-A1F92_08525,所述乳酸消旋酶基因larA的基因序列为NCBI-A1F92_00415;所述植物乳杆菌工程菌株为植物乳杆菌Lactiplantibacillus plantarum CAUH2-2,于2022年5月30日保藏于中国典型培养物保藏中心,地址为:中国,武汉,武汉大学,保藏编号为CCTCC No.M 2022751。
2.如权利要求1所述的植物乳杆菌工程菌株Lactiplantibacillus plantarumCAUH2-2在L-乳酸生产中的应用。
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Citations (2)

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JP2004187643A (ja) * 2002-12-13 2004-07-08 Toyota Motor Corp 高光学純度な乳酸の製造方法
CN109504630A (zh) * 2018-12-17 2019-03-22 吉林中粮生化有限公司 一种重组d-乳酸生产植物乳杆菌菌株及利用该菌株生产d-乳酸的方法

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Non-Patent Citations (3)

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Lactate racemase is a nickel-dependent enzyme activated by a widespread maturation system;Benoît Desguin等;《Nat Commun.》;第5卷(第3615期);第3页左栏第2段到右栏最后1行 *
Metabolic Engineering of Lactobacillus plantarum for Direct L-Lactic Acid Production From Raw Corn Starch;Kenji Okano等;《Biotechnol. J.》;第13卷(第5期);摘要,第2.3小节,第3.3小节,第2.5小节最后1句 *

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