CN115054604A - 一种鸭嘴花碱干预银屑病的实验方法 - Google Patents

一种鸭嘴花碱干预银屑病的实验方法 Download PDF

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黄丰
杜雯霞
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Abstract

本发明公开了一种鸭嘴花碱干预银屑病的实验方法，选取SPF级BABL/c雄性小鼠24只，随机分为空白组，模型组，阳性药组，实验组。空白组每日于背部皮损处外涂62.5mg凡士林，其余三组每日于背部皮损处外涂62.5mg咪喹莫特(IMQ)诱导小鼠进行银屑病造模，期间模型组和空白组以生理盐水进行灌胃，阳性药组每日以甲氨蝶呤灌胃，实验组以鸭嘴花碱进行灌胃，同时对背部皮损处拍照记录，PASI对皮损处红斑、表皮脱屑及浸润程度评分，共5天。与模型组相比，鸭嘴花碱显著缓解银屑病小鼠的皮损样症状，PASI结果表示皮损处红斑、表皮增厚、鳞屑程度均有缓解，脏脾指数呈下降趋势；鸭嘴花碱对银屑病小鼠的皮损病理情况有治疗效果。

Description

一种鸭嘴花碱干预银屑病的实验方法
技术领域
本发明涉及银屑病治疗技术领域，具体是指一种鸭嘴花碱干预银屑病的实验方法。
背景技术
银屑病俗称牛皮藓，是皮肤科临床中一种常见的慢性炎症性、红斑鳞屑性皮肤病，易反复发作且难以根治，发病时间较长，有的患者几乎终身不愈，任何人只要停药有复发的可能，多在冬季加重，夏季有明显缓解，即冬重夏轻。累计人群较广，我国银屑病患病几率为0.47％患病人数超过600万，因其易反复发作和红斑鳞屑性皮损而严重影响患者的生活质量和美观，对患者的身体健康和精神状况都有影响。银屑病的发病机制很复杂包括遗传因素，免疫机制，环境因素，中医病因，人类对银屑病的认识经历了一个较为漫长曲折的过程，到目前为止，还没有找到能够根治银屑病的药物和方法，最多见的治疗措施有生物制剂、光疗、免疫调剂、抗炎等。现有方案有序贯疗法、交替及联合。尽管这些方法在临床治疗中得到了肯定，但都在一定程度上存在着对皮肤的损害及相应的不良反应，因此寻找安全有效都新药的研发仍然是目前医学界关注的重点。
银屑病的病理表现主要为境界清楚的浸润性红斑的基础上，表皮角化过度伴有角度不全，覆盖着银白色的鳞屑，鳞屑较厚，一般没有明显的瘙痒。它的诱发和加重因素很多，目前尚未完全明确，在中医理论里，银屑病是被认为在“松皮癣”“白疕”“疕风”等的范畴，它的发病原因包括了血瘀、湿邪、血热、外风等，其中，银屑病最常见的致病因素就是血热风盛，它贯穿在了银屑病的整个病理过程中，血热之邪结聚于皮肤，患有银屑病者会感到脾胃积热和内热偏盛，或者外感风热，热入血液，局部气血流动受阻，血热引起皮肤红斑，热盛血燥引起鳞屑、脱屑等症状。因此中医还可以从清热凉血的角度治疗银屑病。从现代医学角度它是一种基因遗传和免疫功能失调及T细胞异常引起的表皮质形成细胞的过度增生导致的皮肤炎症反应。
本发明探究的药物鸭嘴花碱(vasicine)是从爵床科植物鸭嘴花(AdhatodavasicaNees.)及蒺藜科植物骆驼蓬(PeganumharmalaLinn.)等植物中分离获得的含有一个手性中心的吡咯并[2，1-b]喹唑啉类生物碱，主要分布于我国云南，四川等地。藏医经典著作《晶珠本草》里面记有鸭嘴花味苦性凉，治血热病，肝热，赤巴热的功效，是类风湿性关节炎常用药物，其中从鸭嘴花的二氯甲烷部位萃取出的一系列抗炎活性较强的化合物，具体有鸭嘴花酮碱、鸭嘴花碱、7-甲氧基鸭嘴花碱、丁香脂素、3-吲哚甲醛等成分。后续也经过实验证实这些成分确实有效改善皮损组织的病理情况，能够降低肥大细胞数量和外周血中炎性细胞因子数量，由此想到到用鸭嘴花里的成分鸭嘴花碱可能对皮肤炎症性银屑病有治疗作用。
发明内容
针对上述情况，为克服现有技术的缺陷，本发明提供了一种鸭嘴花碱干预银屑病的实验方法，通过采用咪喹莫特(IMQ)诱导BALB/c小鼠进行银屑病造模，通过皮损PASI评分、光镜进行观察小鼠HE染色的皮肤的病理损伤情况、酶联免疫吸收法(ELISA)检测小鼠皮肤匀浆及外周血中IL-17A、IL-23、IL-25的表达水平来探讨鸭嘴花碱干预银屑病的可能机制。
为实现上述目的，本发明提供以下的技术方案：一种鸭嘴花碱干预银屑病的实验方法，以雄性小鼠为实验对象，包括如下步骤：
1)动物造模，使用咪喹莫特或***进行诱导，诱发雄性小鼠的背部表现出类似人类的银屑病症状；并对动物分组，分为正常组、模型对照组、3mg/kg阳性对照组和200mg/kg鸭嘴花碱组；
2)动物给药，正常组以及模型对照组以生理盐水灌胃，每日一次，连续5日；
阳性药对照组以0.5％CMC-Na溶解3mg/kg甲氨蝶呤灌胃，每日一次，连续5日；
鸭嘴花碱组以0.5％CMC-Na溶解200mg/kg鸭嘴花碱灌胃，每日一次，连续5日；
3)通过PASI法评价皮损程度、动物取材及HE染色、酶联免疫吸收法检测小鼠皮肤匀浆以及外周血中IL-17A、IL-23、IL-25细胞因子的表达水平，来记录雄性小鼠背部皮肤皮损处组织的情况；
4)通过统计学对相关数据进行处理，对结果进行分析。
优选的，所述步骤1)中，使用剃毛器和脱毛膏将所有雄性小鼠背部去毛形成2cm×3cm暴露区域，然后再涂药膏。
优选的，所述步骤1)中，正常组以62.5mg凡士林涂抹背部；模型对照组以62.5mg5％咪喹莫特涂抹背部；鸭嘴花碱对照组在暴露区外涂62.5mg 5％咪喹莫特软膏；阳性药对照组在暴露区外涂62.5mg 5％咪喹莫特软膏。
优选的，所述步骤3)中，依据PASI评分标准进行PASI评分，因皮损面积均为背部，不予考虑面积百分比，记录小鼠皮损处红斑、表皮脱屑及浸润程度分别记0-4分，小鼠皮损指标总积分按照红斑、表皮脱屑和板块肥厚三者之和。
优选的，所述步骤3)中，关于动物取材及HE染色，在末次给药1h后，各组小鼠取血，每只1ml，取血后当即在4℃环境下离心1500r/min共5min，吸取出上层血清，-20℃保存，用于细胞因子检测；接着把小鼠进行断颈处死，将背部皮肤取下一部分进行病理切片，然后固定在10％甲醛溶液中，进行石蜡包埋，切片，最后是苏木精-伊红染色后；一部分背部皮肤取下进行组织匀浆，送公司进行组织内细胞因子的检测。通过玻片扫描进行观察小鼠HE染色的皮肤损伤组织其病理损伤状况。
优选的，所述步骤3)中，准确称量小鼠皮肤组织重量，按1:9比例加入PBS，用组织研磨仪充分匀浆。4℃、3000转离心20min，收集上清，按ELISA试剂盒说明书提示检测各组皮肤组织中IL-17A、IL-23、IL-25细胞因子的表达水平。
优选的，所述步骤3)中，麻醉小鼠摘取眼球，眼眶内取血，静置30min，于低温高速离心机离心10min，4℃、3000转离心，吸取上层血清，-80℃保存。按ELISA试剂盒说明书提示检测各组外周血中IL-17A、IL-23、IL-25细胞因子的表达水平。
采用以上技术方案的有益效果是：通过本试验方法可以表明鸭嘴花中的生物活性成分能显著改善银屑病模型小鼠的病理症状，由免疫组化结果显示鸭嘴花碱可抑制炎性细胞因子的过度表达。对银屑病小鼠有治疗作用。
附图说明
图1鸭嘴花碱对银屑病小鼠皮肤组织外观影响图；
图2各组小鼠皮肤组织PASI图；
图3鸭嘴花碱对银屑病小鼠背部皮损病理改变的影响图(HE染色，200×，比例尺50μm)；
图4各组小鼠脾脏指数变化图；
图5鸭嘴花碱对银屑病模型小鼠外周血中IL-17A含量的影响图；
图6鸭嘴花碱对银屑病模型小鼠外周血中IL-23含量的影响图；
图7鸭嘴花碱对银屑病模型小鼠外周血中IL-25含量的影响图；
图8鸭嘴花碱对银屑病模型小鼠皮肤组织匀浆中IL-17A含量的影响图；
图9鸭嘴花碱对银屑病模型小鼠皮肤组织匀浆中IL-23含量的影响图；
图10鸭嘴花碱对银屑病模型小鼠皮肤组织匀浆中IL-25含量的影响图。
上述附图中，Normal-正常组；Model-模型组；MTX-阳性对照组(3mg/kg)；Vas-鸭嘴花碱组(200mg/kg)。
附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例；基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
下面详细说明本发明的优选实施方式。
实验材料准备，雄性小鼠由实验动物有限责任公司提供的重量为18-20g，8-12周的雄性小鼠，于云南中医药大学SPF级动物实验中心饲养，饮用水由实验中心提供，饲养温度维持在18-24℃，予以定期投喂饲料，更换垫料，定期对笼具进行清洗消毒，实验性喂养一周后开始实验。
实验药物包括鸭嘴花碱，咪喹莫特软膏，阳性药(甲氨蝶呤)；实验试剂包括生理盐水、0.5％CMC-Na、云南省中医院供给的规格：500g/瓶的白凡士林；实验仪器包括生强科技玻片扫描影像分析***，离心机，组织匀浆器。
实验方法包括以下步骤，
1)动物造模
动物造模是指人为的用一些方法，诱发动物背部表现出类似人类的银屑病症状，常用的人工方法有，控制该动物所需的必须脂肪酸，给予化学刺激及药物等目前绝大多数采用咪喹莫特和***进行诱导。本实验采用咪喹莫特涂抹的方式造模。
将24只BALB/c雄性小鼠，适应性喂养一周后，使用剃毛器和脱毛膏将所有小鼠背部去毛形成2cm×3cm暴露区域后，按照随机分配的原则进行分组，具体是空白组、模型对照组、3mg/kg阳性对照组、200mg/kg鸭嘴花碱组。
2)动物给药
正常组以62.5mg凡士林涂抹背部；然后用生理盐水灌胃，每日一次，连续5天
模型组以62.5mg咪喹莫特涂抹背部；然后用生理盐水灌胃，每日一次，连续5天。
鸭嘴花碱对照组在暴露区外涂62.5mg 5％咪喹莫特软膏；然后以0.5％CMC-Na溶解200mg/kg鸭嘴花碱灌胃，每日一次，连续5天。
阳性药对照组在暴露区外涂62.5mg 5％咪喹莫特软膏；然后以0.5％CMC-Na溶解3mg/kg甲氨蝶呤灌胃，每日一次，连续5天。
3)对雄性小鼠背部皮肤皮损处组织的情况进行分析
PASI评价皮损程度
在给药过程中，依据PASI评分标准进行PASI评分，因皮损面积均为背部，不予考虑面积百分比，记录小鼠皮损处红斑、表皮脱屑及浸润程度分别记0-4分，小鼠皮损指标总积分按照红斑、表皮脱屑和板块肥厚三者之和。具体评定标准有：无红斑、无表皮脱屑、无组织肥厚或皮肤完整，记录为0分；皮肤表皮可见淡红色斑、肉眼可见少许细微表皮脱屑或皮损程度较正常稍高，记录为1分；皮肤表皮可见红色斑块、皮损有较为明显***或表皮损伤程度呈皮状的表皮脱屑，记录为2分；肉眼可见明显皮损组织***，皮肤颜色呈深红色板块，表皮可见较明显脱屑或较明显浸润，记录为3分；肉眼可见皮损极为明显增厚***，且颜色为极深红色斑块、表面覆盖厚实而且呈层状的脱屑或明显浸润为极重度，记录为4分。PASI＝鳞屑评分+红斑评分+皮肤增厚评分。把对三个组小鼠的评分取平均值，绘制趋势线，观察趋势线对各小组银屑病样皮损情况做出评价。
动物取材及HE染色
末次给药，禁食12h后，各组小鼠取血，取血后当即在4℃环境下离心1500r/min共5min，吸取出上层血清，-20℃保存，用于细胞因子检测。接着把小鼠进行断颈处死，将背部皮肤取下一部分进行病理切片，然后固定在10％甲醛溶液中，进行石蜡包埋，切片，最后是苏木精-伊红(hematoxylin-eosin，HE)染色后和甲苯胺蓝染色。一部分背部皮肤取下进行组织匀浆，进行组织内细胞因子的检测。通过玻片扫描进行观察小鼠HE染色的皮肤损伤组织其病理损伤状况。具体评判标准有：镜下可明显观察到角化过度或不全角化皮损出现，可观察到颗粒消失、或者颗粒层显著变薄，***水肿及***上变薄的棘层并向上延长，毛细血管扩张，血管外渗出炎性细胞、以及包裹大量炎性细胞浸润(如：肥大细胞大量堆积形成脓肿)。
酶联免疫吸收法(ELISA)检测小鼠皮肤匀浆中IL-17A、IL-23、IL-25的表达水平
准确称量小鼠皮肤组织重量，按1:9比例加入PBS，用组织研磨仪充分匀浆。4℃、3000转离心20min，收集上清，按ELISA试剂盒说明书提示检测各组皮肤组织中IL-17A、IL-23、IL-25炎性因子的表达水平。
酶联免疫吸收法(ELISA)检测外周血IL-17A、IL-25、IL-23的表达水平
麻醉小鼠摘取眼球，眼眶内取血，静置30min，于低温高速离心机离心10min，4℃、3000转离心，吸取上层血清，-80℃保存。按ELISA试剂盒说明书提示检测各组外周血中IL-17A、IL-23、IL-25炎性因子的表达水平。
一般情况分析：观察并记录小鼠的体质量、脾质量、并计算脾脏指数；脾指数＝脾质量/体质量×100％。
4)通过统计学对相关数据进行处理，对结果进行分析
对所得数据进行统计学分析，数据x±s表示，使用单因素方差分析和t检验分析，P＜0.05的值表示差异具有统计学意义。
鸭嘴花碱对小鼠皮损症状的影响及PASI评分
正常组小鼠背部皮肤光滑无红斑、鳞屑、增厚等改变。模型组背部肉眼可见皮损极为明显增厚***、明显红斑、表皮覆盖厚实而且成层状细小鳞屑，鸭嘴花碱组与阳性对照组小鼠背部银屑病皮损样症状较模型组轻微，其中鸭嘴花碱组表皮增厚、红斑、鳞屑程度较阳性组对照组稍高(见图1)。PASI评分结果(如图2)所示模型组小鼠从给药的第二天开始皮损处红斑、表皮脱屑、板块增厚及浸润程度一直处于加重的趋势，阳性药组和鸭嘴花碱组与模型组相比皮损样症状有明显改善，且在后面两天的阳性组和鸭嘴花碱组PASI评分几乎是相等的结果，表明鸭嘴花碱对小鼠银屑病症状确实有治疗作用，便且治疗作用和阳性药的药效几乎一致。
鸭嘴花碱对小鼠皮损组织病理程度的影响
正常对照组小鼠皮肤组织无明显异常，表皮完整清晰，复层扁平上皮层较薄，细胞排列较为整齐紧密；真皮内胞质红染，呈嗜酸性，毛囊与腺体形态正常，脂肪组织清晰可见。模型组小鼠角质层过度角化，颗粒层明显变厚，皮突明显延长及有起伏，棘层肥厚，真皮层可见炎细胞浸润。阳性药(甲氨蝶呤)组小鼠颗粒层显著变薄，皮突稍有延长及有起伏，真皮层内可见少量炎细胞浸润，无其他明显病变。鸭嘴花碱组小鼠角质层角化过度，真皮层内可见少量炎细胞浸润，无其他明显病变。
鸭嘴花碱对小鼠脾系数的影响
正常组组小鼠的脾脏指数较低，在0.5以下，模型组的脾脏指数远远高于正常组大约在1.3左右，与模型组相比鸭嘴花碱组和阳性药组的指数都有明显降低，说明鸭嘴花碱可降低银屑病模型小鼠的脾脏指数。
鸭嘴花碱对小鼠外周血IL-7A、IL-23、IL-25细胞因子的影响
正常组小鼠的外周血中IL-7A、IL-23、IL-25含量表达较低不到20pg/ml，相比于正常组，模型组小鼠外周血中IL-7A、IL-23、IL-25的含量明显增多达30pg/ml，可见小鼠出现银屑病样症状的机制与炎性细胞因子IL-7A、IL-23、IL-25的表达含量增多有关，而与模型组相比鸭嘴花碱组和阳性组外周血的IL-7A、IL-23、IL-25含量均降低，说明鸭嘴花碱能够抑制银屑病模型小鼠外周血中IL-7A、IL-23、IL-25的表达。(如图5-7)
鸭嘴花碱对银屑病小鼠皮肤组织匀浆中IL-7A、IL-23、IL-25含量的影响
正常组小鼠皮肤组织匀浆中IL-7A、IL-23、IL-25表达量较低，相比于正常组，模型组小鼠皮肤组织匀浆中IL-7A、IL-23、IL-25的含量明显增多，显示小鼠出现银屑病样症状时皮肤组织匀浆中的炎性细胞因子IL-7A、IL-23、IL-25的表达量也成增高趋势，在给予鸭嘴花碱和阳性对照药后小鼠皮肤组织匀浆中IL-7A、IL-23、IL-25含量均降低，鸭嘴花碱组表达含量降低的程度小于阳性对照组，推测鸭嘴花碱能够抑制银屑病模型小鼠皮肤组织匀浆中中IL-7A、IL-23、IL-25的含量表达，但抑制效果不如阳性药。(如图8-10)
经研究发现，银屑病常与代谢综合征、肥胖、糖尿病等疾病共同发生，银屑病的起因与病理发展历程与细胞因子等小分子密切相关，经研究证实，IL-17A/IL-23轴在银屑病发展历程中联络各细胞因子的中心炎症轴，IL-23主要来自于单核细胞、朗格汉斯细胞、巨噬细胞、真皮树突状细胞，在银屑病的病理过程中通过结合相关受体促进Th17细胞增殖和分泌IL-17、IL-25等炎症因子，导致这些炎性因子的过度表达，进而引起角质形成细胞的异常增殖和过度活化，发生一系列特异性免疫反应，也通过诱导其他炎性因子例如IL-36(IL-36α、IL-36β、IL-36γ)的过度表达加重银屑病的病理情况。IL-17在银屑病发病过程中的重要性尤为突出，是银屑病的关键致病因子，主要来源于真皮γδTCRlow T细胞，能够活化中性粒细胞，阻止其凋亡，促进TNF-α、IL-6、IL-1等多种细胞的形成，导致角质形成细胞活化和异常增生，促使中性粒细胞向皮损处聚集，导致表皮组织结构的病理性改变，因此要有效改善银屑病的病理情况因该要能够抑制炎性细胞因子IL-23、IL-17的表达。
本实验研究结果表明鸭嘴花中的生物活性成分能显著改善银屑病模型小鼠的病理症状，由免疫组化结果显示鸭嘴花碱可抑制炎性细胞因子的过度表达。对银屑病小鼠有治疗作用。
以上所述的仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明创造构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。

Claims (7)

1.一种鸭嘴花碱干预银屑病的实验方法，以雄性小鼠为实验对象，其特征在于，包括如下步骤：
1)动物造模，使用咪喹莫特或***进行诱导，诱发雄性小鼠的背部表现出类似人类的银屑病症状；并对动物分组，分为正常组、模型对照组、3mg/kg阳性对照组和200mg/kg鸭嘴花碱组；
2)动物给药，正常组和模型对照组以生理盐水灌胃，每日一次，连续5日；
阳性药对照组以0.5％CMC-Na溶解3mg/kg甲氨蝶呤灌胃，每日一次，连续5日；
鸭嘴花碱对照组以0.5％CMC-Na溶解200mg/kg鸭嘴花碱灌胃，每日一次，连续5日；
3)通过PASI法评价皮损程度、动物取材及HE染色、酶联免疫吸收法检测小鼠外周血和皮肤匀浆中IL-17A、IL-23、IL-25的表达水平，来记录鸭嘴花碱对银屑病小鼠背部皮肤皮损处组织的干预情况；
4)通过统计学对相关数据进行处理，对结果进行分析。
2.根据权利要求1所述的鸭嘴花碱干预银屑病的实验方法，其特征在于，所述步骤1)中，使用剃毛器和脱毛膏将所有雄性小鼠背部去毛形成2cm×3cm暴露区域，然后再涂药膏。
3.根据权利要求2所述的鸭嘴花碱干预银屑病的实验方法，其特征在于，所述步骤1)中，正常组以62.5mg凡士林涂抹背部；模型对照组以62.5mg 5％咪喹莫特涂抹背部；鸭嘴花碱对照组在暴露区外涂62.5mg 5％咪喹莫特软膏；阳性药对照组在暴露区外涂62.5mg 5％咪喹莫特软膏。
4.根据权利要求1所述的鸭嘴花碱干预银屑病的实验方法，其特征在于，所述步骤3)中，依据PASI评分标准进行PASI评分，因皮损面积均为背部，不予考虑面积百分比，记录小鼠皮损处红斑、表皮脱屑及浸润程度分别记0-4分，小鼠皮损指标总积分按照红斑、表皮脱屑和板块肥厚三者之和。
5.根据权利要求1所述的鸭嘴花碱干预银屑病的实验方法，其特征在于，所述步骤3)中，关于动物取材及HE染色，在末次给药1h后，各组小鼠取血，每只1ml，取血后当即在4℃环境下离心1500r/min共5min，吸取出上层血清，-20℃保存，用于细胞因子检测；接着把小鼠进行断颈处死，将背部皮肤取下一部分进行病理切片，然后固定在10％甲醛溶液中，进行石蜡包埋，切片，最后是苏木精-伊红染色后和甲苯胺蓝染色；一部分背部皮肤取下进行组织匀浆，送公司进行组织内细胞因子的检测。通过玻片扫描进行观察小鼠HE染色的皮肤损伤组织其病理损伤状况。
6.根据权利要求1所述的鸭嘴花碱干预银屑病的实验方法，其特征在于，所述步骤3)中，准确称量小鼠皮肤组织重量，按1:9比例加入PBS，用组织研磨仪充分匀浆；4℃、3000转离心20min，收集上清，按ELISA试剂盒说明书提示检测各组皮肤组织中IL-17A、IL-23、IL-25细胞因子的表达水平。
7.根据权利要求1所述的鸭嘴花碱干预银屑病的实验方法，其特征在于，所述步骤3)中，麻醉小鼠摘取眼球，眼眶内取血，静置30min，于低温高速离心机离心10min，4℃、3000转离心，吸取上层血清，-80℃保存。按ELISA试剂盒说明书提示检测各组外周血中IL-17A、IL-23、IL-25细胞因子的表达水平。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN110876693A (zh) * 2019-12-09 2020-03-13 南京薏蓼生物科技有限公司 一种用于牛皮癣的天然皮肤修复乳液及其制备办法

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张义英;王俊儒;李越鲲;姚伟琴;: "骆驼蓬生物碱生物活性的研究进展", 动物医学进展, no. 10, pages 1 - 2 *

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