CN115053803A - 一种具备强化颜色标记与高频单倍体诱导率的诱导系选育方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种具备强化颜色标记与高频单倍体诱导率的诱导系选育方法及其应用。本发明提供了一种玉米单倍体诱导系的选育方法，通过将颜色标记进行聚合，强化诱导系颜色标记，并对诱导系选育材料自交颜色标记与诱导率提前筛选，在诱导系自交当代对颜色标记和自交诱导率进行选择，提前淘汰颜色标记弱和诱导率偏低的候选单株，有效降低后续单倍体诱导测验工作量，从而提高诱导系选育的效率。另外结合单倍体诱导基因分子标记辅助选择、幼胚培养、单倍体加倍等技术，可大大缩短选育周期。最终实现选育具备强化颜色标记与高频单倍体诱导率的诱导系的目的。

Description

一种具备强化颜色标记与高频单倍体诱导率的诱导系选育方 法及其应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种具备强化颜色标记与高频单倍体诱导率的诱导系选育方法及其应用。
背景技术
玉米商业化育种的关键在于纯系的制备，常规育种即自交或回交以及单倍体育种即DH(doubled haploid)技术被广泛应用于纯系选育中。而单倍体育种以其可以大大缩短育种年限的优势，应用范围不断扩大。据CIMMTY估计，目前北美和欧洲主要种子公司，生产的玉米新品种亲本中，大约70％到80％含有一个或多个DH系，以DH为基础的玉米杂交种覆盖全球面积约6.0到7.5亿亩(CIMMTY，2015)。单倍体育种技术主要包括诱导、鉴别、加倍和DH评价四个方面。其中单倍体的诱导作为单倍体育种技术的首要环节被广泛关注。目前玉米单倍体育种技术主要基于孤雌生殖诱导系完成，因此单倍体诱导系的选育直接影响单倍体育种技术的应用与效率。针对单倍体诱导系选育年限长、工作量大的问题，提供缩短育种年限，减少工作量的方法，可有效提高具备高频、强化标记单倍体诱导系选育效率。
发明内容
为解决单倍体诱导系选育年限长，工作量大的问题，本发明提供了一个可行的方案，可大大提高单倍体育种技术的效率。
第一方面，本发明要求保护一种选育玉米单倍体诱导系的方法。
本发明所要求保护的选育玉米单倍体诱导系的方法，可包括如下步骤：先对候选群体内单株的自交或回交后代进行颜色标记的强化和诱导率评价，在利用测验种进行杂交检验；所述候选群体由携带纯合单倍体诱导基因和纯合颜色标记基因的若干单株组成。
在本发明的一些案例中，所述方法可包括如下步骤：
(A1)父本和母本杂交获得F1代；所述父本和所述母本中至少一个为携带单倍体诱导基因和颜色标记基因的单倍体诱导系；
(A2)将(A1)所得F1代进行自交或者与诱导系亲本回交，从自交或回交后代中选择携带纯合所述单倍体诱导基因和纯合所述颜色标记基因的若干单株组成单株群1；
该步骤可通过分子标记进行筛选。
(A3)将所述单株群1中的单株进行自交或与诱导系亲本回交，所得自交或回交后代中含有单倍体和二倍体，对其中的单倍体进行加倍，对加倍成功的单倍体和所述二倍体的着色情况、和/或单倍体诱导性能进行鉴定，从中筛选出着色相对较深、和/或单倍体诱导性能相对较好的若干单株组成单株群2；
(A4)将所述单株群2中的单株与测验种进行杂交，对所得杂交后代的着色情况、和/或单倍体诱导性能进行鉴定，从所述单株群2中筛选能够与所述测验种杂交产生着色相对较深、和/或单倍体诱导性能相对较好的杂交后代的单株，作为候选单株；
该步骤中，所述测验种不含有(A1)中所述的颜色标记基因。进一步地，所述测验种中不含有任何颜色标记基因。
(A5)若(A4)所得候选单株来自于(A3)中所述的加倍成功的单倍体，则所述候选单株为候选诱导系DH系；若(A4)所得候选单株来自于(A3)中所述的二倍体，则将所述候选单株继续重复步骤(A3)和步骤(A4)的步骤直至纯合稳定(完成背景纯化)，得到候选诱导系。
该步骤中，候选单株中二倍体利用幼胚培养与筛选的方式，可以实现一年3-4代，快速纯化背景。
(A6)从(A5)得到的所述候选诱导系DH系和所述候选诱导系中筛选得到目的玉米单倍体诱导系。
进一步地，对(A5)得到的所述候选诱导系DH系和所述候选诱导系进行单倍体诱导性能和农艺性状评价，筛选得到所述目的玉米单倍体诱导系(具备强化颜色标记与高频单倍体诱导率)。
该步骤中，所述农艺性状可包括但不限于株高、穗位、雄穗分支数、单穗结实数。
该步骤中，剔除雌雄不协调，不抗倒伏，雄穗偏小，花药稀少，自交结实差等不利性状的单株。重点记录紫色等有色单株性状，其诱导产生单倍体植株正常颜色，杂合二倍体为紫色等，可作为单倍体植株鉴别辅助标记，进一步强化诱导系颜色标记。
在所述方法中，经过步骤(A3)，淘汰了自交显色及单倍体诱导性能差的候选单株，大大减少候选系后续步骤(A4)诱导杂交单倍体诱导与鉴别工作量。
进一步地，步骤(A1)中，当所述父本和所述母本均为携带纯合所述单倍体诱导基因和纯合所述颜色标记基因的单倍体诱导系时，跳过或不跳过步骤(A2)。此时的所述F1代即为携带纯合所述单倍体诱导基因和纯合颜色标记基因的若干单株(即所述单株群1)。
进一步地，所述单倍体诱导性能可体现为幼胚单倍体诱导率、成熟籽粒单倍体诱导率和/或单穗单倍体数等。
进一步地，所述着色情况可为幼胚着色和/或成熟籽粒着色和/或芽鞘着色和/或叶片着色和/或植株着色等。
在本发明的一些案例中，对幼胚着色情况进行鉴定以及对幼胚单倍体诱导率进行鉴定均是在授粉后15-20天(如15天)时进行鉴定的。
在本发明的一些案例中，所述颜色标记基因具体为R1-nj。所述单倍体诱导基因具体为Zmpla1和Zmdmp。
在本发明的一些案例中，步骤(A3)中，对所述单倍体进行加倍为对单倍体幼胚进行加倍。进一步地，对所述单倍体幼胚进行加倍和对所述幼胚着色情况进行鉴定是按照如下操作同步进行的：将幼胚置于含有0.1g/L秋水仙素的培养基(如MS培养基)上光照培养12-48h(如24h)，实现所述单倍体幼胚的加倍并进行幼胚着色情况评价。
在本发明的一些案例中，所述着色相对较深的单株为按照颜色从深到浅的顺序排列，排名前10％的单株。
对于幼胚而言，所述着色相对较深也可以理解为幼胚显色程度为4级或5级。幼胚显色程度划分级数的原则如下：幼胚连续培养24h后，根据幼胚显色情况分为1-5级，具体分级标准如下：1级，幼胚不显色或显色极弱；2级，幼胚为淡紫色且显色面积较小；3级，幼胚均显色为淡紫色或紫色；4级，幼胚均显紫色；5级，幼胚呈紫黑色。
在本发明的一些案例中，所述单倍体诱导性能相对较好的单株为将所述单倍体诱导性能按照从优到劣的顺序排列，排名前10％的单株。
在本发明的一些案例中，步骤(A1)中，所述父本和所述母本均为携带纯合所述单倍体诱导基因和纯合所述颜色标记基因的单倍体诱导系。进一步地，所述父本和所述母本为玉米单倍体诱导系CHOI4和CAU6。步骤(A4)中，所述测验种为京科999。
第二方面，本发明要求保护如下任一应用：
(B1)由前文第一方面所述方法得到的玉米单倍体诱导系在玉米育种中的应用；
(B2)前文第一方面所述方法在提高玉米单倍体诱导率中的应用；
(B3)由前文第一方面所述方法得到的玉米单倍体诱导系在提高玉米单倍体诱导率中的应用；
(B4)前文第一方面所述方法在提高玉米单倍体鉴别效率中的应用；
(B5)由前文第一方面所述方法得到的玉米单倍体诱导系在提高玉米单倍体鉴别效率中的应用。
本发明通过将颜色标记进行聚合，强化诱导系颜色标记，并对诱导系选育材料自交颜色标记与诱导率提前筛选，在诱导系自交当代对颜色标记和自交诱导率进行选择，从而提前淘汰颜色标记弱和诱导率偏低的候选单株，有效降低后续单倍体诱导测验工作量，从而提高诱导系选育的效率。另外结合单倍体诱导基因分子标记辅助选择、幼胚培养、单倍体加倍等技术，可大大缩短选育周期。最终实现选育具备强化颜色标记与高频单倍体诱导率的诱导系的目的。
附图说明
图1为本发明玉米单倍体诱导系选育流程图。
图2为着色幼胚分级。
图3为自交着色差异单株杂交诱导幼胚着色比较。
图4为自交着色差异单株杂交诱导幼胚显色率与单倍体鉴别准确率比较。
图5为自交着色差异单株自交与杂交诱导籽粒着色比较。
图6为自交单倍体诱导率与杂交单倍体诱导率相关性分析。
具体实施方式
本发明整体具体选育流程，参见图1。可包括如下步骤：(1)利用双诱导系或一个诱导系与非诱导系杂交获得F1；(2)利用双分子标记分别检测控制玉米单倍体诱导主效基因Zmpla1和Zmdmp，保留两个基因均纯合,并且同时携带纯合R1-nj标记的单株；(3)对诱导基因和颜色标记纯合的候选单株自交，授粉后15天，对其自交幼胚离体培养，并根据其选择着色较好的幼胚进行成苗；(4)对上述成苗继续自交，评价其自交幼胚、籽粒着色及单倍体诱导率，淘汰幼胚着色差或自交单倍体诱导率较低的单株；(5)对上一轮保留的单株进行杂交诱导，对其杂交诱导幼胚着色及单倍体诱导性能进行筛选；(6)候选单株后代中单倍体直接加倍获得稳定诱导系，二倍体利用幼胚培养与鉴定的方式，实现快速背景纯化；(7)由此结合候选诱导系自交幼胚及籽粒着色，候选诱导系测验杂交幼胚及籽粒着色，候选诱导系自交幼胚及籽粒单倍体诱导率，候选单株诱导杂交单倍体幼胚及籽粒诱导率和单穗单倍体数，最终选育获得具备强化颜色标记与高频单倍体诱导率的诱导系。
具体涉及如下技术环节：
1、玉米材料准备与选育流程确认
选择具备优良颜色标记性状的玉米单倍体诱导系作为诱导系选育亲本之一，其中优良颜色标记主要包括紫胚、紫芽和紫色叶片、茎秆等性状。筛选具备强化颜色标记玉米自交系或单倍体诱导系作为另一亲本，进行杂交组配获得F1。所选择作为亲本之一的单倍体诱导系携带纯合单倍体诱导基因Zmpla1和Zmdmp，以及颜色标记基因R1-nj。
2、主效诱导基因检测
若上述所得F1亲本均为携带纯合单倍体诱导基因Zmpla1和Zmdmp的诱导系，则将F1直接进行自交或使用亲本之一回交。若所得F1亲本之一为非诱导系，则需对F1进行自交或使用诱导系亲本进行回交，获得分离获得F2或BC1F1分离群体。玉米单倍体诱导性状的主要受两大主效基因Zmpla1和Zmdmp控制,单独的Zmpla1仅能表现出约2％的诱导率，Zmdmp可显著增强Zmpla1的单倍体诱导效应，两者相叠加上可提高2-3倍的诱导率。具体引物序列参照专利“CN103088109A”和“CN104846104A”。根据分子标记辅助选择结果，选择Zmpla1和Zmdmp均纯合的单株，可显著提高单倍体诱导率的选择响应。而后利用分子标记对分离群体单株进行检测，获得同时具备纯合基因Zmpla1和Zmdmp，并根据籽粒颜色剔除无色不携带R1-nj标记的单株。
3、颜色标记筛选与强化
对上述所得携带纯合R1-nj标记、Zmpla1和Zmdmp的F1或F1以上世代单株进行自交或诱导系回交，授粉后15-20天，取自交或回交果穗进行剥胚离体培养，整个过程在无菌操作室完成，首先使用75％酒精对果穗进行消毒，而后在超净台剥胚幼胚，将幼胚置于MS加倍培养基(配方：MS盐3.0g/L+蔗糖30g/L+琼脂7.5g/L+秋水仙素0.1g/L+2％二甲基亚砜，pH＝5.8。各物质的浓度为在培养基中的终浓度)进行离体培养，胚平面朝下，培养条件24h光照，湿度60％。连续培养24h后，对自交或回交幼胚显色情况进行评价，根据单个幼胚显色情况进行分级1-5级，幼胚显色程度划分级数的原则如下：自交幼胚连续培养24h后，根据幼胚显色情况分为1-5级，具体分级标准如下：1级，自交幼胚不显色或显色极弱；2级，自交幼胚为淡紫色且显色面积较小；3级，自交幼胚均显色为淡紫色或紫色；4级，自交幼胚均显紫色；5级，自交幼胚呈紫黑色。具体分级请参见图2。选择显色等级达到4级或5级的幼胚转移至1/2MS培养基(配方：MS盐1.5g/L+蔗糖30g/L+琼脂7.5g/L，pH＝5.8。各物质的浓度为在培养基中的终浓度)进行成苗进入下一世代。继续培养24-72h，幼胚发芽长根后，根据胚芽鞘颜色及胚根颜色的显色强度，对芽苗进行分类继续成苗，并进行田间移栽。从而实现聚合芽苗辅助鉴别标记，强化单倍体鉴别标记，提升单倍体鉴别效率的目的。
4、根据候选单株自交幼胚及成熟籽粒着色，强化颜色标记
由于上述所选单株均携带纯合R1-nj标记、Zmpla1和Zmdmp，在进行自交或亲本诱导系回交的后代中，会出现一定比例的单倍体，且所得单倍体同样携带R1-nj标记、Zmpla1和Zmdmp，利用MS加倍培养基(配方同前)对幼胚显色进行评价的同时，即可完成诱导系单倍体的加倍工作，而二倍体幼胚加倍试剂耐受性强，其在加倍试剂处理后仍可正常生长。因此，根据田间表型对上述所得成苗进行分类，单倍体植株矮小，株型紧凑，叶片细长且上冲，二倍体植株处于较低世代，株型较为高大且披散。对加倍成功的单倍体及发育正常的二倍体进行自交，对于自交的加倍成功的单倍体，受单倍体加倍DH0结实较少的影响，仅在收获时，对所得诱导系DH系成熟籽粒胚乳和胚着色情况进行评价筛选，并对其进行排序，记录显色较好的前10％作为候选诱导系进入下一世代。对于候选的二倍体植株，在自交15天后，取中上部果穗剥胚用于自交幼胚培养，同时保留中下部果穗正常成熟，即对二倍体候选单株同时进行幼胚和成熟籽粒着色评价，同时记录自交单倍体幼胚诱导率。同时记录显色较好的前10％单株和单倍体诱导率较高的前10％单株，结合幼胚着色与自交诱导率两个指标选择，两个指标均处于排序靠前的10％的单株作为候选诱导系进入下一世代。经幼胚培养的候选诱导系，继续成苗，用于下一世代的诱导系筛选，中下部果穗成熟籽粒用于保种。上述候选单株若籽粒为有色种皮，可通过切开籽粒看胚着色，对成熟籽粒胚着色由深到浅进行排序，筛选前10％作为优良果穗。
5、根据候选单株杂交着色，强化颜色标记
取候选单株花粉对测验种(如京科968)进行授粉4穗以上。授粉后15天，取1穗候选诱导系与测验种(如京科968)杂交果穗，剥胚于MS加倍培养基(配方同前)进行培养，操作流程如前所述，对杂交幼胚显色进行分级，具体分级如下：幼胚连续培养24h后，根据幼胚显色情况分为1-5级，具体分级标准如下：1级，幼胚不显色或显色极弱；2级，幼胚为淡紫色且显色面积较小；3级，幼胚均显色为淡紫色或紫色；4级，幼胚均显紫色；5级，幼胚呈紫黑色。记录杂交幼胚显色等级达到4-5级的候选诱导系编号。单倍体幼胚仅含有母本(测验种)染色体，因此不显色，杂合二倍体幼胚携带诱导系R1-nj标记而显色，因此根据显色情况，统计单倍体幼胚数，计算诱导率。剩余的杂交诱导果穗，待成熟后，结合诱导系自交成熟籽粒显色情况，显色较差，则可以直接剔除，不进行杂交二倍体显色、诱导率成熟籽粒着色评价等后续工作，对于显色较好的候选单株根据杂交成熟籽粒胚乳及胚着色情况进行排序，选择胚乳和胚均着色明显，按照颜色从深到浅的顺序排列排名前10％的单株的父本单株，作为候选诱导系进入下一世代。
6、单倍体诱导性能评价
根据候选单株自交幼胚着色、自交成熟籽粒着色、杂交幼胚显色等级，杂交成熟籽粒显色等级，诱导率，筛选自交着色好，杂交显色等级高，诱导率较高的候选单株，进入下一轮。若候选单株为单倍体，其自交所得籽粒均为DH系，可直接作为稳定诱导系进行下一步评价。若候选单株为二倍体，则可选择上述幼胚加代成苗进行下一步的诱导系性能评价工作。重复步骤3-5，进一步自交进行背景纯化。结合胚培养技术，可完成一年3-4代，实现快速育种。记录幼胚及成熟籽粒杂交单倍体诱导率，单穗单倍体数等指标。
7、农艺性状筛选
在对候选诱导系颜色标记进行筛选强化的同时，对候选单株农艺性状进行筛选，根据田间表现，剔除雌雄不协调，不抗倒伏，雄穗偏小，花药稀少，自交结实差等不利性状的单株。重点记录紫色等有色单株性状，其诱导产生单倍体植株绿色(正常颜色)，杂合二倍体为紫色，可作为单倍体植株鉴别辅助标记，进一步强化诱导系颜色标记。
8、综合鉴定指标
具体鉴定指标主要包括：(1)单倍体鉴别颜色标记类型：紫色幼胚标记，紫色芽鞘标记和紫色植株标记等；(2)单倍体鉴别颜色标记强化筛选时期：候选诱导系自交幼胚及籽粒，候选诱导系测验杂交幼胚及籽粒；(3)单倍体诱导性能：单倍体幼胚诱导率、单倍体成熟籽粒诱导率、单穗单倍体数、候选诱导系自交单倍体幼胚及成熟籽粒诱导率；(4)其他农艺性状：株高、穗位、雄穗分支数和单穗结实数等。
利用前述方法选育具有强化颜色标记的诱导系，可在诱导系自交当代对颜色标记和自交诱导率进行选择，从而提前淘汰颜色标记弱和诱导率偏低的候选单株，进而大大减少后续候选单株杂交测验工作量，从而提高诱导系选育的效率。
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中的高频单倍体诱导系CHOI4，其平均诱导率为10％以上，具有R1-nj标记，在文献“Liu Chenxu,et al.Development of high-oil maize haploid inducerwith a novelphenotyping strategy”中公开过，公众可从中国农业大学获得，该材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
下述实施例中的高频单倍体诱导CAU6，其平均诱导率为12％，具有R1-nj标记，在文献“Zhong Yu,Liu Chenxu,et al.Mutation of Zmdmp enhances haploid inductionin maize.[J].Nature plants,2019,5(6).”中公开过，公众可从中国农业大学获得，该材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
以下实施例中玉米(Zea mays L.)杂交种京科999(植物新品种权申请公告号CNA034213E)为公知材料，由北京市农林科学院玉米研究中心自选育，公众可从北京市农林科学院获得，以重复本申请实验，不可作为其它用途使用。
下述实施例中的MS盐、蔗糖和琼脂糖等试剂均为北京吉普腾生物技术有限公司产品。
实施例1、自交当代对单倍体鉴别颜色标记筛选的有效性验证
一、构建分离群体
选用诱导系CHOI4和CAU6为亲本进行杂交获得F1，两诱导系均携带纯合主效诱导基因Zmpla1、Zmdmp和单倍体鉴别R1-nj颜色标记。其中诱导系CHOI4为紫杆诱导系，CAU6为青杆诱导系。
二、自交幼胚显色双向选择
将所得F1自交，由于两亲本所携带诱导基因与R1-nj颜色标记均为纯合，因此F1分离后代在诱导基因与颜色标记方面不会发生分离。在授粉后15天，取F1自交果穗，按照幼胚离体培养标准流程，剥取幼胚，于MS加倍培养基(配方：MS盐3.0g/L+蔗糖30g/L+琼脂7.5g/L+秋水仙素0.1g/L+2％二甲基亚砜，pH＝5.8。各物质的浓度为在培养基中的终浓度)上培养，培养条件24h光照，湿度60％。连续培养24h后，根据幼胚着色情况，显色分级原则如下：自交幼胚连续培养24h后，根据幼胚显色情况分为1-5级，具体分级标准如下：1级，自交幼胚不显色或显色极弱；2级，自交幼胚为淡紫色且显色面积较小；3级，自交幼胚均显色为淡紫色或紫色；4级，自交幼胚均显紫色；5级，自交幼胚呈紫黑色(具体幼胚显色分级参照图2)。分别选取显色1-2级(基本对应颜色由深到浅排序的后10％)和4-5级(基本对应颜色由深到浅排序的前10％)幼胚各100个，转移至1/2MS培养基(配方：MS盐1.5g/L+蔗糖30g/L+琼脂7.5g/L，pH＝5.8。各物质的浓度为在培养基中的终浓度)进行成苗。直接对自交后代幼胚显色向深色和浅色两个方向选择，以便验证自交颜色标记的筛选对杂交后代着色的效应。
三、诱导杂交着色评价
分别将优显色(显色等级4-5)和差显色(显色等级1-2)，幼胚成苗进行田间移栽，而后取候选单株花粉与测验种京科999杂交，每个单株测验4穗以上，授粉后15天取杂合幼胚离体培养，以24h显色率(24h着色幼胚数/最终总着色幼胚数*100％)为指标对幼胚着色进行评价，并将所得拟单倍体成苗进行田间移栽，对单倍体幼胚鉴别效率进行评价。结果如图3所示，连续培养24h后，以优显色单株为父本时，杂交所得幼胚着色深，着色面积大，更利于单倍体幼胚的鉴别。其显色效果明显优于差显色单株杂交所得幼胚，差显色单株为父本时，杂合幼胚着色不明显且不均一，着色浅且着色面积小。统计24h显色率发现，优显色父本诱导杂交幼胚24h显色率分布在69.0-99.4％，24h平均显色率为84.8％，而差显色父本诱导杂交幼胚24h显色率仅分布在65.3-85.7％，24h平均显色率为75.6％,两者达到显著水平(显著性检验采用双尾t-Test)。进一步将所得拟单倍体幼胚种植于田间进行真实性检验，最终发现，优显色父本诱导杂交单倍体鉴别平均准确率高达85.0％，最高可达98.8％；而差显色父本诱导杂交单倍体鉴别平均准确率显著偏低，仅为68.1％(图4)。
四、成熟籽粒双向选择
待候选单株自交及测验种(京科999)诱导杂交果穗成熟后，比较自交及诱导杂交果穗显色情况发现，优显色单株无论是自交还是诱导杂交，籽粒着色情况均明显优于差显色单株，特别是在着色面积方面更为明显(图5)。
实施例2、自交当代对单倍体诱导率筛选的有效性验证
一、自交单倍体诱导率评价
根据自交幼胚显色，自交籽粒显色，杂交幼胚和籽粒显色，获得显色等级为4和5的中选单株(参见实施例1)，由于中选单株携带纯合主效诱导基因Zmpla1和Zmdmp。在自交过程中会产生一定比例的单倍体。将中选单株自交幼胚培养或成熟籽粒播种于田间，根据植株形态鉴别单倍体，统计单倍体数目，可获得中选单株自交单倍体诱导率，用于辅助选择杂合幼胚单倍体诱导率。其中每个中选单株取50个幼胚用于幼胚培养。结果显示(表1)，对幼胚自交单倍体频率进行统计发现，50个幼胚中单倍体诱导率分布在2.0-23.0％之间，平均单倍体数可达4.6，比较自交诱导率来看，成熟籽粒诱导率分布在1.3-21.5％，平均诱导率(所有中选单株自交幼胚或籽粒单倍体诱导率的平均值)略低于幼胚，为7.4％，可能与部分单倍体籽粒无法正常发芽成苗，而单倍体幼胚均可正常成苗有关。
表1、候选单株自交诱导率统计
自交 测验单株数 诱导率分布 平均诱导率 单倍体数分布 平均单倍体数
幼胚 56 2.0-23.0％ 8.7％ 1-10 4.6
籽粒 54 1.3-21.5％ 7.4％ 3-42 18.8
二、自交诱导率与杂交诱导率评价
将F1自交所得中选单株与测验种京科999杂交，而后统计单倍体成熟籽粒诱导率，与中选单株自交单倍体诱导率进行相关性分析发现，候选单株自交单倍体诱导率与诱导杂交单倍体诱导率相关系数高达0.86(图6)，由此说明针对候选单株自交单倍体诱导率进行筛选，可有效反应其杂交诱导单倍体频率，候选单株杂交测验一般要求3穗以上，由此可根据自交单倍体诱导率，淘汰自交单倍体诱导率偏低的候选单株，从而减少后续候选单株杂交诱导单倍体鉴别与诱导率测验工作，从而大大提高单倍体诱导系选育效率。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

Claims (10)

1.一种选育玉米单倍体诱导系的方法，包括如下步骤：先对候选群体内单株的自交或回交后代进行颜色标记的强化和诱导率评价，再利用测验种进行杂交检验；所述候选群体由携带纯合单倍体诱导基因和纯合颜色标记基因的若干单株组成。
2.一种选育玉米单倍体诱导系的方法，包括如下步骤：
(A1)父本和母本杂交获得F1代；所述父本和所述母本中至少一个为携带单倍体诱导基因和颜色标记基因的单倍体诱导系；
(A2)将(A1)所得F1代进行自交或者与诱导系亲本回交，从自交或回交后代中选择携带纯合所述单倍体诱导基因和纯合所述颜色标记基因的若干单株组成单株群1；
(A3)将所述单株群1中的单株进行自交或与诱导系亲本回交，所得自交或回交后代中含有单倍体和二倍体，对其中的单倍体进行加倍，对加倍成功的单倍体和所述二倍体的着色情况、和/或单倍体诱导性能进行鉴定，从中筛选出着色相对较深、和/或单倍体诱导性能相对较好的若干单株组成单株群2；
(A4)将所述单株群2中的单株与测验种进行杂交，对所得杂交后代的着色情况、和/或单倍体诱导性能进行鉴定，从所述单株群2中筛选能够与所述测验种杂交产生着色相对较深、和/或单倍体诱导性能相对较好的杂交后代的单株，作为候选单株；
(A5)若(A4)所得候选单株来自于(A3)中所述的加倍成功的单倍体，则所述候选单株为候选诱导系DH系；若(A4)所得候选单株来自于(A3)中所述的二倍体，则将所述候选单株继续重复步骤(A3)和步骤(A4)的步骤直至纯合稳定，得到候选诱导系；
(A6)从(A5)得到的所述候选诱导系DH系和所述候选诱导系中筛选得到目的玉米单倍体诱导系。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤(A1)中，当所述父本和所述母本均为携带纯合所述单倍体诱导基因和纯合所述颜色标记基因的单倍体诱导系时，跳过或不跳过步骤(A2)。
4.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于：所述单倍体诱导性能体现为幼胚单倍体诱导率、成熟籽粒单倍体诱导率和/或单穗单倍体数。
5.根据权利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于：所述着色情况为幼胚着色和/或成熟籽粒着色和/或芽鞘着色和/或叶片着色和/或植株着色。
6.根据权利要求4或5所述的方法，其特征在于：所述方法中，对幼胚着色情况进行鉴定以及对幼胚单倍体诱导率进行鉴定均是在授粉后15-20天时进行鉴定的。
7.根据权利要求1-6中任一所述的方法，其特征在于：所述颜色标记基因为R1-nj；和/或
所述单倍体诱导基因为Zmpla1和Zmdmp。
8.根据权利要求2-7中任一所述的方法，其特征在于：在步骤(A3)中，对所述单倍体进行加倍为对单倍体幼胚进行加倍；
进一步地，对所述单倍体幼胚进行加倍和对所述幼胚着色情况进行鉴定是按照如下操作同步进行的：将幼胚置于含有0.1g/L秋水仙素的培养基上光照培养12-48h，实现所述单倍体幼胚的加倍并进行幼胚着色情况评价；
和/或
所述着色相对较深的单株为按照颜色从深到浅的顺序排列，排名前10％的单株；
和/或
所述单倍体诱导性能相对较好的单株为将所述单倍体诱导性能按照从优到劣的顺序排列，排名前10％的单株。
9.根据权利要求2-8中任一所述的方法，其特征在于：步骤(A1)中，所述父本和所述母本均为携带纯合所述单倍体诱导基因和纯合所述颜色标记基因的单倍体诱导系；
进一步地，所述父本和所述母本为玉米单倍体诱导系CHOI4和CAU6；
和/或
步骤(A4)中，所述测验种为京科999。
10.如下任一应用：
(B1)由权利要求1-9中任一所述方法得到的玉米单倍体诱导系在玉米育种中的应用；
(B2)权利要求1-9中任一所述方法在提高玉米单倍体诱导率中的应用；
(B3)由权利要求1-9中任一所述方法得到的玉米单倍体诱导系在提高玉米单倍体诱导率中的应用；
(B4)权利要求1-9中任一所述方法在提高玉米单倍体鉴别效率中的应用；
(B5)由权利要求1-9中任一所述方法得到的玉米单倍体诱导系在提高玉米单倍体鉴别效率中的应用。
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