CN109997683B - 一种基于单倍体诱导系的水稻双单倍体育种方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种基于单倍体诱导系的水稻双单倍体育种方法，属农业技术领域。本发明是通过利用水稻三系保持系材料与具有显性红米基因的水稻材料杂交后筛选出携带显性红米基因的红米保持系，并将其经化学定向诱导并筛选出着丝粒基因功能的突变体，将其与水稻三系不育系杂交，获得携带红米基因和着丝粒突变基因的保持系和不育系，根据育种目标配制的杂交F1与红米单倍体诱导不育系杂交后保留无色种皮杂交种子；利用秋水仙素对无色种皮杂交种子进行处理，获得二倍体材料，即形成新品系。该方法可快速纯合基因，克服了传统杂交育种分离世代长的缺点，在水稻育种上得到了应用。

Description

一种基于单倍体诱导系的水稻双单倍体育种方法

技术领域

本发明涉及一种基于单倍体诱导系的水稻双单倍体育种方法，属于农业技术领域。

背景技术

单倍体育种技术是将自然或人工培育的单倍体植株通过染色体组加倍的方式获得纯化的双单倍体(DH植株)，因其快速、准确、高效的特点越来越得到了育种家的重视，目前全世界有250多个作物物种应用了双单倍体育种，l2个物种中培育了300多个来自于栽培种的双单倍体纯系。传统育种技术的核心是通过不断的选择将有利基因固定并纯合，该过程通常需要多个世代的自交或回交过程，如利用传统常规育种方法选育玉米自交系，获得一个相对纯系需要6代以上，而利用双单倍体育种方法一般只需2代，大大加快了育种进程。此外，由于加倍后的双单倍体每个基因座位上均纯合，所以能简化基因互作，去掉超显性效应，保留有利的加性和加性上位效应，还可淘汰有害的、致死和半致死的隐性基因，加快了有利基因的选择效率。双单倍体技术若与种质扩增和育种材料的改良有机的结合起来，先对目标诱导材料进行有效的重组改良，累积足够的有利基因位点，然后再用双单倍体技术获得纯系，将会极大地发挥双单倍体育种的优势。

利用双单倍体技术选育新品种已成为玉米育种发展的趋势。杜邦先锋、孟山都、先正达等公司已经把它作为玉米育种的重要方法，称其为育种技术“黑马”。目前，这些跨国种业公司在DH育种方面均呈现大规模、高通量、流程化的选育模式，年获得的DH纯系数目均达到50000个以上。

单倍体自然发生机率极低，一般不超过0.01％，要获得大量的单倍体必须依靠人工诱导。人工诱导的方法很多，主要有远缘杂交、花药培养、孤雌生殖、单倍体诱导系杂交诱导单倍体等。远缘杂交、花药培养、孤雌生殖等方法存在着明显不足：远缘杂交存在着诱导率极低；花药培养存在着花药培养效率低、基因型障碍、愈伤组织诱导率和绿苗分化率低下；孤雌生殖频率极低，效果不稳定，基因型间差异大，获得种子数量少等问题。鉴于远缘杂交、花药培养、孤雌生殖诱导产生单倍体的各种不足，利用单倍体诱导系杂交诱导单倍体得到了广泛重视。玉米孤雌生殖单倍体诱导系Stock6的发现，为玉米单倍体育种带来突破性进展。

发明内容

针对目前水稻单倍体诱导存在的问题，本发明通过对着丝粒控制基因CENH3的突变基因的定向筛选，获得具有应用价值的单倍体诱导材料，并将其转育成具有红色种皮标记性状的不育系，利用不育系与待诱导的育种材料进行杂交，筛选具有红色种皮的单倍体种子，并利用秋水仙素实现加倍，对加倍后的材料进行鉴定并选育新品种。

本发明通过以下技术方案予以实现：

一种基于单倍体诱导系的水稻双单倍体育种方法，包含如下步骤：

S1.选择优良的水稻三系保持系材料，与具有显性红米基因的水稻材料杂交，并利用保持系回交多个世代，选育出携带显性红米基因的红米保持系，采用所述显性红米基因用以控制水稻种子种皮呈现红色；

S2.将筛选出的携带显性红米基因的红米保持系材料在浓度为0.3％-1.0％的EMS中浸泡12h-24h，获得含有水稻着丝粒基因功能突变体的红米保持系材料；

S3.定向筛选水稻着丝粒基因功能突变体，筛选出的突变体自交2个世代形成稳定遗传材料，经鉴定其突变体单倍体诱导效率高于5％即为稳定的遗传材料，而突变体单倍体诱导效率是指利用突变体与正常品种杂交，其中突变体作为母本，统计所获得种子中单倍体种子的比率；

S4.将步骤S3中筛选出的稳定的遗传材料与与水稻三系不育系杂交，以红米保持系突变体为轮回亲本回交5个世代，完成不育系核基因的替换，获得携带红米基因和着丝粒突变基因的红米单倍体诱导保持系和不育系；

S5.根据育种目标配制的杂交F1与红米单倍体诱导不育系杂交，对获得的杂交种子进行种皮颜色鉴定，淘汰红色种皮杂交种子，保留无色种皮杂交种子；

S6.利用秋水仙素对无色种皮杂交种子进行处理，获得加倍后的二倍体材料，鉴定二倍体材料农艺性状或基因型，形成新品系，所述鉴定二倍体材料农艺性状或基因型，指调查二倍体材料的生育期、结实率、千粒重、穗数、穗粒数等经济性状指标，基因型指调查二倍体在品质或抗性基因的基因型。

优选的，所述S3中定向筛选方法为利用测序检测CENH3基因的GGA→GAG序列差异，与对照有差异的材料为突变体。

优选的，S4中所述将红米保持系突变体与水稻三系不育系杂交，以红米保持系突变体为轮回亲本回交5个世代，完成不育系核基因的替换，每个回交世代中选择红色种皮种子进行下一轮回交，红色种皮种子为二倍体，携带杂合的红色种皮基因。

优选的，S5中所述对获得的杂交种子进行种皮颜色鉴定，其中种皮呈现红色的种子为非单倍体种子，种皮无色的种子为单倍体种子，可利用人工或机器实现种皮颜色的筛选。

优选的，S6中所述无色种皮杂交种子用秋水仙素进行处理，指利用浓度为0.6％的秋水仙素浸泡胚萌动的种子8h，浸泡结束后即可实现单倍体的加倍。

与现有技术比较，本发明具有以下有益效果：

1、现有的水稻单倍体育种技术依赖花药组织培养进行，具有组织培养基因型依赖性，如粳稻较易获得组织培养个体，而籼稻组织培养能力很差，很多籼稻材料无法通过花药培养的方法得到单倍体，极大地限制了单倍体育种技术的应用；

2、现有的花药培养技术获得单倍体时间较长，从取得花药都最终获得组织培养分化个体需3-4个月的时间，本发明提供单倍体诱导系从杂交到单倍体种子获得只需要1个月的时间，育种时间显著缩短；

3、现有依赖花药培养的水稻单倍体育种技术通用性不强，特别是花药培养的技术流程几乎无法通用，从培养基配方到激素配比均需大量前期研究，而本发明技术通用性强，任何待诱导材料均可与单倍体诱导不育系杂交，进而获得单倍体种子；

4、本发明通过识别种皮颜色判别单倍体种子，易于实现批量化、自动化，传统的单倍体识别技术需表型及染色体观察，技术难度较大；

5、由于着丝粒基因完全失活将导致植株个体死亡，本发明提出利用物理或化学诱变诱导基因产生点突变，创制基因功能降低的突变体而非完全丧失功能的基因突变体，此种类型的突变体本身育性降低，但仍可繁育本身种子；

6、玉米的单倍体诱导系为利用花粉诱导目标个体产生单倍体种子，需要人工去除母本雄蕊，此工作由人工完成，所需人工成本较高，本发明提供了单倍体诱导不育系，以不育系作为母本直接接受目标个体的花粉，杂交效率更高，易于实现机械化制种；

7、单倍体诱导不育系需通过配套的保持系才能繁育不育系种子，更有利于育种者控制诱导系种子来源，保护知识产权。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为实施例1基于单倍体诱导系的水稻双单倍体育种技术流程。

具体实施方式

下面结合具体实施例和附图对本发明作进一步说明。

一种基于单倍体诱导系的水稻双单倍体育种方法，如图1所示，包括以下步骤：

1、将携带多个有利基因的保持系H353-B转育成红米保持系。

本研究组前期选育出携带3个优良基因(直链淀粉含量基因Wx、香味基因fgr、稻瘟病抗性基因Pita)的三系保持系H353-B，并配套选育了其同核异质不育系H353-A，两者杂交获得F1高度不育。利用一个携带显性红色种皮基因RR的材料H22(父本)与H353-B(母本)杂交，其F1代种子种皮呈现红色，以H353-B为轮回亲本，每个回交世代选择红色种皮个体与H353-B回交，回交6个世代以后选择红色种皮个体自交1次，从自交后代中选择无分离的红色种皮植株，该植株细胞质与H353-B相同，细胞核与H353-B相似度达99％，命名为H353-BR。H353-BR除种皮颜色外，其余性状与H353-B高度相似。

2、利用EMS诱变H353-BR。

挑选饱满、无病虫害的H353-BR干种子20000粒，用0.5％EMS浸泡12h，无菌水流水冲洗12h。处理后的种子种植于田间形成诱变一代，常规水肥管理，3叶期调查苗高，成熟期调查株高并统计结实率。数据表明，0.5％EMS处理后，水稻苗高比对照降低21％，株高降低10％，结实率降低15％，表明此EMS浓度是较合适的诱变剂量。植株成熟时，每个主穗取10粒种子，混合播种形成诱变二代群体20000株。诱变二代分单株编号，每株取5cm左右的叶片用于实验室基因型分析。

3、定向筛选着丝粒控制基因CENH3的点突变类型，获得携带红米基因的单倍体诱导系H353-BRI。

CENH3为拟南芥中报道的着丝粒控制基因，该基因完全失活会导致植株死亡，因此本发明筛选序列中GGA→GAG的点突变，该点突变有可能导致基因功能降低而非失活。利用BLAST搜寻CENH3在水稻中的同源基因，设计引物扩增编码区，通过测序分析是否存在GGA→GAG的点突变。存在点突变的个体单株繁育，进行重复测序验证。以真实突变体为母本，籼稻品种华航一号为父本，两者杂交，统计杂交种子中的单倍体比例，选择可产生5％单倍体种子的突变体扩大繁育，定名为H353-BRI。该突变体为携带红米基因的单倍体诱导系H353-BRI。

4、携带红米基因的单倍体诱导系H353-BRI与不育系H353-A杂交，以H353-BRI为轮回亲本连续回交5次，培育携带红米基因的单倍体诱导系不育系H353-ARI。

由于H353-BRI本身仍可自交得到种子，在与目标个体杂交时需先人工去除雄花，不利获得大量杂交种子。为克服上述缺点，利用H353-BRI与不育系H353-A杂交，以H353-BRI为轮回亲本连续回交6次，每个回交世代选择红色种皮且不育的个体进行杂交，最终获得带红米基因的单倍体诱导系不育系H353-ARI(图1)。

5、利用H353-ARI诱导产生单倍体。

设计育种方案，目标是把香味基因fgr和稻瘟病抗性基因Pik基因快熟聚合到一个个体中。具体方案及执行如下：携带香味基因fgr的籼稻材料H25做为母本，携带稻瘟病抗性基因Pik的籼稻材料H26作为父本，两者杂交得到F1种子，F1种子田间种植形成F1植株，开花期用F1的花粉授给不育系H353-ARI，收获杂交种子。杂交种子的种皮有两种类型，一种为红色，一种为无色。由于待诱导F1植株种子并不是红色，所以与单倍体诱导系杂交获得的种子中无色种皮的个体即为只携带父本染色体的单倍体，而红色种皮杂交种子是诱导系与F1花粉结合形成的二倍体。筛选出全部无色种子，进行下一步加倍工作。

6、利用秋水仙素加倍单倍体种子。

利用无菌水浸泡获得的单倍体种子24小时，然后置于湿润的无菌滤纸上萌发24小时，待种子胚部萌动时，用0.6％的秋水仙素浸泡8个小时，流水冲洗8个小时。处理后的种子播种于温室，正常肥水管理。对幼苗进行观察，由于水稻单倍体发育不良，所以可以根据表型淘汰发育不良或畸形个体，正常发育的幼苗即为成功加倍获得的二倍体。

7、对二倍体进行基因型鉴定，获得同时含有fgr和Pik纯合基因的个体。

取二倍体植株叶片，进行基因型鉴定，保留同时含有fgr和Pik纯合基因的个体，达到基因聚合目的，完成第5步中拟定的育种目标。

本文中应用了具体个例对本发明的原理及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想；同时，对于本领域的一般技术人员，依据本发明的思想，在具体实施方式及应用范围上均会有改变之处。综上所述，本说明书内容不应理解为对本发明的限制。

Claims (4)

1.一种基于单倍体诱导系的水稻双单倍体育种方法，其特征在于，包含如下步骤：

S1.选择优良的水稻三系保持系材料，与具有显性红米基因的水稻材料杂交，并利用保持系回交多个世代，选育出携带显性红米基因的红米保持系；

S2.将筛选出的携带显性红米基因的红米保持系材料在浓度为0.3％-1.0％的EMS中浸泡12h-24h，获得含有水稻着丝粒基因功能突变体的红米保持系材料；

S3.定向筛选水稻着丝粒基因功能突变体，筛选出的突变体自交2个世代形成稳定遗传材料；

S4.将步骤S3中筛选出的稳定的遗传材料与水稻三系不育系杂交，以红米保持系突变体为轮回亲本回交5个世代，完成不育系核基因的替换，获得携带红米基因和着丝粒突变基因的红米单倍体诱导保持系和不育系；

S5.根据育种目标配制的杂交F1与红米单倍体诱导不育系杂交，对获得的杂交种子进行种皮颜色鉴定，淘汰红色种皮杂交种子，保留无色种皮杂交种子；

S6.利用秋水仙素对无色种皮杂交种子进行处理，获得加倍后的二倍体材料，鉴定二倍体材料农艺性状或基因型，形成新品系；

所述步骤S3中定向筛选方法为利用测序检测CENH3基因的GGA→GAG序列差异，与对照有差异的材料为突变体。

2.根据权利要求1所述基于单倍体诱导系的水稻双单倍体育种方法，其特征在于，S4中所述将红米保持系突变体与水稻三系不育系杂交，以红米保持系突变体为轮回亲本回交5个世代，完成不育系核基因的替换，每个回交世代中选择红色种皮种子进行下一轮回交，红色种皮种子为二倍体，携带杂合的红色种皮基因。

3.根据权利要求1所述基于单倍体诱导系的水稻双单倍体育种方法，其特征在于，S5中所述对获得的杂交种子进行种皮颜色鉴定，其中种皮呈现红色的种子为非单倍体种子，种皮无色的种子为单倍体种子，可利用人工或机器实现种皮颜色的筛选。

4.根据权利要求1所述基于单倍体诱导系的水稻双单倍体育种方法，其特征在于，S6中所述无色种皮杂交种子用秋水仙素进行处理，指利用浓度为0.6％的秋水仙素浸泡胚萌动的种子8h，浸泡结束后即可实现单倍体的加倍。

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