CN115040691A - 一种用于丰胸的脂肪填充剂及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种用于丰胸的脂肪填充剂及其制备方法，所述脂肪填充剂由包括如下组分构成：脂肪干细胞、MSC细胞、脂肪干细胞外泌体、维生素C、氨基酸和PRP。本发明脂肪填充剂通过各组分的选择，在通过调节各组分配比，使得脂肪填充剂在各组分协同作用下，达到了细胞存活率以及吸收率较高的效果，具有显著的丰胸效果。

Description

一种用于丰胸的脂肪填充剂及其制备方法
技术领域
本发明涉及填充材料技术领域，具体涉及一种用于丰胸的脂肪填充剂及其制备方法。
背景技术
丰胸，也叫隆胸或***，是女性为了提升个人女性魅力而针对***进行的一种增大行为，主要依靠外力手法，对胸部的形状进行塑造。常见的丰胸方法有：食物丰胸，即通过调整饮食规律，借用蔬菜里面的营养物质达到丰胸目的；药物丰胸，就是使用或服用药物进行丰胸；手术丰胸，对胸部填充硅胶等制品达到丰胸目的，隆胸手术需要切出伤口以放入填塞物，这个伤口当然要隐蔽，避免被人发现。
然而，假体丰胸副作用比较多：包膜挛缩：由于人体对于异物的排异反应，会在假体周围形成一层包膜，正常情况是没有影响的，如果排异反应过重会导致包膜挛缩，******、畸形；感染：假体属于异物，会携带细菌，术后引流不畅，或者抵抗力下降会引起感染；移位：如果早期没有固定好假体或者上臂过度活动，会导致假体移位；疼痛：多由于术中损伤神经，或者假体压迫神经所致，术后容易反复出现疼痛不适；假体外露：选择的假体太大导致张力过大，皮肤会变薄，假体出现外露，或者切口愈合不良导致假体外露。
目前，比较流行的丰胸方式为脂肪丰胸，但传统脂肪丰胸细胞成活率为20～40％，成活率较低无法达到预期效果；此外，还存在脂肪液化、脂肪钙化、脂肪成团等副作用。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于丰胸的脂肪填充剂及其制备方法，本发明脂肪填充剂通过各组分的选择，有效提高了细胞的存活率且吸收率好，能够长久保持隆胸效果。
为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
本发明第一方面提供一种用于丰胸的脂肪填充剂，所述脂肪填充剂由包括如下组分构成：
脂肪干细胞、MSC细胞、脂肪干细胞外泌体、维生素C、氨基酸和PRP。
在本发明脂肪填充剂中脂肪干细胞能够在体外稳定增值且衰亡率低，同时取材容易，少料组织即可获得大量的细胞，而且来源广泛，体内储备量大，对机体损伤小等优点，适宜自体移植；而且采用自体干细胞丰胸，只需一次移植既可以达到隆胸的功效，该方法创伤小，负担轻，无明显切口，安全有效。间充质干细胞(Mesenchymal stem cells,MSC)是一种具有自我复制能力和多向分化潜能的成体干细胞，可体外诱导分化成骨、软骨、脂肪和其他类型的细胞，有助于脂肪干细胞的存活；而且间充质干细胞与组织微环境相互作用的过程中可呈现出抗炎或促炎表型，并通过调节固有免疫和适应性免疫重塑炎症反应，实现免疫稳态。脂肪干细胞外泌体含有多种细胞因子，如表皮生长因子，干细胞生长因子等，这些物质可以促进机体干细胞生长增值，使干细胞更加容易在机体存活生长。维生素C，氨基酸为营养物质，有助于干细胞的存活生长。PRP具有迅速止血、止痛、加速伤口愈合的作用；本发明将上述组分共同制得脂肪填充剂，在各组分共同作用下，有效提高了细胞的存活率以及填充剂的吸收率，具有显著的丰胸效果。
优选地，所述脂肪填充剂中脂肪干细胞含量为(1.2～2.0)×106个/ml，MSC细胞含量为(1～3)×105个/ml，脂肪干细胞外泌体含量为0.4～0.8μg/ul，氨基酸含量为1～3μg/ml，维生素C含量为8～12μg/ml，PRP的体积含量为2％～6％。
优选地，所述脂肪填充剂中脂肪干细胞含量为1.6×106个/ml，MSC细胞含量为2×105个/ml，脂肪干细胞外泌体含量为0.6μg/ul，氨基酸含量为2μg/ml，维生素C含量为10μg/ml，PRP的体积含量为4％。
优选地，所述PRP通过如下方法制得：
采集血样并以2800～3500r/min离心8～12min使得血样分成三层，收集中间层，即得所述PRP。
优选地，所述脂肪干细胞、MSC细胞和脂肪干细胞外泌体均为自体细胞以及自体细胞分泌的外泌体。
优选地，所述MSC细胞为第6代细胞。
优选地，所述氨基酸由等质量比的脯氨酸、丝氨酸和色氨酸组成。
优选地，所述脂肪干细胞外泌体通过如下方法制得：
将原代脂肪干细胞进行传代培养，收集脂肪干细胞的第三代培养上清液；再将上清液以(3000～4000)×g进行离心去除细胞和细胞碎片；
向上清液中添加外泌体沉淀试剂进行充分混匀、静置，再以(10000～50000)×g离心20～40min，收集沉淀；
采用PBS重悬沉淀后置于纯化柱中并置于收集管中，将收集管在4℃下以(3000～4000)×g进行离心8～12min，将收集管内溶液再经冻干机冻成干粉，得到所述脂肪干细胞外泌体。
本发明第二方面提供一种上述脂肪填充剂的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：
按照各组分含量，将脂肪干细胞和MSC细胞接种到生理盐水中，再依次加入脂肪干细胞外泌体、氨基酸、维生素C和PRP进行混匀，即得所述脂肪填充剂。
与现有技术相比，本发明的有益效果至少包括：
本发明脂肪填充剂通过各组分的选择，在通过调节各组分配比，使得脂肪填充剂在各组分协同作用下，达到了细胞存活率以及吸收率较高的效果，具有显著的丰胸效果。
本发明脂肪填充剂中通过PRP和个细胞的联合使用，PRP不仅能够为细胞的生长发育提供营养成分，同时还能够促进细胞的生长发育并起到一定支撑作用，进而为细胞提供优良的生长空间，显著提高了细胞的存活率，使得脂肪填充剂具有优异的填充效果。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。在所有附图中，类似的元件或部分一般由类似的附图标记标识。附图中，各元件或部分并不一定按照实际的比例绘制。
图1为本发明典型案例1中脂肪填充剂填充前后的对比图；
图2为本发明典型案例2中脂肪填充剂填充前后的对比图。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明技术方案的实施例进行详细的描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，因此只作为示例，而不能以此来限制本发明的保护范围。
需要注意的是，除非另有说明，本申请使用的技术术语或者科学术语应当为本发明所属领域技术人员所理解的通常意义。
实施例1
本实施例为脂肪干细胞的制备方法，该制备方法包括如下步骤：
1.操作前准备
1.1器械消毒：脂肪制备过程中使用的剪刀、镊子应事先进行消毒，且消毒后保存时间不得超过12小时；
1.2空间消毒：实验室洁净间和超净台应提前进行紫外或臭氧消毒，时间应不小于30min，照射完毕后应开风机30min以便使空间内的臭氧排尽；
1.3物品准备：制备物品事先查点，保证数量充足、质量合格，临时从非洁净区带入细胞操作间的物品，应在传递窗经紫外充分照射后方能使用；
1.4用75％酒精消毒脂肪采集注射器，放置于传递窗内；
1.5洗手、更衣：
1.5.1除去腕部饰物和手表，用自来水充分洗刷手部，尤其清洁掌纹与指甲缝隙处的污垢
1.5.2洗后用高效碘伏全面擦手、晾干；
1.5.3穿戴口罩和隔离衣、佩戴无菌手套，穿戴隔离衣要做到“三不露”：不暴露头发，不暴露口鼻，不暴露躯干部皮肤或内穿衣物；
2.脂肪干细胞的原代培养：
2.1环境要求：实验环境为万级或千级层流室，开放式操作必须在百级洁净工作台内进行；
2.2脂肪的洗涤：在超净台内将脂肪转移至盛有无菌生理盐水离心管内，每管不得超过20ml；充分浸泡洗涤，去除残留血液后再将脂肪转入另一无菌离心管内。
2.3用剪刀将脂肪剪成约1mm3小块，转移至120ml量杯；每只量杯放入20ml脂肪；
2.4加入体积比1:1的I型胶原酶(1mg/ml)混匀，放入37℃恒温摇床消化1h；
2.5消化完全后，用一次性输血器过滤较大组织块，将过滤后的液体转移至离心管，2000rpm离心10min；
2.6离心完后，弃上清；用生理盐水混匀底部细胞，定容至40ml留样计数，1200rpm离心5min。
2.7离心完后，弃上清，10ml培养基(DMEM培养基+10％干细胞添加剂)重悬并混匀细胞，接种于1个T75培养瓶内；37℃，饱和温度，CO2浓度5％的状态开始培养；
3.换液：
3.1原代细胞种瓶后的24小时内不要移动培养瓶，以免影响其贴壁，之后定时观察细胞；
3.2根据细胞的生长情况和培养液的情况选择第一次换液时间(一般原代细胞出现在种瓶后的2～3天，细胞开始析出并贴壁，培养液颜色由粉红色变为淡黄色即可换液)；
3.3培养瓶中培养基倒到废液缸中，重新往每个培养瓶中加入10ml新鲜的培养基；
3.4将培养瓶放入培养箱中培养；
4.传代：P0传P1(换液后3～5天)
4.1胰酶消化：细胞铺满培养瓶底部约90％面积时，进行胰酶消化传代；
4.1.1将培养液用移液管吸出弃掉；
4.1.2用生理盐水轻轻冲洗细胞后，加入生理盐水和0.25％胰蛋白酶各1ml，平放培养瓶并轻轻摇动，使胰蛋白酶平铺于培养瓶底部；
4.1.3在倒置显微镜下观察，同时轻轻拍打瓶壁，待大部分细胞开始脱壁时用完全培养液中止消化；
4.1.4消化后细胞悬液移入50ml离心管内，用少量生理盐水洗涤培养瓶后一并移入离心管内。
4.2接种：
4.2.1离心后弃去上清，加入少量培养液，将细胞混匀；
4.2.2按1:2的比例进行传代接种，每瓶加入10ml培养基记为P1，并标明传代时间和条形码；
4.2.3细胞扩增至2T75；
5.传代：P1传P2
5.1将旧培养基收集于50ml离心管内；
5.2胰酶消化收集细胞，1200rpm离心5min；
5.3弃剩余上清，5ml培养基重悬细胞，接种至2个T175，补充培养基至13ml/瓶；
6传代：P2传P3
6.1胰酶消化：细胞铺满培养瓶底部约90％面积时，进行胰酶消化传代；
6.1.1将培养液用移液管吸出弃掉；
6.1.2用生理盐水轻轻冲洗细胞后，加入生理盐水和0.25％胰蛋白酶各2.5ml，平放培养瓶并轻轻摇动，使胰蛋白酶平铺于培养瓶底部；
6.1.3在倒置显微镜下观察，同时轻轻拍打瓶壁，待大部分细胞开始脱壁时用完全培养液中止消化；
6.1.4消化后细胞悬液移入50ml离心管内，用少量生理盐水洗涤培养瓶后一并移入离心管内；
6.1.5倒掉上清，将细胞沉淀合并到一个离心管中，定容至40ml，取样计数；然后再次用1200rpm离心洗涤5min；
6.2弃上清，用10ml培养基重悬细胞，接种至8个T175，补充培养基至13ml/瓶。
实施例2
本实施例为一种间充质干细胞的制备方法，该制备方法包括如下步骤：
1、仪器及耗材、D-MEM/F12培养基、胎牛血清、倒置显微镜、超净工作台、CO2培养箱、离心机、细胞因子、ITS和Pbs等；
2、试剂配置
1.D-MEM/F12培养基配置：含10％胎牛血清，细胞因子一只，ITS5ml的D-MEM/F12培养基；
2、细胞因子:含20ng/ml EGF，5ng/ml bFGF；
3、实验前的准备
5把剪刀，5把止血钳，3把组织镊，3把普通镊子，2个肾形盘，3个50ml烧杯，2个药勺(20cm左右)，500ml pbs 121℃高压灭菌30分钟；
4、实验操作
(1)、超净工作台紫外照射30分钟，擦拭台面；
(2)、将灭菌的实验器械放入工作台，点燃酒精灯，拿出一个肾形盘，倒入75％酒精一半，将脐带放进肾形盘中，消毒30秒；
(3)、取一个50ml烧杯，倒入一半灭菌的pbs，将脐带放入烧杯中，反复洗3次；
(4)、拿出另一个肾形盘，将脐带放入其中，倒入适量pbs，右手拿剪刀，左手拿普通镊子，将脐带剪成2cm左右的小段；
(5)、左手拿止血钳，右手拿组织镊，慢慢的将脐带外皮和血管去掉；
(6)、将剩余组织放入一个干净的烧杯中，用剪刀剪成大概3mm左右；
(7)、用药勺将组织块铺在T75的瓶子里，每瓶100左右组织块，将所有组织块铺完；
(8)、在T75瓶子一侧慢慢加入培养基15ml；放入CO2培养箱孵育；
(9)、48h换液一次，待一星期左右天观察干细胞爬出情况，若爬出情况较好，将组织块拍掉弃之，加入培养基；
(10)、48h后消化细胞，加入1ml胰蛋白酶消化，收集离心(1200转，5分钟)，弃上清，加入培养基重悬细胞，根据细胞数量(1×106)接种细胞，即为P1代；
(11)、48h后消化离心，计数，传代，即为P2代；
(12)、两天后消化离心，取上清(检测无菌，支原体，内毒素，)计数细胞，以4.5×106冻存；
(13)、根据生产需要复苏P2代细胞，传至P5代取上清检测(检测无菌，支原体，内毒素，细胞表型等)计数传代；
(14)、P6代是使用的理想代次，生产用于回输的细胞。
实施例3
本实施例为一种脂肪干细胞外泌体的制备方法：
1、按照实施例1的方法进行脂肪干细胞培养，收集脂肪干细胞的第三代培养上清液；
2、取3代(细胞数量和活性都是比较理想的代次)细胞培养上清40ml，于4000×g，4℃离心20分钟，去除细胞或细胞碎片，离心后将上清吸入新管中，收集样本至于冰上；
3、取10.0ml处理后的细胞培养上清放入15ml离心管中，加入1.5ml外泌体沉淀试剂，颠倒充分混匀后4℃静置30min，静置后的样品12000×g，4℃离心30min，管底可见白色沉淀，吸去上清，注意不要破坏外泌体沉淀；
4、外泌体重悬
加入100ul 1×PBS，用移液器反复吹打或漩涡混合均匀，彻底溶解沉淀，此重悬液中含有完整的外泌体；
5、外泌体纯化
将重悬的外泌体转移至纯化柱，放入1.5ml收集管中，3000×g，4℃，离心10min，弃掉纯化柱，收集管中为提取的外泌体溶液，再经冷冻干燥，得到脂肪干细胞外泌体；提取的外泌体可直接应用于下游实验，或者储存在2-8℃保存一周，或者-80℃保存大约三个月。
实施例4
本实施例为PRP的制备方法，该制备方法包括如下步骤：
1、将装有5ml血液的采血管(不添加抗凝剂)两支对称放置到eppendorf离心机中，3000r/min离心10min；
2、经过离心，血液分成3层，上层为淡黄色的贫血小板血浆层，底层为红细胞层，二者之间即为富含血小板的纤维蛋白凝胶层；
3、用长针头慢慢吸取中间层至5ml冻存管中，密封，4℃保存待用。
实施例5
本实施例为一种用于丰胸的脂肪填充剂，该脂肪填充剂由包括如下组分构成：
脂肪干细胞、MSC细胞、脂肪干细胞外泌体、维生素C、氨基酸和PRP，其中，脂肪干细胞含量为1.6×106个/ml，MSC细胞含量为2×105个/ml，脂肪干细胞外泌体含量为0.6μg/ul，氨基酸含量为2μg/ml，维生素C含量为10μg/ml，PRP的体积含量为4％。
实施例6
本实施例为一种用于丰胸的脂肪填充剂，该脂肪填充剂由包括如下组分构成：
脂肪干细胞、MSC细胞、脂肪干细胞外泌体、维生素C、氨基酸和PRP，其中，脂肪干细胞含量为2.0×106个/ml，MSC细胞含量为1×105个/ml，脂肪干细胞外泌体含量为0.8μg/ul，氨基酸含量为1μg/ml，维生素C含量为12μg/ml，PRP的体积含量为2％。
实施例7
本实施例为一种用于丰胸的脂肪填充剂，该脂肪填充剂由包括如下组分构成：
脂肪干细胞、MSC细胞、脂肪干细胞外泌体、维生素C、氨基酸和PRP，其中，脂肪干细胞含量为1.2×106个/ml，MSC细胞含量为2×105个/ml，脂肪干细胞外泌体含量为0.4μg/ul，氨基酸含量为3μg/ml，维生素C含量为8μg/ml，PRP的体积含量为6％。
对比例1
本对比例为一种用于丰胸的脂肪颗粒，该脂肪颗粒通过如下方法制得：将抽出的脂肪置于离心管中，再将离心管置于离心机中，以1300g离心力，离心处理5min,离心后可见离心管内内容物分层明显，去除上层油滴和下层液体成分后，得到中间层即为脂肪颗粒。
实验例
为了验证脂肪填充剂的吸收效率，进行了以下实验，征选志愿者26名，分为两组，甲组13人，为研究组。乙组13人，为对照组；研究组注射的为实施例5的脂肪填充剂，乙组注射的为对比例1的自体脂肪颗粒。每组胸部注射都为100ml，其结果如表1所示：
表1
Figure BDA0003663370620000111
由表1可知：
本发明实施例制备得到的脂肪填充剂能够更好的被机体吸收，其吸收效率高，与对照组相比，吸收效率显著提高，具有更好的丰胸效果且持续稳定性好。
典型案例
1、孙某某，年龄36，***松弛下垂，采用本发明实施例5的脂肪填充剂进行填充，填充100ml，填充前以及填充，186天后胸部照片如图1所示，图1中左图为填充前图，右图为填充后图；由图1可知，本发明脂肪填充剂具有优异的隆胸效果，吸收率高，具有持久稳定性。
2、田某，年龄32，***发育不良偏小，采用本发明实施例5的脂肪填充剂进行填充，填充100ml，填充前以及填充210天后胸部照片如图2所示，图2中上图为填充前图，下图为填充后图；由图2可知，本发明脂肪填充剂具有优异的隆胸效果，吸收率高，具有持久稳定性。
本发明脂肪填充剂适用人群如下：1、身体有一定脂肪基础的人；2、除了胸部Ⅲ度松弛下垂者，其他都均可；3、身体健康，无急慢性疾病者；4、***发育不良或因良性病变所致的一侧***过小，双乳不对称；5、哺乳或生育后所致的乳腺萎缩；6、缺乏锻炼或哺乳所致的***轻度松垂或***凹陷等；7、因疾病而不得不切除***，保留了***乳晕的女性患者。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围，其均应涵盖在本发明的权利要求和说明书的范围当中。

Claims (9)

1.一种用于丰胸的脂肪填充剂，其特征在于，所述脂肪填充剂由包括如下组分构成：
脂肪干细胞、MSC细胞、脂肪干细胞外泌体、维生素C、氨基酸和PRP。
2.根据权利要求1所述的脂肪填充剂，其特征在于，所述脂肪填充剂中脂肪干细胞含量为(1.2～2.0)×106个/ml，MSC细胞含量为(1～3)×105个/ml，脂肪干细胞外泌体含量为0.4～0.8μg/ul，氨基酸含量为1～3μg/ml，维生素C含量为8～12μg/ml，PRP的体积含量为2％～6％。
3.根据权利要求1所述的脂肪填充剂，其特征在于，所述脂肪填充剂中脂肪干细胞含量为1.6×106个/ml，MSC细胞含量为2×105个/ml，脂肪干细胞外泌体含量为0.6μg/ul，氨基酸含量为2μg/ml，维生素C含量为10μg/ml，PRP的体积含量为4％。
4.根据权利要求1～3任一所述的脂肪填充剂，其特征在于，所述PRP通过如下方法制得：
采集血样并以2800～3500r/min离心8～12min使得血样分成三层，收集中间层，即得所述PRP。
5.根据权利要求1～3任一所述的脂肪填充剂，其特征在于，所述脂肪干细胞、MSC细胞和脂肪干细胞外泌体均为自体细胞以及自体细胞分泌的外泌体。
6.根据权利要求1～3任一所述的脂肪填充剂，其特征在于，所述氨基酸由等质量比的脯氨酸、丝氨酸和色氨酸组成。
7.根据权利要求1～3任一所述的脂肪填充剂，其特征在于，所述MSC细胞为第6代细胞。
8.根据权利要求1～3任一所述的脂肪填充剂，其特征在于，所述脂肪干细胞外泌体通过如下方法制得：
将原代脂肪干细胞进行传代培养，收集脂肪干细胞的第三代培养上清液；再将上清液以(3000～4000)×g进行离心去除细胞和细胞碎片；
向上清液中添加外泌体沉淀试剂进行充分混匀、静置，再以(10000～50000)×g离心20～40min，收集沉淀；
采用PBS重悬沉淀后置于纯化柱中并置于收集管中，将收集管在4℃下以(3000～4000)×g进行离心8～12min，收集管内溶液，再经冻干机冻成干粉。
9.权利要求1～8任一所述的脂肪填充剂的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
按照各组分含量，将脂肪干细胞和MSC细胞接种到生理盐水中，再依次加入脂肪干细胞外泌体、氨基酸、维生素C和PRP进行混匀，即得所述脂肪填充剂。
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