CN107779430A - 脐带间充质干细胞上清液的收集方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及脐带间充质干细胞上清液收集方法，去除了易致敏的血清，加入了能够增强细胞活力的人参皂苷，从而增加了细胞因子的分泌量，人参具有补气益津的作用，其主要成分人参皂苷在生物学中具有类生长因子作用，可以促进细胞增殖，促进生长因子合成。创面的愈合是一个复杂而有序的过程，在机体的调控下，炎性细胞、多种细胞因子等诸多因素相互协调，一起参与创面愈合。人参皂苷自身可以促进细胞增殖，增强细胞活力，它的添加使上清液治疗难愈性创面的效果更加明显。

Description

脐带间充质干细胞上清液的收集方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，主要应用于临床患者皮肤创面的治疗，尤其是一种脐带间充质干细胞上清液的收集方法。
背景技术
间充质干细胞(mesenchymal stem cells)MSCs是一类来源于早期中胚层，具有高度自我更新和多向分化能力的一类多能干细胞，由于其良好的自我分化、免疫调节和强大的抗炎能力，在临床治疗方面越来越多的受到专家的重视。经研究表明，MSCs具有自分泌和旁分泌功能，能够在局部分泌多种蛋白，引导细胞的迁移、分化，改善局部供血功能、消除局部炎症反应。MSCs分泌的活性蛋白主要涉及促细胞迁移类、受体类、促细胞分化类、调节类和血管生成等几类。这些不同种类的活性蛋白在改善修复靶器官组织功能、抗炎、抗凋亡、免疫调节等方面发挥了重要的作用，是其重要的治疗机制之一。因此，除了上述的临床治疗，MSCs在治疗难愈性创面和皮肤病方面发挥着明显的治疗作用，有非常好的治疗效果。
由于新鲜MSCs制剂在保存液中存活24h后开始出现凋亡，因此制备成品后需要迅速运输至临床为患者使用，否则无法获得治疗效果，这使MSCs在临床的应用受到局限。MSCs主要通过分泌机制来实现对创伤的修复，而MSCs培养液中含有大量的分泌因子，因此用MSCs的上清液可以进行替代MSCs制剂的治疗。为此，寻找一种制备简便，可长时间保存的上清液制备方法成为必要。
现有技术存在的缺陷：目前收集MSCs上清液多采用收集不断传代后的细胞培养上清进行混合。细胞培养上清需要加入血清，细胞才能够贴壁增殖，所以上清液中含有外源性血清。而外源性血清是皮肤致敏的主要致敏原，如果将这种上清液涂抹于皮肤上，尤其是有严重创面的皮肤，失去表皮与真皮的保护，会有一定程度的过敏风险。上清液中的细胞因子全部由细胞分泌，因此细胞的生长状态尤为重要。细胞生长状态佳，分泌细胞因子的含量就会提高，保证细胞最佳的生长状态是重要的一个环节。目前培养细胞多用DMEM/F12培养基，细胞状态完全依赖于原代细胞状态，经过不断的传代，细胞状态也会随之衰减，影响细胞因子的分泌量。细胞因子属于一种蛋白质，在常温状态下很不稳定，光照、氧化、温度都会使其降解，失去促细胞增殖作用。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足之处，提供一种脐带间充质干细胞上清液的制备方法。本方法去除了易致敏的外源性血清，改用无血清培养基饥饿培养收集上清液。本方法加入人参皂苷这种中药提取成分，提高细胞生物活性，增加细胞因子的分泌量，同时人参皂苷自身可促进细胞增殖，有助于难愈性创面的愈合，使得治疗效果倍增。本方法将细胞上清液制备成冻干粉，有助于上清液长期的保存和使用。
本发明实现目的的技术方案如下：
一种脐带间充质干细胞上清液收集方法，方法由下列步骤组成
⑴取足月产健康剖腹产胎儿脐带，取出放置烧杯中用PBS反复冲洗干净，去除残留在脐带上的血液，获得干净脐带；
⑵将脐带的静脉和动脉血管用器械钝性分离出来；
⑶将剩余的沃顿氏胶剪成0.5-1cm左右小段，用镊子放入无菌烧杯中；
⑷将烧杯中的脐带小段剪碎成大小为1mm3以下的组织块；
⑸将组织块转移至无菌培养瓶中，均匀平铺在瓶底，放置于CO2培养箱中干燥1小时；
⑹向每个培养瓶中加入含血清的DMEM/F12培养基10ml，37℃，5％CO2静置培养；
⑺6天后换液，以后每5天全量换液一次，待细胞融合度达到80％进行传代；
⑻用PBS冲洗培养瓶，吸弃组织块，每瓶加入胰蛋白酶，消化3-5分钟后，用血清终止消化；
⑼收集终止后的消化液，1000rpm，5min离心，吸弃上清液，收获间充质干细胞；
⑽将间充质干细胞按照8000个/cm2进行接种，约每3天传代一次；
⑾间充质干细胞传至P5代时吸弃原培养基，PBS冲洗瓶底，加入不含酚红的无血清DMEM/F12培养基，同时按照20μg/ml的浓度加入配制好的人参皂苷饥饿培养；
⑿饥饿培养72小时后收集细胞上清液，4000g，20min离心；
⒀收集离心后的上清液，0.22μm滤器过滤，将滤液收集到无菌收集管中，-80℃冷冻，后将冷冻凝固的上清液抽真空，生化干燥，制备出冻干粉，-20℃冷冻保存。
而且，所述的步骤⑷中将脐带机械剪碎的工具为剪刀。
而且，所述的步骤⑸中无菌培养瓶为75cm2培养瓶。
而且，所述的步骤⑹中加入血清与DMEM/F12培养基的比例是1:10体积比。
本发明的有益效果为：
本发明提供的方法在原有培养基的基础上，加入人参皂苷成分来提高MSCs的细胞状态，提高细胞因子的分泌量，且最大限度的保持了干细胞原有的生物特性和活性，人参具有补气益津的作用，其主要成分人参皂苷在生物学中具有类生长因子作用，可以促进细胞增殖，促进细胞因子分泌，同时人参皂苷涂抹于皮肤表面，可以同细胞因子起到联合增强难愈性创面的治疗作用。液体状态下的细胞因子很不稳定，易于分解，制成冻干粉后低温保存，可以长时间保持细胞因子的治疗效果。
附图说明
图1为不同浓度人参皂苷在不同时间对MSCs促增殖作用的影响。
图2为不同浓度人参皂苷对MSCs饥饿不同时间获得细胞因子浓度的比较。
具体实施方式
下面结合附图并通过具体实施例对本发明作进一步详述，以下实施例只是描述性的，不是限定性的，不能以此限定本发明的保护范围。
本发明的目的在于克服外源性血清用于皮肤所带来的致敏问题，在原有培养基的基础上，加入人参皂苷成分来提高MSCs的细胞状态，提高细胞因子的分泌量，且最大限度的保持了干细胞原有的生物特性和活性，人参具有补气益津的作用，其主要成分人参皂苷在生物学中具有类生长因子作用，可以促进细胞增殖，促进生长因子分泌，同时人参皂苷涂抹于皮肤表面，可以起到联合增强难愈性创面的治疗作用。液体状态下的细胞因子很不稳定，制成冻干粉后低温保存，可以长时间保持其效果。本发明步骤简单，成本低廉，效果突出。
一种脐带间充质干细胞上清液收集方法，该方法由下列步骤组成
⑴取足月产健康剖腹产胎儿脐带，取出放置烧杯中用PBS反复冲洗干净，去除残留在脐带上的血液，获得干净脐带。
⑵将脐带的静脉和动脉血管用器械钝性分离出来。
⑶将剩余的沃顿氏胶剪成0.5-1cm左右小段，用镊子放入无菌烧杯中。
⑷将烧杯中的脐带小段剪碎成大小为1mm3以下的组织块。
⑸将组织块转移至无菌培养瓶中，均匀平铺在瓶底，放置于CO2培养箱中干燥1小时。
⑹向每个培养瓶中加入含血清的DMEM/F12培养基10ml，37℃，5％CO2静置培养。
⑺6天后换液，以后每5天全量换液一次，待细胞融合度达到80％进行传代。
⑻用PBS冲洗培养瓶，吸弃组织块，每瓶加入胰蛋白酶，消化3-5分钟后，用血清终止消化。
⑼收集终止后的消化液，1000rpm，5min离心，吸弃上清液，收获间充质干细胞。
⑽将间充质干细胞按照8000个/cm2进行接种，约每3天传代一次。
⑾间充质干细胞传至P5代时吸弃原培养基，PBS冲洗瓶底，加入不含酚红的无血清DMEM/F12培养基，同时按照20μg/ml的浓度加入配制好的人参皂苷饥饿培养。
⑿饥饿培养72小时后收集细胞上清液，4000g，20min离心。
⒀收集离心后的上清液，0.22μm滤器过滤，将滤液收集到无菌收集管中，-80℃冷冻，后将冷冻凝固的上清液抽真空，生化干燥，制备出冻干粉，-20℃冷冻保存。
所述的步骤4中将脐带机械剪碎的工具为剪刀。
所述的步骤5中无菌培养瓶为75cm2培养瓶。
所述的步骤6中加入血清与DMEM/F12培养基的比例是1:10。
验证实验1：
本方法通过CCK8细胞增殖实验，来观察培养基中加入一定浓度人参皂苷后，对MSCs的促增殖能力影响。
实验步骤：
将MSCs按照相同的密度分为5列接种于一块96孔板中，每列做3个复孔。
24h细胞贴壁后，在原有培养基基础上，选择4列分别加入人参皂苷，调整终浓度为10μg/ml、20μg/ml、30μg/ml、40μg/ml，调整每孔培养基体积相同。每块96孔板为1组，分为24h、48h、72h、96h共4组。
用CCK8试剂盒检测人参皂苷与细胞共培养24h、48h、72h、96h后，细胞增殖情况。每孔中加入CCK8试剂，37℃孵育2h，酶标仪450nm处测吸光度，记录实验数据。
实验结论：
人参皂苷对MSCs有明显的促增殖作用，与阴性对照组比较，差异有统计学意义(p<0.05)，当人参皂苷浓度为20μg/ml，细胞培养72h，对细胞促增殖效果最好。
验证实验2：
本方法通过检测细胞因子含量，来观察在培养基中加入人参皂苷对细胞的促分泌因子能力。
实验步骤：
将P5代MSCs按照相同的接种密度分为4组，每组5瓶接种于T75培养瓶中，每一组分别对应一个时间段，共分为24h、48h、72h、96h四个时间段。
待细胞贴壁且生长密度为80％左右时，弃掉上清液，所有培养瓶中均加入无血清DMEM/F12培养基，每一组选择4瓶细胞加入人参皂苷，调整终浓度为10μg/ml、20μg/ml、30μg/ml、40μg/ml，调整每瓶培养基体积相同。
用BCA试剂盒检测细胞饥饿24h、48h、72h、96h后细胞因子分泌量。取标准品做标准曲线，每孔实验样本加入BCA试剂，37℃孵育30min，酶标仪562nm处测吸光度，记录实验数据。
实验结论：
培养基中加入人参皂苷对MSCs饥饿培养可以提高细胞因子分泌量，与阴性对照组相比，差异有统计学意义(p<0.05)，当人参皂苷浓度为20μg/ml，细胞饥饿72h后，获得细胞因子浓度最高。

Claims (4)

1.一种脐带间充质干细胞上清液收集方法，其特征在于：方法由下列步骤组成
⑴取足月产健康剖腹产胎儿脐带，取出放置烧杯中用PBS反复冲洗干净，去除残留在脐带上的血液，获得干净脐带；
⑵将脐带的静脉和动脉血管用器械钝性分离出来；
⑶将剩余的沃顿氏胶剪成0.5-1cm左右小段，用镊子放入无菌烧杯中；
⑷将烧杯中的脐带小段剪碎成大小为1mm3以下的组织块；
⑸将组织块转移至无菌培养瓶中，均匀平铺在瓶底，放置于CO2培养箱中干燥1小时；
⑹向每个培养瓶中加入含血清的DMEM/F12培养基10ml，37℃，5％CO2静置培养；
⑺6天后换液，以后每5天全量换液一次，待细胞融合度达到80％进行传代；
⑻用PBS冲洗培养瓶，吸弃组织块，每瓶加入胰蛋白酶，消化3-5分钟后，用血清终止消化；
⑼收集终止后的消化液，1000rpm，5min离心，吸弃上清液，收获间充质干细胞；
⑽将间充质干细胞按照8000个/cm2进行接种，约每3天传代一次；
⑾间充质干细胞传至P5代时吸弃原培养基，PBS冲洗瓶底，加入不含酚红的无血清DMEM/F12培养基，同时按照20μg/ml的浓度加入配制好的人参皂苷饥饿培养；
⑿饥饿培养72小时后收集细胞上清液，4000g，20min离心；
⒀收集离心后的上清液，0.22μm滤器过滤，将滤液收集到无菌收集管中，-80℃冷冻，后将冷冻凝固的上清液抽真空，生化干燥，制备出冻干粉，-20℃冷冻保存。
2.根据权利要求1所述的脐带间充质干细胞上清液收集方法，其特征在于：所述的步骤⑷中将脐带机械剪碎的工具为剪刀。
3.根据权利要求1所述的脐带间充质干细胞上清液收集方法，其特征在于：所述的步骤⑸中无菌培养瓶为75cm2培养瓶。
4.根据权利要求1所述的脐带间充质干细胞上清液收集方法，其特征在于：所述的步骤⑹中加入血清与DMEM/F12培养基的比例是1:10。
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