CN115032284A - 一种分离检测咀嚼片中有关物质的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种分离检测咀嚼片中有关物质的方法，属于分析化学领域。所述方法采用十八烷基‑五氟苯基键合硅胶色谱柱，以流动相A和流动相B进行洗脱，A相为磷酸二氢铵缓冲溶液与甲醇的混合溶液，B相为甲醇。本发明的方法灵敏度高，专属性好，准确度可靠。
Description
技术领域
本发明涉及分析化学领域，具体涉及一种分离检测盐酸贝那普利螺内酯咀嚼片中盐酸贝那普利有关物质的方法。
背景技术
对于患有心脏病的动物，治疗药物的适口性问题非常关键，因为不能够强迫喂药增加动物的应激，另外动物对药物的依从性不佳，会直接影响药物的治疗效果，无法改善患病动物的生活质量，也就是治疗失败。为改善药物的适口性，将盐酸贝那普利与螺内酯与相关辅料制备成一种咀嚼片剂。
关于该咀嚼片中的盐酸贝那普利的有关物质检测方法，采用现有技术盐酸贝那普利片国家药品标准方法检测，杂质较多且峰型及分离度均不佳，两个成分相关杂质互相交叉干扰，即盐酸贝那普利及其有关物质受香精及螺内酯相关峰干扰，现有技术的方法不适用于盐酸贝那普利螺内酯咀嚼片中盐酸贝那普利有关物质的检测。为了更好更准确地控制产品中的杂质，保证药品的质量，需要研究适合于盐酸贝那普利螺内酯咀嚼片中的贝那普利有关物质的分析检测方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种分离检测盐酸贝那普利螺内酯咀嚼片中盐酸贝那普利有关物质的方法，从而实现盐酸贝那普利螺内酯咀嚼片中盐酸贝那普利有关物质的分离和测定。本发明提供的方法能够有效分离测定盐酸贝那普利螺内酯咀嚼片中盐酸贝那普利有关物质的含量，方法的灵敏度高，专属性好，准确度可靠，可用于盐酸贝那普利螺内酯咀嚼片中有关物质的质量控制。
一种分离检测盐酸贝那普利螺内酯咀嚼片中盐酸贝那普利有关物质的方法，其包括：取盐酸贝那普利螺内酯咀嚼片的样品溶液，采用十八烷基-五氟苯基键合硅胶色谱柱，以流动相A和流动相B进行洗脱，A相为磷酸二氢铵缓冲溶液与甲醇的混合溶液，B相为甲醇。
所述十八烷基-五氟苯基键合硅胶色谱柱可为ACE excel C18-PFP。
所述流动相A中磷酸二氢铵缓冲溶液的浓度为0.01mol/L-0.03mol/L。在一些实施方式中，所述流动相A中磷酸二氢铵缓冲溶液的浓度为0.015mol/L。在一些实施方式中，所述流动相A中磷酸二氢铵缓冲溶液的浓度为0.02mol/L。在一些实施方式中，所述流动相A中磷酸二氢铵缓冲溶液的浓度为0.025mol/L。在一些实施方式中，所述流动相A中磷酸二氢铵缓冲溶液的浓度为0.01mol/L-0.015mol/L。在一些实施方式中，所述流动相A中磷酸二氢铵缓冲溶液的浓度为0.015mol/L-0.02mol/L。在一些实施方式中，所述流动相A中磷酸二氢铵缓冲溶液的浓度为0.025mol/L-0.03mol/L。
所述流动相A的pH值范围为1.9-2.1。在一些实施方式中，所述流动相A的pH值范围为1.9。在一些实施方式中，所述流动相A的pH值范围为2.0。所述流动相A的pH值范围为2.1。
所述流动相A中磷酸二氢铵缓冲溶液与甲醇的体积比为6:4。
在一些实施方式中，所述流动相A为0.02mol/L磷酸二氢铵缓冲溶液:甲醇＝6:4(V:V，体积比)且pH值为2.0的混合溶液。
按照体积比计，所述洗脱程序为：
| 时间(min) | 流动相A | 流动相B |
| 0 | 100 | 0 |
| 5 | 100 | 0 |
| 40 | 50 | 50 |
| 45 | 33 | 67 |
| 50 | 33 | 67 |
| 50.1 | 17 | 83 |
| 60 | 17 | 83 |
| 60.1 | 100 | 0 |
| 65 | 100 | 0 |
。
所述分离检测盐酸贝那普利螺内酯咀嚼片中盐酸贝那普利有关物质的方法，可包括以下步骤或按以下步骤实现：
1)取盐酸贝那普利螺内酯咀嚼片样品，配制成浓度为0.5mg/mL-1mg/mL的样品溶液；
2)设置仪器参数：流动相的流速、色谱柱柱温、洗脱程序、检测波长；
3)取步骤1)的样品溶液，注入高效液相色谱仪，记录色谱图，完成盐酸贝那普利螺内酯咀嚼片中盐酸贝那普利有关物质的分离测定。
所述流动相的流速为0.5mL/min-0.7mL/min。在一些实施方式中，所述流动相的流速为0.5mL/min-0.6mL/min。在一些实施方式中，所述流动相的流速为0.6mL/min-0.7mL/min。在一些实施方式中，所述流动相的流速为0.6mL/min。
所述色谱柱柱温范围为28℃-32℃。在一些实施方式中，所述色谱柱柱温为29℃。在一些实施方式中，所述色谱柱柱温为30℃。在一些实施方式中，所述色谱柱柱温为31℃。
所述洗脱程序为0min-5min：流动相A:流动相B＝100:0(V:V)，5min-40min：流动相A:流动相B＝50:50(V:V)，40min-45min：流动相A:流动相B＝33:67(V:V)，45min-50min：流动相A:流动相B＝33:67(V:V)，50.1min-60min：流动相A:流动相B＝17:83(V:V)，60.1min-65min：流动相A:流动相B＝100:0(V:V)。
所述进样体积为5μL-15μL。在一些实施方式中，所述进样体积为10μL。
所述稀释剂为乙腈：水＝1:9(V:V)混合溶液。
所述检测波长为238nm-242nm。在一些实施方式中，所述检测波长为239nm。在一些实施方式中，所述检测波长为240nm。在一些实施方式中，所述检测波长为241nm。
在一些实施方式中，所述分离检测盐酸贝那普利螺内酯咀嚼片中盐酸贝那普利有关物质的方法，包括以下步骤或按以下步骤实现：
1)取盐酸贝那普利螺内酯咀嚼片样品，配制成浓度为0.5mg/mL的样品溶液；
2)设置流动相流速0.5mL/min-0.7mL/min，色谱柱柱温28℃-32℃，检测波长为238nm-242nm，洗脱程序为0min-5min：流动相A:流动相B＝100:0(V:V)，5min-40min：流动相A:流动相B＝50:50(V:V)，
40min-45min：流动相A:流动相B＝33:67(V:V)，45min-50min：流动相A:流动相B＝33:67(V:V)，
50.1min-60min：流动相A:流动相B＝17:83(V:V)，60.1min-65min：流动相A:流动相B＝100:0(V:V)；3)取5μL-15μL步骤1)的样品溶液，注入高效液相色谱仪，记录色谱图，完成盐酸贝那普利螺内酯咀嚼片中基因毒性杂质的分离测定。
在一些实施方式中，所述的分离检测盐酸贝那普利螺内酯咀嚼片中盐酸贝那普利有关物质的方法，可包括以下步骤或按以下步骤实现：
1)取盐酸贝那普利螺内酯咀嚼片样品，配制成浓度为0.5mg/mL的样品溶液；
2)设置流动相流速0.6mL/min，色谱柱柱温30℃，检测波长为240nm，洗脱程序为0min-5min：流动相A:流动相B＝100:0(V:V)，5min-40min：流动相A:流动相B＝50:50(V:V)，40min-45min：流动相A:流动相B＝33:67(V:V)，45min-50min：流动相A:流动相B＝33:67(V:V)，50.1min-60min：流动相A:流动相B＝17:83(V:V)，60.1min-65min：流动相A:流动相B＝100:0(V:V)；
3)取10μL步骤1)的样品溶液，注入高效液相色谱仪，记录色谱图，完成盐酸贝那普利螺内酯咀嚼片中盐酸贝那普利有关物质的分离测定。
高效液相色谱仪可为美国Agilent 1260型高效液相色谱***及工作站或其他适宜可行的***。
在一些实施方式中，所述的分离检测盐酸贝那普利螺内酯咀嚼片中盐酸贝那普利有关物质的方法，包括：取盐酸贝那普利螺内酯咀嚼片样品配制成浓度为0.5mg/mL的溶液，再以HPLC法检测其中的盐酸贝那普利有关物质；采用的色谱柱选自ACE excel C18-PFP。
在一些实施方式中，所述的分离检测盐酸贝那普利螺内酯咀嚼片中盐酸贝那普利有关物质的方法，包括：取盐酸贝那普利螺内酯咀嚼片样品配制成浓度为0.5mg/mL的溶液，再以HPLC法检测其中的盐酸贝那普利有关物质；采用的色谱柱选自ACE excel C18-PFP；以流动相A和流动相B进行洗脱，A相为磷酸二氢铵缓冲溶液与甲醇的混合溶液，B相为甲醇。
在一些实施方式中，所述的分离检测盐酸贝那普利螺内酯咀嚼片中盐酸贝那普利有关物质的方法，包括：取盐酸贝那普利螺内酯咀嚼片样品配制成浓度为0.5mg/mL的溶液，再以HPLC法检测其中的盐酸贝那普利有关物质；采用的色谱柱选自ACE excel C18-PFP；以流动相A和流动相B进行洗脱，A相为0.02mol/L磷酸二氢铵缓冲溶液与甲醇的混合溶液，B相为甲醇。
在一些实施方式中，所述的分离检测盐酸贝那普利螺内酯咀嚼片中盐酸贝那普利有关物质的方法，包括：取盐酸贝那普利螺内酯咀嚼片样品配制成浓度为0.5mg/mL的溶液，再以HPLC法检测其中的盐酸贝那普利有关物质；采用的色谱柱选自ACE excel C18-PFP；以流动相A和流动相B进行洗脱，流动相A为0.02mol/L磷酸二氢铵缓冲溶液与甲醇且pH值为2.0的混合溶液，B相为甲醇。
在一些实施方式中，所述的分离检测盐酸贝那普利螺内酯咀嚼片中盐酸贝那普利有关物质的方法，包括：取盐酸贝那普利螺内酯咀嚼片样品配制成浓度为0.5mg/mL的溶液，再以HPLC法检测其中的盐酸贝那普利有关物质；采用的色谱柱选自ACE excel C18-PFP；以流动相A和流动相B进行洗脱，流动相A为0.02mol/L磷酸二氢铵缓冲溶液：甲醇＝6:4(V:V)的且pH值为2.0的混合溶液，B相为甲醇。
在一些实施方式中，所述的分离检测盐酸贝那普利螺内酯咀嚼片中盐酸贝那普利有关物质的方法，包括：取盐酸贝那普利螺内酯咀嚼片样品配制成浓度为0.5mg/mL的溶液，再以HPLC法检测其中的盐酸贝那普利有关物质；采用的色谱柱选自ACE excel C18-PFP；以流动相A和流动相B进行洗脱，流动相A为0.02mol/L磷酸二氢铵缓冲溶液：甲醇＝6:4(V:V)且pH为2.0的混合溶液，B相为甲醇；所述洗脱程序为0min-5min：流动相A:流动相B＝100:0(V:V)，5min-40min：流动相A:流动相B＝50:50(V:V)，40min-45min：流动相A:流动相B＝33:67(V:V)，45min-50min：流动相A:流动相B＝33:67(V:V)，50.1min-60min：流动相A:流动相B＝17:83(V:V)，60.1min-65min：流动相A:流动相B＝100:0(V:V)。
在一些实施方式中，所述的分离检测盐酸贝那普利螺内酯咀嚼片中盐酸贝那普利有关物质的方法，包括：取盐酸贝那普利螺内酯咀嚼片样品配制成浓度为0.5mg/mL的溶液，再以HPLC法检测其中的盐酸贝那普利有关物质；采用的色谱柱选自ACE excel C18-PFP；以流动相A和流动相B进行洗脱，流动相A为0.02mol/L磷酸二氢铵缓冲溶液：甲醇＝6:4(V:V)的且pH值为2.0的混合溶液，B相为甲醇；所述洗脱程序为0min-5min：流动相A:流动相B＝100:0(V:V)，5min-40min：流动相A:流动相B＝50:50(V:V)，40min-45min：流动相A:流动相B＝33:67(V:V)，45min-50min：流动相A:流动相B＝33:67(V:V)，50.1min-60min：流动相A:流动相B＝17:83(V:V)，60.1min-65min：流动相A:流动相B＝100:0(V:V)；流动相流速为0.6mL/min。
在一些实施方式中，所述的分离检测盐酸贝那普利螺内酯咀嚼片中盐酸贝那普利有关物质的方法，包括：取盐酸贝那普利螺内酯咀嚼片样品配制成浓度为0.5mg/mL的溶液，再以HPLC法检测其中的盐酸贝那普利有关物质；采用的色谱柱选自ACE excel C18-PFP；以流动相A和流动相B进行洗脱，所述流动相A为0.02mol/L磷酸二氢铵缓冲溶液与甲醇体积比为6:4且pH值为2.0的混合溶液，B相为甲醇；所述洗脱程序为0min-5min：流动相A:流动相B＝100:0(V:V)，5min-40min：流动相A:流动相B＝50:50(V:V)，40min-45min：流动相A:流动相B＝33:67(V:V)，45min-50min：流动相A:流动相B＝33:67(V:V)，50.1min-60min：流动相A:流动相B＝17:83(V:V)，60.1min-65min：流动相A:流动相B＝100:0(V:V)；流动相流速为0.6mL/min；色谱柱柱温30℃；检测波长为240nm。
术语定义
在上文或下文的内容中，无论是否使用“大约”或“约”等字眼，所有在此公开了的数字均为近似值。基于公开的数值，每一个数字的数值有可能会出现1％、2％、5％、7％、8％或10％等差异。
本发明提供的方法，可以将药物中相关物质进行有效分离，分离度达到1.5以上或2.5以上或5以上，完全基线分离，可解决直接检测原型时灵敏度差，稳定性差的问题。本发明的方法简单、快捷、准确且灵敏度高。
本发明中，HPLC表示高效液相色谱法；DAD表示二极管阵列检测器；RSD表示相对标准偏差。
本发明中，μL表示微升，mL表示毫升，℃表示摄氏度，mg表示毫克，mg/mL表示毫克/毫升，μg/mL表示微克/毫升，min表示分钟，mL/min表示毫升/分钟，mm表示毫米，nm表示纳米。
本发明所述样品进样前需用0.22μm滤膜过滤。
附图说明
图1示实施例1中供试品溶液HPLC图谱，横坐标表示采集时间(Retention Time)，单位分钟(min)，纵坐标表示电信号，单位mAU；
图2示实施例2中空白溶液HPLC图谱，横坐标表示采集时间(Retention Time)，单位分钟(min)，纵坐标表示电信号，单位mAU；
图3示实施例2中专属性考察试验HPLC图谱，横坐标表示采集时间(RetentionTime)，单位分钟(min)；
图4示实施例2中***适用性溶液HPLC图谱，横坐标表示采集时间(RetentionTime)，单位分钟(min)，纵坐标表示电信号，单位mAU；
图5示实施例2中灵敏度溶液HPLC图谱，横坐标表示采集时间(Retention Time)，单位分钟(min)，纵坐标表示电信号，单位mAU。
具体实施方式
本发明实施例公开了一种分离检测盐酸贝那普利螺内酯片有关物质的方法。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明实施例中，所述盐酸贝那普利有关物质的含量，计算公式如下：
式中：
WS：盐酸贝那普利对照品称样量，mg；
PS：盐酸贝那普利对照品的纯度，％；
Ai：供试品溶液各杂质峰峰面积；
Dt：供试品溶液稀释体积，mL；
F：杂质校正因子；
AS：对照品溶液1中主峰峰面积平均值；
DS：对照品溶液稀释体积，mL；
L：盐酸贝那普利螺内酯片标示量，以盐酸贝那普利计10mg、5mg、2.5mg；
n：投片片数。
仪器与色谱柱的规格参见下表：美国Agilent 1260型高效液相色谱仪***及工作站，自动进样。
为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明进行详细说明。
实施例1(药典方法)：
仪器与条件
色谱柱：waters，xbridge C18，4.6×250mm，5μm；
检测器：DAD；
流速：1mL/min；
柱温：30℃；
进样量：20μL；
检测波长：240nm；
流动相：Buffer-甲醇＝42:58(Buffer：0.09mol/L KCl+0.02mol/L NaClO4)；
洗脱程序：等度洗脱；
运行时间：200min；
实验步骤
稀释剂：流动相；
1)供试品储备液：取本品5片(相当于盐酸贝那普利50mg)，置于100mL量瓶中，加入约60mL稀释液，超声30min(需控制水温为室温或置冰水浴中)，用稀释液定容至刻度，摇匀，离心(10000rpm，10min)，取上清液过滤(尼龙，0.22μm，Φ13mm，津腾)，弃去2mL初滤液，取续滤液，即得盐酸贝那普利浓度为0.5mg/mL的供试品储备液。
2)供试品溶液：用移液管精密移取步骤1)供试品储备液2mL样品置于200mL量瓶中，用稀释剂稀释至刻度，制成浓度为0.01mg/ml的供试品溶液。
3)取步骤2)供试品溶液按上述色谱条件进样，记录色谱图，结果如图1所示。
实施例2
仪器与条件
色谱柱：ACE execl C18-PFP，4.6×150mm，3μm；
检测器：DAD；
流速：0.6mL/min；
柱温：30℃；
进样量：10μL；
检测波长：240nm；
流动相A：流动相A为0.02mol/L磷酸二氢铵缓冲溶液与甲醇体积比为6:4的混合溶液，pH值2.0；
流动相B：甲醇；
洗脱程序：
| 时间(min) | 流动相A | 流动相B |
| 0 | 100 | 0 |
| 5 | 100 | 0 |
| 40 | 50 | 50 |
| 45 | 33 | 67 |
| 50 | 33 | 67 |
| 50.1 | 17 | 83 |
| 60 | 17 | 83 |
| 60.1 | 100 | 0 |
| 65 | 100 | 0 |
运行时间：65min。
实验步骤
1)稀释剂/空白溶液：乙腈：水＝1:9(V:V)；
2)***适用性溶液：
贝那普利拉对照品储备液：取贝那普利拉对照品约2mg，精密称定，置于20mL量瓶中，加入约0.8mL盐酸使其溶解，再加入量瓶体积约60％的稀释液，超声10min使溶解，再加稀释液稀释至刻度，摇匀，即得0.1mg/mL贝那普利拉对照品储备液；
坎利酮对照品储备液：取坎利酮对照品约2mg，精密称定，置于20mL量瓶中，加入2mL乙腈使溶解，再加水稀释至刻度，摇匀，即得0.1mg/mL坎利酮对照品储备液；
***适用性溶液：取盐酸贝那普利对照品约25mg，精密称定，置50mL量瓶中，再分别精密移取2.5mL贝那普利拉对照品储备液和2.5mL坎利酮对照品储备液置同一量瓶中，用稀释液稀释至刻度，摇匀即得坎利酮浓度约为5μg/mL、贝那普利拉浓度约为5μg/mL、盐酸贝那普利浓度约为0.5mg/mL的***适用性溶液；
3)对照品溶液：取盐酸贝那普利对照品约20mg，精密称定，置100mL量瓶中，加稀释液溶解并定容至刻度，摇匀。精密移取该溶液2.5mL至100mL量瓶中，加稀释液定容至刻度，摇匀即得盐酸贝那普利浓度约为5μg/mL的对照品溶液，平行配制两份；
4)灵敏度溶液：精密移取盐酸贝那普利对照品溶液5mL至50mL量瓶中，加稀释液稀释至刻度，摇匀，即得盐酸贝那普利浓度约为0.5μg/mL的灵敏度溶液；
5)供试品溶液：取本品5片(相当于盐酸贝那普利50mg)，置于100mL量瓶中，加入约60mL稀释液，超声30min(需控制水温为室温或置冰水浴中)，用稀释液定容至刻度，摇匀，离心(10000rpm，10min)，取上清液过滤(尼龙，0.22μm，Φ13mm，津腾)，弃去2mL初滤液，取续滤液，即得盐酸贝那普利浓度为0.5mg/mL的供试品溶液，平行配制6份；
6)空白辅料溶液：按100％处方比例称取空白辅料2950mg(含螺内酯)，置于100mL量瓶中，加稀释液60mL，超声30min，加稀释液稀释至刻度，摇匀，离心(10000rpm，10min)，过滤(尼龙，0.22μm，Φ13mm，津腾)即得；
7)盐酸贝那普利储备液：取盐酸贝那普利对照品10mg，精密称定，置200mL量瓶中，加稀释液溶解并定容至刻度，摇匀，即得浓度为50μg/mL盐酸贝那普利储备液；
8)贝那普利拉储备液：取贝那普利拉对照品约10mg，精密称定，置于200mL量瓶中，先加约8mL浓盐酸使溶解，再加入量瓶体积约60％的稀释液，超声约10min使溶解，再加稀释液定容至刻度，摇匀，即得浓度为50μg/mL贝那普利拉储备液；
9)杂质E储备液：取杂质E对照品约10mg，精密称定，置于200mL量瓶中，加稀释液溶解并定容至刻度，摇匀，即得浓度为50μg/mL的杂质E储备液；
10)未知杂质准确度溶液配制：按表1称取相应量的空白辅料(含螺内酯)置于相应的量瓶中，加入约量瓶30％体积的稀释液，精密移取相应体积的未知杂质储备液至上述相应量瓶中，再加入稀释液约至量瓶体积的60％，超声30min，加稀释液定容至刻度，离心(10000rpm，10min)，过滤(尼龙，0.22μm，Φ13mm，津腾)，取续滤液即得。每个浓度平行配制3份；
11)已知杂质准确度溶液：按表2、表3取相应数量的药片置于相应量瓶中，加入约量瓶30％体积的稀释液，精密移取相应体积的贝那普利拉储备液/杂质E储备液至同一相应的量瓶中，再加入稀释液约至量瓶体积的60％，超声30min，加稀释液定容至刻度，离心(10000rpm，10min)。过滤(尼龙，0.22μm，Φ13mm，津腾)，取续滤液即得，每个浓度平行配制3份；
表1：未知杂质准确度溶液
| 浓度水平(％) | 0.3％ | 1.0 | 1.5 |
| 未知杂质储备液(mL) | 6 | 2 | 3 |
| 容量瓶(mL) | 200 | 20 | 20 |
| 空白辅料(含螺内酯)(mg) | 5900 | 590 | 590 |
| 盐酸贝那普利理论浓度(μg/mL) | 1.5 | 5 | 7.5 |
表2：贝那普利拉准确度溶液
| 浓度水平(％) | 0.3 | 3.0 | 4.5 |
| 贝那普利拉定量限储备液(mL) | 3 | 6 | 9 |
| 容量瓶(mL) | 100 | 20 | 20 |
| 片子数量(片) | 5 | 1 | 1 |
| 贝那普利拉理论浓度(μg/mL) | 1.5 | 15 | 22.5 |
表3：杂质E准确度溶液
| 浓度水平(％) | 0.3 | 1.0 | 1.5 |
| 杂质E定量限储备液(mL) | 3 | 2 | 3 |
| 容量瓶(mL) | 100 | 20 | 20 |
| 片子数量(片) | 5 | 1 | 1 |
| 杂质E理论浓度(μg/mL) | 1.5 | 5 | 7.5 |
12)线性溶液配制如下表4所示：
表4：盐酸贝那普利/贝那普利拉/杂质E线性溶液
13)取空白溶液，灵敏度溶液、***适用性溶液、空白辅料溶液、供试品溶液、线性溶液、准确度溶液，按上述条件进行高效液相色谱分析，进样序列表见表5，记录色谱图，如图2-图5所示，结果如表6-表12所示。
表5：进样序列表
表6：***适用性和回收率结果
表7：专属性结果
表8：线性结果
表9：分析重复性考察结果
表10：贝那普利拉准确度结果
表11：贝那普利拉准确度结果
表12：杂质E准确度结果
实施例3：
仪器与条件
色谱柱：ACE execl C18-PFP，4.6×150mm，3μm；
检测器：DAD；
流速：0.6mL/min；
柱温：30℃；
进样量：10μL；
检测波长：240nm；
样品盘控温：8℃；
流动相A：流动相A为0.02mol/L磷酸二氢铵缓冲溶液与甲醇体积比为6:4的混合溶液，pH值2.0；
流动相B：甲醇；
洗脱程序：
| 时间(min) | 流动相A | 流动相B |
| 0 | 100 | 0 |
| 5 | 100 | 0 |
| 40 | 50 | 50 |
| 45 | 33 | 67 |
| 50 | 33 | 67 |
| 50.1 | 17 | 83 |
| 60 | 17 | 83 |
| 60.1 | 100 | 0 |
| 65 | 100 | 0 |
运行时间：65min。
实验步骤
1)稀释剂/空白溶液：乙腈：水＝1:9(V:V)；
2)供试品溶液：取本品5片(相当于盐酸贝那普利50mg)，置于100mL量瓶中，加入约60mL稀释液，超声30min(需控制水温为室温或置冰水浴中)，用稀释液定容至刻度，摇匀，离心(10000rpm，10min)，取上清液过滤(尼龙，0.22μm，Φ13mm，津腾)，弃去2mL初滤液，取续滤液，即得盐酸贝那普利浓度为0.5mg/mL的供试品溶液。
3)取空白溶液、供试品溶液，按上述条件进行高效液相色谱分析，记录色谱图，结果如表11所示。
表11：
实施例4
仪器与条件
色谱柱：ACE execl C18-PFP，4.6×150mm，3μm；
检测器：DAD；
流速：0.5mL/min；
柱温：30℃；
进样量：10μL；
检测波长：240nm；
样品盘控温：8℃；
流动相A：流动相A为0.02mol/L磷酸二氢铵缓冲溶液与甲醇体积比为6:4的混合溶液，pH值2.0；
流动相B：甲醇；
洗脱程序：
| 时间(min) | 流动相A | 流动相B |
| 0 | 100 | 0 |
| 5 | 100 | 0 |
| 40 | 50 | 50 |
| 45 | 33 | 67 |
| 50 | 33 | 67 |
| 50.1 | 17 | 83 |
| 60 | 17 | 83 |
| 60.1 | 100 | 0 |
| 65 | 100 | 0 |
运行时间：65min。
实验步骤
1)稀释剂/空白溶液：乙腈：水＝1:9(V:V)；
2)供试品溶液：取本品5片(相当于盐酸贝那普利50mg)，置于100mL量瓶中，加入约60mL稀释液，超声30min(需控制水温为室温或置冰水浴中)，用稀释液定容至刻度，摇匀，离心(10000rpm，10min)，取上清液过滤(尼龙，0.22μm，Φ13mm，津腾)，弃去2mL初滤液，取续滤液，即得盐酸贝那普利浓度为0.5mg/mL的供试品溶液。
3)取空白溶液、供试品溶液，按上述条件进行高效液相色谱分析，记录色谱图，结果如表12所示。
表12：
实施例5
仪器与条件
色谱柱：ACE execl C18-PFP，4.6×150mm，3μm；
检测器：DAD；
流速：0.7mL/min；
柱温：30℃；
进样量：10μL；
检测波长：240nm；
样品盘控温：8℃；
流动相A：流动相A为0.02mol/L磷酸二氢铵缓冲溶液与甲醇体积比为6:4的混合溶液，pH值2.0；
流动相B：甲醇；
洗脱程序：
| 时间(min) | 流动相A | 流动相B |
| 0 | 100 | 0 |
| 5 | 100 | 0 |
| 40 | 50 | 50 |
| 45 | 33 | 67 |
| 50 | 33 | 67 |
| 50.1 | 17 | 83 |
| 60 | 17 | 83 |
| 60.1 | 100 | 0 |
| 65 | 100 | 0 |
运行时间：65min。
实验步骤
1)稀释剂/空白溶液：乙腈：水＝1:9(V:V)；
2)供试品溶液：取本品5片(相当于盐酸贝那普利50mg)，置于100mL量瓶中，加入约60mL稀释液，超声30min(需控制水温为室温或置冰水浴中)，用稀释液定容至刻度，摇匀，离心(10000rpm，10min)，取上清液过滤(尼龙，0.22μm，Φ13mm，津腾)，弃去2mL初滤液，取续滤液，即得盐酸贝那普利浓度为0.5mg/mL的供试品溶液。
3)取空白溶液、供试品溶液，按上述条件进行高效液相色谱分析，记录色谱图，结果如表13所示。
表13：
实施例6
仪器与条件
色谱柱：ACE execl C18-PFP，4.6×150mm，3μm；
检测器：DAD；
流速：0.6mL/min；
柱温：28℃；
进样量：10μL；
检测波长：240nm；
样品盘控温：8℃；
流动相A：流动相A为0.02mol/L磷酸二氢铵缓冲溶液与甲醇体积比为6:4的混合溶液，pH值2.0；
流动相B：甲醇；
洗脱程序：
| 时间(min) | 流动相A | 流动相B |
| 0 | 100 | 0 |
| 5 | 100 | 0 |
| 40 | 50 | 50 |
| 45 | 33 | 67 |
| 50 | 33 | 67 |
| 50.1 | 17 | 83 |
| 60 | 17 | 83 |
| 60.1 | 100 | 0 |
| 65 | 100 | 0 |
运行时间：65min。
实验步骤
1)稀释剂/空白溶液：乙腈：水＝1:9(V:V)；
2)供试品溶液：取本品5片(相当于盐酸贝那普利50mg)，置于100mL量瓶中，加入约60mL稀释液，超声30min(需控制水温为室温或置冰水浴中)，用稀释液定容至刻度，摇匀，离心(10000rpm，10min)，取上清液过滤(尼龙，0.22μm，Φ13mm，津腾)，弃去2mL初滤液，取续滤液，即得盐酸贝那普利浓度为0.5mg/mL的供试品溶液。
3)取空白溶液、供试品溶液，按上述条件进行高效液相色谱分析，记录色谱图，结果如表14所示。
表14：
实施例7
仪器与条件
色谱柱：ACE execl C18-PFP，4.6×150mm，3μm；
检测器：DAD；
流速：0.6mL/min；
柱温：32℃；
进样量：10μL；
检测波长：240nm；
样品盘控温：8℃；
流动相A：流动相A为0.02mol/L磷酸二氢铵缓冲溶液与甲醇体积比为6:4的混合溶液，pH值2.0；
流动相B：甲醇；
洗脱程序：
| 时间(min) | 流动相A | 流动相B |
| 0 | 100 | 0 |
| 5 | 100 | 0 |
| 40 | 50 | 50 |
| 45 | 33 | 67 |
| 50 | 33 | 67 |
| 50.1 | 17 | 83 |
| 60 | 17 | 83 |
| 60.1 | 100 | 0 |
| 65 | 100 | 0 |
运行时间：65min。
实验步骤
1)稀释剂/空白溶液：乙腈：水＝1:9(V:V)；
2)供试品溶液：取本品5片(相当于盐酸贝那普利50mg)，置于100mL量瓶中，加入约60mL稀释液，超声30min(需控制水温为室温或置冰水浴中)，用稀释液定容至刻度，摇匀，离心(10000rpm，10min)，取上清液过滤(尼龙，0.22μm，Φ13mm，津腾)，弃去2mL初滤液，取续滤液，即得盐酸贝那普利浓度为0.5mg/mL的供试品溶液。
3)取空白溶液、供试品溶液，按上述条件进行高效液相色谱分析，记录色谱图，结果如表15所示。
表15：
Claims (10)
1.一种分离检测盐酸贝那普利螺内酯咀嚼片中盐酸贝那普利有关物质的方法，其包括：取盐酸贝那普利螺内酯咀嚼片的样品溶液，采用十八烷基-五氟苯基键合硅胶色谱柱，以流动相A和流动相B进行洗脱，A相为磷酸二氢铵缓冲溶液与甲醇的混合溶液，B相为甲醇。
2.根据权利要求1所述的方法，所述色谱柱为ACE excel C18-PFP。
3.根据权利要求1所述的方法，所述流动相A中磷酸二氢铵缓冲溶液的浓度为0.01mol/L-0.03mol/L，流动相A的pH值范围为1.9-2.1；所述流动相A中磷酸二氢铵缓冲溶液与甲醇的体积比为6:4。
4.根据权利要求1-3任一所述的方法，包括以下步骤：
1)取盐酸贝那普利螺内酯咀嚼片样品，配制成浓度为0.5mg/mL-1.0mg/mL的样品溶液；
2)设置仪器参数：流动相的流速、色谱柱柱温、洗脱程序、检测波长；
3)取步骤1)的样品溶液，注入高效液相色谱仪，记录色谱图，完成盐酸贝那普利螺内酯咀嚼片中盐酸贝那普利有关物质的分离测定。
5.根据权利要求4所述的方法，所述流动相的流速为0.5mL/min-0.7mL/min。
6.根据权利要求4所述的方法，所述检测波长为238nm-242nm。
7.根据权利要求4所述的方法，所述色谱柱柱温28℃-32℃。
8.根据权利要求4-7任一所述的方法，按照体积比，所述洗脱程序为0min-5min：流动相A:流动相B＝100:0，5min-40min：流动相A:流动相B＝50:50，40min-45min：流动相A:流动相B＝33:67，45min-50min：流动相A:流动相B＝33:67，50.1min-60min：流动相A:流动相B＝17:83，60.1min-65min：流动相A:流动相B＝100:0。
9.根据权利要求1-8任一所述的方法，包含以下步骤：
1)取盐酸贝那普利螺内酯咀嚼片样品，配制成浓度为0.5mg/mL-1.0mg/mL的样品溶液；
2)设置流动相流速0.5mL/min-0.7mL/min，色谱柱柱温28℃-32℃，检测波长为238nm-242nm，按照体积比，洗脱程序为0min-5min：流动相A:流动相B＝100:0，5min-40min：流动相A:流动相B＝50:50，40min-45min：流动相A:流动相B＝33:67，45min-50min：流动相A:流动相B＝33:67，50.1min-60min：流动相A:流动相B＝17:83，60.1min-65min：流动相A:流动相B＝100:0；
3)取5μL-15μL步骤1)的样品溶液，注入高效液相色谱仪，记录色谱图，完成盐酸贝那普利螺内酯咀嚼片中基因毒性杂质的分离测定。
10.根据权利要求1-9任一所述的方法，包含以下步骤：
1)取盐酸贝那普利螺内酯咀嚼片样品，配制成浓度为1.0mg/mL的样品溶液；
2)设置流动相流速0.6mL/min，色谱柱柱温30℃，检测波长为240nm，按照体积比，洗脱程序为0min-5min：流动相A:流动相B＝100:0，5min-40min：流动相A:流动相B＝50:50，40min-45min：流动相A:流动相B＝33:67，45min-50min：流动相A:流动相B＝33:67，50.1min-60min：流动相A:流动相B＝17:83，60.1min-65min：流动相A:流动相B＝100:0；
3)取10μL步骤1)的样品溶液，注入高效液相色谱仪，记录色谱图，完成盐酸贝那普利螺内酯咀嚼片中盐酸贝那普利有关物质的分离测定。
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