CN111474270B - 米索前列醇固体制剂中有关检测及供试品溶液的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种规格为5μg～80μg的米索前列醇固体制剂中有关物质检测所用的供试品溶液的制备方法，及一种检测规格为5μg～80μg的米索前列醇固体制剂中有关物质的HPLC方法。本发明提供的供试品溶液的制备方法，可为规格为5μg～80μg的米索前列醇固体制剂配制出适合HPLC法检测有关物质的供试品溶液，本发明提供的检测方法，分离效果好、重现性好、灵敏度高。

Description

米索前列醇固体制剂中有关检测及供试品溶液的制备方法

技术领域

本发明涉及制剂分析方法技术领域，特别涉及一种低剂量米索前列醇固体制剂(规格：5μg～80μg)有关物质HPLC检测方法及检测中所用的供试品溶液的制备方法。

背景技术

米索前列醇，是一种***素E1衍生物，由于活性极高，临床应用只需要微克级别即可。米索前列醇已成功开发并批准用于治疗胃溃疡或者流产，规格为200μg。

临床应用中进一步发现，米索前列醇还有多种用途，比如在较低剂量下(如5μg～80μg)可用于足月引产等。研究人员需要针对不同适应症开发不同规格的米索前列醇制剂，由于携带和使用方便，米索前列醇固体制剂是一种较好的选择。

制剂开发中质量控制、尤其是有关物质控制尤为重要。米索前列醇降解杂质包括已知的8-表米索前列醇、A-构型米索前列醇、B-构型米索前列醇及未知杂质等。米索前列醇固体制剂有关物质分析方法开发中的一个重要难题是，规格越小，米索前列醇在制剂中的占比越低，辅料干扰越大，越难于检测，灵敏度达不到要求。

本领域技术人员就米索前列醇有关物质检测方法做了一些尝试。

USP42-NF37中公开了米索前列醇分散体有关物质的检测方法及供试品溶液的制备方法。叶皓等发表了《高效液相色谱法同时测定奥湿克片中两组分的含量及有关物质》一文，采用高效液相色谱法同时测定双氯芬酸钠、米索前列醇(200μg)的含量和有关物质，该方法灵敏度较低，8-表米索前列醇的检测限为0.16％、A-构型米索前列醇的检测限0.13％，均大于报告限0.1％，不满足检测要求；S.A.Carr等发表了《Analytical methodology todetermine the potency and quality of misoprostol tablets》一文，描述了一种HPLC等度洗脱检测200μg米索前列醇片的方法；Getu Kahsay等发表了《Development andvalidation of LC methods for the separation of misoprostol related substancesand diastereoisomers》一文，描述了LC法用于分离米索前列醇原料药、4％分散体和100μg片和200μg片中的有关物质。

但是，上述方法均仅适用于米索前列醇、米索前列醇-分散体和/或规格≥100μg的米索前列醇制剂。按照上述文献提供的供试品溶液制备方法及检测方法，无法用于检测规格为5μg～80μg的米索前列醇固体制剂，辅料干扰大或者检测限达不到要求。

因此，目前急需要一种适于低剂量(规格：5μg～80μg)米索前列醇固体制剂的有关物质检测方法，该方法必须可同时检测已知杂质和未知杂质、灵敏高、分离效果好，同时需要适用于该检测的供试品溶液的制备方法，以此来控制低剂量(规格：5μg～80μg)米索前列醇固体制剂的质量。

发明内容

基于上述技术问题，为了克服现有技术的上述不足之处，本发明提供一种可供低剂量(规格：5μg～80μg)米索前列醇固体制剂中有关物质检测的HPLC方法及检测所用的供试品溶液的制备方法。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：

提供一种用于HPLC法检测米索前列醇固体制剂(规格为5μg～80μg)中有关物质的供试品溶液的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：

1)称量：称取米索前列醇固体制剂适量作为供试品；

2)提取：用第一种溶媒溶解供试品，得米索前列醇提取液，所述提取液浓度为5～80μg/ml；优选地，其中所述第一种溶媒为乙酸乙酯、甲醇或乙醇中的至少一种，更优选地所述第一种溶媒为甲醇。由此，可充分提取供试品中的米索前列醇，且较容易将提取溶液浓缩干燥至所需供试品溶液浓度，同时避免杂质在提取过程中增加。

3)浓缩干燥：取适量提取液浓缩干燥后得供试品提取物；

4)溶解：用第二种溶媒溶解供试品提取物，制成供试品溶液，所述供试品溶液浓度为100～200μg/ml，其中所述第二种溶媒为可使米索前列醇溶解的极性有机溶剂、极性有机溶剂-水溶液或极性有机溶剂-缓冲盐溶液；优选地，所述极性有机溶剂为甲醇、乙醇、异丙醇、乙腈中的至少一种。由此，供试品溶液浓度可满足检测灵敏度要求，且专属性好，且可以避免辅料浓度过大而干扰检测。

优选地，其中所述所述提取的方式为超声或振摇，更优选地为超声。

优选地，其中所述提取时间为5～60min。

优选地，其中所述浓缩干燥的方式为真空干燥或惰性气体吹干，更优选地为氮气吹干。

优选地一种方案为，其中所述第一种溶媒为甲醇，提取方式为超声，提取时间为15～40min，提取液浓度为10～50μg/ml，浓缩干燥的方式为氮气吹干，供试品溶液浓度为100～150μg/ml，由此，主成分和各杂质均能充分提取，且辅料干扰较小。

优选地，所述米索前列醇固体制剂为米索前列醇***片。

优选地，所述米索前列醇固体制剂的规格为25μg。

用本发明提供的供试品溶液制备方法配制的供试品溶液，适用于HPLC法检测米索前列醇有关物质。本发明还提供一种规格为5μg～80μg的米索前列醇固体制剂中有关物质检测的HPLC方法，其特征在于包括以下步骤：

1)供试品溶液配制：按照前面所述方法配制；

2)对照品溶液配制：取米索前列醇对照品适量，精密称定，加前面所述第二种溶媒溶解并定量稀释制成对照品溶液，所述对照品溶液浓度为供试品溶液浓度的1％；

3)***适用性溶液配制：取对照品加前面所述第二种溶媒溶解并稀释作为***适用性溶液，其中对照品至少包含米索前列醇对照品和8-表米索前列醇对照品；

4)色谱峰测定：将配制的供试品溶液、对照品溶液注入液相色谱仪，记录检测数据，并计算供试品溶液中米索前列醇的含量和有关物质含量，其中色谱条件为：用辛烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱，色谱柱内径为4.6mm，色谱柱柱长为150mm或250mm，色谱柱填料粒径为3～5μm，柱温为35～55℃，流速为1.0～2.0ml/min，以磷酸盐缓冲液-异丙醇为流动相，等度洗脱，样品盘控温2～10℃，进样量为50～250μl，检测波长为200～210nm，磷酸调节磷酸盐缓冲液pH值为2.5～3.5、其中磷酸盐缓冲液-异丙醇的体积比为(680～780)：(220～320)，磷酸盐为磷酸二氢钾或磷酸二氢钠。

优选地，其中所述磷酸盐缓冲液的浓度为0.01mol/L，pH值为2.9～3.1，磷酸盐为磷酸二氢钾。

优选地，所述色谱柱为Phenomenex Luna C8(2)，内径为4.6mm，柱长为150mm，填料粒径为5μm，柱温为40～50℃，流速为1.0～2.0ml/min，样品盘控温2～10℃，进样量为100～250μl，磷酸盐缓冲液-异丙醇的体积比为730:270，磷酸盐缓冲液的浓度为0.01mol/L，磷酸盐为磷酸二氢钾，pH值为2.9～3.1，检测波长为205nm。

优选地，流速为1.4～1.6ml/min。

优选地，进样量为100～200μl。

优选地，所述米索前列醇固体制剂为米索前列醇***片。

优选地，所述米索前列醇固体制剂的规格为25μg。

为了验证本发明技术方案的检测效果，采用本发明方案配制供试品溶液并用HPLC检测5μg～80μg米索前列醇固体制剂，结果显示，本发明所述方法能够同时有效分离和检测8-表米索前列醇、A-构型米索前列醇和B-构型米索前列醇，采用已公开的检测方法，无法配制出满足检测灵敏度要求的供试品溶液。

综上所述，本发明提供了一种适于低剂量米索前列醇固体制剂(规格为5μg～80μg)有关物质检测的HPLC法和检测所需供试品溶液的制备方法，本发明的方法能很好地分离米索前列醇已知杂质(8-表米索前列醇、A-构型米索前列醇和B-构型米索前列醇)，检测限均达到0.05％，定量限为0.1％，专属性强、灵敏度高、准确度良好。

附图说明

图1是实施例一中空白溶液的高效液相色谱图。

图2是实施例一中***适用性溶液的高效液相色谱图。

图3是实施例一中空白辅料溶液的高效液相色谱图。

图4是实施例一中供试品溶液的高效液相色谱图。

具体实施方式

为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例对本发明作进一步说明。

实施例一

1、采用仪器及色谱条件

仪器：高效液相色谱仪，岛津LC-20AT；柱温50℃；流速1.5ml/min；检测波长205nm；液相色谱柱用Waters XBridge C8，规格为4.6×150mm，5μm；0.01mol/L磷酸二氢钾溶液(pH3.0)-异丙醇为流动相组成，其最佳配比为(73:27)；进样量为100μl；样品盘控温5℃。

在该色谱条件下，米索前列醇主峰保留时间适中，峰形和柱效均较好。

2、溶液配制

(1)第二种溶媒：异丙醇-水(27:73)溶液。

(2)对照品溶液配制：取米索前列醇对照品适量，精密称定，加第二种溶媒溶解并定量稀释制成每1ml中含米索前列醇1.25μg的溶液，作为对照品溶液。

(3)灵敏度溶液配制：取精密量取对照品溶液适量，用第二种溶媒定量稀释制成每1ml中含米索前列醇0.125μg的溶液，作为灵敏度溶液。

(4)***适用性溶液配制：取米索前列醇对照品与8-表米索前列醇对照品，加第二种溶媒溶解并稀释制成每1ml中含米索前列醇125μg与8-表米索前列醇2.5μg的溶液，作为***适用性溶液。

(5)供试品溶液配制：取米索前列醇***片40片(规格：25μg)，精密称定，研细，精密称取适量，加第一种溶媒乙酸乙酯适量，振摇60min，制成每1ml含25μg的溶液，离心，精密量取上清液5ml，真空干燥后，残渣中精密加入第二种溶媒1ml使溶解，离心，取上清液，作为供试品溶液(含米索前列醇125μg/ml)。

(6)空白辅料溶液配制：取空白辅料片40片，照供试品溶液同法操作，作为空白辅料溶液。

3、操作步骤

分别取上述第二种溶媒(空白溶液)、灵敏度溶液、***适用性溶液、对照品溶液、空白辅料溶液、供试品溶液各100μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图。供试品溶液的色谱图中如有杂质峰，扣除空白辅料峰，按除以响应因子的主成分外标法计算杂质含量，均应符合表1中相应限度规定。

表1米索前列醇有关物质检测限度要求

4、实验结果

图1是实施例一中空白溶液的高效液相色谱图，图2是实施例一中***适用性溶液的高效液相色谱图，图3是实施例一中空白辅料溶液的高效液相色谱图，图4是实施例一中供试品溶液的高效液相色谱图，数据见表3：

实施例二

1、采用仪器及色谱条件：色谱柱用Phenomenex Luna C8(2)，其余同实施例一。

2、溶液配制

供试品溶液配制：取米索前列醇***片40片(规格：25μg)，精密称定，研细，精密称取适量，加第一种溶媒甲醇适量，超声30min，制成每1ml含25μg的溶液，离心，精密量取上清液5ml，用氮气吹干，残渣中精密加入第二种溶媒1ml使溶解，离心，取上清液，作为供试品溶液(含米索前列醇125μg/ml)。

空白辅料溶液配制：取空白辅料片40片，照供试品溶液同法操作，作为空白辅料溶液。

其余溶液配制同实施例一。

3、操作步骤：同实施例一。

4、灵敏度测定

取米索前列醇、8-表米索前列醇、B-构型米索前列醇、A-构型米索前列醇各适量，分别用第二种溶媒配制成浓度为0.1μg/ml的溶液和0.05μg/ml的溶液，分别注入液相色谱仪，各连续测定3次，其S/N分别大于10和大于3，按有关物质检查时浓度100μg/ml计算，其定量浓度为0.1％，检出浓度为0.05％。结果表明，该方法灵敏度高，可以充分满足有关物质检查测定的要求。

5、实验结果

平行测定三个批次供试品，结果见表2：

表2实施例二3批样品检测结果

实施例三

柱温40℃，流速1.0ml/min，第二种溶媒为流动相，其余同实施例一，实验结果见表3。

实施例四

色谱柱用Phenomenex Luna C8(2)，进样量为200μl。

供试品溶液配制：取米索前列醇***片40片(规格：10μg)，精密称定，研细，精密称取适量，加第一种溶媒甲醇适量，超声30min，制成每1ml含10μg的溶液，离心，精密量取上清液10ml，用氮气吹干，残渣中精密加入第二种溶媒1ml使溶解，离心，取上清液，作为供试品溶液(含米索前列醇100μg/ml)。

空白辅料溶液配制：取空白辅料片40片，照供试品溶液同法操作，作为空白辅料溶液。

其余同实施例一，实验结果见表3。

实施例5

色谱柱用Phenomenex Luna C8(2)。

供试品溶液配制：取米索前列醇片40片(规格：50μg)，精密称定，研细，精密称取适量，加第一种溶媒乙醇适量，振摇30min，制成每1ml含50μg的溶液，离心，精密量取上清液4ml，用氮气吹干，残渣中精密加入甲醇1ml使溶解，离心，取上清液，作为供试品溶液(含米索前列醇200μg/ml)。

空白辅料溶液配制：取空白辅料片40片，照供试品溶液同法操作，作为空白辅料溶液。

其余同实施例一，实验结果见表3。

表3实施例一、三～五的检测结果

上述实验结果显示，本发明方案能很好地分离米索前列醇的已知杂质(8-表米索前列醇、A-构型米索前列醇和B-构型米索前列醇)，检测限均达到0.05％，定量限为0.1％，专属性强、灵敏度高、准确度良好。

最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (1)

1.一种用于检测米索前列醇***片中有关物质的HPLC方法，其特征在于包括以下步骤：

供试品溶液配制；

对照品溶液配制：取米索前列醇对照品适量，精密称定，加第二种溶媒溶解并定量稀释制成对照品溶液，所述对照品溶液浓度为供试品溶液浓度的1％；

***适用性溶液配制：取对照品加第二种溶媒溶解并稀释作为***适用性溶液，其中对照品至少包含米索前列醇对照品和8-表米索前列醇对照品；

色谱峰测定：将配制的供试品溶液、对照品溶液注入液相色谱仪，记录检测数据，并计算供试品溶液中米索前列醇的含量和有关物质含量，其中色谱条件为：色谱柱为Phenomenex Luna C8(2)，色谱柱内径为4.6mm，色谱柱柱长为150mm，色谱柱填料粒径为5μm，柱温为40～50℃，流速为1.4～1.6ml/min，以磷酸盐缓冲液-异丙醇为流动相，等度洗脱，样品盘控温2～10℃，进样量为100～200μl，检测波长为205nm，磷酸调节磷酸盐缓冲液pH值为2.9～3.1、其中磷酸盐缓冲液的浓度为0.01mol/L，磷酸盐缓冲液-异丙醇的体积比为730：270，磷酸盐为磷酸二氢钾；

其中所述供试品溶液配制包括以下步骤：

称量：称取米索前列醇***片适量作为供试品；

提取：用第一种溶媒溶解供试品，得米索前列醇提取液，所述提取的方式为超声，提取时间为15～40min，所述提取液浓度为10～50μg/ml，其中所述第一种溶媒为甲醇；

浓缩干燥：取适量提取液浓缩干燥后得供试品提取物；所述浓缩干燥的方式为氮气吹干；

溶解：用第二种溶媒溶解供试品提取物，制成浓度为100～150μg/ml的供试品溶液，其中所述第二种溶媒为异丙醇-水溶液；

其中所述米索前列醇***片的规格为25μg。

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