CN115015353A - 用于肿瘤组织细胞外基质电化学发光成像的试剂盒、成像方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本申请提供一种用于肿瘤组织细胞外基质电化学发光成像的试剂盒，其特征在于，包括：组织固定剂、SA@Ru标记物和共反应剂；其中，所述组织固定剂为多聚甲醛；所述SA@Ru标记物，由双(2,2′‑联吡啶)‑4′‑甲基‑4‑羧基吡啶‑钌‑N‑琥珀酰亚胺酯‑双(六氟磷酸盐)、链霉亲和素和PBS混合后得到；所述共反应剂为三丙胺。本申请建立了一种通过ECL近场成像对组织切片进行电化学可视化的试剂盒和成像与应用，提供了一项能获得高信噪比的近场信息、快速(几分钟)且易用的成像技术。这种技术有助于揭示切片表面的信息，特别是ECM这种在传统成像中被长期掩盖的组织支撑物。
Description
技术领域
本申请涉及电化学发光领域，具体涉及一种用于肿瘤组织细胞外基质电化学发光成像的试剂盒、成像方法及其应用。
背景技术
电化学发光(electrochemiluminescence,ECL)是一种由电化学反应触发的光子发射。ECL结合了电化学激发和光学信号读出，因此它不需要任何光学激发，从而能提供极高的信号读取灵敏度。此外，由于反应中发光体的半衰期和共反应物的自由扩散距离均有限，发光物质的激发态往往在电极表面(小于4μm)产生，这种特性使最终的ECL光信号仅出现在距离电极表面几微米的范围内。这种新兴的成像技术已被应用于多种物体的近场成像，包括但不限于指纹、单微珠、单细胞、细胞膜蛋白和线粒体等。在最近的一些研究中，这项技术还展现了它能够像荧光成像技术那样实现超分辨率细胞成像的潜力。不过目前大多数ECL成像的目标集中在单个对象或简化的反应模型上，迄今为止ECL成像技术在复杂生物体系(例如组织切片)中的表现尚未被报道。因此实现组织切片的ECL可视化可能会帮助揭示其他经典的光学成像技术难以观察到的组织切片支撑面的信息。
几十年来，组织切片的成像和相应的组织学分析已经成为了肿瘤研究的重要参考。其中组织切片的体外分析已经发展成一个在临床实践中得到高度认可和依赖的领域。组织解剖和显微镜观察相结合的技术在临床诊断和基础医学研究中也发挥着不可或缺的作用。
目前苏木精和伊红(hematoxylin and eosin,H&E)染色是病理分析的主流方法，这种方法的依据是苏木精可以将嗜碱性结构染成蓝紫色，而伊红可以将嗜酸性结构染成品红色。但是由于染色有人工误差，组织质量也并不稳定，H&E染色并不总是能提供稳定的对比度来区分各种组织特性、细胞结构或是化学物质的分布。
在生物学，细胞外间质或细胞外基质(Extracellular matrix,ECM)是动物组织的一部分，不属于任何细胞。细胞外间质决定***的特性。ECM由BM和细胞间质组成，为肿瘤转移的重要组织屏障。肿瘤细胞通过其表面受体与ECM中的各种成分粘附后激活或分泌蛋白降解酶类来降解基质，从而形成局部溶解区，构成了肿瘤细胞转移运行通道。因此对于ECM的检测对于肿瘤的研究和与免疫组学结合更好的攻克和治疗也存在十分重要的作用。
近年来免疫荧光技术因其能对目标分子进行特异性标记和高分辨率成像而受到研究者们的青睐。但同时该技术也面临着一些问题，比如冗长的标记程序和光漂白以及自发荧光等荧光自身性质的限制。因此长久以来，人们一直期望在组织切片成像领域出现一种兼顾低背景、高灵敏和稳定成像的方法。
发明内容
技术问题
为解决上述技术问题，本申请旨在提供一种兼顾低背景、高灵敏和稳定成像的试剂盒、检测方法及应用。
技术方案
本申请提供一种用于肿瘤组织细胞外基质电化学发光成像的试剂盒，包括：
组织固定剂、SA@Ru标记物和共反应剂；其中，
所述组织固定剂为多聚甲醛；
所述SA@Ru标记物，由双(2,2′-联吡啶)-4′-甲基-4-羧基吡啶-钌-N-琥珀酰亚胺酯-双(六氟磷酸盐)、链霉亲和素和磷酸盐缓冲溶液混合后得到；
所述共反应剂为三丙胺(TPA)。
在一实施例中，所述双(2,2′-联吡啶)-4′-甲基-4-羧基吡啶-钌-N-琥珀酰亚胺酯-双(六氟磷酸盐)的浓度为0.5-5mg/mL，用量为100-500μL；
所述链霉亲和素浓度为0.5-5mg/mL，用量为100-500μL；
所述磷酸盐缓冲溶液的用量为600-1200μL。
在一实施例中，所述磷酸盐缓冲溶液由0.1M磷酸二氢钠一水合物(NaH2PO4·H2O)和0.1M磷酸氢二钠七水合物(Na2HPO4·7H2O)混合得到。
在一实施例中，所述三丙胺浓度为0.1M，pH值为7.4。
本申请还提供了一种使用所述的用于肿瘤组织细胞外基质电化学发光成像的试剂盒的成像方法，包括如下步骤：
步骤一：准备待检测的肿瘤组织冰冻切片，用磷酸盐缓冲溶液清洗，以洗脱冰冻切片表面的包埋剂(OCT)；
步骤二：用4％的多聚甲醛(PFA)溶液，浸泡清洗后的肿瘤组织切片5-20分钟，以固定所述肿瘤组织切片；
步骤三：在室温下，用所述SA@Ru标记物孵育所述肿瘤组织切片10-40分钟，用磷酸盐缓冲溶液清洗后，转移至玻碳电极表面；
步骤四：用0.1M三丙胺溶液浸泡肿瘤组织切片，以提供电化学发光过程的共反应剂；
步骤五：通过Ag/AgCl/KCl 3M电极施加1.4-1.8V的恒电位激发肿瘤组织电化学发光，通过电子倍增电荷耦合器件(EMCCD)记录得到的所述肿瘤组织细胞外基质电化学发光成像。
在一实施例中，所述SA@Ru标记物由溶解在DMSO的双(2,2′-联吡啶)-4′-甲基-4-羧基吡啶-钌-N-琥珀酰亚胺酯-双(六氟磷酸盐)[Ru(bpy)2(mcbpy-O-Su-ester)(PF6)2]、溶解在PBS里的链霉亲和素和PBS混合制得混合物；所述混合物在4℃涡旋混合2-6小时，在4℃透析4-10小时；得到SA@Ru标记物的溶液含有0.5-5mg/mL SA@Ru标记物。
在一实施例中，所述步骤五中的所述电化学发光成像通过具有三电极配置的聚四氟乙烯装置实施，其中，
玻碳电极作为工作电极，铂丝用作对电极，Ag/AgCl/KCl 3M电极用作参比电极，所述电化学发光由CHI 600E电化学分析仪激发，电化学发光图像通过落射荧光显微镜和电子倍增电荷耦合器件相机记录；扫描电子显微镜图像通过JEOL的JSM-7800F记录；循环伏安结果和ECL信号通过MPI-A ECL分析仪收集。
在一实施例中，还包括通透化处理，所述通透化处理为将所述肿瘤组织切片在用所述SA@Ru标记物孵育前使用0.5％的Triton X-100处理5-20分钟。
在一实施例中，步骤五中所述肿瘤组织细胞外基质电化学发光成像经过伪彩处理，在FIJI软件进行调整亮度/对比度、提取光强度分布曲线以及转换为3D版本的处理。
本申请还提供一种所述的用于肿瘤组织细胞外基质电化学发光成像的试剂盒在检测肿瘤组织中ECM的应用。
有益效果
本申请通过近场ECL成像技术实现了组织切片的可视化并发掘到了切片的表面信息。提供一种在组织切片成像领域兼顾低背景、高灵敏和稳定成像的方法。与光致发光(photoluminescence,PL)得到的图像相比，ECL图像提供了来自切片截面底部的结构信息，并且呈现出更好的信噪比。更重要的是，ECL的近场成像特性使这项技术在观察肿瘤的细胞外基质(extra-cellular matrix,ECM)时展现了优势，这些结果能为肿瘤进展相关研究提供必要的信息。
本申请提供的试剂盒，检测方法，利用来自组织切片本身的内源性生物素足以结合SA@Ru。基于此结果，在后续实验中可以省去了生物素化步骤以提高时间效率。极大程度的提供检测效率和成像效果，对于精准的呈现肿瘤组织成像，并未实现大规模，快速以及高通量检测提供可能。
在本申请的成像中，引入了额外的通透化处理使这些膜转换为高渗透状态。处理本身并不会影响后续SA@Ru的标记效率，与此同时ECL显示了更好的信噪比。
本申请建立了一种通过ECL近场成像对组织切片进行电化学可视化的试剂盒和成像与应用，提供了一项能获得高信噪比的近场信息、快速(几分钟)且易用的成像技术。这种技术有助于揭示切片表面的信息，特别是ECM这种在传统成像中被长期掩盖的组织支撑物。由于肿瘤进展时的ECM信息有助于预测治疗反应，避免对组织样品结构的误判。该技术不仅有利于肿瘤发生发展的基础研究，而且有望在未来与免疫组化技术相结合实现多路复用和高通量分析。
附图说明
图1示出(a)ECL组织切片成像装置示意图；(b)ECL组织切片成像时ECL信号的生成机制；
图2示出贴附在工作电极上的冰冻切片的明场(BF)和光致发光(PL)信号的合并图像；
图3示出用于ECL成像的冷冻切片的H&E染色情况(a)同时具有正常肝脏结构和肿瘤浸润区域的组织切片的H&E染色图；(b)胰腺癌肝转移模型小鼠的肝脏；(c)图(a)中截取的三个感兴趣区域(ROI)的放大图像，分别指示肿瘤(ROI 1)、早期转移灶(ROI 2)和正常肝组织(ROI 3)；
图4示出在标记SA@Ru之前(a)有和(b)没有经过生物素处理的组织切片的PL(绿色)、ECL(红色)以及两种光信号的合并图像；
图5示出组织切片的PL(a)、BF(b)和ECL(c)图像。；(d)PL(绿色)和ECL(红色)的信号叠加图像以及一个感兴趣的选区(region of interest,ROI)；ROI内的两种光强度值进行了0-1的归一化(e)与计算信噪比(f)两种处理；
图6示出伏安图与ECL表征；
图7示出通透化处理后组织切片的PL(a)、BF(b)和ECL(c)图像(d)PL(绿色)和ECL(红色)的信号叠加图像以及一个ROI，ROI内的两种光强度值进行了0-1的归一化(e)与计算信噪比(f)两种处理；
图8组织切片中导管结构的PL(a)和ECL(b)图像。(c)PL(绿色)和ECL(红色)信号的叠加图像。(d)管腔结构PL与ECL信号的3D分布图；
图9切片上不同恶性程度的区域的BF图像、PL图像、ECL图像、PL和ECL的叠加图像以及来自相同视角的相邻切片的H&E染色图像。其中(a)肿瘤中心，(b-c)肿瘤边缘，(d)早期肿瘤转移灶，(e)正常肝组织。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐明本发明，应理解这些实施例，仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，在阅读本发明之后，本领域技术人员对本发明的各种等价形式的修改均落于本申请所附权利要求所限定的范围。
试剂
三丙胺(TPA)、磷酸盐缓冲溶液(PBS 1X,pH 7.4)、链霉亲和素、双(2,2′-联吡啶)-4′-甲基-4-羧基吡啶-钌-N-琥珀酰亚胺酯-双(六氟磷酸盐)([Ru(bpy)2(mcbpy-O-Su-ester)(PF6)2])、多聚甲醛(PFA)和曲通(Triton X-100)来自Sigma-Aldrich，无需任何进一步纯化即可使用。生物素(biotin X)来自Fisher Scientific。二甲基亚砜(DMSO)来自Invitrogen。
0.1M(pH 7.4)磷酸盐缓冲溶液(PBS)由0.1M磷酸二氢钠一水合物(NaH2PO4·H2O)和0.1M磷酸氢二钠七水合物(Na2HPO4·7H2O)混合得到，这些试剂均来自Sangon Biotech并按原样使用。
SA@Ru标记物由100μL溶解在DMSO的[Ru(bpy)2(mcbpy-O-Su-ester)(PF6)2](10mg/mL)、100μL溶解在PBS里的链霉亲和素(1mg/mL)和800μL PBS合成。该混合物在4℃涡旋混合2-6小时，然后在4℃透析4-10小时。最终使用的溶液含有0.5-5mg/mL SA@Ru标记物。
组织切片的制备
胰腺癌肝转移模型小鼠的冰冻切片及其邻近H&E染色切片由浙江大学医学院附属第二医院普外科提供。浙江大学附属第二医院动物伦理委员会批准了该研究(证书编号：2020-30)。对于常规处理的切片，组织切片用PBS清洗，用4％的PFA固定5-20分钟，并在室温下用SA@Ru标记物孵育10-40分钟。
仪器设备
电化学反应池是自制的具有三电极配置的聚四氟乙烯(PTFE)装置，其中工作电极是玻碳电极。铂丝用作对电极，Ag/AgCl/KCl 3M电极用作参比电极。ECL由CHI 600E电化学分析仪激发。施加在工作电极的电位为1.4-1.8V vs Ag/AgCl/KCl 3M。光致发光(PL)图像与电化学发光(ECL)图像通过落射荧光显微镜(Nikon Eclipse Ti2)和电子倍增电荷耦合器件相机(Photometrics,Evolve 512 Delta)记录。扫描电子显微镜(SEM)图像通过JEOL的JSM-7800F记录。循环伏安结果和ECL信号通过MPI-A ECL分析仪(瑞迈，西安)收集。
所有图像都经过了伪彩处理，在FIJI(ImageJ,NIH)软件进行调整亮度/对比度、提取光强度分布曲线以及转换为3D版本的处理。
实施例1
在胰腺癌肝转移模型小鼠的肝脏冰冻切片上标记SA@Ru标记物，即链霉亲和素(streptavidin,SA)与三联吡啶钌(tris(2,2’-bipyridyl)dichlororuthenium II,[Ru(bpy)3]2+)的复合物(下文标注为SA@Ru)，并将标记后的切片转移到玻碳电极(glassycarbon electrode,GCE)表面以激发ECL信号(参见图1中a))。用SA@Ru标记的组织切片贴附在玻碳电极上，通过对该电极施加恒定的电位来产生ECL信号。同时，溶液中的三丙胺(tri-n-propylamine,TPA)作为共反应物参与ECL信号的生成(参见图1中b))。
其具体ECL“revisited-route”反应机理，参见下列反应式，
SA@[Ru(bpy)3]2+*→SA@[Ru(bpy)3]2++hvECL (5)
在该反应机理中，TPA作为共反应物直接在电极表面被氧化，产生阳离子基TPA·+和中性离子基TPA·。这两种自由基在溶液中扩散并与固定在切片上的SA@Ru发生反应，生成[Ru(bpy)3]2+的激发态，最后放射光子并产生ECL信号。
我们选择GCE作为工作电极，因为它能高效且可重复地通过异质性反应通路(即“revisited-route”)产生ECL信号。在该反应机理中，TPA作为共反应物直接在电极表面被氧化，产生阳离子基TPA·+和中性离子基TPA·。这两种自由基在溶液中扩散并与固定在切片上的SA@Ru发生反应，生成[Ru(bpy)3]2+的激发态，最后放射光子并产生ECL信号。
在本申请的实例中，通过近场ECL成像技术实现了组织切片的可视化并发掘到了切片的表面信息。
实施例2
实验中使用的切片来源于胰腺癌肝转移模型小鼠的肝组织(厚度约8微米，图2)。展示了贴附在工作电极上的冰冻切片的明场(BF)和光致发光(PL)信号的合并图像，用以确认切片的厚度。从合并的侧视图图像中可以观察到该冷冻切片厚度约为8微米。同一块切片上同时存在正常肝组织和浸润性的肿瘤组织(图3)。图3中a)同时具有正常肝脏结构和肿瘤浸润区域的组织切片的H&E染色图。图3中b)胰腺癌肝转移模型小鼠的肝脏。图3中c)为图3中a)中截取的三个感兴趣区域(ROI)的放大图像，分别指示肿瘤(ROI 1)、早期转移灶(ROI2)和正常肝组织(ROI 3)。现有一些研究通过用链霉亲和素修饰[Ru(bpy)3]2+成功将ECL的发光体标记在了生物素化的细胞膜上。因此，在这项工作中我们首先将组织切片用多聚甲醛(paraformaldehyde，PFA)固定，然后用生物素(biotin-X)处理使切片表面生物素化，最后用SA@Ru标记并进行ECL成像。由于生物素是肝脏细胞的必需酶辅因子，我们也测试了不进行生物素化处理，直接用SA@Ru修饰切片时的ECL成像。实际上这两种方法都成功标记了[Ru(bpy)3]2+，并且在成像结果上没有明显的差异(图4)。在标记SA@Ru之前图4中a)有和图4中b)没有经过生物素处理的组织切片的PL(绿色)、ECL(红色)以及两种光信号的合并图像。ECL通过在含有100mM TPA(pH 7.4)的PBS溶液中对工作电极施加1.7V的阳极电位得到。比例尺：300μm。也就是说来自组织切片本身的内源性生物素足以结合SA@Ru。基于此结果，在后续实验中我们省去了生物素化步骤以提高时间效率。
实施例3
由于[Ru(bpy)3]2+的PL光信号能反映其空间分布，所以在本实施例中，首先在荧光模式下观察标记后的切片。如图5中a)所示，图中箭头表示提取光强度值的方向。ECL通过在含有100mM TPA(pH 7.4)的PBS溶液中对工作电极施加1.7V的阳极电位得到。比例尺：300μm。整块切片上都出现了PL光信号，这证明SA@Ru标记成功。其中正常肝组织(粉红色箭头)和血栓区域(蓝色箭头)显示出了较强的PL信号，而肿瘤浸润区域(黄色箭头)的信号相对较弱。这种差异可归因于两点。首先，由于腺癌自身的结构特性，肿瘤组织往往比较松散。这个特点也可以从明场(bright field,BF)图像中观察到(图5中b))，癌区的细胞无序生长并形成许多空腔，导致这些区域的SA@Ru量减少。其次，内源性生物素在肝脏细胞中高表达，这为SA@Ru的结合提供了更多机会，因此正常肝脏区域表现出较强的PL信号。
随后，相同视野下的切片被施加电刺激以激发ECL。经测量，ECL光强度在1.7V(vs.Ag/AgCl/KCl 3M，本研究的所有电位测量都来自这种参比电极)电位处达到峰值参见图6。图5中c)展示了在施加1.7V的阳极电位时拍摄的组织切片ECL图像，ECL信号在整个切片截面展现了与PL信号相似的多样性。但是相比于荧光成像捕获的是目标切片的光激发信号，ECL成像更关注靠近电极表面的切片基底侧信息。这些信息长期以来一直在传统荧光显微成像中被忽视，而ECL成像技术则有助于揭示近场信息，以避免对样品性质的误判。例如，图5中a)中的白框区域在PL模式下观察到的似乎是一块正常的肝组织，但ECL图像提示这块区域的基底面存在一些带有管腔的松散结构(图5中c))。这意味着该区域实际上已经被肿瘤侵入，但在PL视角下这种重要信息是缺失的。
值得注意的是，ECL信号在肿瘤区域较强，在正常肝脏区域受到抑制，而在血栓处几乎不可见，这与PL观察到的现象有显著差异。从图5中d的叠加图像可以看出，绿色(PL)主导了血栓区，而红色(ECL)占据了肿瘤区。当对这两种光信号进行归一化处理时，我们所选的感兴趣区域(region of interest,ROI)的光强度曲线也进一步说明了这两种信号的强度在切片上同一位点呈现相反趋势(图5中e))。例如左侧蓝色方框选中的曲线(对应于图5中d)上侧青色框中的肿瘤浸润区域)展现出了较高的ECL信号和较低的PL信号。而右侧蓝色方框选中的区域(对应图5中d)下侧的青色方框)则表现出较高的PL信号和几乎为零的ECL信号，这个现象与血栓的高组织密度性有关。此外，当两种光信号都被除以背景值时，ECL呈现出了比PL更好的信噪比(图5中f))。
实施例4
对于额外通透化处理的切片，组织切片在SA@Ru标记前先用0.5％的Triton X-100处理20分钟。最后SA@Ru标记的组织切片在用PBS彻底清洗后转移到玻碳电极表面等待下一步处理。
为了进一步阐明组织ECL成像的过程，我们引入了额外的通透化处理。在SA@Ru标记步骤之前，切片由0.5％Triton X-100处理20分钟。这种处理通常在免疫组化或免疫荧光中被用于去除和透化切片上的各种生物膜，使这些膜转换为高渗透状态。从PL与BF图像可以观察到，通透化处理后的组织切片结构保持完整(图7中a)、7中b))。细胞排列规则的肝组织(粉红色箭头)具有较高的PL信号，而细胞排列无序、结构稀疏的肿瘤浸润区域(黄色箭头)呈现较低的PL光强度。门静脉区域(蓝色箭头，该区域包括门静脉、肝动脉和胆管的分支)由于内部含有大量***，也显示出较低的PL光强度。这项结果表明，Triton X-100处理本身并不会影响后续SA@Ru的标记效率。图中箭头表示提取光强度值的方向。ECL通过在含有100mM TPA(pH 7.4)的PBS溶液中对工作电极施加1.7V的阳极电位得到。比例尺：300μm。
通透化处理后的ECL信号分布呈现了与PL信号分布极高的相似性。肿瘤浸润区(黄色箭头)的ECL强度弱于肝组织(粉红色箭头)(图7中c))，这意味着在组织透化后，溶液中TPA分子在GCE表面的氧化过程不再受到高密度组织的物理阻挡。因此电生的TPA自由基可以从电极表面扩散并与整块切片基底面上的[Ru(bpy)3]2+标记反应。排除了TPA扩散效率的干扰后，切片ECL信号的变化仅由SA@Ru引起，因此PL和ECL信号的分布具有高度相似性。图7中d)中绿色(PL)和红色(ECL)很好地融合在一起，使整个图像呈现金黄色。PL与ECL信号的叠加图像中提取的信号强度分布图(图7中e))也证明了ECL信号在总体趋势上与PL信号高度一致。与此同时ECL显示了更好的信噪比(图7中f))。
实施例5
ECL近场成像技术提供了一种观察复杂生物体系中薄层物质的方法，这是传统荧光显微镜无法做到的。当合并组织切片中ECM的PL和ECL信号时(参见(图8中a)，8中b))，我们能够全面观察ECM的位置与形态，甚至可以清晰地看到其中的孔隙分布(图8中c)，8中d))。ECL通过在含有100mM TPA(pH 7.4)的PBS溶液中对工作电极施加1.7V的阳极电位得到。比例尺：50μm。众所周知这种大面积分泌的ECM仅出现在组织切片的肿瘤浸润区域。许多实体瘤中观察到的大量ECM胶原累积与癌症的预后和癌细胞对全身治疗的抵抗密切相关。在这里，ECL成像不需要像免疫荧光那样进行长时间的样品预处理，也不需要担心在H&E染色中发生的ECM丢失。因此，ECL成像在对ECM的观察上有很大优势。
在恶性肿瘤的进展过程中，ECM的沉积与组分改变会影响基质密度，引起基质分布和孔隙率的变化。ECM局部组分变化，特别是水化作用，将不可避免地影响SA@Ru在切片上的分布和TPA分子的局部动力学行为。为了进一步发掘ECL成像的潜力，我们对组织切片上恶性癌变程度不同的区域进行了成像。在肿瘤核心区域，ECL信号提示典型的腺癌导管结构内有丰富的ECM(图9中a)，白色箭头)。ECL通过在含有100mM TPA(pH 7.4)的PBS溶液中对工作电极施加1.7V的阳极电位得到。比例尺：100μm。ECL信号强度在导管内外并不均匀，这可能意味着ECM的形态和成分存在局部差异。在侵袭性肿瘤的边缘区域，高ECL信号仅在肿瘤侧有稀疏分布(图9中b)、9中c)，白色箭头)，这表明ECM分泌与肿瘤侵袭程度存在一定相关性。
然而这种相关性在早期肿瘤转移灶中变得相对复杂。图9中d)显示破坏了基底膜的恶性细胞表现出高ECL发射(黄色箭头)。这一结果可能暗示了这些癌细胞具有高度分泌ECM的倾向，但它们尚处于发育的早期阶段，还未在管腔内大量形成ECM。作为对照，没有受到肿瘤侵袭的正常小鼠肝组织具有均匀的ECL信号分布(图9中e))。图中肝组织虽然有类似管腔的结构但实际上是一个肝静脉。在肿瘤微环境中，ECM可以直接影响基质细胞的行为造成促癌转化，如血管生成和炎症发生，从而导致促癌微环境的形成。对于传统组织成像，由于ECM信号较微弱并且在漫长的样品制备过程中易丢失，这些微小但十分关键的微环境变化总是无法察觉。ECM的组成、某个区域的ECM具体含量以及分泌来源也仍不清楚，这些都为ECL成像提供了机会。
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的原理的前提下，还可以作数若干改进和润饰，这些改进和润饰也应当视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种用于肿瘤组织细胞外基质电化学发光成像的试剂盒，其特征在于，包括：
组织固定剂、SA@Ru标记物和共反应剂；其中，
所述组织固定剂为多聚甲醛；
所述SA@Ru标记物，由双(2,2′-联吡啶)-4′-甲基-4-羧基吡啶-钌-N-琥珀酰亚胺酯-双(六氟磷酸盐)、链霉亲和素和磷酸盐缓冲溶液混合后得到；
所述共反应剂为三丙胺。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述双(2,2′-联吡啶)-4′-甲基-4-羧基吡啶-钌-N-琥珀酰亚胺酯-双(六氟磷酸盐)的浓度为0.5-5mg/mL，用量为100-500μL；
所述链霉亲和素浓度为0.5-5mg/mL，用量为100-500μL；
所述磷酸盐缓冲溶液的用量为600-1200μL。
3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述磷酸盐缓冲溶液由0.1M磷酸二氢钠一水合物和0.1M磷酸氢二钠七水合物混合得到。
4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述三丙胺浓度为0.1M，pH值为7.4。
5.一种使用权利要求1所述的用于肿瘤组织细胞外基质电化学发光成像的试剂盒的成像方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤一：准备待检测的肿瘤组织冰冻切片，用磷酸盐缓冲溶液清洗，以洗脱冰冻切片表面的包埋剂OCT；
步骤二：用4％的多聚甲醛溶液，浸泡清洗后的肿瘤组织切片5-20分钟，以固定所述肿瘤组织切片；
步骤三：在室温下，用所述SA@Ru标记物孵育所述肿瘤组织切片10-40分钟，用磷酸盐缓冲溶液清洗后，转移至玻碳电极表面；
步骤四：用0.1M三丙胺溶液浸泡肿瘤组织切片，以提供电化学发光过程的共反应剂；
步骤五：通过Ag/AgCl/KCl 3M电极施加1.4-1.8V的恒电位激发肿瘤组织电化学发光，通过电子倍增电荷耦合器件记录得到的所述肿瘤组织细胞外基质电化学发光成像。
6.根据权利要求5所述的成像方法，其特征在于，所述SA@Ru标记物由溶解在DMSO的双(2,2′-联吡啶)-4′-甲基-4-羧基吡啶-钌-N-琥珀酰亚胺酯-双(六氟磷酸盐)、溶解在磷酸盐缓冲溶液里的链霉亲和素和磷酸盐缓冲溶液混合制得混合物；所述混合物在4℃涡旋混合2-6小时，在4℃透析4-10小时；得到SA@Ru标记物的溶液，所述SA@Ru标记物的溶液含有0.5-5mg/mL SA@Ru标记物。
7.根据权利要求5所述的成像方法，其特征在于，所述步骤五中的所述电化学发光成像通过具有三电极配置的聚四氟乙烯装置实施，其中，
玻碳电极作为工作电极，铂丝用作对电极，Ag/AgCl/KCl 3M电极用作参比电极，所述电化学发光由CHI 600E电化学分析仪激发，电化学发光图像通过落射荧光显微镜和电子倍增电荷耦合器件相机记录；扫描电子显微镜图像通过JEOL的JSM-7800F记录；循环伏安结果和ECL信号通过MPI-A ECL分析仪收集。
8.根据权利要求5所述的成像方法，其特征在于，还包括通透化处理，所述通透化处理为将所述肿瘤组织切片在用所述SA@Ru标记物孵育前使用0.5％的Triton X-100处理5-20分钟。
9.根据权利要求6所述的成像方法，其特征在于，步骤五中所述肿瘤组织细胞外基质电化学发光成像经过伪彩处理，在FIJI软件进行调整亮度/对比度、提取光强度分布曲线以及转换为3D版本的处理。
10.权利要求1所述的用于肿瘤组织细胞外基质电化学发光成像的试剂盒在检测肿瘤组织中ECM的应用。
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202210625592.0A Pending CN115015353A (zh) | 2022-06-02 | 2022-06-02 | 用于肿瘤组织细胞外基质电化学发光成像的试剂盒、成像方法及其应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN115015353A (zh) |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN111007259A (zh) * | 2019-12-23 | 2020-04-14 | 江苏三联生物工程有限公司 | 一种用于检测乙酰胆碱受体抗体（AchR-Ab）的电化学发光试剂盒的制备 |
| CN111393524A (zh) * | 2020-02-20 | 2020-07-10 | 北京化工大学 | 基于金属标记的阿尔兹海默症脑组织Aβ蛋白的原位检测方法 |
| CN114152604A (zh) * | 2020-09-07 | 2022-03-08 | 南京大学 | 一种用于细胞成像的无试剂电致化学发光检测方法 |
-
2022
- 2022-06-02 CN CN202210625592.0A patent/CN115015353A/zh active Pending
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN111007259A (zh) * | 2019-12-23 | 2020-04-14 | 江苏三联生物工程有限公司 | 一种用于检测乙酰胆碱受体抗体（AchR-Ab）的电化学发光试剂盒的制备 |
| CN111393524A (zh) * | 2020-02-20 | 2020-07-10 | 北京化工大学 | 基于金属标记的阿尔兹海默症脑组织Aβ蛋白的原位检测方法 |
| CN114152604A (zh) * | 2020-09-07 | 2022-03-08 | 南京大学 | 一种用于细胞成像的无试剂电致化学发光检测方法 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| SILVIA VOCI 等: "Surface-Confined Electrochemiluminescence Microscopy of Cell Membranes", 《JOURNAL OF THE AMERICAN CHEMICAL SOCIETY》 * |
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