CN116626123A - 单个细胞胞内纳米ph探针 - Google Patents

单个细胞胞内纳米ph探针 Download PDF

Info

Publication number
CN116626123A
CN116626123A CN202310453241.0A CN202310453241A CN116626123A CN 116626123 A CN116626123 A CN 116626123A CN 202310453241 A CN202310453241 A CN 202310453241A CN 116626123 A CN116626123 A CN 116626123A
Authority
CN
China
Prior art keywords
nanopipette
chitosan
cell
cells
intracellular
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202310453241.0A
Other languages
English (en)
Inventor
R·E·奥泽尔
N·普尔曼德
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
University of California
Original Assignee
University of California
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by University of California filed Critical University of California
Publication of CN116626123A publication Critical patent/CN116626123A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
    • G01N27/26—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating electrochemical variables; by using electrolysis or electrophoresis
    • G01N27/416—Systems
    • G01N27/4166—Systems measuring a particular property of an electrolyte
    • G01N27/4167—Systems measuring a particular property of an electrolyte pH
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
    • G01N27/26—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating electrochemical variables; by using electrolysis or electrophoresis
    • G01N27/28—Electrolytic cell components
    • G01N27/30—Electrodes, e.g. test electrodes; Half-cells
    • G01N27/302—Electrodes, e.g. test electrodes; Half-cells pH sensitive, e.g. quinhydron, antimony or hydrogen electrodes
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B82—NANOTECHNOLOGY
    • B82Y—SPECIFIC USES OR APPLICATIONS OF NANOSTRUCTURES; MEASUREMENT OR ANALYSIS OF NANOSTRUCTURES; MANUFACTURE OR TREATMENT OF NANOSTRUCTURES
    • B82Y40/00—Manufacture or treatment of nanostructures
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0625—Epidermal cells, skin cells; Cells of the oral mucosa
    • C12N5/0631—Mammary cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
    • C12N5/0656—Adult fibroblasts
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0681—Cells of the genital tract; Non-germinal cells from gonads
    • C12N5/0682—Cells of the female genital tract, e.g. endometrium; Non-germinal cells from ovaries, e.g. ovarian follicle cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0693—Tumour cells; Cancer cells
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/75—Systems in which material is subjected to a chemical reaction, the progress or the result of the reaction being investigated
    • G01N21/77—Systems in which material is subjected to a chemical reaction, the progress or the result of the reaction being investigated by observing the effect on a chemical indicator
    • G01N21/78—Systems in which material is subjected to a chemical reaction, the progress or the result of the reaction being investigated by observing the effect on a chemical indicator producing a change of colour
    • G01N21/80—Indicating pH value
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
    • G01N27/26—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating electrochemical variables; by using electrolysis or electrophoresis
    • G01N27/28—Electrolytic cell components
    • G01N27/30—Electrodes, e.g. test electrodes; Half-cells
    • G01N27/327—Biochemical electrodes, e.g. electrical or mechanical details for in vitro measurements
    • G01N27/3275—Sensing specific biomolecules, e.g. nucleic acid strands, based on an electrode surface reaction
    • G01N27/3277—Sensing specific biomolecules, e.g. nucleic acid strands, based on an electrode surface reaction being a redox reaction, e.g. detection by cyclic voltammetry
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
    • G01N27/26—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating electrochemical variables; by using electrolysis or electrophoresis
    • G01N27/28—Electrolytic cell components
    • G01N27/30—Electrodes, e.g. test electrodes; Half-cells
    • G01N27/327—Biochemical electrodes, e.g. electrical or mechanical details for in vitro measurements
    • G01N27/3275—Sensing specific biomolecules, e.g. nucleic acid strands, based on an electrode surface reaction
    • G01N27/3278—Sensing specific biomolecules, e.g. nucleic acid strands, based on an electrode surface reaction involving nanosized elements, e.g. nanogaps or nanoparticles
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
    • G01N27/26—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating electrochemical variables; by using electrolysis or electrophoresis
    • G01N27/416—Systems
    • G01N27/49—Systems involving the determination of the current at a single specific value, or small range of values, of applied voltage for producing selective measurement of one or more particular ionic species
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/483—Physical analysis of biological material
    • G01N33/487—Physical analysis of biological material of liquid biological material
    • G01N33/48707—Physical analysis of biological material of liquid biological material by electrical means
    • G01N33/48728—Investigating individual cells, e.g. by patch clamp, voltage clamp

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Electrochemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Nanotechnology (AREA)
  • Spectroscopy & Molecular Physics (AREA)
  • Plasma & Fusion (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Condensed Matter Physics & Semiconductors (AREA)
  • Manufacturing & Machinery (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)

Abstract

公开了一种用于感测单个活细胞中的pH的方法和装置。所述装置被构造成引导纳米尺寸的探针刺穿单个细胞，并且实时由其提取精确的pH测量值。通过将生物相容性pH响应性聚合物脱乙酰壳多糖物理吸附到极小孔径(‑97nm)的高度羟基化石英纳米移液管上来制备包含电极的纳米移液管。pH变化改变脱乙酰壳多糖的表面电荷，所述表面电荷可测量为纳米孔处离子电流的变化。所述纳米pH探针的动态pH范围为2.6至10.7，灵敏度为0.09个pH单位。本发明的装置可用于使用例如非癌性和癌性人类细胞，包括人成纤维细胞和模型细胞诸如HeLa(子宫颈上皮)进行单个细胞胞内pH测量。

Description

单个细胞胞内纳米PH探针
本申请是申请日2016年2月24日，申请号为201680012883.5，发明名称为“单个细胞胞内纳米PH探针”的中国发明专利申请的分案申请。
相关专利申请的交叉引用
本专利申请要求提交于2015年2月25日的美国临时专利申请No.62/120,624的优先权，该专利申请全文据此以引用的方式并入。
政府支持声明
本发明根据美国国家癌症研究所(National Cancer Institute)颁发的合同号U54CA143803、美国国家健康研究所(National Institutes of Health)颁发的合同号P01-35HG000205和美国国家神经疾病和中风研究所(National Institute of NeurologicalDisorders and Stroke)颁发的合同号R21NS082927在政府支持下进行。政府具有本发明的某些权利。序列表、计算机程序或光盘的引用
无。
背景技术
技术领域
本发明涉及纳米孔尺度装置和传感器领域，具体地讲用于单个细胞内的流体和溶液的pH感测。
相关领域
下文提供了本发明某些方面的背景信息，因为它们可涉及具体实施方式中提及的技术特征，但不一定详细描述。即，本发明所用的单个组合物或方法可在下文讨论的公开和专利中更详细地描述，它们可为本领域的技术人员制备或使用受权利要求书保护的本发明的某些方面提供进一步指导。不应将下文的讨论理解为承认所述专利或公开的相关性或现有技术效果。
个性化给药保持了很大的潜力，特别是在治疗癌症中，其保留了重大医疗挑战，因为常规化疗药物具有固有和获得性耐受性1-3。在最近十年，开发个性化癌症治疗剂，以增加化疗的功效已取得了进展4。尽管对个人定制药物作出了很大努力，但结果千差万别5。该事实与单个肿瘤内存在基因不同的细胞有关6。在最近的研究中，利用基因组测序技术鉴定一大群细胞中的这些基因改变7-9。虽然癌细胞异质性的遗传方面和突变和耐药性之间的关系已广泛研究，但检测异质性，即在一大群细胞内查找细胞代谢和生理学不同的的癌细胞的预筛选技术的开发正在研究中。
细胞异质性的评估可通过测量胞质离子和分子来进行。金属离子的积聚10、活性氧(ROS)和活性氮物类(RNS)水平的变化11和蛋白质表达12是细胞群内癌性细胞的重要标志。虽然很少受到认可，但pH也是癌细胞的鉴定性要素。pH是引发和调节许多细胞事件，诸如肿瘤中的多重耐药性13、蛋白质加工14、胞吞作用15和细胞凋亡16的最引人注目的特征之一。由于pH具有重要意义，胞内环境的pH通过各种离子通道以及胞内弱酸和碱，诸如碱阳离子-H+交换蛋白、碳酸氢盐和酸负载转运蛋白严格调控。在哺乳动物细胞中，亚细胞隔室具有不同的pH值，以维持某些代谢功能的最佳运行条件17。在正常生理条件下，哺乳动物细胞的静息胞内pH维持在6.8和7.3之间18。另一方面，胞外pH值呈微碱性，在7.2至7.4的范围内。胞内pH的调节异常通常与细胞功能、增殖和耐药性的改变相关，并且可见于癌性肿瘤中19。此外，pH对肿瘤生长和癌细胞迁移具有很大影响，从而可能导致癌细胞转移20,21。
由于癌细胞的高代谢率与供血不足相关，致癌性肿瘤是异质性的并且被广泛认为是酸性的。该区域性高代谢和灌注的缺乏触发了厌氧代谢，导致胞外pH水平降低至～6.022。另外，需氧代谢可增加二氧化碳(CO2)的胞内浓度，导致局部pH水平降低。这两个酸中毒机制在癌症研究中是广泛接受的。然而，关于胞内pH水平是否有助于肿瘤内异质性，以及其是否为一大群细胞中癌细胞预先存在代谢异质性的指示，却知道得很少。pH数据的较大粒度不仅对于开发新型抗癌药物和载体，因为大部分新药物递送体系旨在使用pH灵敏性聚合物或pH灵敏性聚合物纳米粒子，而且对于探知抗癌药物如何有效地在治疗过程中工作将具有重大意义。因此，胞内pH的实时定量测量对于联系肿瘤内细胞异质性、耐药性和药物递送体系以便进行有效治疗可为重要的。
pH可用作鉴定肿瘤组织中癌细胞变体的标志。一旦鉴定，即可在药物治疗的过程中标记和跟踪这些细胞。然后可从标记的细胞收集样品，对其RNA和DNA测序，以阐明使这些细胞具有耐药性的序列。
在细胞水平检测pH不仅对于研究单个癌细胞和肿瘤环境中的细胞异质性，而且对于理解神经退化和衰老也是重要的。神经退行性疾病，诸如帕金森氏病和阿尔茨海默氏病，由于线粒体氧化磷酸化而形成了异质性物理化学环境，因此测量pH并理解其对大脑损伤部位处神经恢复的作用是重要的23。另外，大脑pH被发现是大脑损伤后代谢紊乱和致死的主要标志之一24。很多这些研究因缺乏适当的分析工具而不能进行。
常用的测量胞内pH值的分析技术包括核磁共振(NMR)25、电化学26,27、共聚焦显微术28以及吸收和荧光光谱29-31。在这些技术中，荧光光谱和成像是最常用的技术。然而，荧光强度难以直接定量并且受到实验因素诸如染料定位、光漂白、激发波长以及细胞摄入和释放速率的影响。另外，荧光强度可受到自体荧光的影响。此外，荧光探针不允许进行胞内pH水平的连续和部位特异性检测。
因此，胞内pH是细胞代谢的指示，并且在许多细胞功能诸如多重耐药性、蛋白质加工和细胞凋亡的诱导和调节中也发挥重要作用。即使在大无性系群体，诸如癌性肿瘤实体内，细胞也是不相同的，并且单个细胞的胞内pH水平差值可以是可与临床实践有关的异质性的重要指示，特别是我们转向更个性化的给药。因此，在单个细胞水平检测胞内pH对于鉴定和研究异常细胞具有重要意义。然而，细胞群内单个细胞的胞内pH的定量和实时测量是对现有技术的挑战，并且需要设计新方法。
具体专利和公开
Functionalized Nanopipette Biosensor(Karhanek等人，2010年3月25日公开的美国专利申请公开2010/0072080)公开了用于生物分子检测的方法和装置，其包括纳米移液管，例如具有纳米尺度圆锥形吸头开口，适用于保持电解质溶液的中空惰性非生物结构，该电解质溶液可包含分析物诸如蛋白质生物分子，该分析物通过吸头开口时被检测。
Nanopore Device for Reversible Ion and Molecule Sensing or Migration(Pourmand等人，2012年9月6日公开的美国专利申请公开2012/0222958)公开了用于检测离子迁移和结合的方法和装置，其利用适用于电化学感测电路的纳米移液管。脱乙酰壳多糖用在PAA(聚丙烯酸)层上，该层首先附接到纳米移液管，用于测量离子诸如铜的结合。
Actis等人在“Functionalized nanopipettes:toward label-free,single cellbiosensors”Bioanalytical Reviews 1:177-185(2010)中公开了作为能够鉴定DNA和蛋白质的非标生物传感器的纳米移液管。
Umehara等人在“Label-free biosensing with functionalized nanopipetteprobes”Proc.Nat Acad.Sci.106(12):4611-4616(2009)中公开了使用功能化纳米移液管电极进行的无标记实时蛋白质分析。蛋白质与涂覆有探针分子的纳米移液管吸头相互作用。据显示，纳米移液管吸头表面的静电、生物素-链亲和素和抗体-抗原相互作用影响了流经50-nm孔的离子电流。
发明内容
以下发明内容不旨在包括本发明的所有特征和方面，也不意味着本发明必须包括该发明内容中讨论的所有特征和方面。
在某些实施方案中，本发明包括用于测量单个细胞内pH的装置，其包括(a)纳米移液管结构，该纳米移液管结构(i)可操作地连接至用于刺穿支承件上的细胞的显微操作器和感测装置，(ii)包含工作电极于其中，所述(iii)包含选择性吸收氢离子的聚合物涂层；(b)所述纳米移液管结构还连接至放大器电路，该放大器电路被构造成在溶液中的工作电极和参考电极之间施加不同的电压，还被构造成测量在不同电压下工作电极和参考电极之间的离子电流，以及(c)用于将所述放大器电路测量的不同离子电流与纳米移液管结构外部的细胞内pH值关联的逻辑装置。
在某些实施方案中，本发明包括这样的装置：其中显微操作器和感测装置包括SICM(扫描离子电导显微镜)和xyz控制器，该xyz控制器控制纳米移液管移至和移入单个细胞。在某些实施方案中，本发明包括这样的装置：其中放大电路包括具有增益控制和具有低通滤波器的检测电路，用于检测离子电流。在一些实施方案中，本发明包括这样的装置：其包括连接至单个逻辑装置的纳米移液管结构的阵列，如例如图16所示。在某些实施方案中，脱乙酰壳多糖具有在约30,000和60,000个单位之间的单体数。脱乙酰壳多糖可包含与其连接的血红素蛋白。
在一些实施方案中，本发明包括这样的装置：其中聚合物涂层选自磺化四氟乙烯共聚物聚-l-赖氨酸和藻酸盐。在某些实施方案中，本发明包括这样的装置：其中放大器电路包括连接至参考电极并且响应于来自放大器的输入的稳压器，该放大器具有来自工作电极的输入。在另外的实施方案中，本发明包括这样的装置：其中稳压器连接至反电极，该反电极还连接至稳压器的参考电极。在某些实施方案中，本发明包括这样的装置：其中工作电极和反电极是Ag/AgCl。
在某些实施方案中，本发明包括用于测量单个细胞内pH的装置，其包括(a)电连接至电路并且附接到***装置的纳米移液管，该电路测量各种电势下的离子电流对电势，该***装置用于将纳米移液管***单个细胞；(b)用于将整流值与已知的pH值关联的逻辑装置，其中在细胞中获得的整流值可与已知的整流值关联，从而提供识别所测量的pH值的输出；(c)所述纳米移液管具有一层脱乙酰壳多糖材料，该脱乙酰壳多糖材料直接结合至纳米移液管的表面并且对氢离子是多孔的；以及(d)包括参考电极的电路，该参考电极也发挥辅助电极的功能并且连接至稳压器。
在另外的实施方案中，本发明包括这样的装置：其中逻辑装置被编程为通过测量辅助电极处的电流来扫描工作电极在给定电势范围内相对于参考电极的电势。该装置可包括通过滤波器选择和灵敏度选择电路桥接的i/V放大器，其中调整该部件以根据通过电解质溶液的电流调整可检测电流范围。
在某些实施方案中，本发明包括制备用于测量单个细胞内pH的装置的方法，其包括(a)制备纳米移液管结构，该纳米移液管结构(i)可操作地连接至用于刺穿支承件上的细胞的显微操作器和感测装置，(ii)包含工作电极于其中，并且(iii)包含选择性吸收氢离子的聚合物涂层；(b)将所述纳米移液管结构连接至放大器电路，该放大器电路被构造成在溶液中的工作电极和参考电极之间施加不同的电压，还被构造成测量在不同电压下工作电极和参考电极之间的离子电流；(c)将所述纳米移液管结构连接至逻辑装置，用于将所述放大器电路测量的不同离子电流与纳米移液管结构外部的细胞内pH值关联。
在另外的实施方案中，本发明包括如上所述的方法，其中通过将脱乙酰壳多糖材料层结合到纳米移液管来施加所述聚合物涂层；还包括将所述工作电极连接至放大器，该放大器导电并且测量通过纳米移液管的离子电流的I-V曲线。
在某些实施方案中，本发明包括测量细胞中pH的方法，其包括(a)提供纳米移液管结构，该纳米移液管结构具有响应于pH离子的内部层，并且通过工作电极电连接至电路，该电路包括稳压器，该稳压器被构造成测量在电化学电池中在各种电势下通过所述纳米移液管结构的离子电流对电势，该电化学电池包含所述纳米移液管结构和参考电极；(b)将所述纳米移液管结构***所述电化学电池中的细胞；以及(c)使用所述电路测量所述离子电流，其中所述电流与已知的pH关联。
在一些实施方案中，本发明包括如上所述的方法，其中所述***所述纳米移液管包括使用SICM和x-y-z控制器。在某些实施方案中，本发明包括这样的方法：其中所述电路还包括放大电路，该放大电路包括具有增益控制和具有低通滤波器的检测电路，用于检测离子电流。在某些方面和实施方案，本发明包括这样的方法：其中所述内部层包括平均孔径在50nm和150nm直径之间的脱乙酰壳多糖材料层。脱乙酰壳多糖可具有在约30,000和60,000个单位之间的单体数，并且可包含与其连接的血红素蛋白。
在某些实施方案中，本发明包括如上所述的方法，其中内部层包括选自磺化四氟乙烯共聚物聚-l-赖氨酸和藻酸盐的聚合物涂层。
在某些实施方案中，本发明包括如上所述的方法，其中电路包括连接至参考电极并且响应于来自放大器的输入的稳压器，该放大器继而具有来自工作电极的输入。在另外的实施方案中，本发明包括这样的方法：其中稳压器连接至反电极，该反电极连接至参考电极。工作电极和反电极可以是Ag/AgCl。
在一些实施方案中，本发明包括如上所述的方法，其中电压在0.5V和0.7V之间。在另外的实施方案中，本发明包括这样的方法：其中在稳压器上设定各种电压。
在某些实施方案中，本发明包括如上所述的方法，其中pH值取在癌性细胞上，并且与非癌性细胞上的pH比较。
本发明提供了：
1.一种用于测量单个细胞内pH的装置，其包括：
(a)纳米移液管结构，其(i)可操作地连接至用于刺穿支承件上的细胞的显微操作器和感测装置，(ii)包含工作电极于其中，所述(iii)包含选择性吸收氢离子的聚合物涂层；
(b)所述纳米移液管结构还连接至放大器电路，所述放大器电路被构造成在溶液中的所述工作电极和参考电极之间施加不同的电压，且还被构造成测量在不同电压下所述工作电极和所述参考电极之间的离子电流；以及
(c)用于将所述放大器电路测量的不同离子电流与所述纳米移液管结构外部的细胞内pH值关联的逻辑装置。
2.如项1所述的装置，其中所述显微操作器和感测装置包括SICM(扫描离子电导显微镜)和xyz控制器，所述xyz控制器控制所述纳米移液管移至和移入单个细胞。
3.如项1或2所述的装置，其中所述放大电路包括具有增益控制和具有低通滤波器的检测电路，用于检测离子电流。
4.如项1或2所述的装置，其包括连接至单个逻辑装置的纳米移液管结构的阵列。
5.如项4所述的装置，其中所述脱乙酰壳多糖具有在约30,000和60,000个单位之间的单体数。
6.如项5所述的装置，其中所述脱乙酰壳多糖包含与其连接的血红素蛋白。
7.如项1所述的装置，其中所述聚合物涂层选自磺化四氟乙烯共聚物聚-l-赖氨酸和藻酸盐。
8.如项1所述的装置，其中所述放大器电路包括连接至所述参考电极并且响应于来自放大器的输入的稳压器，所述放大器具有来自所述工作电极的输入。
9.如项8所述的装置，其中所述稳压器连接至反电极，所述反电极还连接至所述稳压器的参考电极。
10.如项8所述的装置，其中所述工作电极和所述反电极是Ag/AgCl。
11.一种用于测量单个细胞内pH的装置，其包括：
(a)电连接至电路并且附接到***装置的纳米移液管，所述电路测量各种电势下的离子电流对电势，所述***装置用于将所述纳米移液管***单个细胞；
(b)用于将整流值与已知的pH值关联的逻辑装置，其中在细胞中获得的整流值可与已知的整流值关联，从而提供识别所测量的pH值的输出；
(c)所述纳米移液管具有一层脱乙酰壳多糖材料，所述脱乙酰壳多糖材料直接结合至所述纳米移液管的表面并且对氢离子是多孔的；以及
(d)包括参考电极的电路，所述参考电极也发挥辅助电极的功能并且连接至稳压器。
12.如项11所述的装置，其中所述逻辑装置被编程为通过测量辅助电极处的电流来扫描所述工作电极在给定电势范围内相对于所述参考电极的电势。
13.如项11所述的装置，其包括通过滤波器选择和灵敏度选择电路桥接的i/V放大器，其中调整部件以根据通过电解质溶液的电流调整可检测电流范围。
14.一种用于制备测量单个细胞内pH所用的装置的方法，其包括：
(a)制备纳米移液管结构，所述纳米移液管结构(i)可操作地连接至用于刺穿支承件上的细胞的显微操作器和感测装置，(ii)包含工作电极于其中，并且(iii)包含选择性吸收氢离子的聚合物涂层；
(b)将所述纳米移液管结构连接至放大器电路，所述放大器电路被构造成在溶液中的所述工作电极和参考电极之间施加不同的电压，且还被构造成测量在不同电压下所述工作电极和所述参考电极之间的离子电流；以及
(c)将所述纳米移液管结构连接至逻辑装置，用于将所述放大器电路测量的不同离子电流与所述纳米移液管结构外部的细胞内pH值关联。
15.如项14所述的方法，其中通过将脱乙酰壳多糖材料层结合到所述纳米移液管来施加所述聚合物涂层；其还包括将所述工作电极连接至放大器，所述放大器导电并且测量通过所述纳米移液管的离子电流的I-V曲线。
16.一种测量细胞中pH的方法，其包括：
(a)提供纳米移液管结构，所述纳米移液管结构具有响应于pH离子的内部层，并且通过工作电极电连接至电路，所述电路包括稳压器，所述稳压器被构造成测量在电化学电池中在各种电势下通过所述纳米移液管结构的离子电流对电势，所述电化学电池包含所述纳米移液管结构和参考电极；
(b)将所述纳米移液管结构***所述电化学电池中的活细胞；以及
(c)使用所述电路测量所述离子电流，其中所述电流与已知的pH关联。
17.如项16所述的方法，其中所述***所述纳米移液管包括使用SICM和x-y-z控制器。
18.如项16或17所述的方法，其中所述电路还包括放大电路，所述放大电路包括具有增益控制和具有低通滤波器的检测电路，用于检测离子电流。
19.如项16或17所述的方法，其中所述内部层包括一层脱乙酰壳多糖材料，所述脱乙酰壳多糖材料具有在50nm和150nm直径之间的平均孔径。
20.如项19所述的方法，其中所述脱乙酰壳多糖具有在约30,000和60,000个单位之间的单体数。
21.如项20所述的方法，其中所述脱乙酰壳多糖包含与其连接的血红素蛋白。
22.如项16所述的方法，其中所述内部层包括选自磺化四氟乙烯共聚物聚-l-赖氨酸和藻酸盐的聚合物涂层。
23.如项16所述的方法，其中所述电路包括连接至所述参考电极并且响应于来自放大器的输入的稳压器，所述放大器继而具有来自所述工作电极的输入。
24.如项23所述的方法，其中所述稳压器连接至反电极，所述反电极连接至所述参考电极。
25.如项23所述的方法，其中所述工作电极和所述反电极是Ag/AgCl。
26.如项23所述的方法，其中所述电压在0.5V和0.7V之间。
27.如项26所述的方法，其中在所述稳压器上设定各种电压。
28.如项23所述的方法，其中所述pH值取在癌性细胞上，并且与非癌性细胞上的pH比较。
附图说明
图1A、1B、1C和1D包括图像和扫描电子显微图，它们示出了本发明的纳米移液管的性质。图1A的图像是裸的和脱乙酰壳多糖改性的石英纳米移液管的离子电流整流比较。两个测量均使用填充有10mM PBS(pH 7.0)的石英纳米移液管进行。在不存在脱乙酰壳多糖材料的情况下，电流与电势对Ag/AgCl呈线性关系。图1B是扫描电子显微图，其示出了典型的纳米移液管孔开口。还示出了聚焦离子束切割(图1C)裸纳米移液管吸头和(图1D)脱乙酰壳多糖改性纳米移液管的SEM图像，它们示出了纳米移液管的内表面上的脱乙酰壳多糖层。
图2A-2B是一对扫描电子显微图，它们示出了(图2A)纳米移液管吸头的侧视图，以及(图2B)脱乙酰壳多糖改性的纳米移液管的孔。
图3A-3B包括(图3A)示出作为pH的结果的本发明的纳米移液管的表面电荷的可逆变化的示意图，以及(图3B)示出在6.02至8.04的生理相关pH范围内脱乙酰壳多糖改性的纳米移液管的校正图像。所有数据点以+/-0.5V处的相对整流比对Ag/AgCl参考电极表示。误差棒表示n＝4次重复测量的标准偏差。0.1M PBS用作支持电解质。如图所示，在酸性条件下，脱乙酰壳多糖层将从阴性表面转变为阴离子和阳离子的混合物。pH降低将导致聚合物的质子化，并且表面电荷的变化将导致在本发明电路中检测到电流整流。
图4A、4B、4C是一组图像，它们示出了(图4A)脱乙酰壳多糖改性的纳米移液管的酸滴定的典型线性扫描伏安图以及(图4B)脱乙酰壳多糖改性的纳米移液管的碱滴定的典型线性扫描伏安图。(图4C)中的图像是在2.59和10.83之间的对应校正纳米pH探针。在原始图中迹线用颜色表示。在图4A中，最小测量pH 6.96以箭头示出。在所示的-0.5点，较小的pH值显示出较大的电流。在图4B中，最大pH 10.83以箭头示出。
图5是示出裸纳米移液管的pH响应的图像。误差棒表示n＝3次重复测量的标准偏差。
图6A-6B是一对图像，它们示出了细胞培养基中的脱乙酰壳多糖改性的纳米移液管的校正。图6A中的培养基是1X MEM，图6B中的培养基是DMEM。电流响应在0.6V的固定偏电势下测量。误差棒表示n＝4次重复测量的标准偏差。
图7A-7B是一对图像，它们示出了脱乙酰壳多糖改性的纳米移液管在细胞培养基(图7A)MEM和(图7B)DMEM中的酸滴定的电流-电势曲线。较大pH值以箭头示出。
图8A-8B是脱乙酰壳多糖改性的纳米移液管获得的电流迹线和纳米移液管的显微图。图8A示出了在细胞刺穿之前、期间和之后使用Axopatch 200B放大器记录的自定义扫描离子电导显微镜电流反馈信号。在y轴的幅值是纳安培。图8B是***的脱乙酰壳多糖改性的纳米移液管的对应显微图。
图9A、9B、9C、9D是一组图像，它们示出了脱乙酰壳多糖改性的纳米移液管测量的单个细胞的胞内pH水平。记录(图9A)人成纤维细胞、(图9B)HeLa、(图9C)MCF-7和(图9D)MDA-MB-231细胞的pH水平。水平线表示使用纳米pH探针测量的平均胞内pH。
图10A、10B、10C、10D是一组图像，它们示出了使用脱乙酰壳多糖改性的纳米移液管测量不同细胞类型：(图10A)人成纤维细胞、(图10B)HeLa、(图10C)MCF7和(图10D)MDA-MB-231的胞内pH的代表性电流-电势曲线。使用单个pH纳米探针获得每种类型细胞系的所有读数。细胞1在(图10A)、(图10C)和(图10D)中以箭头示出。
图11A、11B、11C包括示出纳米pH探针***的代表性显微图以及使用纳米pH探针获得的电流-电压曲线图像。该显微图示出了(图11A)***MDA-MB-231细胞的纳米pH探针和(图11B)撤回探针后的***点。细胞未显示出任何形态变化并且在***和测量的过程中保持完整，在撤回后存活。(图11C)在0.1M PBS(pH7.0)中进行细胞询问后，纳米pH探针的再生基线的线性扫描伏安图。
图12是图像，其示出了使用纳米pH探针测量的实时胞内pH。pH测量在不存在(菱形)和存在(方形)100μM NPPB(Cl-通道阻断剂)的情况下对MDA-MB-231细胞进行。图中的箭头示出了NPPB的加入时间。在通道阻断剂暴露后每21秒获取读数7分钟。误差棒表示n＝3次重复的标准偏差。
图13是图像，其表示作为100μM NPPB(Cl-通道阻断剂)暴露的结果，三个MDA-MB-231细胞随时间推移的pH变化。在通道阻断剂暴露后每21秒获取读数。
图14A-14B示出了(图14A)本发明装置的示意图，其中纳米pH探针包括脱乙酰壳多糖材料层。图14B示出了在酸性条件导致聚合物层(上图板)上质子的存在增加的情况下的pH变化；还示出了整流比(RpH/R中性)在6(～0.7)至8(～1.1)的pH范围内的增加(下图板)。
图15是本发明电路的示意图，还阐明了图14A所示的构造。
图16是示意图，其示出了纳米探针阵列的2D剖视图。纳米探针安装在阵列上，每个纳米探针包括纳米移液管，该纳米移液管包含导电材料并且连接至工作电极。在纳米移液管外部，每个工作电极连接至信号放大器，该信号放大器具有来自工作电极和普通参考电极的输入。
具体实施方式
定义
除非另有定义，本文所用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解相同含义。虽然任何类似或等同于本文所述那些的方法和材料可用于本发明的实践或测试，但优选的方法和材料也有所描述。一般来讲，结合细胞和分子生物学和化学使用的命名及其技术是本领域熟知和常用的。某些未特别定义的实验技术通常根据本领域熟知的常规方法进行，并且如本说明书通篇引用和讨论的各种一般和更具体的参考文献所述。为清晰起见，以下术语的定义如下。
范围：为简明起见，除非另外说明，所示任何范围旨在包括在所述范围内的任何子范围。作为非限制性例子，120至250的范围旨在包括120-121、120-130、200-225、121-250等的范围。术语“约”具有其普通含义大约并且可在语境中通过实验差异确定。在不确定的情况下，术语“约”意指指定数值加或减5％。
术语“纳米移液管”意指具有纳米尺度圆锥形吸头开口，即具有0.05nm至约500nm、优选地约(+或–20％)50nm或约80nm或约100nm的吸头开口的纳米孔的中空自支承惰性非生物结构。中空结构可以是例如玻璃或石英，并且适用于将通过吸头开口的流体保持在其内部。选择或改性纳米移液管的内部，使分析物的非特异性结合最小化。纳米移液管的内部通常为细长锥体的形式，具有一致壁厚的单层石英或其他生物惰性材料，并且尺寸设定成允许***接触纳米移液管中的溶液的电极。本文所用的纳米移液管通常具有单镗孔，但具有多个同心镗孔的纳米移液管可通过拉伸双镗孔毛细管制备。吸头区中的外径通常小于约1μm。
如本文所述，术语“纳米孔”意指电绝缘膜，优选地纳米移液管的吸头中的小孔。纳米孔将在吸头区中，它是邻近纳米孔的纳米移液管镗孔的最后几毫米。如下文所述，纳米孔的尺寸设定成使得小分子复合物影响离子和分子通过纳米孔的移动。纳米孔设计成在这样的装置中发挥功能：其监测在膜的两端施加电压时通过纳米孔的离子电流。纳米孔将具有通过纳米移液管体形成的通道区，并且优选地将是逐渐变细的，如截头圆锥体构造。如下文所述，通过拉伸石英毛细管，可获得可重复的和确定的纳米孔形状。
如下文所述，术语“纳米pH探针”是指包括纳米移液管的装置，该纳米移液管包含内部的电极和功能化内部，该装置还包括连接至电极，以感测纳米移液管中离子电流的小变化的电路，该小变化是材料中pH的指示。
术语“石英”意指纳米移液管介质是熔融二氧化硅或无定形石英，它比结晶石英更便宜。然而，可使用结晶石英。也可使用陶瓷和玻璃陶瓷以及硼硅酸盐玻璃，但精密性不如石英。术语“石英”旨在和定义为涵盖该特别材料以及适当的陶瓷、玻璃陶瓷或硼硅酸盐玻璃。应当指出的是，各种类型的玻璃或石英可用于本发明的纳米移液管制造。首先考虑的是材料被拉伸为窄直径开口的能力。优选的纳米移液管材料基本上由二氧化硅组成，如以各种类型的玻璃和石英的形式包括在内。熔融石英和熔融二氧化硅是主要包含无定形(非结晶)形式二氧化硅的玻璃类型。
本文以其常规意义使用的术语“脱乙酰壳多糖”是指由无规分布的β-(1-4)-连接D-葡糖胺(脱乙酰化单元)和N-乙酰基-D-葡糖胺(乙酰化单元)组成的直链多糖。脱乙酰壳多糖中的氨基具有～6.5的pKa值，导致在酸性至中性溶液中质子化，其电荷密度取决于pH和％DD(脱乙酰化程度)值。这使得脱乙酰壳多糖具有水溶性和生物粘附性，易于结合至带负电的表面，诸如粘膜。脱乙酰壳多糖增强了极性药物跨过上皮表面的转运，并且是生物相容的和可生物降解的。脱乙酰壳多糖通过甲壳质的脱乙酰化商业化制备，甲壳质是甲壳类(蟹、虾等)的外骨骼和真菌细胞壁中的结构元件。脱乙酰化程度(％DD)可通过NMR光谱确定，商业化脱乙酰壳多糖中的％DD在60-100％的范围内。商业化制备的脱乙酰壳多糖的分子量平均在3800至20,000道尔顿之间。
术语“脱乙酰壳多糖材料”意指上述天然存在的脱乙酰壳多糖，以及例如Rinaudo,“Chitin and chitosan:Properties and application,”Prog.Polym.Sci 31:603-632(2006)所述的各种同素异形物和衍生物。如该文献所述，脱乙酰壳多糖可具有各种溶解度、乙酰化或分子量。如该文献所述，脱乙酰壳多糖材料或天然的脱乙酰壳多糖可形成薄的和稀薄的层，以得到将离子接纳于层内的纳米或微米孔。
术语“高度羟基化”结合石英材料(SiO2)使用，该石英材料用于本发明的具有羟基的纳米孔。例如，α-石英(0001)可以如Yang等人“Water adsorption on hydroxylatedα-quartz(0001)surfaces,”Phys.Rev.b 73:035406(2006)所述羟基化。参见例如Konecny等人“Reactivity of free radicals on hydroxylated quartz surface and itsimplications for pathogenicity experimental and quantum mechanical study,”J.Environ Pathol Toxicol Oncol.2001；20 Suppl 1:119-32。
术语“血红素蛋白”是指包含血红素辅基的金属蛋白，血红素是允许蛋白质执行不能单独发挥的多个功能的有机化合物。血红素包含还原铁原子、高度疏水的平面卟啉环中心的Fe2+。血红素蛋白包括血红蛋白、肌红蛋白、神经珠蛋白、细胞球蛋白和豆血红蛋白。
术语pH具有公认的定义，即水溶性物质的酸性或碱性的度量(pH代表“氢的电势”)。pH值是1至14是数字，7为中(中性)点。小于7的值表示酸性，随着数字的减小而增强，1的酸性最强。大于7的值表示碱性，随着数字的增大而增强，14的碱性最强。然而，该标度不是像厘米或英寸标度(其中两个相邻的值具有相同的差值)那样的线性标度。
术语“逻辑装置”意指可编程或被编程为将一系列电子信号转换为一个或多个有形的可测量值的逻辑电路。例如，授予Birkner等人的美国专利No.4,124,899示出了可编程逻辑电路，其称为可编程阵列逻辑或PAL电路。本发明的逻辑装置根据通过所述探针(包含氢离子灵敏性和响应性纳米移液管并且包含电极)的离子电流相对于参考探针的给定变化生成pH值。如所理解，任何所需的计算机程序可加载到计算机上，包括但不限于通用计算机或专用计算机，或产生机器的其他可编程处理装置，使得在计算机或其他可编程处理装置上执行的计算机程序指令创建用于执行功能的装置。因此，本文所用的适当逻辑装置可以是提供为由使用者在编程为感测和控制本发明装置的外部计算机上使用的软件。
发明和实施方案概述
本发明提供了可在不需要任何外源材料的情况下测量单个细胞内pH以及细胞内pH变化的装置和装置。该测量是实时的，并且可跟踪pH变化，同时纳米移液管***细胞并且灵敏电路测量纳米移液管的纳米孔开口处的离子电流，该纳米移液管在细胞中，例如在细胞质、细胞核、线粒体等等中。检测电路提供大约0.1-0.01个pH单位的高度灵敏度，所述例子显示出检测到0.09个pH单位。此外，该***具有在约pH 2-11之间的大动态范围。
本发明还包括用于测量响应于细胞中溶液的pH变化而变化的电流的方法和装置。在一种方法中，该装置使用不同的标准pH溶液校正。校正曲线反映了电流对pH，并且计算和用于测量样品中的pH。用于电流测量的优选电压设定为0.6V，或在0.5V-0.7V的范围内。所测量的电流(使用稳压器测量)随着样品中pH的减小而增加。稳压器记录了电流，并且扫描整个电压范围，以确定各种响应和/或确定最佳操作电压。通常，施加的电压从约0.2V扫描至0.6V。在所用的本发明优选方法中，稳压器向***施加选择的电压并且记录pH相关的电流。
在一个方面，本发明包括使用控制浓度的高度多孔脱乙酰壳多糖材料，该材料形成分子海绵以捕获包括H+的离子，增加离子整流，如图1A、图4A、4B等的迹线所示。高度多孔涂层(孔径为大约50-150nm，平均直径为大约100nm)允许与纳米pH探针中存在的氢离子直接相互作用。可渗透氢离子(质子)通常具有约0.012埃的离子半径。平均孔径可通过显微装置确定或从孔隙度值计算。参见例如Zeng等人“Control of Pore Sizes in MacroporousChitosan and Chitin Membranes,”Ind.Eng.Chem.Res.,1996,35(11)，第4169–4175页。
如本领域已知，离子电流整流通过一种电压极性的离子导电增加来表征，但对于相反极性的相同电压值，离子导电减少，生成不对称I-V曲线。将正和负电压施加到电极；离子电流响应之间的差值是孔中从而细胞中pH的指示。
高度多孔脱乙酰壳多糖材料可通过使用相对低浓度的脱乙酰壳多糖材料涂覆纳米移液管内部孔来制备。在一些方面，脱乙酰壳多糖材料以0.25％至1％脱乙酰壳多糖材料之间的浓度施加。脱乙酰壳多糖材料在邻近纳米孔内部的位置处直接结合至到纳米移液管的石英材料上的羟基。优选地，使用具有约30,000至60,000的单体数的短链脱乙酰壳多糖材料。结合可通过使石英与化学品反应，以增加表面官能团来增强，诸如硫酸、氢氧化氢(hydrogen hydroxide)、氢氧化铵等。这将用于减少污染物和使石英羟基化。
在另一个方面，本发明包括脱乙酰壳多糖材料层的改性，以包含对细胞中的氧化还原电势灵敏的材料。细胞的氧化还原电势以常规意义使用，是指用于推断涉及电子传递的反应的方向和自由能消耗的度量。化合物的氧化还原电势，或更精确地还原电势是指其获得电子从而被还原的趋势。
例如，可使用氧化还原电势将这两个参与者联系起来，并估算可从NADH的氧化产生(例如在TCA循环中产生)的ATP分子数的上限。细胞的氧化还原电势可被各种疾病干扰。
在另一个方面，本发明包括灵敏电子装置以及在本体溶液和纳米移液管内部之间使用的工作和参考电极的布置。参考电极还作为辅助电极发挥功能，并且连接至稳压器。该***通过扫描工作电极在给定的电势范围内相对于参考电极的电势来发挥功能，该扫描通过测量辅助电极处的电流进行。i/V放大器通过滤波器选择和灵敏度选择电路桥接。这些用于根据通过电解质溶液的电流调整可检测电流范围。
现在参见图14A，本发明的装置包括具有pH响应性聚合物(例如脱乙酰壳多糖)内部的纳米移液管142。脱乙酰壳多糖(响应性聚合物，图14B)直接吸收到纳米移液管的内表面。纳米移液管包含被构造成感测纳米移液管注入细胞的液体的小开口(开口小于约200nm，优选地在10和20nm之间)。纳米移液管142包括在还包含参考电极150的***中(还在图15中示出)。参考电极150连接至稳压器的输入端，该稳压器还连接至低通滤波器146并且由此输出148。如下文所述，工作电极还连接至稳压器，该稳压器通过参考电极将电流注入电化学电池152。电化学电池中的工作溶液还包含连接至稳压器的参考电极150和外部电极(图14A中未示出)。纳米移液管142***电化学电池中工作溶液(培养基)中的细胞，参考电极150浸入该电化学电池中。
如下文所述，纳米移液管(纳米pH探针)可操作地连接至显微操作器(未示出)，诸如检测电流反馈的扫描离子电导显微镜，该电流反馈用于定位纳米移液管并且将其***选择的细胞。
如图14B示意性地示出，细胞中的pH减小导致脱乙酰壳多糖或等同聚合物的质子化，该脱乙酰壳多糖或等同聚合物可在接触纳米移液管142中的涂层时从溶液收回质子。纳米孔区的脱乙酰壳多糖层的表面的变化影响了可通过孔的离子电流。离子电流的变化改变了从通常如144所示的反馈放大器的输出。该输出通过低通滤波器146过滤，并且在148输出至监视器，如结合图15所述。稳压器还连接至增益选择器154a数字衰减器156。
图15示出了本发明的装置中布置的稳压器如何在细胞中实现高灵敏度pH测量。纳米移液管(图14A所示的142)包含电化学电池152内的工作电极，以六边形示出。电化学电池152是包含上述单个细胞的溶液以及连接工作电极和参考电极150的导电溶液。参考电极150还作为辅助电极或反电极发挥功能，并且还连接至稳压器。如所示和已知的那样(详情参见US 5,466,356)，稳压器提供在电化学电池中工作的硬件。工作电极(在纳米移液管中)是其中控制电势和测量电流的电极。参考电极用于测量工作电极电势。参考电极应具有恒定电化学电势，只要无电流通过即可。反电极通过工作电极完善电路。当电化学环境不具导电性(小于1uA)时，参考电极和反电极二者可附接到相同的电极。
图15所示的两个电路同时工作：测量参考电极和工作电极之间的电势差，以确认电化学电池中的电压；并且测量工作电极和反电极之间的电流。工作电极和反电极之间的电流测量将感测pH变化。当电流很小并且当电极材料是Ag/AgCl时，反电极和参考电极二者可在单个电极上工作，因为两个同时事件可在无任何干涉的情况下发生。
该***通过扫描工作电极在给定的电势范围内相对于参考电极的电势来发挥功能，该扫描通过测量辅助电极处的电流进行。稳压器连接至增益选择器154，该增益选择器用于控制进行信号放大的频率。工作电极(在纳米移液管中)连接至i/V(电流/电压)放大器158的输入端，该放大器输出至数字衰减器156，并由其返回(如上文所述)参考电极，形成反馈电路。i/V放大器158还通过滤波器选择162和灵敏度选择电路164桥接。这些用于根据通过电解质溶液的电流调整可检测电流范围。
放大器158输出至低通滤波器146和输出连接部148(圆圈)，该输出连接部显示出连接至低通滤波器。这和稳压器提供了至监视器的输入端(圆圈)，该监视器可测量和记录通过纳米移液管的离子电流。该监视器可包括编程为监测和控制上述部件产生的信号的计算机。
该计算机将包含根据使用期间建立的或者构建成装置校正，将来自稳压器电路的检测电流转换为pH值的逻辑装置。
其中***纳米移液管的单个细胞可以是液体培养中或固定在基底上的细胞。单个细胞可以是组织的一部分。其通过显微确认，纳米移液管通过***细胞的x-y-z控制器控制。扫描离子电导显微镜(SICM)可用于此用途。
本发明的纳米pH探针可用作阐明pH和许多疾病之间的关系的分析工具。本发明的纳米pH探针可利用扫描离子电导显微镜(SICM)原理32。纳米移液管是可测量纳米孔处离子电流差的电气装置。其小尺寸允许进行直接实时体外高空间分辨率以及微创测量，允许监测单个细胞在药物治疗过程中的胞内变化。最近纳米移液管作为新型感测工具获得了重要地位，并且已研究用于蛋白质33,34、金属阳离子32,35、DNA36和碳水化合物37的检测。石英纳米移液管可使用各种识别材料功能化。在该研究中，生物聚合物脱乙酰壳多糖材料用作纳米移液管内表面的pH灵敏性表面涂层。脱乙酰壳多糖具有生物相容性并且具有低毒性，这使其成为生物用途的理想选择。它具有独特的成膜能力、高表面粘附性和强大的机械强度。此外，脱乙酰壳多糖显示出作为用于生物传感器制造的选择性涂层38-40。
本文示出了用于在生理缓冲液和细胞培养基中进行pH测量的脱乙酰壳多糖改性的石英纳米移液管的开发和表征。然后将脱乙酰壳多糖改性的纳米移液管用于在四种不同的细胞类型，包括人成纤维细胞、HeLa、MCF-7和MDA-MB-231中进行胞内pH的直接测量。如本文所述，可使用氯化物通道阻断剂实现脱乙酰壳多糖改性的纳米pH探针的体外特异性。纳米pH探针不仅是研究许多病理状态包括癌性肿瘤的细胞异质性，而且也是研究神经退行性疾病和衰老的强大候选物。
本发明的装置显示出克服了在单个细胞水平进行胞内pH测量的缺陷。胞内pH的直接测量显示出通过将脱乙酰壳多糖材料简单物理吸附到石英纳米移液管的新方式进行。该方法利用pH响应性脱乙酰壳多糖聚合物层和小尺寸纳米移液管在单个细胞水平进行胞内pH测量。本文描述了通过将脱乙酰壳多糖(生物相容性pH响应性聚合物)物理吸附到极小孔径(～97nm)的高度羟基化石英纳米移液管上来制备的纳米pH探针。pH变化改变了脱乙酰壳多糖的表面电荷，该表面电荷可通过纳米孔处离子电流的变化测量。纳米pH探针的动态pH范围为2.6至10.7，灵敏度为0.09个pH单位。利用为单个细胞导航定制的扫描离子电导显微镜，我们能够将纳米pH探针***单个细胞。我们使用非癌性和癌性细胞系，包括人成纤维细胞、HeLa、MDA-MB-231和MCF-7，通过纳米pH探针进行了单个细胞胞内pH测量。体外结果显示，脱乙酰壳多糖-功能化纳米移液管进行了选择性高时间分辨率胞内pH测量。对于人成纤维细胞、HeLa、MCF-7和MDA-MB-231，平均胞内pH水平分别为7.37±0.29、6.75±0.27、6.91±0.20和6.85±0.11。这些结果显示成纤维细胞和癌性细胞之间存在良好的隔离，癌性细胞具有比非癌性细胞酸性更强的胞质环境。另外，我们的发现反映了细胞群内的单个细胞可具有不同的胞内pH。我们还示出了传感器的实时连续单个细胞pH测量能力，这显示了对药物操纵的细胞pH响应。NPPB暴露实验显示，在生物化学引起胞内pH变化时，纳米pH探针允许进行单个细胞的实时连续询问。
我们的数据显示，脱乙酰壳多糖改性的纳米移液管感测技术是询问单个细胞pH水平的强大方法，其具有高空间和时间分辨率，以及高选择性和灵敏度。该纳米pH探针技术的另外应用可提供对细胞异质性和耐药性的更深入理解。为实现该目标，我们致力于开发在药物治疗过程中进行细胞群的高通量筛选的完全自动化***。另外，我们将使用纳米pH探针研究pH变化和肿瘤微环境(例如肿瘤组织)差异。
一般方法和材料
试剂和材料。脱乙酰壳多糖(低分子量)、5-硝基-2-(3-苯基丙基氨基)-苯甲酸(NPPB)、磷酸氢二钠和磷酸二氢钠购自Sigma Aldrich。氯化钠(ACS级)、盐酸、氢氧化钠和过氧化氢得自Fisher Scientific。乙酸(冰)得自Riedel-de-Haen。2-丙醇得自SpectrumChemicals。2’,7’-双-(2-羧乙基)-5-(和-6)-羧基荧光素乙酰氧基甲酯(BCECF-AM)购自Invitrogen。二甲基亚砜(无水)得自Fluka。最小基本培养基eagle(MEM)、Dulbecco改良eagle培养基(DMEM)和胰蛋白酶购自CellGro，胎牛血清(FBS)和青霉素-链霉素购自Gibco。所有水溶液在电阻率为18.2 Ωcm的蒸馏去离子水(Millipore,Synthesis System)中制备。
纳米pH探针的制备。纳米移液管从含原丝(QF100-70.7.5,Sutter Instrument)的石英毛细管制造。在拉伸之前，使用食人鱼溶液(硫酸:过氧化氢，3:1v/v)处理毛细管(注意：“食人鱼溶液”与有机物质剧烈反应，在制备时溶液可变得非常热。)并使用蒸馏水和2-丙醇充分冲洗。处理的毛细管保持在2-丙醇中直到使用，以防止污染。使用P-2000激光拉针仪(Sutter Instrument)和以下参数的双线程序拉伸毛细管；Line 1:Heat 700,Fil 4,Vel20,Del 170,Pull 0和Line 2:Heat 680,Fil 4,Vel 40,Del 170,Pull 200。如FEI Quanta3D场致发射显微镜所检测，所得的纳米移液管具有～97nm的孔直径。纳米移液管保存在密封盒子中直到改性。纳米移液管通过以下步骤功能化：回填10μl 0.25％脱乙酰壳多糖溶液并以4000rpm离心，以确保脱乙酰壳多糖基质覆盖纳米移液管吸头。在离心后，吸出过量的脱乙酰壳多糖，让纳米移液管风干过夜。用10mM磷酸盐缓冲盐水(PBS)溶液pH 7.0回填干燥的纳米移液管，然后离心移除截留在纳米移液管吸头的残余气泡。一旦填充，即可将所有的纳米移液管保持在10mM PBS(pH 7.0)中直到pH测量，以防止纳米孔的阻塞。
感测装备。为进行脱乙酰壳多糖改性的纳米移液管传感器的分析表征实验，将连接至稳压器(1030C,CH Instruments Inc.)两电极装备用于感测。125μm铂丝(GoodfellowCorporation)置于填充有电解质的纳米移液管中，作为工作电极，同时准Ag/AgCl电极置于本体溶液(PBS或细胞培养基)中，作为参考电极。使用线性扫描伏安法进行全部体外测量，扫描速率为0.1V/秒。
通过将稳压器和扫描离子电导显微镜(SICM)与低噪声机械开关组合进行胞内测量。SICM装备包括Axopatch 200B放大器(Molecular Devices)(用于电流反馈测量)、MP-285机械化显微操作器(Sutter Instrument)(用于纳米pH探针的粗定位)、压力台(NanoCube,Physik Instrumente)(用于纳米pH探针传感器的精定位和***)以及可编程接口(用于装备的硬件控制)。该***通过LabVIEW(National Instruments)编写的定制软件运行。所有细胞实验在配备有目镜相机(Dino-Eye,Big C)的倒置荧光显微镜(Olympus IX70)上进行。
细胞培养。HeLa、MCF-7、MDA-MB-231和人成纤维细胞在5％CO2和90％湿度、37℃的条件环境中培养。HeLa、MCF-7和MDA-MB-231细胞在1X MEM中培养，人成纤维细胞在1X DMEM中培养。所有培养基补充有10％ FBS和1％青霉素-链霉素。
荧光显微镜。MDA-MB-231细胞培养物暴露至pH灵敏性荧光指示剂BCECF-AM。在Hank缓冲盐溶液(HBSS)中制备1μM浓度的工作溶液，并在37℃下温育15分钟，然后进行荧光成像。使用Dulbecco磷酸盐缓冲盐水(DPBS)洗涤细胞，然后加入1μM BCECF-AM溶液。在温育后，冲洗掉过量的荧光染料，含HBSS的细胞加入培养基进行成像。
对于胞内pH缓冲液校正，将细胞培养物暴露至根据胞内pH校正缓冲液试剂盒(Life Technologies,P35379)提供的方案制备的完全pH校正缓冲液，并且在37℃下温育10分钟，然后成像。胞内pH校正重复进行三次。所有荧光显微分析使用Leica SP5共聚焦显微镜通过Leica Application Suite Advance Fluorescence(LAS AF 3)软件进行。另外的图像分析使用Fiji-ImageJ软件进行。
实施例
实施例1：pH响应性石英纳米移液管传感器的表征
纳米移液管的测量原理基于吸头处的离子电流。该离子电流高度依赖于纳米移液管的孔径和表面电荷34。由于玻璃-液体界面处硅醇基的解离，石英纳米移液管的表面电荷是负的。石英在极度酸性pH值下经历质子化41。石英的这些表面性质降低了pH感测能力，使得裸纳米移液管不适于测量非常小的pH变化。低灵敏度裸石英表面相关的缺陷可通过将pH响应性聚合物实体掺入纳米移液管表面来克服。在本文中，我们将脱乙酰壳多糖用作pH灵敏性表面涂层。在酸性pH下具有强正电荷的脱乙酰壳多糖通过静电相互作用吸引到带负电的石英表面上的羟基部分。除表面电荷的改变之外，脱乙酰壳多糖层的厚度显示出随pH而变化，这可增加纳米移液管的灵敏度42,43。为评估脱乙酰壳多糖层的存在和对纳米移液管表面的影响，我们监测了由于表面改性而导致的电流响应变化。图1A示出了填充有10mMPBS(pH 7.0)的裸的和脱乙酰壳多糖改性的石英纳米移液管在-0.5至0.5V的电势范围内的电化学迹线(对Ag/AgCl参考电极)。在脱乙酰壳多糖改性后，所记录的电流响应显著减少。纳米移液管吸头的典型几何形状是圆锥形(图2A)，并且石英纳米移液管的孔径通过SEM确定为～97nm(图1B)。采集另外的SEM显微图以进一步确认脱乙酰壳多糖层的存在(图2B)。因为脱乙酰壳多糖改性在纳米移液管的内部进行，所以聚焦离子束用于竖直蚀刻纳米移液管并暴露内表面。横截面图像示出了纳米移液管表面内部的脱乙酰壳多糖残基与裸纳米移液管内部的比较(图1C和D)。
一旦使用SEM和电化学法确认脱乙酰壳多糖层的存在，即可使用线性扫描伏安法进行功能化纳米移液管的分析表征。电势范围从-0.5至0.5V，扫描速率为0.1V/秒。pH的调节通过常规酸-碱滴定法实现。脱乙酰壳多糖改性的纳米移液管的校正通过连续地首先向0.1M PBS(pH 7.0)加入20μl 1M NaOH，然后加入HCl来进行。在+/-0.5V处改性纳米移液管的电流整流响应于缓冲溶液pH的变化而变化，可以通过脱乙酰壳多糖层上的电荷改变预知。脱乙酰壳多糖包含其多糖主链上的葡糖胺残基(pKa～6.5)，使脱乙酰壳多糖具有pH响应性38。小于pKa的pH值使脱乙酰壳多糖层质子化，使纳米移液管表面带正电，而碱性条件使脱乙酰壳多糖的胺官能团脱质子化，增加了表面的净负电荷(图3A)。对于pH的定量，相对整流比(RR)定义为RRR＝RRpH/RR中性，其中RRpH和RR中性分别为特定pH和pH 7.0下的RR。图3B示出了使用脱乙酰壳多糖改性的纳米移液管通过酸-碱滴定获得的在6.02至8.04的生理相关pH范围内的校正曲线。从pH校正曲线观察的趋势是典型的等电点测量实验。脱乙酰壳多糖等电点的微小变化可以是由于纳米尺度的圆锥形几何形状纳米移液管吸头，这可阻止离子的均匀扩散。脱乙酰壳多糖功能化pH纳米探针的灵敏度为0.09个pH单位。对pH的高灵敏度使纳米探针成为胞内pH测量的强大工具。单个pH的电流-电势曲线以及大范围pH校正如图4A-4C所示。测试裸纳米移液管的pH感测；可以预知，这些纳米移液管显示出对pH变化的低灵敏度(图5)。
实施例2：细胞培养基中的pH感测
我们开发固态纳米孔pH探针的动机是在单个细胞水平测量胞内pH以及使用独特的代谢特征鉴定癌细胞。为进行胞内pH测量，在细胞培养基、MEM和DMEM中进一步校正脱乙酰壳多糖改性的纳米移液管。由于细胞培养基包含各种氨基酸、维生素和其他成分，最佳工作参数不同于PBS测量的那些参数。扫描电势范围为-0.2至0.6V，扫描速率为0.1V/秒。脱乙酰壳多糖改性的纳米移液管对pH变化的灵敏度在0.6V最高。图6A-6B示出了在1X MEM和DMEM溶液中进行的纳米pH探针校正。培养基中的纳米pH探针校正通过连续加入20μl 0.1MHCl来进行。将酸溶液加入细胞培养基得到均匀溶液之后，进行测量15秒。对于MEM和DMEM培养基的酸滴定，代表性线性扫描伏安图如图7A-7B所示。由于这些培养基的成分不同，其缓冲能力稍有不同，DMEM的pH变化耐受性比MEM更强。
实施例3：癌性和非癌细胞的胞内pH测量
由于细胞的较小尺寸和生理基质的复杂性，胞内pH的直接测量是具有挑战性的。虽然生理pH水平稍微偏碱性，但大细胞群中单个细胞的胞内pH水平和亚细胞隔室是未知的。通常，荧光染料(如BCECF-AM、俄勒冈绿)用于细胞中pH的间接检测30。虽然这些pH指示剂反映了大细胞群中的pH近似值，但使用荧光染料有很多缺点：i)由于pH范围窄，灵敏度低，ii)快速光漂白，iii)细胞毒性。另外，这些染料积聚在某些细胞器中以及它们的渗漏速率可导致误判。我们的研究使用常规pH指示剂BCECF-AM测量MDA-MB-231细胞的胞内pH，已证明使用荧光进行胞内事件的精确和灵敏评估的缺点。在这些研究中，其中进行了荧光胞内pH测量，将细胞暴露至BCECF-AM并温育15分钟。然后，洗涤细胞并暴露至含尼日利亚菌素的细胞pH校正缓冲液(pH 7.5、6.5、5.5和4.5)10分钟。BCECF-AM具有双激发波长；因此，在458和488nm采集图像。获得每个pH值的两个激发波长下的亮视野和荧光显微图。使用16至23个单个细胞的荧光强度获得比例校正曲线(数据未示出)。一组细胞作为阴性对照(无BCECF-AM)以评估胞内自体荧光的存在。在不存在pH染料的情况下，MDA-MB-231不存在可观察的荧光。暴露至BCECF-AM的细胞用于评估单个细胞的胞内pH值。从10个单个细胞获得的平均胞内pH值计算得到6.78(±0.83)。然而，BCECF-AM暴露之后采集的显微图反映了荧光强度随细胞体而变化(数据未示出)。细胞越密集，荧光强度越大。另外，据发现，单个细胞中任何两个彼此靠近区域的pH值变化很大。这些变化可归因于(i)荧光染料的不均匀分布或积聚；(ii)荧光染料与另外分子的交叉反应。荧光测量的另一个缺点是样品制备步骤需要频繁改变培养基，这可胁迫细胞并且改变基本胞内水平。此外，荧光染料的使用不允许在治疗过程中，诸如在药物测试或毒性测量中进行单个细胞的连续询问，因为这些染料以及所关注化合物的存在可通过改变细胞的生理学或通过与待测试化合物的交叉反应而导致假实验结论。换句话讲，在一段时间内用于评估治疗剂、通道活化剂或毒素的细胞影响的单个细胞连续询问不能使用常规荧光探针进行。
为了直接和精确测量胞内pH，将脱乙酰壳多糖改性的纳米移液管***培养中细胞的胞质。我们第一次使用该感测技术直接监测人癌性和非癌性细胞系，包括人成纤维细胞、HeLa、MCF-7和MDA-MB-231的胞内pH。人成纤维细胞被选为非癌性模型，研究正常胞质条件下的胞内pH水平。HeLa细胞系由于其能够在细胞培养物中快速和连续生长，是最常用的人类癌症类型。另外，由于HeLa细胞的污染和异质性报道，这些细胞的胞内pH水平测量可允许我们评估细胞异质性44。MCF-7和MDA-MB-231是不同的乳腺癌细胞系。MCF-7是激素响应细胞系，其生长通过***刺激；MDA-MB-231来源于侵润性乳腺癌，被发现具有高度转移性45。我们选择询问这两种乳腺癌细胞系，因为它们表现出不同的药物灵敏度，我们寻求确定这是否与胞内pH水平的差异相关。
使用定制的扫描离子电导显微镜将脱乙酰壳多糖改性的纳米移液管***单个细胞，所述扫描离子电导显微镜检测电流反馈，用于定位纳米移液管。最近我们展示了，该定制平台可在单个细胞水平进行纳米活检，以进行基因组研究46。图8A示出了在脱乙酰壳多糖改性的纳米移液管的接近-刺穿-撤回过程期间记录的代表性反馈信号。在纳米pH探针***细胞之后，记录线性扫描伏安图，将0.6V偏电势下的电流响应用于计算单个细胞的胞内pH水平。
从0.6V的伏安法电流响应对Ag/AgCl得到的单个细胞的计算胞内pH水平和所有细胞系的平均pH值如图9A-9D所示。询问七种人成纤维细胞的胞内pH，平均pH为7.37±0.29(图9A)。在这些人成纤维细胞中观察到的胞内pH水平与通过间接和破坏性方法估算pH水平的前述报道一致，包括监测离子交换剂(NHE和NBC)和酸转运蛋白(AE)17。
我们还使用纳米pH探针研究非癌性和癌性细胞之间的代谢差异。由于癌细胞的代谢率高于非癌性细胞，癌细胞的酸物类和CO2产生也高于非癌性细胞。我们使用脱乙酰壳多糖改性的纳米pH探针测量14个单独HeLa细胞的胞内pH，发现HeLa细胞的平均pH为6.75±0.27(图9B)。
为比较类似的酸性胞内环境是否存在于其他癌细胞系中，我们对乳腺癌细胞系进行了pH测量。使用纳米pH探针观察到14个单独MCF-7细胞的平均胞内pH水平为6.91±0.20(图9C)。使用11个单个细胞发现MDA-MB-231的平均胞内pH为6.85±0.11(图9D)。单个细胞测量的代表性线性扫描伏安图如图10A-10D所示。我们的数据显示，每个细胞的胞内环境在可通过pH检测的意义上不尽相同。这些差异可归因于单个细胞的不同代谢速度，并且可用于鉴定大细胞群中的异质性细胞，诸如肿瘤。纳米pH探针的小尺寸吸头减少了***(图11A-11C，11A和11B中的比较显微图)和测量期间的损伤。这方面允许在药物操纵和药物治疗的过程中连续或间歇询问相同的细胞(参见下一部分)。图11C示出了纳米pH探针用于连续体外测量的再生和复用。在0.1M PBS(pH 7.0)中进行细胞询问后测试pH探针。另外，该测试对于在用于体外测试后控制探针的完整性是重要的。
为了更充分地利用本文所述的pH纳米探针，构建了完全自动化高通量机器人***，它允许我们在几分钟内询问数百个细胞。鉴定出pH值比一般细胞群更小或更大的细胞，然后用分子标志来标记用于DNA和RNA测序的纳米活检标本。
实施例4：胞内pH的药物操纵
本发明的纳米pH探针可用于在药物治疗期间监测胞内pH变化。为此，将本发明的纳米pH探针布置成在加入已知的氯化物通道阻断剂、5-硝基-2-(3-苯基丙基氨基)-苯甲酸(NPPB)期间在单个细胞水平连续监测。NPPB之前显示出在肾脏上皮和巨噬细胞中阻断氯化物通道，导致胞内环境的酸性增加。通常，通过引入荧光染料(BCECF-AM)间接测量pH变化47,48。因此，该药物操纵测试不仅用于展示纳米pH探针的实时测量能力，而且还用于展示对pH检测的特异性。为获取基线，将纳米pH探针***MDA-MB-231细胞，每21秒进行连续pH测量达7分钟。该MDA-MB-231细胞的实时pH监测显示，在测量过程中围绕值7发生微小漂移(图12，菱形)。为研究NPPB的作用，将纳米pH探针***MDA-MB-231细胞，在将100μM NPPB(在无水DMSO中新鲜制备)加入细胞培养基之前即开始胞内pH记录。图12中的方形示出了pH在7分钟时间期内随着NPPB暴露的变化。胞内pH水平在引入NPPB之后的前2分钟内显著下降至2.5。在NPPB引入之后稳定所测量的pH水平4分钟。pH增加可以是由于细胞凋亡导致细胞体收缩而产生的，这可使纳米pH探针的吸头暴露至细胞培养基。使用纳米pH探针测量三个单独MDA-MB-231细胞的胞内pH不仅显示了NPPB暴露后的实时pH变化，还显示了细胞间药物响应性的变化(图13)。
实施例5：细胞中氧化还原变化的检测
上述装置还可使用层改性，所述层附接到纳米移液管上的脱乙酰壳多糖层，所述脱乙酰壳多糖层响应于细胞中组分的氧化或还原。
上述脱乙酰壳多糖改性的石英纳米移液管可使用固定化蛋白诸如血红素蛋白和酶改性。所述脱乙酰壳多糖的固定化可通过肽键形成机制或催化反应实现，因为脱乙酰壳多糖的聚合物主链上具有羧基和无规分布的葡糖胺残基。氧化还原活性小蛋白固定至脱乙酰壳多糖层使所谓的功能化纳米移液管对高度反应性自由基诸如活性氧(ROS)和活性氮物类(RNS)以及过氧化氢具有灵敏性。关于ROS的详情，参见Salehi等人，“Hemeproteinsincluding hemoglobin,myoglobin,neuroglobin,cytoglobin and leghemoglobin,”J.Photochemistry and Photobiology B:Biology 133 11-178(2014)。
已知这些自由基(如活性氧物类)有助于治疗很多疾病状态，诸如癌症、衰老、中风、帕金森氏病和阿尔茨海默氏病。因此ROS和RNS的生理水平测量具有重要意义。
在存在ROS或RNS的情况下，纳米移液管内部的氧化还原灵敏性表面官能团根据其氧化状态经历还原或氧化。此类氧化状态的变化导致表面电荷的变化。表面电荷的变化与水性环境中存在的ROS或RNS的量相关。当在石英纳米孔两端施加电势差时，反应性物类的检测通过测量纳米孔处离子电流的波动进行。
实施例6：纳米pH探针的多重阵列
上述装置还可以纳米pH探针的多重阵列构造。此外，许多表面识别材料可添加到阵列中所用的各种纳米移液管内部。许多纳米移液管结构可以是不同的，但并非所有它们都包含脱乙酰壳多糖pH感测涂层。
制备用于该阵列的圆锥形纳米移液管结构的一种可能方法如Meyyappan,U.S.9,182,394所述。该专利描述了在支承阳极化的金属样材料中形成和控制的纳米移液管通道阵列。如该专利所述，可阳极化金属诸如Al、Mg、Zn、Ti、Ta和/或Nb的薄基底在T＝20-200℃的温度下、在pH＝4-6的化学浴和1-300伏的电势中阳极化，获得直径为10-50nm、氧化通道表面厚度为5-20nm的阳极化纳米移液管通道阵列。长度为1-5μm的相邻纳米移液管通道之间的暴露非氧化可阳极化金属的一部分被蚀刻掉，暴露纳米移液管通道的内表面和外表面。
图16示意性地示出了纳米探针阵列的二维剖视图。图16示出了六个纳米移液管探针，仅出于展示目的。可使用更大的阵列。单个纳米pH探针包括含导电材料的纳米移液管，并且连接至工作(感测)电极161，该工作电极延伸至纳米移液管的内部。绝缘层166施加到纳米移液管阵列164的后部，该纳米移液管如上文所述被构造为例如结晶SiO2。非活性支承结构163附接到绝缘层166，并且用于支承绝缘和电极阵列。如图所示，阵列164中的每个纳米移液管从绝缘层延伸一段距离达到高度Δh，并且具有直径d的吸头开口。纳米孔的直径(d)可在5和200nm之间，并且纳米移液管尺寸的长度Δh可10和400μm之间。每个工作电极161连接至单个放大器170的输入端，该放大器具有不同于阵列164中的单个探针的输入端，该阵列包含纳米移液管内的导电材料。每个纳米移液管具有单个信号放大器170，并且输出(连接部未示出)至测量装置，该测量装置具有灵敏的细胞中pH变化读数，诸如如图15所示。阵列164中的纳米移液管在由例如氧化铝制成的穿孔绝缘层166上制造。该穿孔用于***感测电极，该感测电极具有5至125μm的尺寸范围。
此外，磁性结构168a,168b用于提供支承结构163和绝缘层166之间的可拆卸附接件。这提供了阵列中纳米移液管的接触，并且允许对移液管进行改性，以及用支承电解质填充。
改性在***电极(161)之前通过用聚合物或识别分子浇注移液管结构的内表面进行。表面涂层工艺可对整个内表面进行，但不是必要的，因为离子电流变化受到纳米孔前0.1至5μm的支配。
这些表面识别材料可以是聚合物，包括苯二胺、聚-l-赖氨酸、聚丙烯酸和聚吡咯；酶，包括氧化还原酶和脱氢酶家族；蛋白质，包括亲和素和阮病毒；以及抗原、RNA片段和核酸配体。这些物质可单独或组合用于单个纳米探针或纳米探针阵列的官能化，以进行靶向感测。表面改性方案必须为每种识别材料优化，包括用于固定化的表面化学性质、浓度、温育时间和温度。应评估每个感测阵列的纳米移液管填充溶液的性质，诸如pH、电解质类型和浓度的最高检测灵敏度。
在完成必要的表面改性和引入填充电解质之后，通过使电极对齐穿孔将具有内置感测电极的定制印刷电路板(PCB)置于纳米移液管阵列顶部。感测电极是金属，包括银、铂、金；或氧化还原类(银-氯化银(I))或非金属，包括玻璃碳、石墨和硼掺杂金刚石。当电子器件***纳米移液管阵列时，纳米移液管阵列的内部部件完全密封。由钕制成的磁性结构168确保了电子器件和纳米移液管阵列二者彼此锁定。本发明的电子器件结构包含用于单个通道的所有必要电路，并且能够进行同步或自定义感测。
结语
上述具体实施方式旨在列举和示出本发明，并且不应视为限制所附权利要求的字面和等同范围限定的本发明的范围。本说明书涉及的任何专利或公开旨在表述执行本发明的某些方面所用的方法和材料的详情，该详情可以不明确示出，但将是本领域的工作者理解的。此类专利或公开据此以引用方式并入，以达到似乎它们中的每一者特别地和单独地以引用方式并入和包含于本文的程度，如描述和赋予所涉及的方法或材料的目的所需。
参考文献
1.Higgins,C.F.Multiple molecular mechanisms for multidrug resistancetransporters.Nature 446,749-757(2007).
2.Videira,M.,Reis,R.L.&Brito,M.A.Deconstructing breast cancer cellbiology and the mechanisms of multidrug resistance.Biochimica et BiophysicaActa(BBA)-Reviews on Cancer 1846,312-325,doi：http(colon slash slash)dx.doi.org/10.1016/j.bbcan.2014.07.011(2014)
3.Lee,M.-C.W.et al.Single-cell analyses of transcriptionalheterogeneity during drug tolerance transition in cancer cells by RNAsequencing.Proceedings of the National Academy of Sciences 111,E4726-E4735,doi：10.1073/pnas.1404656111(2014).
4.Workman，P.Genomics and the second golden era of cancer drugdevelopment.Molecular BioSystems 1，17-26，doi：10.1039/b501751n(2005).
5.Garraway，L.A.&P.A.Circumventing Cancer Drug Resistance in theEra of Personalized Medicine.Camcer Discovery 2，214-226，doi：10.1158/2159-8290.cd-12-0012(2012).
6.Yap，T.A.，Gerlinger，M，Futreal，P.A.，Pusztai，L.&Swanton，C.IntratumorHeterogeneity：Seeing the Wood for the Trees.Science Translational Medicine 4，127ps110，doi：10.1126/scitranslmed3003854(2012).
7.Gerlinger，M.et al.Intratumor Heterogeneity and Branched EvolutionRevealed by Multiregion Sequencing.New England Journal of Medicine 366,883-892,doi：doi：10.1056/NEJMoal 113205(2012).
8.Zhang，J.et al.Intratumor heterogeneity in localized lungadenocarcinomas delineated by multiregion sequencing.Science：346，256-259，doi：10.1126/science.1256930(2014).
9.Beltran，H.et al.Targeted Next-generation Sequencing of AdvancedProstate Cancer Identifies Potential Therapeutic Targets and DiseaseHeterogeneity.European Urology 63，920-926，doi：http(colon slash slash)dx.doi.org/10.1016/j.eururo.2012.08.053(2013).
10.Wu，T.，Sempos，C.T.，Freudenheim，J.L.，Muti，P.&Smit，E.Serum iron，copper and zinc concentrations and risk of cancer mortality in USadults.Annals of Epidemiology 14，195-201，doi：http(colon siash slash)dx.doi.org/10.1016/S1047-2797(03)00119-4(2004).
11.Wiseman，H.&Halliwell，B.Damage to DNA by reactive oxygen andnitrogen species：role in inflammatory disease and progression tocancer.Biochem.J.313，17-29(1996).
12.Zheng，G，Patolsky，F.，Cui，Y.，Wang，W.U.&Lieber，C.M.Multiplexedelectrical detection of cancer markers with nanowire sensor arrays.NatBiotech 23，1294-1301，doi：http(colon slash slash)www.nature，com/nbt/journal/v23/n10/suppinfo/nbt1138_S1.html(2005).
13.Raghunand，N.&Gillies，R.J.pH and drug resistance in tumors.DrugResistance Updates 3，39-47，doi：http(colon slash slash)dx.doi.org/10.1054/drup.2000.0119(2000)，
14.Paroutis，P.，Touret,N.&Grinstein,S.The pH of the Secretory Pathway：Measurement,Determinants,and Regulation.Vol.19(2004).
15.Weisz,O.A.Organelle Acidification and Disease.Traffic 4,57-64,doi：10.1034/j.1600-0854.2003.40201.x(2003).
16.Gottlieb,R.A.,Nordberg,J.,Skowronski,E.&Babior,B.M.Apoptosisinduced in Jurkat cells by several agents is preceded by intracellularacidification.Proceedings of the National Academy of Sciences 93,654-658(1996).
17.Casey,J.R.,Grinstein,S.&Orlowski,J.Sensors and regulators ofintracellular pH.Nat Rev Mol Cell Biol 11,50-61,doi：http(colon slash slash)www.nature.com/nrm/journal/v11/n1/suppinfo/nrm2820_S1.html(2010).
18.Mahnensmith,R.L.&Aronson,P.S.The plasma membrane sodium-hydrogenexchanger and its role in physiological and pathophysiologicalprocesses.Circulation Research 56,773-788,doi：10.1161/01.res.56.6.773(1985).
19.Damaghi,M.,Wojtkowiak，J.W.&Gillies，R.J.pH Sensing and Regulationin Cancer.Frontiers in Physiology 4，doi：10.3389/fphys.2013.00370(2013).
20.Stock，C.&Schwab，A.Protons make tumor cells move likeclockwork.Pflugers Arch-Eur J Physiol458，981-992，doi：10.1007/s00424-009-0677-8(2009).
21.Parks，S.K.，Chiche，J.&Pouyssegur，J.pH control mechanisms of tumorsurvival and growth.Journal of Celhdar Physiology 226，299-308，doi：10.1002/jcp.22400(2011).
22.Gatenby，R.A.&Gillies，R.J.Why do cancers have high aerobicglycolysis？Nat Rev Cancer 4，891-899(2004).
23.Rango,M.,Bonifati,C.&Bresolin,N.Parkinson′s disease and brainmitochondrial dysfunction：a functional phosphorus magnetic resonancespectroscopy study.J Cereb Blood Flow Metab 26,283-290(2005).
24.Timofeev,I.,Nortje,J.，Al-Rawi，P.G.，Hutchinson，P.J.A.&Gupta，A.K.Extracellular brain pH with or without hypoxia is a marker of profoundmetabolic derangement and increased mortality after traumatic brain injury.JCereb Blood Flow Metab 33，422-427(2013).
25.Hashim,A.I.，Zhang，X.，Wojtkowiak，J.W.，Martinez，G.V.&Gillies，R.J.Imaging pH and metastasis.NMR in Biomedicine24，582-591，doi：10.1002/nbm.1644(2011).
26.Carter，N.W.Intracellular pH.Kidney Int 1，341-346(1972).
27.Mabe，H.，Blomqvist，P.&Siesjo，B.K.Intracellular pH in the BrainFollowing Transient Ischemia.J Cereb Blood Flow Metab 3，109-114(1983).
28.Lucien，F.，Harper，K.，Pelletier，P.-P.，Volkov，L.&Dubois，C.M.Simultaneous pH Measurement in Endocytic and Cytosolic Compartments inLiving Cells using Confocal Microscopy.e51395，doi：doi：10.3791/51395(2014).
29.Talley，C.E.，Jusinski，L.，Hollars，C.W.,Lane,S.M&Huser,T.Intracellular pH Sensors Based on Surface-Enhanced RamanScattering.Analytical Chemistry 76，7064-7068,doi：10.1021/ac049093j(2004).
30.McNamara，K.P.et al.Synthesis，Characterization，and Application ofFluorescence Sensing Lipobeads for Intracellular pH Measurements.AnalyticalChemistry 73，3240-3246，doi：10.1021/ac0102314(2001).
31.Peng,H.-s.,Stolwijk,J.A.,Sun,L.-N,Wegener,J.&Wolfbeis,O.S.ANanogel for Ratiometric Fluorescent Sensing of Intracellular pHValues.Angewandte Chemie 122，4342-4345，doi：10.1002/ange200906926(2010).
32.Actis，P.et al.Voltage-Controlled Metal Binding on Polyelectrolyte-Functionalized Nanopores.Langmuir 27，6528-6533，doi：10.1021/la2005612(2011).
33.Actis，P.，Mak，A.&Pourmand，N.Functionalized nanopipettes：towardlabel-free，single cell biosensors.Bioanal Rev 1，177-185，doi：10.1007/s12566-010-0013-y(2010).
34.Umehara，S.，Karhanek，M.，Davis，R.W.&Pourmand，N.Label-freebiosensingwith functionalized nanopipette probes.Proceedings of the National Academy ofSciences 106，4611-4616，doi：10.1073/pnas.0900306106(2009).
35.Vilozny，B.，Actis，P.，Seger，R.A.，Vallmajo-Martin，Q.&Pourmand，N.Reversible Cation Response with a Protein-Modified Nanopipette.AnalyticalChemistry 83，6121-6126，doi：10.1021/ac201322v(2011).
36.Karhanek，M.，Kemp，J.T.，Pourmand，N.，Davis，R.W.&Webb，C.D.Single DNAMolecule Detection Using Nanopipettes and Nanoparticles.Nano Letters 5,403-407,doi：10.1021/n10480464(2005).
37.Vilozny,B.et al.Carbohydrate-actuated nanofluidic diode：switchablecurrent rectification in a nanopipette.Nanascale 5，9214-9221(2013).
38.Ozel，R.E.，Wallace，K.N.&Andreescu，S.Chitosan coated carbon fiber microelectrode for selective in vivo detection of neurotran smitters i n livezebrafi sh embryos.Analytica chimica acta 695，89-95，doi：10.1016/j.aca.2011.03.057(2011).
39.Ozel，R.E.，Hayat，A.，Wallace，K.N.&Andreescu，S.Effect of cerium oxidenanoparticles on intestinal serotonin in zebrafish.RSC advances 3，15298-15309，doi：10.1039/C3RA41739E(2013).
40.Ozel,R.E.,Ispas,C.,Ganesana,M.,Leiter,J.C.&Andreescu,S.Glutamateoxidase biosensor based on mixed ceria and titania nanoparticles for thedetection of glutamate in hypoxic environments.Biosensors&bioelectronics 52，397-402，doi：10.1016/j.bios.2013.08.054(2014).
41.Behrens，S.H.&Grier，D.G.The charge of glass and silica surfaces.TheJournal of Chemical Physics 115，6716-6721，doi：doi：http(colon slash slash)dx.doi.org/10.1063/1.1404988(2001).
42.Claesson，P.M.&Ninham，B.W.pH-dependent interactions betweenadsorbed chitosan layers.Lamgnuir 8，1406-1412，doi：10.1021/la00041a027(1992).
43.Lee,H.-S.,Eckmann,D.M.,Lee,D.,Hickok,N.J.&Composto,R.J.SymmetricpH-Dependent Swelling and Antibacterial Properties of ChitosanBrushes.Langmuir 27，12458-12465，doi：10.1021/la202616u(2011).
44.Masters，J.R.HeLa cells 50 years on：the good，the bad and theugly.Nat Rev Cnncer 2，315-319(2002).
45.Holliday，D.&Speirs，V.Choosing the right cell line for breastcancer research.Breast Cancer Research 13，215(2011).
46.Actis，P.et al.Compartmental Genomics in Living Cells Revealed bySingle-Cell Nanobiopsy.ACS Nano 8，546-553，doi：10.1021/nn405097u(2013).
47.Brown，C.D.A.&Dudley，A.J.Chloride channel blockers decreaseintracellular pH in cultured renal epithelial LLC-PK1 cells.British JournalofPharmacology 118，443-444，doi：10.1111/j.1476-5381.1996tb15422.x(1996).
48.Lukacs，G.L.，Nanda，A.，Rotstein，O.D.&Grinstein，S.The chloridechannel blocker 5-nitro-2-(3-phenylpropyl-amino)benzoic acid(NPPB)uncouplesmitochondria and increases the proton permeability of the plasma membrane inphagocytic cells.FEBS Letters 288，17-20，doi：http(colon slash slash)dx.doi.org/10.1016/0014-5793(91)80992-C(1991).

Claims (14)

1.一种测量单个细胞中pH的方法，其包括：
(a)提供纳米移液管结构，所述纳米移液管结构具有响应于pH离子的内部层，并且通过工作电极电连接至电路，所述电路包括稳压器，所述稳压器被构造成测量在电化学电池中在各种电势下通过所述纳米移液管结构的离子电流对电势，所述电化学电池包含所述纳米移液管结构和参考电极，其中所述内部层由选择性吸收氢离子的脱乙酰壳多糖涂层组成，其中所述脱乙酰壳多糖涂层与所述纳米移液管的内部表面直接结合；
(b)将所述纳米移液管结构***所述电化学电池中的活细胞；以及
(c)使用所述电路测量所述离子电流，其中所述电流与已知的pH关联。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述***所述纳米移液管包括使用SICM和x-y-z控制器。
3.如权利要求1或2所述的方法，其中所述电路还包括放大电路，所述放大电路包括具有增益控制和具有低通滤波器的检测电路，用于检测离子电流。
4.如权利要求1所述的方法，其中所述内部层包括在50nm和150nm直径之间的平均孔径。
5.如权利要求4所述的方法，其中所述脱乙酰壳多糖具有在30,000和60,000个单位之间的单体数。
6.如权利要求1所述的方法，其中所述电路包括连接至所述参考电极并且响应于来自放大器的输入的稳压器，所述放大器继而具有来自所述工作电极的输入。
7.如权利要求6所述的方法，其中所述稳压器连接至反电极，所述反电极连接至所述参考电极。
8.如权利要求1所述的方法，其中所述工作电极和所述参考电极是Ag/AgCl。
9.如权利要求1所述的方法，其中所述电压在0.5V和0.7V之间。
10.如权利要求1所述的方法，其中所述pH值在癌性细胞中以及在非癌性细胞中测量。
11.用于测量单个细胞内pH的装置，其包括(a)纳米移液管结构，该纳米移液管结构(i)可操作地连接至用于刺穿支承件上的细胞的显微操作器和感测装置，(ii)包含工作电极于其中，所述(iii)包含选择性吸收氢离子的聚合物涂层；(b)所述纳米移液管结构还连接至放大器电路，该放大器电路被构造成在溶液中的工作电极和参考电极之间施加不同的电压，还被构造成测量在不同电压下工作电极和参考电极之间的离子电流，以及(c)用于将所述放大器电路测量的不同离子电流与纳米移液管结构外部的细胞内pH值关联的逻辑装置。
12.细胞培养物，其中HeLa、MCF-7、MDA-MB-231和人成纤维细胞在5％CO2和90％湿度、37℃的条件环境中培养。
13.纳米pH探针的制备的方法，其中纳米移液管从含原丝的石英毛细管制造；在拉伸之前，使用食人鱼溶液处理毛细管并使用蒸馏水和2-丙醇充分冲洗；处理的毛细管保持在2-丙醇中直到使用，以防止污染；使用P-2000激光拉针仪(Sutter Instrument)和参数的双线程序拉伸毛细管。
14.控制浓度的高度多孔脱乙酰壳多糖材料的用途，该材料形成分子海绵以捕获包括H+的离子，增加离子整流，其中所述高度多孔脱乙酰壳多糖材料通过在涂覆纳米移液管内部孔中使用0.25％-1％脱乙酰壳多糖材料制备。
CN202310453241.0A 2015-02-25 2016-02-24 单个细胞胞内纳米ph探针 Pending CN116626123A (zh)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201562120624P 2015-02-25 2015-02-25
US62/120,624 2015-02-25
CN201680012883.5A CN107407657A (zh) 2015-02-25 2016-02-24 单个细胞胞内纳米ph探针
PCT/US2016/019333 WO2016138116A1 (en) 2015-02-25 2016-02-24 Single-cell intracellular nano-ph probes

Related Parent Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201680012883.5A Division CN107407657A (zh) 2015-02-25 2016-02-24 单个细胞胞内纳米ph探针

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN116626123A true CN116626123A (zh) 2023-08-22

Family

ID=56789191

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202310453241.0A Pending CN116626123A (zh) 2015-02-25 2016-02-24 单个细胞胞内纳米ph探针
CN201680012883.5A Pending CN107407657A (zh) 2015-02-25 2016-02-24 单个细胞胞内纳米ph探针

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201680012883.5A Pending CN107407657A (zh) 2015-02-25 2016-02-24 单个细胞胞内纳米ph探针

Country Status (6)

Country Link
US (1) US20180045675A1 (zh)
EP (1) EP3262404A4 (zh)
JP (1) JP6776252B2 (zh)
KR (1) KR102657461B1 (zh)
CN (2) CN116626123A (zh)
WO (1) WO2016138116A1 (zh)

Families Citing this family (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107884329B (zh) * 2016-09-29 2020-03-10 中国科学院化学研究所 检测单颗粒的方法和装置
JP7067760B2 (ja) * 2017-09-08 2022-05-16 国立大学法人金沢大学 表面計測方法、イオン伝導顕微鏡およびプローブ
US20190261897A1 (en) * 2017-11-28 2019-08-29 Alan D. Kersey Apparatus and method for assessment of cancer margin
WO2019157434A1 (en) * 2018-02-12 2019-08-15 The Regents Of The University Of California Methods for simultaneous detection of analytes and apparatuses for practicing same
US20200326325A1 (en) 2019-04-12 2020-10-15 Lisa Diamond Nanosensor chip with compound nanopores
CN112014429B (zh) * 2019-05-30 2024-01-30 华东理工大学 一种基于超微电渗流调控的细胞膜振动检测方法
US20210003529A1 (en) * 2019-07-01 2021-01-07 Hach Company pH MEASUREMENT OF AN AQUEOUS SAMPLE
CN110673662B (zh) * 2019-09-04 2022-06-14 广东工业大学 一种精确控制药物分子的装置及方法
WO2022164262A1 (ko) * 2021-02-01 2022-08-04 포항공과대학교 산학협력단 세포내 ph 측정을 위한 나노탐침과 이를 이용하여 단일 세포 내의 ph를 측정하기 위한 방법 및 장치
CN114137029B (zh) * 2021-11-26 2024-05-14 复旦大学 一种ta-ms/aao异质结纳米通道及其制备方法
WO2023233345A1 (en) * 2022-06-01 2023-12-07 Ecole Polytechnique Federale De Lausanne (Epfl) Nanopore-based scanning system and method

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU602031B2 (en) * 1986-12-29 1990-09-27 Sony Corporation Filter circuit
US4924091A (en) * 1989-02-01 1990-05-08 The Regents Of The University Of California Scanning ion conductance microscope
CN100478436C (zh) * 2003-11-12 2009-04-15 艾森生物(杭州)有限公司 实时电子细胞传感***及其在基于细胞的测定中的应用
US7573572B1 (en) 2005-09-07 2009-08-11 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Navy Drift tube amplifier and method to amplify current
EP2345892A1 (en) * 2010-01-07 2011-07-20 Université Catholique de Louvain Smart sensor system using an electroactive polymer
JP6151644B2 (ja) * 2011-03-03 2017-06-21 ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア 操作装置、堆積方法、注入方法、検出装置及び検出方法
KR101923241B1 (ko) * 2011-03-04 2018-11-28 더 리전트 오브 더 유니버시티 오브 캘리포니아 가역적인 이온 및 분자 감지 또는 이동을 위한 나노세공 장치
US20130037423A1 (en) * 2011-03-17 2013-02-14 Michael G. Schrlau Multi-Point Cellular Analysis
JP6453300B2 (ja) * 2013-03-14 2019-01-16 ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア 細胞内分析のためのナノピペット装置および方法

Also Published As

Publication number Publication date
JP6776252B2 (ja) 2020-10-28
KR102657461B1 (ko) 2024-04-12
JP2018508018A (ja) 2018-03-22
WO2016138116A1 (en) 2016-09-01
CN107407657A (zh) 2017-11-28
EP3262404A1 (en) 2018-01-03
US20180045675A1 (en) 2018-02-15
EP3262404A4 (en) 2018-12-12
KR20170118766A (ko) 2017-10-25

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP6776252B2 (ja) 単一細胞の細胞内のナノｐＨプローブ
Dong et al. Highly sensitive electrochemical detection of tumor exosomes based on aptamer recognition-induced multi-DNA release and cyclic enzymatic amplification
Chiappini Nanoneedle-based sensing in biological systems
Zhao et al. Branched Au nanoparticles on nanofibers for surface-enhanced Raman scattering sensing of intracellular pH and extracellular pH gradients
Liang et al. Ultrasensitive cytosensor based on self-enhanced electrochemiluminescent ruthenium-silica composite nanoparticles for efficient drug screening with cell apoptosis monitoring
Zuaznabar-Gardona et al. A wide-range solid state potentiometric pH sensor based on poly-dopamine coated carbon nano-onion electrodes
Torkashvand et al. Construction of a new electrochemical sensor based on molecular imprinting recognition sites on multiwall carbon nanotube surface for analysis of ceftazidime in real samples
Özel et al. Single-cell intracellular nano-pH probes
Ruan et al. Target-triggered assembly in a nanopipette for electrochemical single-cell analysis
Zhang et al. Brain neurochemical monitoring
Yaman et al. Development of clay-protein based composite nanoparticles modified single-used sensor platform for electrochemical cytosensing application
Lemaître et al. Recent advances in electrochemical detection of exocytosis
Guo et al. Dynamic single-cell intracellular pH sensing using a SERS-active nanopipette
Zhang et al. Bioinspired Solid‐State Nanochannel Sensors: From Ionic Current Signals, Current, and Fluorescence Dual Signals to Faraday Current Signals
Ge et al. Application of Au cage/Ru (bpy) 32+ nanostructures for the electrochemiluminescence detection of K562 cancer cells based on aptamer
Farshchi et al. Flexible paper-based label-free electrochemical biosensor for the monitoring of miRNA-21 using core–shell Ag@ Au/GQD nano-ink: a new platform for the accurate and rapid analysis by low cost lab-on-paper technology
Mariani et al. Micro-and nano-devices for electrochemical sensing
Romo-Herrera et al. based plasmonic substrates as surface-enhanced Raman scattering spectroscopy platforms for cell culture applications
Aref et al. Potentiometric pH nanosensor for intracellular measurements: Real-time and continuous assessment of local gradients
Liu et al. Recent development in amperometric measurements of vesicular exocytosis
Ashraf et al. Topical advancements in electrochemical and optical signal amplification for biomolecules detection: A comparison
Huang et al. Application and outlook of electrochemical technology in single-cell analysis
Liu et al. A label-free impedimetric cytosensor based on galactosylated gold-nanoisland biointerfaces for the detection of liver cancer cells in whole blood
Ricci et al. Gold-Etched Silver Nanowire Endoscopy: Toward a Widely Accessible Platform for Surface-Enhanced Raman Scattering-Based Analysis in Living Cells
Jiang et al. In situ measurement of atp in single cells by an amphiphilic aptamer-assisted electrochemical nano-biosensor

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination