CN115011632B - 紫花苜蓿MsMYB基因在提高植物抗倒伏能力中的应用 - Google Patents

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Abstract

紫花苜蓿MsMYB基因在提高植物抗倒伏能力中的应用，属于基因工程技术领域。本发明为了提高植物的抗倒伏能力，提供了一种利用紫花苜蓿MsMYB基因增强植物抗倒伏能力的方法，具体为通过构建重组载体pBI121‑MsMYB，将重组载体转入到农杆菌中，通过农杆菌介导的叶盘法得到携带MsMYB基因的转基因植物。利用该方法获得的转基因烟草植株相比于野生型烟草植株茎秆粗壮坚挺，叶片面积更大。

Description

紫花苜蓿MsMYB基因在提高植物抗倒伏能力中的应用
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及紫花苜蓿MsMYB基因在提高植物抗倒伏能力中的应用。
背景技术
紫花苜蓿(Medicago sativa L.)因其生物量高、适口性强的特点，是世界上种植最多的多年生牧草作物，在全世界的种植面积约有三千万公顷。紫花苜蓿因其柔软、鲜嫩的茎叶而被各种动物所喜爱。紫花苜蓿具备质量优良，抗旱，高产，可改良土壤等品质。在生态环境中紫花苜蓿同样起到了重要作用，紫花苜蓿间接影响了畜牧业的经济发展。
植物为了不被自然选择所淘汰，在适应不断变化的生存环境的过程中，产生了独特的基因表达和调节机制。植物任何阶段都由各种不同基因形成复杂的调控网络进而调控生理过程。MYB家族转录因子是植物转录因子中最大的一类，其中R2R3类型MYB在植物中的存在最为广泛，调控着植物多个方面的生命进程，例如调控植物次生代谢、响应生物及非生物胁迫、表皮细胞的建成等功能。
倒伏是作物增收的主要障碍，倒伏不仅降低作物产量、影响作物质量，也增加了机械收获难度。20世纪50年代初期，中国水稻有效降低了植株高度，单产水平得到显著提高。矮秆品种的大面积应用，虽解决了倒伏问题，但因植株过矮、生物量不足，难以有效提高水稻产量；适度的株高、合适的生物学产量是实现水稻超高产育种目标的关键。而倒伏是一个复杂性状，茎秆的物理性状也是影响倒伏的关键因素。
综上所述，在MYB家族转录因子中挖掘能够提高植物抗倒伏能力的基因具有重要的应用价值。
发明内容
为了提高植物的抗倒伏能力，本发明提供了紫花苜蓿的MsMYB基因在提升植物抗倒伏能力中的应用，所述MsMYB基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
进一步地限定，所述应用是利用MsMYB基因获得转基因植物，以提高植物抗倒伏能力。
本发明还提供了一种含有上述MsMYB基因的重组载体在提升植物抗倒伏能力中的应用。
进一步地限定，所述重组载体是将MsMYB基因重组到pBI121质粒上。
本发明还提供了一种含有上述重组载体的重组表达转化体在提升植物抗倒伏能力中的应用。
进一步地限定，所述重组表达转化体的宿主为农杆菌。
进一步地限定，所述植物为烟草。
本发明还提供了一种提高烟草抗倒伏能力的方法，包括以下步骤：
(1)构建重组载体：将MsMYB基因重组到pBI121质粒上，获得重组载体 pBI121-MsMYB，所述MsMYB基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；
(2)制备携带MsMYB基因的农杆菌：将步骤(1)得到的重组载体pBI121-MsMYB 转入到农杆菌感受态中进行培养，得到携带MsMYB基因的农杆菌；
(3)获得携带MsMYB基因的转基因烟草：培养烟草种子到成苗期，对烟草苗进行预培养处理，然后用步骤(2)中得到的农杆菌侵染经预培养处理后的烟草苗，再经过芽诱导、生根诱导和移栽驯化，得到携带MsMYB基因的转基因烟草。
进一步地限定，步骤(1)所述重组载体的构建方法具体为利用限制性内切酶分别酶切载体pMD18T-MsMYB和pBI121质粒，得到MsMYB基因的序列片段与pBI121质粒的酶切产物，然后将MsMYB基因的序列片段与pBI121质粒的酶切产物进行连接反应，得到的重组载体pBI121-MsMYB。
进一步地限定，限制性内切酶为XbaI和SmaI。
进一步地限定，上述连接反应的体系是为：5μL的pBI121质粒酶切产物、3μL的MsMYB基因的序列片段、1μL的10×T4 DNA连接缓冲液和1μL的T4 DNA连接酶，反应温度为16℃，反应时间为12h。
进一步地限定，步骤(3)所述侵染的具体步骤如下：
1)将携带MsMYB基因的农杆菌涂布于含有卡那霉素、链霉素和利福平的YEB固体培养基上，在28℃条件下，培养48h；
2)利用1/2MS液体培养基重悬步骤1)得到的农杆菌的菌落，得到农杆菌的菌液，再用1/2MS液体培养基将菌液稀释至OD600值为0.4-0.6；
3)取烟叶叶片，在步骤2)得到的农杆菌的菌液中侵染6min-7min，将植物叶片取出放置于无菌滤纸上，吸去附着的菌液，放置于MS1培养基上，在黑暗条件下培养2天。
进一步地限定，上述预培养处理是将烟草叶片切成1cm×1cm的方形，预培养48h。
本发明的有益效果：
本发明通过构建含有MsMYB基因的重组载体，并将其转化获得携带MsMYB基因的农杆菌，利用该农杆菌侵染烟草叶片获得了表达MsMYB基因的烟草植株，该烟草植株相比于野生型的烟草植株叶片面积和茎秆都有显著提升，说明MsMYB基因可以通过提高植物的生物量来提高植物抗倒伏能力。
附图说明
图1为pBI121质粒的图谱；
图2为叶盘法侵染烟草的流程图；
图3为转MsMYB基因阳性烟草鉴定结果图；
图4为转MsMYB阳性烟草与野生型烟草全株的对比结果图，其中，图4中的A为转MsMYB阳性烟草，图4中的B为野生型烟草；
图5为转MsMYB阳性烟草与野生型烟草叶片对比结果图，其中，图5中的A为转MsMYB阳性烟草叶片，图5中的B为野生型烟草叶片；
图6为转MsMYB阳性烟草与野生型烟草茎秆对比结果图，其中，图6中的A为转MsMYB阳性烟草茎秆，图6中的B为野生型烟草茎秆。
具体实施方式
以下结合具体实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明，以下的实施例便于更好地理解本发明，但并用于不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的药品试剂，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。
实验材料：野生型烟草种子(Nicotiana tabacum L.cv.SR-1)由本实验室保存。
试验试剂：胶回收试剂盒(TIANGEN)、RNA提取试剂盒(TIANGEN)、PCR试剂盒(TAKARA)、载体连接试剂盒(TAKARA)、质粒提取试剂盒购自AXYGEN生物公司。
实施例1：目的基因MsMYB的获得
1、提取紫花苜蓿的RNA：
(1)将0.1g紫花苜蓿放入经液氮预冷的研钵中，研磨至细碎的粉末状。
(2)将粉末转移到1.5mL的无菌离心管中，加入450μLRL(确认是否加入β-巯基乙醇)。
(3)将所有液体转移至过滤柱中，12000rpm离心5min，小心吸取上清至新的RNase-Free离心管中。
(4)缓慢加入0.5倍上清体积的无水乙醇，混匀，将得到的溶液和沉淀一起转入吸附柱中，12000rpm离心60s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放回收集管中。
(5)向吸附柱中加入350μL去蛋白液，12000rpm离心60s，弃滤液，将吸附柱放回收集管中。
(6)配制DNase工作液：取10μL的DNaseⅠ反应液中加入70μLRDD溶液，轻柔混匀。
(7)将80μLDNase工作液加入到吸附柱滤膜上，静置15min。
(8)向离心吸附柱中加入350μL去蛋白液，12000rpm离心60s，弃滤液，将吸附柱放回收集管中。
(9)向离心吸附柱中加入300μL漂洗液，室温静置2min，12000rpm离心60s，弃滤液，将吸附柱放回收集管中。
(10)重复步骤(9)。
(11)12000rpm离心2min，弃滤液，将吸附柱置于室温放置5min，以彻底晾干吸附柱中残留的漂洗液。
(12)将离心吸附柱转移至RNase-free收集管中，加入30μLRNA洗脱液静置1-2min，12000rpm离心2min，收集管中即为RNA样品，-80℃保存。
2、紫花苜蓿RNA反转录得到cDNA：
以提取的RNA为模板，利用TOYOBAFSK101反转录PCR的方法获得cDNA，反应过程为：
(1)制备反应液Ⅰ：Random Primer(25pmol/μL)1μL，mRNA 10～100ng。
(2)将反应液Ⅰ混合后置于65℃水浴5min，水浴后迅速放入冰中。
(3)制备反应液Ⅱ：5×RT Buffer 4μL，dNTPMixture(10mM)2μL，RNase Inhibitor(10U/μL)1μL，ReverTraAce 1μL，Total Volume 1μL。
变性后的RNA溶液12μL。
反应程序：30℃10min；42℃20min；99℃5min。
MsMYB基因的上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，即 5’-GCTCTAGAATGAAGAACAATAATTCTAAGAGA-3’
MsMYB基因的下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，即 5’-CCCCGGGTCAAATTGATAGGTCCAAGTT-3’
PCR扩增程序：94℃5min，30个循环的程序为94℃30s，55.9℃30s，72℃1min，最后72℃10min；1％琼脂糖凝胶电泳检测。
胶回收目标基因条带：采用DNA凝胶回收试剂盒回收PCR扩增得到的目标基因片段。
最终获得的MsMYB基因核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示：
ATGAAGAACAATAATTCTAAGAGAAGTGGTGTAAGAAAATACCACAAATCAAA ACAGCCACGCCTTCGATGGACACCGGAACTTCATCAATACTTTGTTCAAACTGTTGAAAGTCTTGGTGGAAAAGATAAGGCTAGTCCTAAACACATTTTGAATATGATGCAAGT GAAGGGGTTGAGAATCTCCCATATTAAAAGTCATCTCCAGATGTACAGGAACGTGAAGGGACAAACTATTCTTGCACCAACACTGGAAGAAAACAAGGCACAATTCAATCATC TTCCAATCTGCTCCAGTTGTTCACCCCAAAGATCGAGGAATATCAATCAAGAACAACTTCAACCTTTACACAATAAAGGACTTTCACAAGCAAGTGAAACTGATCATTATTATGA TCTAAATCAGGAGCCTGAGTCAAGTGCATGCTTTCTTAGTGACATATCAAATGAAGAAGACGATTGTAGAACTACCAACAAATATCTAAATCTACCATTCCCTTTCAGTTCTCTA TTAATTCCAGTGGTGCATAGTGATCAAGGCAGAACACATTTTTCTTCACCAAATACG ACAAATAATCATGATGTAGATTCTAGTTCTATAAAATCCCATGGGAGAGATTATATAAACTTGGACCTATCAATTTGA
实施例2：含有MsMYB基因的重组载体pBI121-MsMYB的构建方法
1、构建载体pMD18T-MsMYB：
(1)连接反应体系：1μL的pMD18-T vector、3μL的目标基因(MsMYB)片段溶液、1μL的ddH2O、5μL的Solution I。反应温度16℃，反应时间12h以上(过夜)。
(2)连接MsMYB目的基因片段到克隆载体pMD18T上，连接产物利用热激法转入到大肠杆菌感受态中，其具体内容为：大肠杆菌感受态从-80℃冰箱中取出后迅速放到冰上，待其溶化后加入20μL的连接产物，冰浴30min；取出后快速放于42℃水浴热激1min 15s后，迅速***冰中，冰浴2min。加入800μL LB液体培养基，置于200rpm摇床，37℃，振荡1h；取出离心管，4000rpm离心5min，取出上清800μL，重悬剩余菌体，将剩余约200μL的菌液以体积比为3:1的比例涂于含有氨苄抗性的两个LB固体培养基上；37℃培养箱中倒置培养，过夜；挑取培养基上的单菌落进行鉴定，挑取阳性菌落进行扩增培养，利用质粒提取试剂盒提取pMD18T-MsMYB质粒。
2、构建重组载体pBI121-MsMYB：
(1)采用Xba I和Sma I对pBI121质粒(见图1)DNA进行双酶切，双酶切的反应体系为：65μL的pBI121质粒、10μL的TAKARA10×M Buffer、3.5μL的Xba I、3.5μL 的Sma I和10μL的BSA，得到pBI121质粒的酶切产物。
(2)采用Xba I和Sma I对pMD18T-MsMYB的质粒DNA进行双酶切，双酶切的反应体系为：50μL的PCR产物、10μL的10×M Buffer、2.5μL的Xba I、2.5μL的Sma I、 5μL的BSA和30μL的ddH2O，得到MsMYB的序列片段。
(3)采用DNA凝胶回收试剂盒回收MsMYB的序列片段和pBI121质粒的酶切产物；表达载体pBI121与MsMYB的序列片段连接，连接时的反应体系为：5μL的pBI121质粒DNA酶切产物、3μL的MsMYB序列片段、1μL的10×T4 DNA连接缓冲液和1μL的T4 DNA连接酶；反应条件是：反应温度16℃，反应12h-18h得到连接产物。
(4)重组质粒的鉴定：
菌落PCR鉴定，用含有Xba I和Sma I酶切位点的MsMYB基因引物进行PCR鉴定，反应体系为：7.μL的ddH2O、1μL的10×PCR Buffer(TAKARA)、0.8μL的dNTP Mix (2.5mmol/L)、0.4μL的MsMYB-Xba I(10μmol/L)、0.4μL的MsMYB-Sma I(10μmol/L)、 0.1μL的rTaqDNApolymerase(5μmol/L)、1μL的检测菌落样本。
单菌落反应程序(30循环)：
提取重组的pBI121-MsMYB的质粒DNA进行酶切验证，验证的反应体系为：6.6μL 的pBI121-MsMYB重组质粒、1μL的10×T Buffer、1μL的BSA、0.3μL的Xba I、0.3μL 的Sma I、0.8μL的ddH2O。
鉴定结果显示得到约660bp左右的目的条带，即表明成功获得重组质粒 pMD18T-MsMYB。
实施例3：携带MsMYB基因的重组表达转化体的制备
冻融法转化实施例2获得的重组质粒pBI121-MsMYB，方法如下：
①取-80℃保存的农杆菌感受态细胞置于冰中融化。
②将10μLpBI121-MsMYB重组质粒加入到100μL农杆菌感受态细胞GV3101中，用手拨打管底混匀。
③依次置于冰上静置5min，液氮5min，37℃水浴5min，冰浴5min。
④加入700μL无抗生素的YEB液体培养基，于28℃振荡培养2-3h。
⑤6000rmp离心1min收菌，留取100μL上清重悬菌块，将菌液涂布于含有卡那霉素(50mg/mL)+链霉素(50mg/mL)+利福平(50mg/mL)的YEB固体培养基上，倒置放于28℃培养箱中暗培养2-3d。
鉴定转化后的农杆菌，其鉴定方式为：挑取生长较为均匀的单菌落，用基因特异性引物进行菌落PCR扩增；鉴定的反应体系为：Template DNA菌落、1μL的10×Buffer、0.8 μL的dNTP Mix、0.2μL的MsMYB-Xba I、0.2μL的MsMYB-Sma I、0.1μL的rTaq和 7.7μL的ddH2O；反应条件为：①94℃、5min；②94℃、30s；③55.9℃、30s；④72℃、 1min；⑤72℃、10min；⑥4℃、1h；①～⑥循环30次。
实施例4：一种提高烟草抗倒伏能力的方法
培养烟草的种子达到成苗期，对烟草苗进行预培养处理，利用实施例3获得的表达MsMYB基因的农杆菌侵染预培养处理后的烟草苗，然后经过芽诱导、生根诱导和移栽驯化，得到携带MsMYB基因的烟草。
烟草种子培养的方法：
将野生型烟草种子置于灭菌的离心管中，用75％的酒精消毒3min，灭菌水冲洗6-8遍；再用1mL 10％的次氯酸钠处理5min，灭菌水冲洗6-8遍；将处理好的种子均匀的铺于MS固体培养基上，培养置长出小苗；将小苗移入装有MS固体培养基的瓶中，继续培养长到成苗期，叶片用于侵染实验。
预培养处理烟草苗的方法：将烟草叶片切成1cm×1cm左右的方形，预培养48h。
实施例3获得的表达MsMYB基因的农杆菌在侵染烟草苗前要进行活化，具体方法为：在超净工作台中将表达MsMYB基因的农杆菌涂布于含有Km、Str、Rif的YEB固体培养基上，28℃，倒置培养48h，然后用1/2MS液体培养基重悬菌落后得到菌液，再用1/2MS 将菌液稀释至OD600约为0.4-0.6左右。将上述所用菌液转移至50mL锥形瓶中用于侵染烟草。
侵染方法为：将经预培养处理后的烟草叶片放入活化后的表达MsMYB基因的农杆菌菌液中侵染6min，其间不断颠倒，以保证叶片充分接触到菌液，将叶片取出放置于无菌滤纸上，吸去附着的菌液，将叶片背面向上，放置于MS1的培养基上，暗培养2d。
芽诱导：将叶片转移至MS2培养基上进行芽诱导，每3天更换一次培养基，连续3 次后，每2周更换一次培养基。
生根诱导：待分化的小芽长至2cm左右，将分化的小芽切下，转移至MS3培养基中，进行生根培养。
如图2所示，通过农杆菌介导的叶盘法将MsMYB基因对烟草进行遗传转化，可获得卡那霉素抗性植株。
移栽驯化：将生根后的烟草幼苗转移至土中进行培养。
鉴定阳性植物的方法：对Km抗性植株进行PCR鉴定，以pBI121-MsMYB质粒为阳性对照，能扩增出约645bp左右的片段，且与阳性对照片段一致，可初步证明MsMYB 已转入烟草中，部分PCR鉴定结果如图3所示。
培养携带MsMYB基因的植物，将长大后的抗性植株移栽到含有土：蛭石为1：1的花盆中，统计植物茎秆直径与叶片表面积的情况，并与野生烟草的生长情况做对比。
对比结果如图4，图5和图6所示，转MsMYB基因的方法使烟草叶片表面积和茎秆直径显著提高，即表明MsMYB基因可以通过提高烟草的生物量以提高烟草的抗倒伏能力。
SEQUENCE LISTING
<110> 哈尔滨师范大学
<120> 紫花苜蓿MsMYB基因在提高植物抗倒伏能力中的应用
<160> 3
<170> PatentIn version 3.5
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Claims (9)

1.紫花苜蓿的MsMYB基因在提升烟草抗倒伏能力中的应用，其特征在于，所述MsMYB基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述应用是利用MsMYB基因获得转基因烟草，以提高烟草抗倒伏能力。
3.一种含有紫花苜蓿的MsMYB基因的重组载体在提升烟草抗倒伏能力中的应用，其特征在于，所述MsMYB基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述重组载体是将MsMYB基因重组到pBI121质粒上。
5.一种表达含有紫花苜蓿的MsMYB基因的重组载体的重组表达转化体在提升烟草抗倒伏能力中的应用，其特征在于，所述MsMYB基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述重组表达转化体的宿主为农杆菌。
7.一种提高烟草抗倒伏能力的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）构建重组载体：将MsMYB基因重组到pBI121质粒上，获得重组载体pBI121-MsMYB，所述MsMYB基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；
（2）制备携带MsMYB基因的农杆菌：将步骤（1）得到的重组载体pBI121-MsMYB转入到农杆菌感受态中进行培养，得到携带MsMYB基因的农杆菌；
（3）获得携带MsMYB基因的转基因烟草：培养烟草种子到成苗期，对烟草苗进行预培养处理，然后用步骤（2）中得到的农杆菌侵染经预培养处理后的烟草苗，再经过芽诱导、生根诱导和移栽驯化，得到携带MsMYB基因的转基因烟草。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤（1）所述重组载体的构建方法具体为利用限制性内切酶分别酶切载体pMD18T-MsMYB和pBI121质粒，得到MsMYB基因的序列片段与pBI121质粒的酶切产物，然后将MsMYB基因的序列片段与pBI121质粒的酶切产物进行连接反应，得到的重组载体pBI121-MsMYB。
9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤（3）所述侵染的具体步骤如下：
1)将携带MsMYB基因的农杆菌涂布于含有卡那霉素、链霉素和利福平的YEB固体培养基上，在28℃条件下，培养48h；
2)利用1/2MS液体培养基重悬步骤1)得到的农杆菌的菌落，得到农杆菌的菌液，再用1/2MS液体培养基将菌液稀释至OD600值为0.4-0.6；
3)取烟叶叶片，在步骤2)得到的农杆菌的菌液中侵染6 min-7 min，将烟草叶片取出放置于无菌滤纸上，吸去附着的菌液，放置于MS1培养基上，在黑暗条件下培养2天。
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