CN115011499B - 一种马铃薯淀粉废水处理菌剂 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种马铃薯淀粉废水处理菌剂，所述菌剂包含一种贝莱斯芽孢杆菌菌株，其特征在于该菌株于2021年11月29日保藏于中国典藏培养物保藏中心，地址：湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内，保藏号为CCTCC M 20211501。本发明还提供了利用该菌种制备废水处理菌剂的方法，该菌种和菌剂能够有效降解马铃薯淀粉废水。

Description

一种马铃薯淀粉废水处理菌剂

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，具体地说是一种马铃薯淀粉废水处理菌剂制备方法及应用。

背景技术

随着我国生态文明建设地位和作用日益凸显，如何合理经济的降解马铃薯淀粉加工过程产生的高浓度有机废水并利用马铃薯渣的问题在马铃薯生产行业内变得十分突出。有研究表明1t马铃薯加工淀粉可以产生0.7～1.0t的高浓度有机废水，这些废水主要为马铃薯细胞液和淀粉洗涤水，排放不当会导致环境的严重污染，给人们的生产生活环境带来损伤。目前，国内外企业普遍采用生物处理法作为马铃薯淀粉废水处理方法。生物处理法主要有厌氧生物处理法、好氧生物处理法和联合生物处理法三大类。常用的生物处理装置有升流式厌氧污泥床、厌氧膨胀颗粒污泥床、厌氧折流板反应器、微生物燃料电池和膜生物反应器等。这些生物处理装置的核心都是接种厌氧污泥或活性污泥后，通过驯化形成具有马铃薯淀粉废水处理能力的核心功能微生物群。然而微生物的生长对温度要求很高，大部分的微生物生长的适宜温度在25℃左右，在低温环境微生物的生长将受到广泛限制。因此，亟待寻找一种能够在低温环境下有效的高浓度马铃薯淀粉废水修复方法。

固定化微生物技术是将选定的微生物固定在无毒害作用的载体上，限制其活动的空间区域，具有高度的密集性和较长的生物活性。在适宜条件下能够快速、大量增殖，在相对贫乏的条件下能够较长地维持自身活性。固定化微生物菌剂具有生物浓度易控制、耐毒害能力强、外部环境要求低等特点。近年来固定化微生物技术的研究十分活跃，已被广泛应用于环境保护、食品工业、医学和制药等多种领域。生物炭作为固定化微生物优良载体之一，具有比表面积大、孔隙度丰富的特点。生物炭可以为微生物的生长和繁殖提供较好的生长环境，并为附着在生物炭上的微生物提供一个稳定的周边环境，使得菌株对温度和酸碱度展现更广泛的适应性。通过生物炭的固定化提高了降解效果，同时固态菌剂便于储存和运输，对降低菌剂运输和使用成本具有重要意义。

因此，本发明采用从马铃薯淀粉废水沉淀物中分离筛选的马铃薯淀粉废水处理菌株制备微生物菌剂，使其能够在自然环境中快速增殖，作为即投即用的马铃薯淀粉废水处理菌剂，以解决马铃薯淀粉废水的高效处理的难题。

现有技术存在的问题：

(1)马铃薯淀粉加工生产具有季节性，我国的马铃薯淀粉加工时间主要集中在八月中旬至次年一月份，大部分加工时间处于冬季，环境温度低。目前，生物处理方法对温度要求较高，有的甚至需要将温度控制在35℃，这样无疑需要耗费大量能源，加大马铃薯淀粉加工企业处理马铃薯淀粉废水的负担。在低温条件下，现有的生物处理方法处理效率不高，常常出现大量降解马铃薯淀粉废水核心功能菌株的死亡现象，严重影响菌株对马铃薯淀粉废水的降解性能。

(2)马铃薯淀粉废水具有COD浓度高，常常是间歇排放，单次排放量大的特点。目前，升流式厌氧污泥床、膨胀颗粒污泥床、厌氧内循环反应器等生物处理装置抗冲击性能较差。这些生物处理装置在多次使用后，因为内部菌株的流失减少，其对马铃薯淀粉废水降解能力会逐次下降。所以，这些生物处理装置经常需要更换其内部菌种，以维持对马铃薯淀粉废水的降解效能。

发明内容

鉴于现有技术的不足，本申请欲解决马铃薯淀粉废水在现实环境中降解效率低，生物处理装置抗冲击性差的问题，通过从马铃薯淀粉废水沉淀物中分离筛选能够降解马铃薯淀粉废水的菌株，进一步利用马铃薯淀粉加工厂的产生的废弃物(薯渣)烧制生物炭作为微生物载体制备微生物菌剂，使其能够在快速适应环境，作为即投即用的马铃薯淀粉废水处理菌剂。

本发明采用如下技术方案：

1.一种贝莱斯芽孢杆菌Bacillus velezensis GAU35，该菌株于2021年11月29日保藏于中国典藏培养物保藏中心，地址：湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内，保藏号为CCTCC M 20211501。

2.一种贝莱斯芽孢杆菌Bacillus velezensis GAU35在马铃薯淀粉废水处理中的应用。

3.一种筛选分离如权利要求1所述贝莱斯芽孢杆菌Bacillus velezensis的方法，其特征在于包括：(1)样品的采集；(2)对来自马铃薯淀粉废加工厂活性污泥中的微生物进行分离；(3)菌株体培养及其生长能力检测；(4)细菌降解马铃薯淀粉废水能力的测定；(5)菌株的鉴定。

4.一种废水处理菌剂制作方法，其特征在于包括：

(1)烧制生物炭固定化载体

收集马铃薯淀粉生产过程中产生的马铃薯渣，在烘箱80℃烘干，粉碎，用0.20mm标准筛筛取。将称取一定量的样品放入陶瓷舟内置于管式炉中，在氮气保护的条件下以10℃/min的升温速率，烧制生物炭的温度分别在550℃、350℃、450℃、550℃、650℃、750℃、850℃恒温热解2h，自然冷却至室温，所得产物即为生物炭，称重计算得率。烧制生物炭的温度分别为550℃、350℃、450℃、550℃、650℃、750℃、850℃。图中可以看出在250℃烧制的生物炭得率最高，但是由于烧制温度较低，生物炭呈红褐色，未烧透彻所以不可用，在烧制温度达到550℃生物炭得率趋于稳定，从节省能源与节省时间考虑，本实验采用550℃烧制的生物炭。之后将生物炭在研钵中磨碎，过0.20mm标准筛，得到微米粒径的生物炭，用分别用5％的盐酸浸泡8h，再用蒸馏水浸泡8h，然后用蒸馏水洗至中性，最后在80℃烘干，制得马铃薯渣生物炭。

(2)添加如权利要求1所述菌种并培养

称取生物炭1g置于250mL的锥形瓶内121℃高压灭菌20min。之后将制备好的菌悬液40ml加入250mL锥形瓶，轻轻摇晃至生物炭分散在悬液中，放入恒温摇床(25℃，180rpm)培养12h，并每间隔两小时测定其悬液中菌的含量。如图6所示，测定菌株的生物炭固定化时间。将固定化微生物菌悬液倒入50mL离心管内，以5000r/min离心10min，离心结束后弃去上清液，进行冷冻干燥。冷冻干燥后的生物炭固定化微生物粉末放在4℃冰箱保存。

(3)微生物菌剂降解马铃薯淀粉废水效能分析

菌株的准备：将菌株GAU35制备成菌悬液。将菌悬液与生物炭吸附固定8h左右。将固定化的微生物用冷冻干燥的方法制备成固体菌剂。将固定化菌剂应用于COD浓度为2500mg/L左右的淀粉废水中，通过与未固定化的GAU35和未加菌的生物炭进行比较发现，我们所制备的固定化微生物菌剂在马铃薯淀粉废水COD去除方面具有很好的效果。利用我们制备的生物炭固定化我们分离的菌株GAU35，使得菌株能够快速适应环境，高效处理马铃薯淀粉废水。

有益效果：在纯培养条件下，菌株GAU35对马铃薯淀粉废水COD和TOC都具有明显的降解作用，根据图2，初始COD浓度为2000mg/L的马铃薯淀粉废水被GAU35降解12h后，COD和TOC都具有明显的下降，COD从2200mg/L下降至1400mg/L，TOC从2000mg/L下降至1200mg/L。与纯培养相比微生物菌剂有更加明显的马铃薯淀粉废水处理效果。根据图7，在同样的马铃薯淀粉废水中，微生物菌剂(GAU35+Biochar)短时间内对马铃薯淀粉废水的COD去除效率可达50％以上，随着处理时间的延长，处理效果可以达到70％以上。该菌剂的制作过程中使用的载体材料为马铃薯渣，从社会效益和环境效益来讲是一种廉价和环保的材料，而且生物炭对废水具有一程度的吸附作用。本发明结合了生物炭和微生物对马铃薯淀粉废水的双重处理效果，比传统的淀粉废水处理方法更加环保和高效。

附图说明

图1为菌株GAU35的生长曲线图。

其中，菌株GAU35在培养温度为25℃，转速为180rpm的LB基础培养基中的生长情况，由图可以看出在培养12h时，菌株就达到了对数生长，说明该菌株在以上培养条件下能够快速生长。

图2为菌株GAU35对马铃薯淀粉废水的降解能力。

其中，图2是通过测定GAU35处理前后，马铃薯淀粉废水COD和TOC的变化，随着培养时间的后移，马铃薯淀粉废水中的COD和TOC含量都在不断降低，而且在培养12h后马铃薯淀粉废水中COD和TOC的含量明显降，说明菌株GAU35对马铃薯淀粉废水具有处理能力

图3为生物炭制备条件的探索。

其中，图3A是对烧炭温度的探索，根据研究结果，随着生物炭裂解温度的不断提升，生物炭的产量趋近于稳定，在温度为550℃时，生物炭产量基本稳定，说明在这个温度下烧制的生物炭灰分完全去除，达到生物炭的生产标准。图3B是利用不同温度下制备的生物炭去吸附固定微生物，结果表明，制炭温度达到550℃后，对微生物的吸附效率也达到最高。所以综上所述，550℃为制备马铃薯渣生物炭的最佳温度。

图4为马铃薯渣生物炭烧制流程图。

其中，生物炭的制作烧制流程主要分为三部分，首先是马铃薯渣的前处理，淀粉生产后产生的薯渣含有大量的水分，且颗粒较大无法直接用于生物炭的烧制，需要烘干后粉碎过筛。为了保证薯渣生物炭在烧制后具有一定的孔径和微孔数量，还需要进一步对薯渣进行预处理，用一定浓度的氯化锌预处理，使其在生物炭成型过程中保持微孔的数量。最后一步是对裂解后生物炭的清洗，去除一些杂质，得到纯净的生物炭。

图5为不同视野下生物的形态。

其中，图5a为眼视野下的生物炭呈现纯黑色，没有褐色和灰白色的物质，证明生物炭的裂解过程是完全无氧条件下完成的。图5b为在光学显微镜下可以看到生物炭是不规则的松散状态，不是紧实的堆积的颗粒，证明该状态下制备的生物炭具有吸附微生物和其他有机物的潜能。图5c是通过扫描电镜发现了生物炭具有许多介孔，就更加充分的证明了生物炭的吸附潜能。

图6为菌株GUA35的固定化时间。

其中，我们用所制备的生物炭对不同初始浓度的菌株GAU35进行吸附固定，实验结果表明，该生物炭对不同浓度菌株的固定化时间基本是一致的。从图6我们可以看出，无论是哪种初始浓度，马铃薯渣生物炭对菌株GAU35固定化时间基本稳定在8h左右。8h以后生物炭对微生物的吸附已经达到饱和，不会在发生改变，从中我们可以确定，我们所制备的马铃薯渣生物炭对菌株GAU35的固定化时间约为8h左右。

图7为固定化微生物菌剂对马铃薯淀粉废水的降解能力。

其中，Biochar为马铃薯渣生物炭，GAU35+Biochar为微生物菌剂，通过与未固定化的菌株GAU35和纯生物炭进行比较发现，我们所使用的固定化微生物菌剂在马铃薯淀粉废水COD去除方面具有一定的潜力和效率，我们的制备的固定化微生物菌剂在24h时对马铃薯淀粉废水具有较强的降解能力。

具体实施方式

为使发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面结合附图对本发明的具体实施方式进行详细说明。这些优选实施方式的示例在附图中进行了例示。附图中所示和根据附图描述的本发明的实施方式仅仅是示例性的，并且本发明并不限于这些实施方式。在此，还需要说明的是，为了避免因不必要的细节而模糊了本发明的技术方案，在附图中仅仅示出了与根据本发明的方案密切相关的结构和/或处理步骤，而省略了关系不大的其他细节。

实施例1

该实施例提供一种能高效降解马铃薯淀粉废水的菌株，所述菌株是Bacillusvelezensis GAU35(GAU为甘肃农业大学英文缩写，35为序列号)，该菌株于2021年11月29日保藏于中国典藏培养物保藏中心(CCTCC)，地址：湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内，保藏号为CCTCC M 20211501，保藏证明出具时间为2021年12月6日。

实施例2

本实施例提供了一种马铃薯淀粉废水处理菌株分离方法，包括：

1.采集马铃薯淀粉加工厂排污口的污泥

泥土样品采自位于甘肃省定西市境内马铃薯淀粉加工厂。该工厂海拔为1889.7m。样品采集后立即装入无菌的封口袋并置于车载冰箱，运抵实验室后于-20℃保存备用，实验选取其中沉积物样品进行分离研究。

2.培养与分离纯化菌种

(1)称取土样30g，迅速倒入装有100mL无菌水的500mL三角瓶中，振荡5～10min，使土样充分打散，制备土壤悬液。将无菌移液管吸取LB液体培养基200mL加入到土壤菌悬液中，于15℃下富集培养36h。

(2)配置10^-2、10^-4、10^-6、10^-8稀释菌液，吸取100μl菌液滴加到培养基表面。将分别将不同稀释浓度的菌液分别涂布于不同氮源的分离培养基上，分别放置在5℃、10℃、15℃、20℃培养箱中倒置培养，挑取单菌株。

(3)分离菌株的初步鉴定

吸取800μl菌液于提前准备好的已灭菌的1.5ml离心管中离心弃上清，使用细菌DNA提取试剂盒提取基因组DNA，送样测序。将测序结果通过Blast程序提交到GenBank数据库中进行相似性比对搜索，确定其相关属、种近缘菌株类别筛选的菌株。

3.检验功能菌株对马铃薯淀粉废水的降解性能

根据分离菌株所属的分类学地位，在每个属中挑取1～2株菌株进行验证对马铃薯淀粉废水的降解效能。

实施例3

本实施示例提供了一种微生物菌剂的制作方法，包括：

1.烧制生物炭

收集马铃薯淀粉生产过程中产生的马铃薯渣，在烘箱80℃烘干，粉碎，用0.20mm标准筛筛取。将称取一定量的样品放入陶瓷舟内置于管式炉中，在氮气保护的条件下以10℃/min的升温速率，烧制生物炭的温度分别在550℃、350℃、450℃、550℃、650℃、750℃、850℃恒温热解2h，自然冷却至室温，所得产物即为生物炭，称重计算得率。如图3A所示，烧制生物炭的温度分别为550℃、350℃、450℃、550℃、650℃、750℃、850℃。图中可以看出在250℃烧制的生物炭得率最高，但是由于烧制温度较低，生物炭呈红褐色，未烧透彻所以不可用，在烧制温度达到550℃生物炭得率趋于稳定，从节省能源与节省时间考虑，本实验采用550℃烧制的生物炭。之后将生物炭在研钵中磨碎，过0.20mm标准筛，得到微米粒径的生物炭，用分别用5％的盐酸浸泡8h，再用蒸馏水浸泡8h，然后用蒸馏水洗至中性，最后在80℃烘干，制得马铃薯生物炭，流程如图4所示。

2.制备处理马铃薯淀粉废水微生物菌剂

称取生物炭1g置于250mL的锥形瓶内121℃高压灭菌20min。之后将制备好的菌悬液40mL加入250mL锥形瓶，轻轻摇晃至生物炭分散在悬液中，放入恒温摇床(25℃，180rpm)培养12h，并每间隔两小时测定其悬液中菌的含量。如图6所示，测定菌株的生物炭固定化时间。将固定化微生物菌悬液倒入50mL离心管内，以5000r/min离心10min，离心结束后弃去上清液，进行冷冻干燥。冷冻干燥后的生物炭固定化微生物粉末放在4℃冰箱保存。

实施例4

本实施例提供了一种马铃薯淀粉废水处理菌剂的应用，包括：

马铃薯渣烧制生物炭固定化菌株GAU35，对马铃薯淀粉废水COD的降解效率。(1)菌株的准备，将菌株GAU35制备成菌悬液。(2)将菌悬液与生物炭吸附固定8h左右。(3)将固定化的微生物用冷冻干燥的方法制备成固体菌剂。(4)将固定化菌剂应用于COD浓度为2500mg/L左右的淀粉废水中，通过与未固定化的GAU35和未加菌的生物炭进行比较发现，我们所使用的固定化微生物菌剂在马铃薯淀粉废水COD去除方面具有一定的潜力和效率，通过我们的制备的生物炭固定化我们分离的菌株GAU35，使得生物法对快速适应环境，进行高效的马铃薯淀粉废水处理。

以上所述仅是本申请的具体实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本申请的保护范围。

Claims (2)

1.一种贝莱斯芽孢杆菌BacillusvelezensisGAU35，其特征在于该菌株于2021年11月29日保藏于中国典藏培养物保藏中心，地址：湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内，保藏号为CCTCCM20211501。

2.根据权利要求1所述的一种贝莱斯芽孢杆菌BacillusvelezensisGAU35在马铃薯淀粉废水处理中的应用。

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