CN115010940A - 一种铝基金属有机骨架材料及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于先进多孔材料技术应用领域，具体为一种铝基金属有机骨架材料及其制备方法和应用。本发明以价格低廉的六水合氯化铝和3,5‑吡唑二羧酸为原料，可大规模制备亲水性铝基金属有机骨架材料（Al‑MOFs），该铝基金属有机骨架材料具有良好的水稳定性和亲水的1D孔道，以及大的比表面积及合适的孔径尺寸，在标准糖基化肽段样品的富集中表现出优异的循环稳定性（10次），以及超低的灵敏度（0.5 fmol/μL）。进一步，Al‑MOFs材料被成功应用于糖尿病疾病发生发展进程中不同阶段（正常、肥胖、糖尿病前期和糖尿病）糖基化肽段的差异性分析。表明该材料可应用于临床大规模样本中糖基化蛋白质组学的分析研究。
Description
技术领域
本发明属于生物材料技术领域，具体涉及一种铝基金属有机骨架材料及其制备方法和在糖尿病发生发展过程中糖基化肽段富集的应用。
背景技术
2型糖尿病是严重威胁全球人类健康的慢性病之一，其病症包含高血糖、胰岛素抵抗，及葡萄糖稳态破坏。而长期高血糖将影响其它器官并伴随着多种并发症产生，最后导致患者死亡率增高。大部分糖尿病患者直到出现糖尿病引起的并发症才被诊断出来，40%的未确诊病例会进一步发展为肾脏疾病等并发症，增加死亡风险。因此，开发早期糖尿病检测新方法将有助于疾病的有效治疗以及预防糖尿病引起的并发症。
蛋白的糖基化修饰调控蛋白质的各项功能，并且参与机体诸多复杂的生理过程，研究发现蛋白糖基化修饰与糖尿病的发生发展相关。基于全基因组关联研究（GWAS），能够调控N-糖基化相关的基因被证实与糖尿病发生发展呈相关性。此外，血浆蛋白N-聚糖结构的复杂性也被发现与2型糖尿病进展风险相关。例如，在欧洲和东南亚血统的队列中，ST6β-半乳糖苷α-2, 6-唾液酸转移酶1（ST6GAL1）促进 α2, 6-连接唾液酸向含半乳糖的转移底物已被证明与2型糖尿病有关，这证实了高度支链化的N-聚糖可能与糖尿病的患病风险相关。相反的，蛋白质糖基化也同时被发现在预防糖尿病方面发挥重要的作用。例如，葡萄糖转运蛋白2（glut-2）是一种葡萄糖传感器，用于调节β细胞中的胰岛素分泌，并需要N-糖基化以使其保留在β细胞表面，从而维持葡萄糖转运。glut-2糖基化受阻导致膜glut-2和胰岛素分泌减少，最终导致糖尿病。基于以往研究结果，在糖尿病发生发展过程中，蛋白质糖基化可能在促进及预防疾病进展中发挥不同的作用。为了能全面了解糖基化对疾病发展的作用，迫切需要对糖蛋白的修饰和糖基化位点进行全面解析表征，以深入了解糖尿病的发生发展机制以及发现有前景的检测生物标志物。然而，在临床应用研究中，直接使用质谱鉴定血液中位点特异的聚糖修饰的糖蛋白具有很大挑战性。主要存在以下几点原因：（1）临床样本高度复杂，种类繁多；（2）糖基化蛋白质的动态范围宽，波动变化大；（3）与非糖基化肽段相比，糖基化肽段丰度极低, 难检测识别。因此，在质谱分析前对复杂生物样品中的糖基化肽段进行富集分离是成功解析糖基化蛋白的关键，也是解析疾病发生发展过程中糖基化肽段变化的关键。
诸多研究策略被提出用于糖基化肽段的分析研究，其中亲水性相互作用因其无偏倚富集能力、保留完整的糖肽信息、优良的生物相容性和良好的重现性而获得青睐。虽然这些开发的亲水性复合材料被用于捕获糖肽类，并显示了令人鼓舞的结果，但这些复合材料的合成通常需要繁琐的功能化步骤，高能耗过程，并使用昂贵和对环境不友好的试剂。这不仅极大地限制了其规模化生产，也制约其后续商业化应用。因此，进一步探索绿色环保、价格具有竞争力、便于大规模生产的亲水性材料，用于疾病发生发展过程中糖基化肽段的分析研究是十分重要的。
发明内容
本发明目的在于提供一种制备方法简单、稳定性好、生物兼容性好的铝基金属有机骨架材料及其制备方法和在糖尿病发生发展过程中糖基化肽段富集的应用。
本发明提供的铝基金属有机骨架材料的制备方法，具体步骤如下：
（1）将氢氧化钠和3，5-吡唑二羧酸溶解在纯水溶液中，获得混合溶液；所述氢氧化钠和3，5-吡唑二羧酸的重量比为：1：（1-3）；
（2）将步骤（1）中所得混合溶液在超声下反应1-3h，得到混合液；
（3）将六水氯化铝加入到步骤（2）得混合溶液中，超声分散至溶解，六水氯化铝溶液的浓度为1.5-6.0 mmol/L；于80-110 ℃下反应6-12h，冷却至室温，得到反应产物；然后用去离子水充分洗涤反应产物，得到固体物质在将滤饼，再在40-80 ℃下真空干燥10-24h，得到的产物，即为目标铝基金属有机骨架材料，记为Al-MOFs。
本发明步骤（1）中，优选氢氧化钠和3，5-吡唑二羧酸的重量比为1:（1-2.5），更优先重量比为1:2.5。
本发明步骤（2）中，优选超声反应1-2h，更优选超声反应2h。
本发明步骤（3）中，优选六水氯化铝溶液的浓度为1.5-4.0 mmol/L，更优选浓度为4.0 mmol/L。
本发明步骤（3）中，反应温度优选80-100 ℃。
本发明制备的铝基金属有机骨架材料，具有大比表面积、良好的亲水性孔道结构和稳定的生物相容性，易于合成制备、便于商业化推广。
本发明提供的铝基金属有机骨架材料，对于糖基化肽具有高效的分离效应、强富集选择性，以及优异的循环稳定性（10次），以及超低的灵敏度（0.5 fmol/μL），可用于临床复杂样品中糖基化肽的选择性分离、富集与质谱鉴定中。
进一步地，具体步骤为：将铝基金属有机骨架材料与样品的糖基化肽溶液充分混合，加入80-95 %乙腈/0.1-1.0 %三氟乙酸缓冲液中，分散均匀，在30-40 ℃酶解仪中孵育；离心分离出材料，用80-95 %乙腈/0.1-1.0 %三氟乙酸缓冲液洗涤材料3-5次，用25-35 %乙腈/0.1-1.0 %三氟乙酸洗脱；取0.5-1.5 μL洗脱液点在MALDI-TOF-MS靶板上，自然干燥后再滴加0.5-1.5 μL浓度为15-25 mg/mL的2，5-二羟基苯甲酸（DHB）溶液于被分析物液滴上，形成薄层基质，干燥后进行质谱分析。
具体地，本发明制备的铝基金属有机骨架材料，可用于临床血清样品（正常人、肥胖、糖尿病前期和糖尿病人群）中的糖肽的富集鉴定及其糖基化蛋白质组学的分析。经过上述合成的以铝基金属有机骨架材料进行选择性富集后，进行质谱高通量检测，使得原本无法鉴定到的糖基化肽在信号强度上有大幅度提高，以得到清晰、信噪比高的糖基化肽段信号峰。该富集策略已经实践于标准HRP蛋白酶解液、HRP蛋白酶解液与牛血清白蛋白（BSA）和HRP蛋白混合溶液、人血清等多项实验中，并且能够在糖尿病发生发展进程中通过糖基化蛋白质差异进行疾病区分分型。
本发明的有益效果在于：
铝基金属有机骨架材料的合成方法操作简便，原料便宜易得，易于大规模生产；该多孔材料由于具有大的比表面积，合适的亲水性和孔径结构，能够在分离鉴定糖肽的同时成功排除掉大分子蛋白等其他杂质的干扰，在临床复杂样本（糖尿病发生发展进程中）的应用中达到了令人满意的效果。实验结果充分证明，本发明制得的铝基金属有机骨架材料具有优异的稳定性和生物兼容性以及高效选择性分离鉴定糖肽的能力，适用于人体血清、各种组织提取物、各类细胞蛋白等复杂生物样品中糖肽的分离鉴定。该铝基金属有机骨架材料将来可能应用于不同类型、时期的疾病患者的血清/尿液样品中糖肽的分析鉴定，从而发现与疾病相关的潜在生物标志物，有商业化的潜力。
附图说明
图1为铝基金属有机骨架材料的合成流程图。
图2为实施例1中Al-MOFs材料扫描电子显微镜照片。
图3为实施例2中10-6 M的HRP酶解液（a）和（b）经以铝基金属有机骨架材料选择性富集后的质谱图。
图4为实施例3中质量比为1：500: 500的HRP蛋白酶解液、HRP蛋白和BSA蛋白混合溶液（a）、（b）选择性富集前和（c）、（d）经铝基金属有机骨架材料选择性富集后的质谱图。
图5为实施例4中结合铝基金属有机骨架材料应用于临床血清样本（正常人、肥胖、糖尿病前期和糖尿病人群）中糖基化肽段的富集分离。其中，（a）为基于PLS-DA模型分析，（b）为维恩图分析，（c）为热图及趋势分析。
具体实施方式
实施例1：铝基金属有机骨架材料的合成方法，流程如图1所示，具体如下：
（1）将0.27 g氢氧化钠和0.76 g 3，5-吡唑二羧酸溶解在纯水溶液（75 mL）中，获得混合溶液A；
（2）将步骤（1）中所得混合溶液A在超声下反应2h，所得混合液记为B；
（3）将1.06 g六水氯化铝加入到步骤（2）中所得混合液B中，超声分散至溶解，于90℃下反应10h，冷却至室温，得到反应产物，并用去离子水充分洗涤，得到的固体物质在将滤饼在50 ℃下真空干燥18h，得到的产物C即为目标铝基金属有机骨架材料（Al-MOFs材料）。
产物C的扫描电子显微镜照片见图2（a，b）。
实施例2：将实施例1制备的铝基金属有机骨架材料用于标准HRP酶解液中糖基化肽的分离、富集与MALDI-TOF-MS检测。
（1）标准HRP蛋白酶解液的制备：准确称取1 mg标准蛋白HRP溶于25 mM碳酸氢铵缓冲液中，100 ℃下煮沸10分钟，冷却至室温，用25 mM碳酸氢铵缓冲液稀释到1 mg/mL，然后按照与蛋白质量比1：40加入适量的胰蛋白酶，37 ℃下过夜酶解18小时。
（2）将10 mg的铝基金属有机骨架材料用含95 %乙腈/0.1 %三氟乙酸缓冲液洗涤3次，之后分散于1 mL的95 %乙腈/0.1 %三氟乙酸缓冲液中，超声分散至均匀，配置成10 mg/mL溶液。
（3）糖基化肽的富集：取50 μL步骤（2）所得溶液，加入50 μL的95 %乙腈/0.1 %三氟乙酸缓冲液；之后加入HRP标准蛋白酶解液，使得肽段含量为10-6 M，在37 ℃下孵育反应40分钟；离心分离，得到富集了糖肽的Al-MOFs材料，用200 μL95 %乙腈/0.1 %三氟乙酸缓冲液洗涤三次以除去非糖肽和其它杂质，随后用10 μL 30 %乙腈/0.1 %三氟乙酸缓冲液洗脱30分钟，离心分离获得洗脱的肽段溶液。
（4）点靶：取1 μL步骤（3）所述洗脱液点到MALDI-TOF-MS靶板上，室温下置于空气中自然干燥后，再取1 μL的 2,5-二羟基苯甲酸溶液(20 mg/mL的50% ACN溶液)作为基质滴于被分析物液滴上，产生薄基质层，干燥；以后进行质谱分析。
如图3可以看出，在富集前，10-6M的HRP标准蛋白酶解液中难以鉴定到糖基化肽段，质谱图以非糖肽为主（图3（a）），然而经过铝基金属有机骨架材料富集之后，质谱图中出现了23条HRP蛋白的糖基化肽峰，且糖基化肽的信号峰得到了显著提升（图3（b））。
实施例3：将实施例1得到的铝基金属有机骨架材料用于HRP酶解液与HRP蛋白和牛血清白蛋白（BSA）蛋白混合溶液的富集与MALDI-TOF-MS检测。
（1）按蛋白质量比1：500：500将HRP酶解液与HRP和BSA蛋白溶液进行混合，取2 μL标准混合溶液加到150 μL 95 %乙腈/0.1%三氟乙酸缓冲液中，再加入50 μL的铝基金属有机骨架材料的分散液（浓度为10 mg/mL），37 ℃下孵育40分钟；离心分离，用200 μL 95 %乙腈/0.1 %三氟乙酸缓冲液洗涤三次后，用10 μL 30 %乙腈/0.1 %三氟乙酸缓冲液洗脱30分钟，离心分离。
（2）点靶：取1 μL步骤（2）所述洗脱液点到MALDI-TOF-MS靶板上，室温下置于空气中自然干燥后，再取1 μL的 2，5-二羟基苯甲酸溶液(20 mg/mL的50% ACN溶液)作为基质滴于被分析物液滴上，产生薄基质层，干燥后进行质谱分析。
如图4可以看出，在富集前，质量比1:500:500的HRP酶解液与HRP蛋白和BSA蛋白混合溶液中难以鉴定到糖基化肽段峰（图4（a））；然而混合溶液经过铝基金属有机骨架材料富集后，质谱中清楚地呈现了大量糖基化肽峰（图4（c））。在质谱线性模式下，富集前的上清液中鉴定到HRP蛋白和BSA蛋白（图4（b）），而在富集后的洗脱液中没有观察到任何蛋白的信号峰（图4（d））。
实施例4：将实施例1得到的铝基金属有机骨架材料用于临床样本（正常人、肥胖、糖尿病前期和糖尿病人群）血清酶解溶液中糖基化肽的富集与nano-LC-MS/MS检测。
（1）临床血清酶解液的制备：1 μL人血清用去离子水液稀释到20 μL，在14000 rmp转速下离心15分钟。收集上清液，加入10 mM二硫苏糖醇在60°C下反应30分钟，之后加入20mM吲哚乙酸避光在37 ℃下反应60分钟。冷却后按照蛋白与丙酮溶液的体积比为1:6情况下加入丙酮在-20°C下进行蛋白沉淀，过夜反应12小时。蛋白酶解前，用50 mM碳酸氢铵溶液进行稀释，得到最终的蛋白溶度为2 mg/mL，之后按照与蛋白质量比1：30向上清液中加入适量的胰蛋白酶，37 ℃下酶解16小时。
（2）糖基化肽段的富集：取200 μL人血清的酶解液和 100 μL铝基金属有机骨架材料的分散液（浓度为10 mg/mL），加到150 μL 95 %乙腈/0.1 %三氟乙酸缓冲液中，37 ℃下孵育混旋反应40分钟；离心分离，用300 μL 95 %乙腈/1.0 %三氟乙酸缓冲液洗涤三次后，用20 μL 30 %乙腈/0.1 %三氟乙酸缓冲液洗脱30分钟，离心分离。
（3）将洗脱的肽段样品完全冻干，干粉用8 μL色谱流动相A相（0.1 %甲酸水溶液）溶解，17000 rpm下离心15分钟，吸取上清液；取3μL进样，设定线性分离的色谱流动相B（0.1%甲酸乙腈溶液）从2 % 到40 %，再以300 nL/min流速进行洗脱分析。
利用铝基金属有机骨架材料进行富集，在1μL血清中共鉴定到216个糖基化肽段，121个糖基化蛋白。并且基于PLS-DA模型剖析样本间鉴定到的糖基化蛋白的差异可以清晰的区分正常人、肥胖、糖尿病前期和糖尿病患者血清样本（图5a）。从分层聚类热图中可以看出，随着糖尿病的进展，三组糖肽的表达水平有规律地变化。与正常人群组相比，肥胖组、糖尿病前期组和糖尿病组糖蛋白表达水平明显更高（图5c①）。其次也有随着糖尿病的发展逐渐减少的趋势（图5c②）。另外也观察到糖尿病组有些糖蛋白发生了急剧下降趋势（图5c③）。以上结果表明，鉴定出的差异糖肽和糖蛋白可作为糖尿病不同发展阶段的潜在生物标志物。
实施例5：铝基金属有机骨架材料的合成方法的具体步骤同实施例1，其不同之处为：实施例1（3）中反应时间变为5h。
实施例6：将实施例5获得的铝基金属有机骨架材料用于标准HRP酶解液中糖肽的富集分离与质谱检测，富集与检测的具体步骤同实施例2中的（1）、（2）和（3）。
经过实施例5获得的铝基金属有机骨架材料富集之后，质谱图中仅出现了16条HRP蛋白的糖肽信号峰，且最高信号强度仅8000多，说明反应时间对富集效果有不利影响。
实施例7：铝基金属有机骨架材料的合成方法的具体步骤同实施例1，其不同之处为：实施例1（3）中六水氯化铝的投料量减少为0.58 g。
实施例8：将实施例7获得的铝基金属有机骨架材料用于标准HRP酶解液中糖肽的富集分离与质谱检测，富集与检测的具体步骤同实施例2中的（1）、（2）和（3）。
经过实施例7获得的铝基金属有机骨架材料富集之后，质谱图中仅出现了18条HRP蛋白的糖肽信号峰，且最高信号强度仅9000多，说明MOFs材料孔径的形成对富集效果有一定影响。
实施例9：将实施例1获得的铝基金属有机骨架材料用于标准HRP酶解液中糖肽的富集分离与质谱检测，富集与检测的具体步骤同实施例2中的（1）、（2）和（3），仅实施例2中的（2）的30 %乙腈/0.1 %三氟乙酸缓冲液溶液变为50 %乙腈/0.1 %三氟乙酸缓冲液。
实施例9条件下富集分离糖肽后，质谱图中仅出现了14条HRP蛋白的糖肽信号峰，说明ACN/H2O洗脱溶液浓度对富集效果也会产生影响。
Claims (9)
1.一种铝基金属有机骨架材料的制备方法，其特征在于，具体步骤如下：
（1）将氢氧化钠和3，5-吡唑二羧酸溶解在纯水溶液中，获得混合溶液；所述氢氧化钠和3，5-吡唑二羧酸的重量比为：1：（1-3）；
（2）将步骤（1）中所得混合溶液在超声下反应1-3h，得到混合液；
（3）将六水氯化铝加入到步骤（2）得混合溶液中，超声分散至溶解，六水氯化铝溶液的浓度为1.5-6.0 mmol/L；于80-110 ℃下反应6-12h，冷却至室温，得到反应产物；然后用去离子水充分洗涤反应产物，得到固体物质在将滤饼，再在40-80 ℃下真空干燥10-24h，得到的产物，即为目标铝基金属有机骨架材料，记为Al-MOFs。
2.根据权利要求1所述的铝基金属有机骨架材料的制备方法，其特征在于，步骤（1）中所述氢氧化钠和3，5-吡唑二羧酸的重量比为1:（1-2.5）。
3.根据权利要求1所述的铝基金属有机骨架材料的制备方法，其特征在于，步骤（2）中所述超声反应1-2h。
4.根据权利要求1所述的铝基金属有机骨架材料的制备方法，其特征在于，步骤（3）中所述六水氯化铝溶液的浓度为1.5-4.0 mmol/L。
5.根据权利要求1所述的铝基金属有机骨架材料的制备方法，其特征在于，步骤（3）中所述反应温度80-100 ℃。
6.由权利要求1-5之一所述制备方法得到的铝基金属有机骨架材料。
7.如权利要求6所述铝基金属有机骨架材料在复杂样品中糖基化肽的选择性分离、富集与质谱鉴定中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，具体步骤为：
将铝基金属有机骨架材料与样品的糖基化肽溶液充分混合，加入80-95 %乙腈/0.1-1.0 %三氟乙酸缓冲液中，分散均匀，在30-40 ℃酶解仪中孵育；
离心分离出材料，用80-95 %乙腈/0.1-1.0 %三氟乙酸缓冲液洗涤材料3-5次，用25-35%乙腈/0.1-1.0 %三氟乙酸洗脱；
取0.5-1.5 μL洗脱液点在MALDI-TOF-MS靶板上，自然干燥后再滴加0.5-1.5 μL浓度为15-25 mg/mL的2，5-二羟基苯甲酸（DHB）溶液于被分析物液滴上，形成薄层基质，干燥后进行质谱分析。
9.根据权利要求7或8所述的应用，其特征在于，所述样品为血清样品。
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