CN101308141B - 一种分析糖蛋白的方法 - Google Patents

Abstract

一种分析糖蛋白的方法，其首先配制点样缓冲溶液、点制芯片、封闭、清洗、干燥后，得凝集素芯片。将生物样品直接加在凝集素芯片上，进行孵育、清洗去除杂蛋白、形成晶体、解离晶体，用飞行时间质谱仪检测荷电离子在真空电场中飞行的时间，得到糖蛋白图谱信息，直观显示被测生物样品中分子量、丰度等糖蛋白信息，鉴定糖蛋白差异表达。将被测生物样品的糖蛋白图谱信息与样本图谱信息进行比照，得到差异表达的糖蛋白信息。本发明解决了背景技术中检测通量低，检测步骤繁琐，周期长的技术问题。本发明操作简便，灵敏度高，重复性好，适合于医学临床的快速分析应用。

Description

一种分析糖蛋白的方法

技术领域

本发明涉及一种分析糖蛋白的方法，具体是一种采用凝集素芯片，结合表面增强激光解析离子化飞行时间质谱技术对糖蛋白进行检测和鉴定的方法。

背景技术

糖类化合物是生物体维持生命活动所需能量的主要来源，是生物体合成其它化合物的基本原料，是充当生物体的结构原料，是涉及生命活动本质的生物大分子之一。糖类具有多个羟基，糖苷键又有α、β构型之分，单糖的连接可能产生数目很大的异构体，因此，糖链结构蕴含十分丰富的生物语言信息，是高密度的信息载体。细胞是生物体的基本单位，种类繁多的细胞形成各种组织，所有细胞表面均覆盖着一层糖链。糖链和蛋白质构成的共价复合物，即糖基化蛋白，简称糖蛋白。蛋白质糖基化是一种重要的翻译后修饰，约有一半以上的蛋白质是发生糖基化的。糖基化作为一种主要的翻译后修饰对蛋白质的结构和功能有着重要影响，如：对蛋白质的折叠、运输、定位等。在许多生物过程中蛋白质糖基化起着重要的作用，如免疫保护、病毒的复制、细胞生长、细胞与细胞之间的黏附、炎症的产生等。

许多蛋白都发现有糖基化这种翻译后修饰方式。如转录因子、核小孔蛋白、热休克蛋白、RNA聚合酶II、致癌基因翻译产物、酶等。许多疾病的发生、发展过程中糖基化蛋白的糖基化程度都发生了改变，糖基化异常经常导致疾病的发生，如在帕金森病、风湿性关节炎和其他与自由基相关的疾病患者体内，检测到铁转移蛋白糖基化水平过高。铁转移蛋白是一种糖基化的金属转运血清蛋白，糖基化稳定了铁转移蛋白，间接地调节了铁离子的平衡。另有大量文献报道糖基化的紊乱与迅速发展的肌营养不良相关。在目前临床应用的肿瘤筛查标志物中绝大部分是糖基化蛋白，特别是有些糖基化发生改变的糖基化蛋白已应用于人类疾病的诊断、分期和预后评估，例如，诊断原发性肝癌涉及到甲胎蛋白(AFP)是胎儿发育过程中由胎肝合成的一种含糖量为4％的糖蛋白，由590个氨基酸残基组成。每分子AFP含一条糖链，胎儿出生时，脐带血中含AFP为10-100mg/L，出生1年后，降至与正常人水平，含量极低，难以检测。原发性肝癌病人血清AFP明显上升，因此临床上用免疫生化技术测定AEP做为诊断肝癌的依据。在后的研究表明：胃癌、肠癌、胰腺癌等消化***肿瘤血清AFP含量也升高，而肝炎、肝硬化病人血清也可伴有暂时性的AFP上升。

近年研究发现糖基化的改变与肿瘤的发生发展和转移密切相关。肿瘤细胞糖基化改变可分为4种类型：(1)肿瘤组织出现了正常组织没有或含量很少的糖链结构。(2)某些经修饰的糖链结构在肿瘤组织中有较高表达，构成重要的肿瘤相关抗原。某些多肽经糖化后可改变其抗原性，成为肿瘤抗原；(4)某些糖链结构的表达丰度增加。糖基化蛋白是含有共价糖基的蛋白质，由糖链、糖肽键和多肽链3部分组成，其中糖肽键是糖基化蛋白最重要的结构特征，相同肽顺序的蛋白质常含有不同结构的糖链，这一结构的特点成为糖链的异质性，可表现在糖基组成，顺序和联结方式上的差异。糖基化蛋白根据连接的糖苷类型主要分为：(1)由N-乙酰氨基葡萄糖和天门冬氨酰胺连接的N-糖苷型糖基化蛋白，(2)有N-乙酰氨基半乳糖与丝氨酸或苏氨酸连接的O-糖苷型糖基化蛋白。糖基化蛋白以溶解状态和与细胞膜结合状态存在于细胞膜表面和细胞外液，人体中绝大多数血清蛋白和许多重要的生物活性物质的化学本质都是糖基化蛋白。近年来随着实验方法的不断改进，发现细胞膜糖基化蛋白糖链的变化与细胞突变癌基因的活化、肿瘤细胞的转移和侵袭密切相关。肿瘤细胞糖基化蛋白的变化主要分为3类：(1)膜糖基化蛋白的丢失：现已发现各类肿瘤转化细胞和活体肿瘤有粘蛋白的丢失，肿瘤细胞蛋白水解作用加强是其丢失的主要原因，但合成下降，脱落及化学修饰也是部分原因。(2)出现新合成的糖基化蛋白。(3)糖基化蛋白糖链的变化：糖链上增加岩藻糖、唾液酸及N-糖基化糖链分枝现象，普遍见于各类肿瘤细胞。正常肝细胞与肝癌细胞膜糖基化蛋白上的高甘露糖糖链在量和结构上存在明显不同。许多酶、免疫球蛋白、载体蛋白、激素、毒素、凝集素等大多数蛋白质都是糖蛋白。在糖蛋白中，各种糖蛋白糖链的长短与结构，糖链的数目均相差很大，因而含糖量也相差很大。例如：卵白蛋白分子含一条糖链；而羊的颔下腺粘蛋白分子含800条寡糖链，焦原蛋白含糖量不到1％；可溶性血型物质含糖量高达85％。细胞与细胞的相互粘附、相互识别、相互作用、相互制约与调控均与糖蛋白的糖链有关。大量的研究已表明，各种错综复杂的生命现象的产生与疾病的形成过程均包含了许多分子变化和复杂的代谢过程，其中糖蛋白的糖链在受精、发生、发育、分化、炎症与自身免疫疾病，在癌细胞异常增殖及转移，病原体感染，植物与病原体相互作用，豆科植物与根瘤菌的共生过程中，都具有重要作用。

凝集素(Lectin)是狭义上的糖结合蛋白，是广泛存在于自然界的一大类非免疫来源的蛋白质或糖蛋白，它能与糖专一性地、非共价地可逆结合，并且有凝集血细胞的作用，故称为凝集素。通常以其被提取的植物命名，如刀豆素A(Conconval ina，ConA)、麦胚素(Wheat germ agglutinin，WGA)、花生凝集素(Peanut agglutinin，PNA)和大豆凝集素(Soybean agglutinin，SBA)等，凝集素是它们的总称。目前已有近千种植物被测得具有凝集素活性，植物中，不只种子中存在凝集素，根、茎、叶、皮、果实汁中也发现有凝集素。除植物外，其它生物，如各种真菌、某些病毒、无脊椎动物、脊椎动物及至人体的各种组织和器官中都存在凝集素。凝集素具有多方面的特性，最大的特点在于它们能识别糖蛋白和糖肽中，特别是细胞膜中复杂的糖链结构。一种凝集素具有对某一种特异性糖基专一性结合的能力，因此，凝集素可以作为一种探针来研究细胞膜上或糖基化蛋白中特定的糖基。目前按结合糖的类型，凝集素可分为六类：D-甘露糖或D-葡萄糖；N-乙酰氨基葡萄糖；N-乙酰氨基半乳糖；D-半乳糖；L-岩藻糖以及唾液酸。在植物凝集素中，只有麦胚凝集素(WGA)可专一结合唾液酸。细胞间的粘附是细胞间相互作用起决定性作用的起始步骤。作为致病的微生物，首先对宿主细胞进行粘着，然后才能感染和致病。细胞表面的凝集素能专一地识别并结合另一细胞的糖链。凝集素的这种特性，在细胞与细胞，细胞与基质的粘附中起一定作用。由于凝集素与糖分子具有专一性可逆结合的特性，目前已有将凝集素固定化制成亲和层析柱用于分离纯化糖蛋白的产品或各类凝集素固定化于磁性微粒(Magnetic particles)分离纯化各种类型糖蛋白的产品。

带有反射功能的基质辅助激光解吸附电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)和纳升电喷雾串联质谱(nano-ESI-Q-TOF)等具有软电离方式，具有高灵敏度和强有力的分析混合物能力，可提供生物大分子的分子量、序列、一级结构信息以及结构转换、修饰等。目前，采用质谱仪进行糖基化分析的方法如下：

a.分离纯化各种类型糖基化蛋白。用各类凝集素固定化制成的亲和层析柱或磁性微粒分别固定有各类凝集素，分离纯化出各种类型糖基化蛋白。

b.糖基化蛋白的双向电泳。分离纯化出的糖基化蛋白经双向电泳(2-D电泳)，采用Pro-Q300或基于过碘酸氧化原理的488荧光染料，染色2-D胶上的糖基化蛋白的糖链部分，然后用SYPRO Ruby荧光染料只染蛋白质部分，对同一块2-D胶的总蛋白质进行染色。在同一块胶上研究糖基化变化和蛋白质表达水平的改变。

c.质谱法测定(MALDI-TOF-MS/MS)：从胶上将蛋白质点切下，经预处理后，点样于MALDI-TOF质谱靶板上，进行质谱分析，得到肽指纹图数据，检索IPI数据库，确定蛋白质。

d.糖基化蛋白进行糖链解析，确定糖基化蛋白糖链的组成及相应的糖基化位点。采用蛋白酶酶解与糖苷内切酶酶解相结合的方法，把蛋白链上的寡糖切下来，结合MALD-TOF及GC-MS技术鉴定糖链的分子量和分子组成，确定糖基化蛋白的糖基化位点，研究蛋白部分和寡糖部分的结构。

综上所述，目前糖蛋白分析中，糖蛋白多采用固定于固相载体上的各类凝集素分离纯化，用二维电泳、光谱、质谱等分析化学的研究技术，所需技术条件高，仪器昂贵，步骤繁琐，耗时，不适于大规模筛查和临床检测应用。其瓶颈问题如下：

1.在分离纯化糖蛋白过程中占一定比例的低丰度糖蛋白质可能会丢失。

2.适用范围窄。无法用于分离跨膜蛋白，不能检出样品中的众多低丰度糖蛋白。

3.检测通量低。只能依次鉴定单个蛋白斑点，限制了检测通量，不适于大规模医学临床筛查。

4.检测步骤繁琐，周期长，不能实现全自动化的分析检测。

5.检测费用高。应用所需技术条件高，仪器昂贵，导致检测费用高，不适用于临床检测。

6.蛋白质芯片联用飞行时间质谱仪技术无法明确检测糖蛋白。

发明内容

本发明的目的在于提供一种分析糖蛋白的方法，其解决了背景技术中检测通量低，检测步骤繁琐，周期长的技术问题。

本发明的技术解决方案如下：

一种分析糖蛋白的方法，该方法的实现步骤包括：

(1)制备凝集素芯片：

(1.1)点制芯片：将各类凝集素或糖结合蛋白溶于点样缓冲液中，制成1～5mg/mL的点样缓冲液；用芯片点样仪将点样缓冲液点制于衍生化的固相载体上；于25～60℃温育12小时，得凝集素芯片；

(1.2)封闭：用封闭缓冲液对凝集素芯片进行1～2小时封闭；

(1.3)保存：用超纯水清洗凝集素芯片，离心干燥后，于4℃干燥保存；

(2)加载生物样品：

(2.1)将被测生物样品直接加至凝集素芯片上；

(2.2)孵育0.5～2小时，糖蛋白糖链通过与凝集素的特异识别结合到凝集素芯片上；生物样品中的特定糖蛋白糖链与凝集素芯片上的凝集素特异识别，结合到凝集素芯片上；

(3)去除杂质：用清洗缓冲液清洗凝集素芯片，去除凝集素芯片表面的非特异结合蛋白；

(4)形成晶体：将能量吸收分子或基质加至凝集素芯片上，于室温干燥，则能量吸收分子或基质与凝集素芯片上与凝集素特异结合的糖蛋白结合形成混合晶体；

(5)解离晶体：用激光解吸电离的方法使结合在凝集素芯片上的特定糖蛋白解离，形成糖蛋白荷电离子；

(6)绘制质谱图：用飞行质谱仪检测糖蛋白荷电离子在真空电场中飞行的时间，根据得到的糖蛋白图谱信息，绘制质谱图；

(7)鉴定蛋白质的差异表达：将被测生物样品的糖蛋白图谱信息与样本图谱信息进行比照，得到差异表达的被测生物样品中的糖蛋白信息。

上述封闭缓冲液可采用乙醇胺或含BSA的封闭缓冲液等。

上述点样缓冲液可采用磷酸盐缓冲液、碳酸盐缓冲液、Tris-HCl缓冲液、Bis-tris缓冲液或Hepes缓冲液等。

上述衍生化的固相载体可采用环氧乙烷基，也可采用氨基或巯基基团衍生化的固相载体；上述固相载体可采用玻片、金属片、硝酸纤维素膜、瓷片或磁性微粒等。

上述清洗缓冲液具体可采用2×PBS的清洗缓冲液等。

上述能量吸收分子具体可采用白芥子酸，上述基质具体可采用2，5-二羟基苯甲酸或α-氰基-4-羟基肉桂酸等。

上述生物样品可以是血液、尿液、细胞裂解、脑脊液、关节腔滑液或支气管洗脱液等。

本发明具有以下优点：

1.操作简便。可直接用于未纯化的样品分析，不需要对待分析样品进行示踪标记。

2.灵敏度高，重复性好，适合于医学临床的快速分析应用。

3.所需样品量少，应用范围广泛。可用于未纯化的尿液、血液、脑脊液、关节腔滑液、支气管洗脱液、细胞裂解液及各种分泌物等的分析、筛查。

4.具有高通量的分析能力，可同时快速发现多个生物标志物，进行快速、准确的早期检测、分析。具有与“双相电泳加飞行质谱”相似的功能，同时可用于测定疏水蛋白质。

5.在同一***中集发现和检测为一体，不需要对靶糖蛋白进行分离纯化、特异性高，可发现低丰度、小分子量的蛋白质，可鉴定功能蛋白质。

具体实施方式

凝集素芯片是检测糖蛋白的高通量技术，本发明采用凝集素芯片，结合表面增强激光解析离子化飞行时间质谱技术，对糖蛋白进行检测、分析、鉴定，比较不同生物样品中糖蛋白的含量及结构差异，研究和确定生物标志物。具体实现步骤如下：

(1)制备凝集素芯片：

(1.1)点制芯片：将各类凝集素或糖结合蛋白溶于点样缓冲液中，制成1～5mg/mL的点样缓冲液；用芯片点样仪将点样缓冲液点制于衍生化的固相载体上；于25～60℃温育12小时，得凝集素芯片。点样缓冲液可采用磷酸盐缓冲液、碳酸盐缓冲液、Tris-HCl缓冲液、Bis-tris缓冲液或Hepes缓冲液等。衍生化的固相载体可采用环氧乙烷基，也可采用氨基或巯基基团衍生化的固相载体。固相载体可采用玻片、金属片、硝酸纤维素膜、瓷片或磁性微粒等。

(1.2)封闭：用封闭缓冲液对凝集素芯片进行1～2小时封闭。封闭缓冲液可采用乙醇胺或含BSA的封闭缓冲液等。

(1.3)保存：用超纯水清洗凝集素芯片，离心干燥后，于4℃干燥保存。

(2)加载生物样品：

(2.1)将被测生物样品直接加至凝集素芯片上。生物样品可以是血液、尿液、细胞裂解、脑脊液、关节腔滑液或支气管洗脱液等。生物粗样品一般是指含有高盐、去垢剂等杂质的未纯化的生物样品。

(2.2)孵育0.5～2小时，糖蛋白糖链通过与凝集素的特异识别结合到凝集素芯片上，凝集素以共价偶联方式固定于凝集素芯片表面，生物样品中的特定糖蛋白糖链与凝集素通过特异的相互识别和作用，吸附于凝集素芯片上。生物样品中的特定糖蛋白糖链与凝集素芯片上的凝集素特异识别，结合到凝集素芯片上。

(3)去除杂质：用清洗缓冲液清洗凝集素芯片，去除凝集素芯片表面的非特异结合蛋白以及弱结合蛋白，以消除干扰。清洗缓冲液具体可采用2×PBS的清洗缓冲液等。

(4)形成晶体：将能量吸收分子或基质加至凝集素芯片上，于室温干燥，则能量吸收分子或基质与凝集素芯片上与凝集素特异结合的糖蛋白结合形成混合晶体。混合晶体有利于促进蛋白质在检测中的解吸附和离子化。能量吸收分子具体可采用白芥子酸，基质具体可采用2，5-二羟基苯甲酸或α-氰基-4-羟基肉桂酸等。

(5)解离晶体：用激光解吸电离的方法使结合在凝集素芯片上的特定糖蛋白解离，形成糖蛋白荷电离子。

(6)绘制质谱图：用飞行质谱仪检测糖蛋白荷电离子在真空电场中飞行的时间，根据得到的糖蛋白图谱信息，绘制质谱图。由于不同质荷比的荷电离子在真空电场中飞行的时间长短不同，用飞行质谱仪检测荷电离子在真空电场中飞行的时间，得到糖蛋白质谱图，可直观显示被测生物样品中蛋白质的分子量、丰度等信息。

(7)鉴定蛋白质的差异表达：将被测生物样品的糖蛋白图谱信息与样本图谱信息进行比照，得到差异表达的被测生物样品中的糖蛋白信息。

Claims (6)

1.一种分析糖蛋白的方法，该方法的实现步骤包括：

(1)制备凝集素芯片：

(1.1)点制芯片：将各类凝集素溶于点样缓冲液中，制成1～5mg/mL的点样缓冲液；用芯片点样仪将点样缓冲液点制于衍生化的固相载体上；于25～60℃温育12小时，得凝集素芯片；所述的衍生化的固相载体是环氧乙烷基，或是氨基或巯基基团衍生化的固相载体；所述的固相载体是玻片、金属片、硝酸纤维素膜、瓷片或磁性微粒；

(1.2)封闭：用封闭缓冲液对凝集素芯片进行1～2小时封闭；

(1.3)保存：用超纯水清洗凝集素芯片，离心干燥后，于4℃干燥保存；

(2)加载生物样品：

(2.1)将被测生物样品直接加至凝集素芯片上；

(2.2)孵育0.5～2小时，糖蛋白糖链通过与凝集素的特异识别结合到凝集素芯片上；生物样品中的特定糖蛋白糖链与凝集素芯片上的凝集素特异识别，结合到凝集素芯片上；

(3)去除杂质：用清洗缓冲液清洗凝集素芯片，去除凝集素芯片表面的非特异结合蛋白；

(4)形成晶体：

将基质加至凝集素芯片上，于室温干燥，则基质与凝集素芯片上与凝集素特异结合的糖蛋白结合形成混合晶体；

(5)解离晶体：

用激光解吸电离的方法使结合在凝集素芯片上的特定糖蛋白解离，形成糖蛋白荷电离子；

(6)绘制质谱图：

用飞行质谱仪检测糖蛋白荷电离子在真空电场中飞行的时间，根据得到的糖蛋白图谱信息，绘制质谱图；

(7)鉴定蛋白质的差异表达：

将被测生物样品的糖蛋白图谱信息与样本图谱信息进行比照，得到差异表达的被测生物样品中的糖蛋白信息。

2.根据权利要求1所述的分析糖蛋白的方法，其特征在于：所述的封闭缓冲液是乙醇胺或含BSA的封闭缓冲液。

3.根据权利要求1或2所述的分析糖蛋白的方法，其特征在于：所述的点样缓冲液是磷酸盐缓冲液、碳酸盐缓冲液、Tris-HCl缓冲液、Bis-tris缓冲液或Hepes缓冲液。

4.根据权利要求3所述的分析糖蛋白的方法，其特征在于：所述的清洗缓冲液是2×PBS的清洗缓冲液。

5.根据权利要求4所述的分析糖蛋白的方法，其特征在于：所述的基质是白芥子酸、2，5-二羟基苯甲酸或α-氰基-4-羟基肉桂酸。

6.根据权利要求5所述的分析糖蛋白的方法，其特征在于：所述的生物样品是血液、尿液、细胞裂解液、脑脊液、关节腔滑液或支气管洗脱液。