CN114994304B - 一种cTnI干式均相化学发光检测试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物技术领域,具体涉及一种cTnI干式均相化学发光检测试剂盒。本发明提供的试剂盒中包括生物素标记的抗cTnI 24‑40aa嵌合人源抗体冻干小球、抗cTnI 41‑49aa抗体和抗TnC抗体包被的受体微球冻干小球、链霉亲和素包被的供体微球冻干小球、进样稀释液及检测卡。本发明提供的试剂盒采用cTnI+cTnI‑TnC形式检测cTnI抗原,选取能够优先识别较稳定的氨基酸序列的抗体对,从而解决漏检问题;还可以解决混标带来的不确定影响,提高了检测灵敏度,并且使标记过程以及检测结果稳定、可靠,具有更高的发光值及更优的灵敏度。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域,具体涉及一种cTnI干式均相化学发光检测试剂盒。
背景技术
心肌肌钙蛋白I(cTnI)在心肌组织中表达,在胎儿、健康人或疾病状态下的成人骨骼肌中不表达,因而对心肌具有高度特异性。于1994-1995年被美国国家食品与药品管理局(FDA)批准应用于临床急性心肌梗死(AMI)的诊断。肌钙蛋白(Tn)属于调节蛋白,由三个亚单位组成,即肌钙蛋白C(TnC)、肌钙蛋白I(TnI)及肌钙蛋白T(TnT)。TnI是一种碱性蛋白,由209个氨基酸组成,是一个延伸分子,采取反向平行与TnC 形成二元复合物。TnC 是钙离子受体,参予调节细丝的活化过程。TnT 是一种非对称性蛋白质,伴有一球形C端功能区,它有一个与原肌球蛋白结合的位点。cTnI以不同形式存在于心肌细胞中,如以游离形式存在于胞浆内cTnI 只占很少部分,大部分与肌钙蛋白T及C亚单位结合以复合体形式存在。当心肌损伤时,外周血中cTnI主要以cTnI -TnC复合物形式居多(90%以上)。cTnI -cTnT复合物仅发现存在于50%以下病人的血中,因此,检测的重要性远不如cTnI-cTnC复合物;其他形+式的cTnI(如氧化型、还原型、磷酸化、去磷酸化、蛋白降解形式)较少。当心肌细胞膜的完整性受破坏,cTnI先从胞浆内释放,因此,血清水平很快升高,而结合的cTnI由于相对分子质量大,从心肌细胞结构蛋白缓慢持续的释放。心肌损伤后,外周血中心肌肌钙蛋白I一般在5~8h出现增高,在12~24h达最高值,且高水平往往维持7~10d。此外,研究者发现位于氨基酸残基33~110之间的片段高度稳定,能产生较长的持续信号,并分析可能是由于其与cTnC形成了复合物所致。cTnI的蛋白水解片段中,具有96~116个氨基酸残基的片段有较强的抵抗蛋白水解作用,在血清中与TnC形成二聚物的TnI片段是稳定的,而且可能拥有整个抑制区域。cTnI的抑制区域对cTnI-cTnC复合物的免疫活性和稳定性有重要作用。
cTnI的测定始于20世纪80年代中期,多采用双抗体竞争放射免疫法和竞争性ELISA 测定法。目前对cTnI的检测多采用化学发光法。用化学发光物质标记抗cTnI 抗体大大提高了对cTnI测定的精确性和敏感性,但化学发光在非均相标记免疫分析技术中,通过“分离洗涤”去除未参与结合的游离标记物,这降低了检测的可重复性;均相标记免疫分析技术的特点是全程无分离洗涤过程,不存在洗涤误差,但常规的光激均相发光试剂均以液相产品为主,试剂在液态下的运输和储存稳定性受到很大限制。且现通用的cTnI测定方法尚无标准化,不同的方法采用不同的抗体识别位点,大多数文献资料均采用识别cTnI抗原表位(包含易水解磷酸化片段)的抗体而非抗cTnI-TnC复合物的抗体进行对cTnI的测定,可能会造成漏检或者是灵敏度、特异性不足等问题。
中国专利申请CN104090105A公开了一种检测HEV抗体的方法及试剂盒和该试剂盒的制备方法,其提供的试剂盒同样可以降低漏检情况的发生,但其是通过增加抗原检测位点实现的;进一步地,中国专利申请CN107918022A公开了一种cTnI检测试剂盒及其使用方法,提供的试剂盒中包含校准品、清洗液、底物溶液、预处理液、特异性抗体、酶结合物工作液和磁珠结合物工作液等组分,但是其提供的试剂盒检测灵敏度较低,容易出现漏检的问题。
综上可知,现有技术中普遍存在容易造成漏检、灵敏度低及特异性不足等问题。
发明内容
针对现有技术普遍存在的缺陷,本发明提供了一种cTnI干式均相化学发光检测试剂盒。本发明提供的试剂盒采用cTnI+cTnI-TnC形式检测cTnI抗原,选取能够优先识别较稳定的氨基酸序列的抗体对,从而解决漏检问题;还可以解决混标带来的不确定影响,提高了检测灵敏度,并且使标记过程以及检测结果稳定、可靠,具有更高的发光值及更优的灵敏度。
为了达到上述技术效果,本发明采用的技术方案为:
一种cTnI干式均相化学发光检测试剂盒,包括如下组分:生物素标记的抗cTnI24-40 aa嵌合人源抗体冻干小球、抗cTnI 41-49 aa抗体和抗TnC抗体包被的受体微球冻干小球、链霉亲和素包被的供体微球冻干小球、进样稀释液及检测卡。
优选地,所述cTnI 24-40的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示;所述cTnI 41-49 的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
NYRAYATEPHAKKKSKI(SEQ ID NO.1);
SASRKLQLK(SEQ ID NO.2);
优选地,所述抗cTnI 41-49 aa抗体标记微球的制备过程如下:
(1)将100μL,浓度为10mg/mL受体微球混悬液放入试管内,于14000rpm的转速下离心15min,去除上清液,加入两倍体积的pH5~6 MES溶液清洗两遍,同样于14000rpm的转速下离心15min,去除上清,加入200μL的pH5~6 MES溶液,超声分散,制成初级微球混悬液I;
(2)向步骤(1)制得的初级微球混悬液I中分别加入50~70μg抗cTnI 41-49 aa抗体(Anti-cTnI Hytest 4TC21cc-19C7cc)、2~4μL 10mg/mL的EDC-MES溶液、1~3μL 10%的Tween20-去离子水,混匀,在30~37 ℃摇床下震荡2h,反应结束后加入1mg牛血清白蛋白和1.2μL乙醇胺,混匀,置于30~37℃摇床上封闭30min,于14000rpm转速下离心15min,去除上清液,加入两倍体积的缓冲液①清洗两遍,加入50μL的缓冲液①贮存。
优选地,所述抗TnC抗体标记微球的制备过程如下:
(1)将100μL,浓度为10mg/mL受体微球混悬液放入试管内,于14000rpm的转速下离心15min,去除上清液,加入两倍体积的pH5~6的MES溶液清洗两遍,同样于14000rpm的转速下离心15min,去除上清,加入200μL的pH5~6的MES溶液,超声分散,制成初级微球混悬液I;
(2)向步骤(1)制得的初级微球混悬液I中分别加入2~4μL 10mg/mL的EDC-MES溶液、4~8μL 10mg/mL的NHS-MES,混匀,在30~37 ℃摇床下震荡0.5h,反应结束后离心去除上清,加入200μL pH7.4~8.0 0.05M的HEPES清洗2遍,同样于14000rpm的转速下离心15min,去除上清,加入200μL的pH7.4~8 HEPES溶液,超声分散,制成次级微球混悬液Ⅱ;
(3)向步骤(2)制成次级微球混悬液Ⅱ中加入50~70μg抗TnC抗体(Anti-TnChytest 4T27cc-7B9cc)、1~3μL 10%的Tween20-去离子水溶液,混匀,在30~37 ℃摇床下震荡4 h,反应结束后加入1mg牛血清白蛋白和1.2μL乙醇胺,混匀,置于30~37℃摇床上封闭30min,于14000rpm转速下离心15min,去除上清液,加入两倍体积的缓冲液①清洗两遍,加入50μL的缓冲液①贮存。
优选地,所述生物素标记抗cTnI 24-40 aa抗体标记微球制备过程如下:50μg的抗cTnI 24-40 aa抗体(Anti-cTnI hytest RC4T21-RecR33)和0.95~1.89μg的sigma长链生物素加入到50μL,pH9.5,0.05M的CB缓冲液中,于25℃下震荡2h,反应后加入0.5~1mg甘氨酸,于25℃下震荡封闭30min。生物素标记抗cTnI 24-40 aa抗体溶液在pH7.4,0.01M的PBS缓冲液中透析24h,即得。
优选地,所述链霉亲和素包被的供体微球制备过程如下:
(1)将100μL,浓度为10mg/mL供体微球混悬液放入试管内,于14000rpm的转速下离心15min,去除上清液,加入两倍体积的pH5~6 MES溶液清洗两遍,同样于14000rpm的转速下离心15min,去除上清,加入200μL的pH5~6 MES溶液,超声分散,制成初级微球混悬液I;
(2)向步骤(1)制得的初级微球混悬液I中分别加入50~100μg亲和素、2~4μL 10mg/mL的EDC-MES溶液,混匀,在30~37 ℃摇床下震荡2 h,反应结束后1mg牛血清白蛋白和1.2μL乙醇胺,混匀,置于30~37℃摇床上封闭30min,于14000rpm转速下离心15min,去除上清液,加入两倍体积的缓冲液①清洗两遍,加入50μL的缓冲液①贮存。
优选地,所述冻干小球的制备过程如下:将滴珠机出液体积大小调整至10μL,抗cTnI 41-49 aa抗体和抗TnC抗体包被的受体微球工作液、生物素标记的抗cTnI 24-40 aa抗体工作液或链霉亲和素包被的供体微球工作液经滴珠机呈小液滴滴落,滴落的液滴经液氮冷冻后呈小球状;将液氮冷冻小球转移至已预冻至-40℃的冻干机,后进行冷冻干燥;干燥结束后可分别得到三组分的冻干小球。
优选地,所述抗cTnI 41-49 aa抗体和抗TnC抗体包被的受体微球工作液分别用缓冲液②分别稀释至工作浓度为0.5mg/mL和0.25mg/mL;所述生物素标记的抗cTnI 24-40 aa抗体工作液用缓冲液③稀释至工作浓度为2.5μg/mL;所述链霉亲和素包被的供体微球工作液用缓冲液①稀释至工作浓度为0.25mg/mL。
优选地,所述缓冲液①由0.25M TRIS、0~0.9%氯化钠、5~7.5%牛血清白蛋白、0.5~1.0%Tween20、0.5% Proclin-300和去离子水配制而成,pH值8.5;缓冲液②由0.25M TRIS、0~0.9%氯化钠、5~7.5%牛血清白蛋白、0.5~1.0%Tween20、0.5% Proclin-300、0.01~0.05%苯酚红钠盐和去离子水配制而成,pH值8.5;所述缓冲液③由0.25M TRIS、0~0.9%氯化钠、5~7.5%牛血清白蛋白、0.5~1.0%Tween20、0.5% Proclin-300、0.01~0.05%日落黄和去离子水配制而成,pH8.5。
为解决cTnI抗原检测有较高灵敏度、特异性以及液态试剂常温放置不稳定、需冷链运输等问题,开发一种cTnI干式均相化学发光检测试剂盒的设计及制备方法,在均相发光方法学上,发明人通过大量的实验分别对不同识别表位的抗体进行筛选、整合并优化抗体蛋白比例:(1)受体微球包被抗体含有识别IC复合物抗体和识别cTnI表位抗体;(2)生物素标记抗体为识别cTnI表位抗体;(3)为防止HAMA反应选取部分识别表位抗体将鼠抗恒定区替换人源片段。最终选取了能够优先识别较稳定的氨基酸序列的抗体对:生物素标记-抗cTnI 24-40 aa嵌合人源抗体、受体微球标记-抗cTnI 41-49 aa抗体和抗TnC抗体的1+2组合以用于cTnI的高灵敏度和特异性检测,其中(a)我们惊奇的发现不同的抗体标记于生物素或者受体微球对灵敏度以及光值影响较大。故在本方法学中,抗体标记位置对检测结果影响较大,并非放置任何标记位均可达到最优效果;(b)我们发现标记一端含有抗TnC抗体可以补漏检,但低值灵敏度较生物素标记和受体微球标记均为识别cTnI表位的抗体差。(c)我们针对受体微球标记的两种抗体进行标记方式的探究,发现在本发明的标记工艺下抗体混标较单独标记再混合配液测试CV差,且抗41-49 aa和抗TnC抗体的最佳标记pH不同,其中,抗41-49 aa抗体的最佳标记pH值为5~6,抗TnC抗体的最佳标记pH为7.4~8.0,我们针对两种抗体采取了不同的标记方式(一步法或两步法标记)以利于本试剂盒的性能。(d)发明人将试剂制备成冻干小球以便后续检测一步完成,该方式有效避免了试剂盒测试过程洗脱、分离等繁琐步骤,且试剂常温储存稳定性良好。
试剂盒中的稀释液采用生理盐水添加防腐剂(Proclin300)的形式,而检测卡(可参见专利CN202111293823.4)及检测卡检测模式为:3种冻干小球分别取1颗分装至检测卡的反应检测孔中,分装结束对试剂卡进行封口,并将试剂卡放入装有干燥剂的密封袋密封。样品测试时,去掉试剂卡上方的医用易撕膜,加入适量进样稀释液,再将样本加入至检测卡的过滤孔,将试剂检测卡放入仪器,仪器对反应检测孔抽负压,样本及进样稀释液随压力经过滤血材料从通道进入至反应检测孔,进入检测孔的液体复溶3种冻干小球,仪器对试剂卡进行震动数秒,进行一步法孵育,孵育15min结束后,读取光子信号,根据标准曲线计算待测样品浓度,直接得到样本的定量检测结果。
与现有技术相比,本发明提供的cTnI干式均相化学发光检测试剂盒具有如下优势:
(1)本发明提供的试剂盒,采用cTnI+cTnI-TnC形式检测cTnI抗原,抗体选取尽量避开cTnI磷酸化位点以及易水解片段,结合心肌损伤时cTnI释放入血中大部分以结合态形式,选取了能够优先识别较稳定的氨基酸序列的抗体对,从而解决漏检问题;
(2)抗cTnI 41-49 aa抗体和抗TnC抗体包被的受体微球不采用混标的方式,并且分别选取各自最优的标记方式,两种抗体分别标记后研究两者在工作液中的最终浓度以确定最佳的加入量,解决了混标带来的不确定影响,提高了检测灵敏度,并且使标记过程以及检测结果稳定、可靠,也有利于实验的不同变量探究;
(3)抗体用于生物素标记或者是包被于受体微球,对cTnI灵敏度影响较大。本发明发现将抗cTnI 24-40 aa抗体标记于生物素上,可以得到更高的发光值或更优的灵敏度。
附图说明
图1为血液中可能存在的cTnI形态;
图2为检测cTnI抗原的形式。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步解释,但是应当注意的是,以下实施例仅用以解释本发明,而不能用来限制本发明,所有与本发明相同或相近的技术方案均在本发明的保护范围之内。本实施例中未注明具体技术或条件者,按照本领域常规技术方法和仪器说明书内容进行操作;所用试剂或仪器未注明生产厂商者,均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1 cTnI干式均相化学发光检测试剂盒的制备
所述cTnI干式均相化学发光检测试剂盒的制备过程如下:
S1、抗cTnI 41-49 aa抗体和抗TnC抗体包被的受体微球制备及工作溶液的配制:
抗cTnI 41-49 aa抗体标记微球的制备:(1)将100μL,浓度为10mg/mL受体微球混悬液放入试管内,于14000rpm的转速下离心15min,去除上清液,加入两倍体积的pH5 MES溶液清洗两遍,同样于14000rpm的转速下离心15min,去除上清,加入200μL的pH5 MES溶液,超声分散,制成初级微球混悬液I;
(2)向步骤(1)制得的初级微球混悬液I中分别加入50μg抗cTnI 41-49 aa嵌合人源抗体、2μL 10mg/mL的EDC-MES溶液、2μL 10%的Tween20-去离子水,混匀,在30℃摇床下震荡2h,反应结束后加入1mg牛血清白蛋白和1.2μL乙醇胺,混匀,置于30℃摇床上封闭30min,于14000rpm转速下离心15min,去除上清液,加入两倍体积的缓冲液①清洗两遍,加入50μL的缓冲液①贮存。所述缓冲液①由0.05M TRIS、0.9%氯化钠、1.5%牛血清白蛋白、0.2%Tween20、0.1%Proclin-300和去离子水配制而成,pH8.5。
抗TnC抗体标记微球的制备:(1)将100μL,浓度为10mg/mL受体微球混悬液放入试管内,于14000rpm的转速下离心15min,去除上清液,加入两倍体积的pH5 MES溶液清洗两遍,同样于14000rpm的转速下离心15min,去除上清,加入200μL的pH5 MES溶液,超声分散,制成初级微球混悬液I;(2)向步骤(1)制得的初级微球混悬液I中分别加入2μL 10mg/mL的EDC-MES溶液、4μL 10mg/mL的NHS-MES,混匀,在30℃摇床下震荡0.5h,反应结束后离心去除上清,加入200μL pH8.0 0.05M的HEPES清洗2遍,同样于14000rpm的转速下离心15min,去除上清,加入200μL的pH8.0 HEPES缓冲液,超声分散,制成次级微球混悬液Ⅱ;(3)向步骤(2)制成的次级微球混悬液Ⅱ中加入50μg抗TnC抗体、2μL 10%的Tween20-去离子水溶液,混匀,在30 ℃摇床下震荡4h,反应结束后加入1mg牛血清白蛋白和1.2μL乙醇胺,混匀,置于30℃摇床上封闭30min,于14000rpm转速下离心15min,去除上清液,加入两倍体积的缓冲液①清洗两遍,加入50μL的缓冲液①贮存。
配制:包被有抗cTnI 41-49 aa抗体和抗TnC抗体的受体微球贮存液用所述缓冲液②分别稀释至工作浓度为0.5mg/mL和0.25mg/mL。所述缓冲液②由0.25M TRIS、0~0.9%氯化钠、5~7.5%牛血清白蛋白、0.5~1.0%Tween20、0.5% Proclin-300、0.01~0.05%苯酚红钠盐和去离子水配制而成,pH值8.5;
S2、生物素标记抗cTnI 24-40 aa嵌合人源抗体制备及工作溶液的配制:
制备:50μg的抗cTnI 24-40 aa嵌合人源抗体和1.89μg的sigma长链生物素加入到50μL,pH9.5,0.05M的CB缓冲液(碳酸氢钠缓冲液)中,于25℃下震荡2h,反应后加入1mg甘氨酸,于25℃下震荡封闭30min;将生物素标记抗cTnI 24-40 aa嵌合人源抗体溶液在pH7.4,0.01M的PBS缓冲液中透析24h。
配制:生物素标记抗cTnI 24-40 aa嵌合人源抗体标记液进一步用缓冲液③稀释至工作浓度为2.5μg/mL。所述缓冲液③由0.25M TRIS、0.9%氯化钠、7.5%牛血清白蛋白、1.0%Tween20、0.5% Proclin-300、0.01%日落黄和去离子水配制而成,pH8.5。
S3、亲和素包被的供体微球制备及工作溶液的配制
(1)将100μL,浓度为10mg/mL供体微球混悬液放入试管内,于14000rpm的转速下离心15min,去除上清液,加入两倍体积的pH5 MES溶液清洗两遍,同样于14000rpm的转速下离心15min,去除上清,加入200μL的pH5 MES溶液,超声分散,制成初级微球混悬液I;(2)向步骤(1)制得的初级微球混悬液I中分别加入50μg亲和素、2μL 10mg/mL的EDC-MES溶液,混匀,在30 ℃摇床下震荡2h,反应结束后1mg牛血清白蛋白和1.2μL乙醇胺,混匀,置于30℃摇床上封闭30min,于14000rpm转速下离心15min,去除上清液,加入两倍体积的缓冲液①清洗两遍,加入50μL的缓冲液①贮存。
配制:包被有亲和素的供体微球贮存液用所述缓冲液①稀释至工作浓度为0.25mg/mL。
S4、液氮冷冻小球制备:
将滴珠机出液体积大小调整至10μL,抗cTnI 41-49 aa抗体和抗TnC抗体包被的受体微球工作液、生物素标记的抗cTnI 24-40 aa抗体工作液或链霉亲和素包被的供体微球工作液经滴珠机呈小液滴滴落,滴落的液滴经液氮冷冻后呈小球状。将液氮冷冻小球转移至已预冻至-40℃的冻干机,后进行冷冻干燥。干燥结束后可分别得到三组分的冻干小球。
S5、干燥:
将液氮冷冻小球转移至已预冻至-40℃的冻干机,后进行冷冻干燥。干燥结束后,3种冻干小球分别取1颗分装至试剂检测卡的反应检测孔中,分装结束对试剂卡进行封口,并将试剂卡放入装有干燥剂(主要成分为氯化钙)的密封袋密封。
S6、检测结果:
(1)线性范围测定:样本类型为促凝管血清,选取雅培高敏肌钙蛋白I测定试剂盒(化学发光微粒子免疫检测法)测定空白样本L(<检测下限)和高浓度样本H,S1~S5浓度样本按照以下方式进行混合:S1=L,S2=0.75L+0.25H,S3=0.5L+0.5H,S4=0.25L+0.75H,S5=H,分别标记为序号1、2、3、4、5。采用本发明试剂盒进行检测,每个样本重复3次。表1为本发明测试cTnI浓度与雅培测试cTnI浓度对比结果,R2=0.9994。
表1 线性范围测试结果
LOB测定:取空白重复测试20次,得到测试结果的RLU值,计算其平均值和标准差SD,得出+2SD,根据本试剂盒的定标曲线方程计算得到浓度值为7.355pg/mL。选用空白为negative base(厂家:南京松天科产品编号:S-4SP1)。
表2 空白测试
本发明试剂盒的线性范围为:7.355~46892.6 pg/mL。
(2)精密度:将已知浓度的cTnI血清样本取10μL加入试剂检测卡的过滤孔中,每个样品20孔,各添加150μL的稀释液,37℃孵育15min后,采用LiCA Reader读数。
表3 试剂盒精密度结果
结果显示本发明试剂盒批内精密度≤10%,可用于cTnI样本的检测。
实施例2 筛选配对模式
考虑到心肌损伤后cTnI以cTnI-TnC复合物和游离态形式存在,并且在血液中会有不同程度的水解降解,且两者之间比例无法准确判断,单纯用两种表位测定cTnI可能会造成漏检情况。我们分两条技术路线研究:
cTnI最稳定的区域是在30-110 aa,因为TnC的C末端的结构能够与cTnI分子上的33-86 aa形成的螺旋结构紧密结合,起到稳定cTnI作用。TnC和cTnI的结合改变了蛋白构象,也封闭了cTnI抗原表位。此外,由于对免疫诊断而言,HAMA反应影响最为普遍,大多数免疫诊断的抗体选用鼠单抗,解决HAMA效应的影响的有力工具是嵌合抗体(嵌合:将鼠抗体的恒定区替换为人源片段)或者是完全人源化的抗体,或者使用其它动物来源抗体。
cTnI单体与复合物的免疫活性并不相同。针对复合物检测我们的工作选用Anti-cTnI和Anti-cTn-complex/Anti-TnC为基础抗体,分别标记生物素和受体微球,并进行交叉配对测试样本。针对cTnI的检测,我们选用Anti-cTnI和Anti-cTnI不同表位分别标记生物素和受体微球并进行交叉配对。其中,已有研究表明:蛋白质的磷酸化主要发生在几种氨基酸上,丝氨酸和苏氨酸,其次是酪氨酸。而cTnI抗原分子上的磷酸化位点有22/23、43/45、149位丝氨酸、144位酪氨酸。他们共同影响着cTnI的分子结构和功能。我们选用了市场上有/无嵌合人源抗体同步进行了实验。综上,Anti-cTnI我们选取了以下几种表位:24-40(27-40(包含嵌合))、40-50(41-49)、83-106(83-93、85-92)、189-198,尽量避开磷酸化位点。由于交叉配对数据较多,我们选取检测样本相关性较优以及低值灵敏度较高的配对进行具体分析,其中生物素标记物筛选出最优为抗24-40aa表位抗体,受体微球标记的抗体我们筛选出抗41-49aa表位抗体以及抗TnC抗体。以下为筛选出来较优组别不同条件的对比结果。
表4 抗体形式以及免疫来源影响
从表4我们可以得出,相同表位的不同抗体形式对低值测试影响较大。其中将鼠单抗恒定区替换嵌合人源抗体或采用羊多抗,低值测试灵敏度相比识别20-40aa鼠单抗有所改善,且鼠单抗测试个别样本会出现光值偏高现象,可能是由于HAMA效应所致。为了较少HAMA效应带来的影响,抗体的选择可以选用鼠抗恒定区替换为人源或者是其它动物免疫得到抗体。
表5 漏检测试结果
表5显示,抗24-40aa抗体生物素标记物与包被抗41-49aa抗体受体微球检测样本时出现1例漏检样本。在筛选配对时,我们发现抗24-40aa抗体生物素标记物与包被抗TnC抗体受体微球测试该例样本时不会出现假阴,但是该组合方式低值检测梯度较抗24-40aa抗体生物素标记物与包被抗41-49aa抗体受体微球组合差。为了防止测试过程中会出现漏检或者浓度值偏低情况,我们将受体微球工作液的组分在抗41-49aa抗体基础上引入抗TnC抗体。通过测试相同的样本我们发现适量的TnC加入可以补漏检并且可以使测试结果保持良好的梯度以及灵敏度。
表6 抗体标记位置
在本发明平台进行cTnI配对筛选时,我们发现抗体标记在生物素和受体微球上得到的光值可能不一致,甚至有些配对会出现检测样本灵敏度变差的情况。故本发明对抗体的标记位置进行了研究。抗24-40 aa嵌合人源抗体标记在生物素上,检测结果更优。
最终选取了能够优先识别较稳定的氨基酸序列的抗体对:生物素标记-抗cTnI24-40 aa嵌合人源抗体、受体微球标记-抗cTnI 41-49 aa抗体和抗TnC抗体的1+2组合以用于cTnI的高灵敏度和特异性检测,
实施例3 受体微球包被抗体的方式选择
由于发明人探索补漏检以及灵敏度实验时,是将分别标记的抗体-受体微球采用混合进同一工作液不同浓度的形式进行,该种方式有利于快速实验并获取所需的添加至工作液的抗体-受体微球浓度。从前面实验,我们得到受体微球要标记抗41-49 aa抗体和抗TnC抗体。对于筛选出的微球我们进行以下实验:混标或者是单独标记。其中:单独标记我们可以针对抗体选择合适的标记方式。抗体包被于受体微球有一步法标记和两步法标记。其中一步法标记EDC、抗体、微球同步反应;两步法先将EDC、NHS与微球反应再更高的pH与抗体反应。
表7 混标和单独标记方式对比
首先本发明控制标记方式均为一步法,将两种抗体采用混标和单独标记,同时标记三管,并分两天标记。从表7的结果发现混标的CV较单独标记高,并且个别管标记物会影响测试灵敏度,可能采用本发明的一步法混标抗体方式没办法满足较优批间差。
表8 单独标记物一步法和两步法标记方式对比
本发明一步法抗体偶联pH5~6,两步法偶联pH7.4~8,对于其他 pH并没有过多研究。针对以上条件,发明人对抗41-49 aa抗体和抗TnC抗体分别进行不同条件的标记。表8检测灵敏度只是单纯对比同一抗体两种方式的对比结果。发现在本发明标记方法下,抗41-49aa抗体和抗TnC抗体的标记最佳pH不同。所以采用混标的方式可能会损失一部分性能。本发明人建议针对不同种类的抗体进行标记,以使标记物最优。
综上,本发明试剂盒的受体微球包被的两种抗体采用单独标记并且抗41-49 aa抗体采用一步法,抗TnC抗体采用两步法标记。
上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效,而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下,对上述实施例进行修饰或改变。因此,举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变,仍应由本发明的权利要求所涵盖。
SEQUENCE LISTING
<110> 厦门宝太生物科技股份有限公司,厦门宝太和瑞生物技术有限公司
<120> 一种cTnI干式均相化学发光检测试剂盒
<130> 2022.5.17
<160> 2
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 17
<212> PRT
<213> cTnI 24-40的氨基酸序列(Amino acid sequence of cTnI 24-40)
<400> 1
Asn Tyr Arg Ala Tyr Ala Thr Glu Pro His Ala Lys Lys Lys Ser Lys
1 5 10 15
Ile
<210> 2
<211> 9
<212> PRT
<213> cTnI 41-49(Amino acid sequence of cTnI 41-49)
<400> 2
Ser Ala Ser Arg Lys Leu Gln Leu Lys
1 5
Claims (4)
1.一种cTnI干式均相化学发光检测试剂盒,其特征在于,包括如下组分:生物素标记的抗cTnI 24-40 aa嵌合人源抗体冻干小球、抗cTnI 41-49 aa抗体包被的受体微球和抗TnC抗体包被的受体微球制成的冻干小球、链霉亲和素包被的供体微球冻干小球、进样稀释液及检测卡;抗TnC抗体的标记pH为7.4~8.0,采用两步法标记,制备过程如下:
(1)将100μL,浓度为10mg/mL受体微球混悬液放入试管内,于14000rpm的转速下离心15min,去除上清液,加入两倍体积的pH5~6的MES溶液清洗两遍,同样于14000rpm的转速下离心15min,去除上清,加入200μL的pH5~6的MES溶液,超声分散,制成初级微球混悬液I;
(2)向步骤(1)制得的初级微球混悬液I中分别依次加入2~4μL 10mg/mL的EDC-MES溶液、4~8μL 10mg/mL的NHS-MES,混匀,在30~37 ℃摇床下震荡0.5h,反应结束后离心去除上清,加入200μL pH7.4~8.0 0.05M的HEPES清洗2遍,同样于14000rpm的转速下离心15min,去除上清,加入200μL的pH7.4~8 HEPES溶液,超声分散,制成次级微球混悬液Ⅱ;
(3)向步骤(2)制成次级微球混悬液Ⅱ中分别依次加入50~70μg抗TnC抗体、1~3μL 10%的Tween20-去离子水溶液,混匀,在30~37 ℃摇床下震荡4 h,反应结束后加入1mg牛血清白蛋白和1.2μL乙醇胺,混匀,置于30~37℃摇床上封闭30min,于14000rpm转速下离心15min,去除上清液,加入两倍体积的缓冲液①清洗两遍,加入50μL的缓冲液①贮存;所述链霉亲和素包被的供体微球制备过程如下:
A.将100μL,浓度为10mg/mL供体微球混悬液放入试管内,于14000rpm的转速下离心15min,去除上清液,加入两倍体积的pH5~6 MES溶液清洗两遍,同样于14000rpm的转速下离心15min,去除上清,加入200μL的pH5~6 MES溶液,超声分散,制成初级微球混悬液I;
B.向步骤A制得的初级微球混悬液I中分别依次加入50~100μg链霉亲和素、2~4μL10mg/mL的EDC-MES溶液,混匀,在30~37 ℃摇床下震荡2 h,反应结束后1mg牛血清白蛋白和1.2μL乙醇胺,混匀,置于30~37℃摇床上封闭30min,于14000rpm转速下离心15min,去除上清液,加入两倍体积的缓冲液①清洗两遍,加入50μL的缓冲液①贮存;
所述抗cTnI 41-49 aa抗体包被的受体微球和抗TnC抗体包被的受体微球工作液分别用缓冲液②分别稀释至工作浓度为0.5mg/mL和0.25mg/mL;所述生物素标记的抗cTnI 24-40 aa嵌合人源抗体工作液用缓冲液③稀释至工作浓度为2.5μg/mL;所述链霉亲和素包被的供体微球工作液用缓冲液①稀释至工作浓度为0.25mg/mL;所述缓冲液①由0.25M TRIS、0~0.9%氯化钠、5~7.5%牛血清白蛋白、0.5~1.0%Tween20、0.5% Proclin-300和去离子水配制而成,pH值8.5;所述缓冲液②由0.25M TRIS、0~0.9%氯化钠、5~7.5%牛血清白蛋白、0.5~1.0%Tween20、0.5% Proclin-300、0.01~0.05%苯酚红钠盐和去离子水配制而成;所述缓冲液③由0.25M TRIS、0~0.9%氯化钠、5~7.5%牛血清白蛋白、0.5~1.0%Tween20、0.5%Proclin-300、0.01~0.05%日落黄和去离子水配制而成,pH8.5;所述抗41-49 aa抗体的标记pH值为5~6,采用一步法标记,具体制备过程如下:
a.将100μL,浓度为10mg/mL受体微球混悬液放入试管内,于14000rpm的转速下离心15min,去除上清液,加入两倍体积的pH5~6 MES溶液清洗两遍,同样于14000rpm的转速下离心15min,去除上清,加入200μL的pH5~6 MES溶液,超声分散,制成初级微球混悬液I;
b.向步骤a制得的初级微球混悬液I中分别依次加入50~70μg抗cTnI 41-49 aa抗体、2~4μL 10mg/mL的EDC-MES溶液、1~3μL 10%的Tween20-去离子水,混匀,在30~37 ℃摇床下震荡2h,反应结束后加入1mg牛血清白蛋白和1.2μL乙醇胺,混匀,置于30~37℃摇床上封闭30min,于14000rpm转速下离心15min,去除上清液,加入两倍体积的缓冲液①清洗两遍,加入50μL的缓冲液①贮存。
2.如权利要求1所述的cTnI干式均相化学发光检测试剂盒,其特征在于,所述cTnI 24-40aa的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示;所述cTnI 41-49 aa的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
3.如权利要求1所述的cTnI干式均相化学发光检测试剂盒,其特征在于,所述生物素标记抗cTnI 24-40 aa嵌合人源抗体制备过程如下:50μg的抗cTnI 24-40 aa嵌合人源抗体和0.95~1.89μg的sigma长链生物素加入到50μL,pH9.5,0.05M的CB缓冲液中,于25℃下震荡2h,反应后加入0.5~1mg甘氨酸,于25℃下震荡封闭30min,生物素标记抗cTnI 24-40 aa嵌合人源抗体溶液在pH7.4,0.01M的PBS缓冲液中透析24h,即得。
4.如权利要求1所述的cTnI干式均相化学发光检测试剂盒,其特征在于,所述冻干小球的制备过程如下:将滴珠机出液体积大小调整至10μL,抗cTnI 41-49 aa抗体包被的受体微球工作液和抗TnC抗体包被的受体微球工作液、生物素标记的抗cTnI 24-40 aa嵌合人源抗体工作液或链霉亲和素包被的供体微球工作液经滴珠机呈小液滴滴落,滴落的液滴经液氮冷冻后呈小球状;将液氮冷冻小球转移至已预冻至-40℃的冻干机,后进行冷冻干燥;干燥结束后分别得到三组分的冻干小球。
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