CN111909948A - 一种稳定肌钙蛋白i标准物质及其制备方法 - Google Patents

一种稳定肌钙蛋白i标准物质及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种稳定肌钙蛋白I标准物质及其制备方法，在cTnI稳定片段氨基酸序列基础上，转化BL21(DE3)感受态细胞，超声破碎诱导表达的工程菌获取cTnI包涵体，经1％Triton X‑100，2M脲洗涤后溶解在8M脲中，后经CM‑FF柱上复性和稀释复性纯化得到了肌钙蛋白I的标准物质。其中，所述cTnI稳定片段氨基酸序列选自cTnI蛋白序列中第30‑第110的氨基酸序列片段，所述cTnI蛋白序列如SEQ No：1所示。本发明采用了一种新方法实现了对肌钙蛋白I标准物质的制备，解决了肌钙蛋白不稳定的问题。该标准物质可在低温条件下保持长期稳定，满足国家一级标准物质的要求。该标准物质为肌钙蛋白序列的稳定片段，能够覆盖市面上多数试剂盒的抗原表位要求。

Description

一种稳定肌钙蛋白I标准物质及其制备方法
技术领域
本发明涉及生物化学技术领域，特别是涉及一种稳定肌钙蛋白I标准物质的制备方法。
背景技术
心肌肌钙蛋白(Cardiac Troponin，cTn)是心肌细胞的收缩调节蛋白，由Ca2+结合亚基肌钙蛋白C(cTnC)、原肌球蛋白结合亚基肌钙蛋白T(cTnT)、抑制亚基肌钙蛋白I(cTnI)三种亚基组成复合体，调节粗、细肌丝之间的相对滑行，从而调节肌肉收缩。心肌受损时，三个亚基被释放至细胞外，并可在外周血中检测出来，心肌肌钙蛋白是心肌损伤的特异性标志物，是心肌梗死的金指标。
心肌肌钙蛋白T的试剂盒已经由罗氏公司垄断，不存在一致化的问题。但是文献报道，仅美国FDA就至少批准了15家以上的厂家生产肌钙蛋白I检测试剂盒，不同厂家的试剂盒检测同一样本结果的差异甚至可达到100倍。美国标准化研究院NIST与美国临床化学委员会(AACC)早在2001年就成立了肌钙蛋白I标准化委员会来专门做肌钙蛋白I的标准化。2005年美国NIST研制出了人心肌来源的肌钙蛋白标准物质SRM2921，在当时为肌钙蛋白I的标准化做出了很大的贡献。但是随着用户的使用，越来越多的文章报道该标准物质会随着保存时间的推移和温度的变化而不稳定。
中国计量科学研究院对肌钙蛋白I不稳定的问题，重组了肌钙蛋白I的稳定片段序列，并经过纯化得到了肌钙蛋白I的标准物质候选物。由于目前国内尚未研制出肌钙蛋白I的标准物质，且缺乏相关的检测参考方法，因此肌钙蛋白I检测的标准化无法实现，导致许多研究结果截然不同甚至互相矛盾。因此准确定量测定体液中的肌钙蛋白I的含量并建立其定量量值体系在肌钙蛋白I的临床检验和疾病的诊断中有着重要的作用。
发明内容
本发明的目的是提供一种稳定肌钙蛋白I标准物质及其制备方法，具有良好的准确性、可靠性和溯源性。本发明明确被测物质，实现对待测物质的范围划定；简化了蛋白质前处理步骤，消除了过程中引入的其他变量和由此导致的不确定度；不选用特征肽段进入质谱的检测方法，消除了由于异质性而产生的质荷比改变所产生的结果差异；不选用制备过程复杂表征困难的同位素标记的重组cTnI作为内标，简化了实验方案。本发明利用同位素稀释质谱法准确定量重组肌钙蛋白I，建立其标准定值体系，使检测结果可溯源至SI。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案具体如下：
针对肌钙蛋白I不稳定的问题，在cTnI稳定片段氨基酸序列基础上，转化BL21(DE3)感受态细胞，超声破碎诱导表达的工程菌获取cTnI包涵体，经1％Triton X-100，2M脲洗涤后溶解在8M脲中，后经CM-FF柱上复性和稀释复性纯化cTnI，得到了肌钙蛋白I的标准物质；其中，所述cTnI稳定片段氨基酸序列选自cTnI蛋白序列中第30-第110氨基酸序列的片段，所述cTnI蛋白序列如SEQ No:1所示。所述cTnI稳定片段氨基酸序列如SEQ No:2所示。具体包括以下步骤：
(1)人血清样本准备；
(2)稳定心肌肌钙蛋白I标准物质的制备：1)重组质粒转化BL21(DE3)感受态细胞及筛选；2)重组人cTnI的IPTG诱导表达；3)重组人cTnI包涵体蛋白的裂解，洗涤；4)重组人cTnI的纯化。
其中，所述步骤(1)具体为，将采集的人血清样本进行人类免疫缺陷病毒抗体(HIV)、梅毒、乙型肝炎表面抗原(HBV)、丙肝抗体(HCV)及常规生化全套；按照常规方法检测得到的cTnI含量，将血清样本分成低、中、高三个浓度水平，分别记为1-2-1、1-2-2、1-2-3，每个浓度水平的血清混匀后过滤至无菌滤瓶；将血清样本分装，-80摄氏度冰箱冷冻保存。
其中，所述重组质粒转化BL21(DE3)感受态细胞及筛选步骤具体为，
1)从冰箱中取出一管的感受态细胞(BL21，0.5ml)迅速置于冰上，细胞在冰上融化20min；
2)将1ul的重组PET-32a质粒DNA直接加入细胞中，随后将管重置于冰中，30min；
3)42℃水浴60秒，不可摇动，迅速冰上放置5分钟；
4)加入900ul空白LB培养基，37℃，160rpm，1h，取300ul涂布卡那霉素的LB平板；
5)将平板放于工作台上数分钟以使涂布的液体被吸收，倒置，37℃培养过夜；
次日，用无菌接种环从固体平板上挑取状态好的单个菌落，接种到5ml卡那霉素抗性(K+)LB液体培养基，37℃，230rpm，12-18h，直至OD600约为0.6-0.8，其中一管加入诱导剂IPTG(终浓度为lmM)，另一管不加作对照，37℃，230rpm，5h，5000rpm，离心15min收菌，弃上清，加5ml细菌裂解缓冲液裂解菌体，5000rpm，15min，对上清、沉淀进行变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，鉴定目的蛋白的表达情况；筛选出表达目的蛋白单菌落；并且分析目的蛋白可溶性，-20℃保存含有重组质粒pET-32a-cTnI菌种(800ul菌液+200ul 80％甘油)，作为种子液备用。
所述SDS-PAGE的具体操作方法为：
1)固定好玻璃槽，可用去离子水检查是否泄漏，配制12％分离胶，混均注入玻璃板间隙中，缓缓加入几毫升去离子水覆盖；
2)室温约30min凝胶聚合完成，倒掉覆盖水，配制5％浓缩胶，混均注入分离胶上端，小心***梳子避免产生气泡；
3)室温约30min浓缩胶聚合，去掉梳子备用；
4)内外槽均加入lx电极缓冲液，检查是否泄漏，同时样品与上样缓冲液混合，100℃煮沸5min，3000rpm，1min，取上清上样；
5)电泳开始时电压为8V/cm凝胶，待染料进入分离胶后，将电压增加到15V/cm凝胶，待染料达分离胶底部，断开电源，取下凝胶；
6)用染色液浸泡凝胶，摇床上室温约1h；
7)换用脱色液浸泡凝胶，缓慢摇动脱色直到清晰，照相，或封闭在20％甘油中。
其中，所述重组人cTnI的IPTG诱导表达步骤具体为：
1)取50ul甘油保种菌接种到5ml K+抗性的LB液体培养基中，37℃，160rpm，12-16h，使OD600值达到0.6-0.8；
2)将上述5ml菌液加入500ml K+抗性的LB液体培养基中，37℃，230rpm，当OD600值达到0.6-0.8，加入IPTG储藏液(终浓度1mM)，继续培养；
3)诱导5-8h，5000rpm，离心15分钟，弃上清液；
4)经过去离子水重新悬浮后，5000rpm，离心15分钟，弃上清液，-20℃冻存。
其中，所述重组人cTnI包涵体蛋白的裂解、洗涤步骤具体为，
1)包涵体粗品制备：取出5g贮存的诱导菌，融化后加入250ml细菌裂解缓冲液重新悬浮后，冰浴超声波破碎，超声3s，间隔5s，功率400W，20min，然后经6000rpm离心20min，弃上清，并取样，即得cTnI包涵体粗品；
2)包涵体的洗涤：将包涵体粗品依次重悬在300ml 1％Triton X-100洗涤液，2MUre洗涤液中，在4℃分别磁力搅拌洗涤1h和0.5h，最后重悬Tris缓冲液中，6000rpm离心20min，弃上清并取样；
3)包涵体的溶解：将洗涤后的0.1g湿重包涵体加入到50ml包涵体溶解缓冲液中，4℃过夜，沉淀溶液变得透明澄清，备用；
4)分别对洗涤过程中的取样进行变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，分析目的蛋白洗涤，溶解情况。
其中，所述重组人cTnI的纯化步骤包括包涵体的稀释复性及包涵体的阳离子柱上复性。
其中，包涵体的稀释复性具体为：将含0.1g湿重包涵体溶解缓冲液50ml脉冲加入到1L复性缓冲液中，整个过程持续2-3h，冰浴磁力搅拌复性18-24h，过0.22um滤膜，经5KD超滤膜包浓缩后，在4℃透析液(Tris:20mM pH＝7.4)中透析，最后经阳离子柱上样；
具体操作步骤如下：
1)用5CVTris缓冲液平衡阳离子柱(5ml，CM-FF)，UV值调零；
2)样品0.5-1ml/min上样，结束后用Tris缓冲液将UV值洗回基线；
3)分别用30％，100％1M NaCl洗脱缓冲液洗脱，流速5ml/min，注意样品的收集以及取样。
其中，所述包涵体的阳离子柱上复性具体操作步骤如下：
1)用5CV包涵体溶解缓冲液平衡阳离子柱(5ml，CM-FF)，UV值调零；
2)将含0.1g包涵体变性液45ml过0.22um微孔滤膜，0.5-1ml/min上样，结束后用包涵体溶解缓冲液将UV值洗回基线；
3)逐渐增大Tris缓冲液/包涵体溶解缓冲液的比例由0至100％，流速0.5ml/min，2h内完成；
4)分别用8％，30％，80％1M NaCl洗脱缓冲液洗脱，流速5ml/min，收集第二个蛋白峰；
5)最后用8M Ure洗脱缓冲液洗脱柱子上复性失败的蛋白，整个过程注意取样。
同现有技术相比，本发明的突出效果在于：
1)本发明采用了一种新方法实现对肌钙蛋白I标准物质的制备，解决了肌钙蛋白不稳定的问题。
2)标准物质可在低温条件下保持长期稳定，满足国家一级标准物质的要求。
3)标准物质为肌钙蛋白序列的稳定片段，能够覆盖市面上多数试剂盒的抗原表位要求。
4)首次提出了以蛋白质特定序列替代完整蛋白作为标准物质。
下面结合附图说明和具体实施例对本发明所述的稳定肌钙蛋白I标准物质及其制备方法作进一步说明。
附图说明
图1为SDS-PAGE分析cTnI包涵体的复性；
图2为重组肌钙蛋白的高效液相色谱图，内插图显示归一化法得出重组肌钙蛋白I的纯度为97.3％；
图3为肌钙蛋白稳定片段稳定性数据。
具体实施方式
(1)主要试剂
三氟乙酸(色谱纯)，甲酸(分析纯)，全氟庚酸(分析纯)：购自Sigma-AldrichCorporation；Tris碱(保证试剂)：来自安格斯化学公司；
乙腈(色谱纯)：来自J.T Baker Chemical Company；
尿液，碘乙酰胺：北京百迪生物技术有限公司；
Tris(超纯)：来自Amresco，Inc；
碳酸氢铵(分析纯)：来自中国医药集团有限公司；
DTT：来自Inalco；
胰蛋白酶：来自Promega Corporation；
盐酸(保证试剂)：北京化学试剂有限公司；
苯丙氨酸(纯度99.0％)：国家参考物质，GBW(E)100061；
缬氨酸(纯度99.0％)：国家参考物质，GBW(E)100055；
脯氨酸(纯度99.0％)：国家参考物质，GBW(E)100084；
亮氨酸(纯度99.0％)：国家参考材料，GBW(E)100058；
13D8-L-苯丙氨酸(纯度98.0％)，13C5-L-缬氨酸(纯度98.0％)，13C5-L-脯氨酸(纯度98.0％)，13D10-L-亮氨酸(纯度98.0％)：来自Cambridge Isotope Laboratories，Inc。
(2)仪器设备
涡旋混合器：SCILOGEX的产品；
离心机：Sigma-Aldrich Corporation的产品；
KS260型台式浓缩机：IKA产品；
1200型高效液相色谱仪：安捷伦产品；
超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱(UPLC/Q-TOF-MS)：沃特世公司；
XP26型分析天平：Mettler-Toledo产品，最大测量范围为22g，精度为0.001mg；
ME235S型分析天平：Sartorius的产品，最大测量范围为230克，精度为0.01毫克；
MALDI-TOF-MS：布鲁克产品；
移液器(20、200和1000μL)：Thermo Fisher Scientific(德国)的产品；
6410型高效液相色谱三重四极杆质谱仪(HPLC-MS/MS)：安捷伦公司产品。
1、人血清样本的准备
将采集的人血清样本进行人类免疫缺陷病毒抗体(HIV)、梅毒、乙型肝炎表面抗原(HBV)、丙肝抗体(HCV)及常规生化全套。
按照常规方法检测得到的cTnI含量，将血清样本分成低、中、高三个浓度水平，分别记为1-2-1、1-2-2、1-2-3，每个浓度水平的血清混匀后过滤至无菌滤瓶。将血清样本分装，-80摄氏度冰箱冷冻保存。
2、稳定心肌肌钙蛋白I标准物质的制备
2.1重组质粒转化BL21(DE3)感受态细胞及筛选
1)从冰箱中取出一管的感受态细胞(BL21，0.5ml)迅速置于冰上，细胞在冰上融化20min。
2)将1ul的重组PET-32a质粒DNA直接加入细胞中，随后将管重置于冰中，30min。
3)42℃水浴60秒，不可摇动，迅速冰上放置5分钟。
4)加入900ul空白LB培养基，37℃，160rpm，1h，取300ul涂布卡那霉素的LB平板。
5)将平板放于工作台上数分钟以使涂布的液体被吸收，倒置，37℃培养过夜。
次日，用无菌接种环从固体平板上挑取状态好的单个菌落，接种到5ml卡那霉素抗性(K+)LB液体培养基，37℃，230rpm，12-18h，直至OD600约为0.6-0.8，其中一管加入诱导剂IPTG(终浓度为lmM)，另一管不加作对照，37℃，230rpm，5h，5000rpm，离心15min收菌，弃上清，加5ml细菌裂解缓冲液裂解菌体，5000rpm，15min，对上清、沉淀进行变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，鉴定目的蛋白的表达情况。筛选出表达目的蛋白单菌落。并且分析目的蛋白可溶性，-20℃保存含有重组质粒pET-32a-cTnI菌种(800ul菌液+200ul 80％甘油)，作为种子液备用。
SDS-PAGE具体操作方法如下：
1)固定好玻璃槽，可用去离子水检查是否泄漏，配制12％分离胶，混均注入玻璃板间隙中，缓缓加入几毫升去离子水覆盖。
2)室温约30min凝胶聚合完成，倒掉覆盖水，配制5％浓缩胶，混均注入分离胶上端，小心***梳子避免产生气泡。
3)室温约30min浓缩胶聚合，去掉梳子备用。
4)内外槽均加入lx电极缓冲液，检查是否泄漏，同时样品与上样缓冲液混合，100℃煮沸5min，3000rpm，1min，取上清上样。
5)电泳开始时电压为8V/cm凝胶，待染料进入分离胶后，将电压增加到15V/cm凝胶，待染料达分离胶底部，断开电源，取下凝胶。
6)用染色液浸泡凝胶，摇床上室温约1h。
7)换用脱色液浸泡凝胶，缓慢摇动脱色直到清晰，照相，或封闭在20％甘油中。
2.2重组人cTnI的IPTG诱导表达
1)取50ul甘油保种菌接种到5ml K+抗性的LB液体培养基中，37℃，160rpm，12-16h，使OD600值达到0.6-0.8。
2)将上述5ml菌液加入500ml K+抗性的LB液体培养基中，37℃，230rpm，当OD600值达到0.6-0.8，加入IPTG储藏液(终浓度1mM)，继续培养。
3)诱导5-8h，5000rpm，离心15分钟，弃上清液。
4)经过去离子水重新悬浮后，5000rpm，离心15分钟，弃上清液，-20℃冻存。
2.3重组人cTnI包涵体蛋白的裂解，洗涤
1)包涵体粗品制备：取出5g贮存的诱导菌，融化后加入250ml细菌裂解缓冲液重新悬浮后，冰浴超声波破碎，超声3s，间隔5s，功率400W，20min，然后经6000rpm离心20min，弃上清，并取样，即得cTnI包涵体粗品；
2)包涵体的洗涤：将包涵体粗品依次重悬在300ml 1％Triton X-100洗涤液，2MUre洗涤液中，在4℃分别磁力搅拌洗涤1h和0.5h，最后重悬Tris缓冲液中，6000rpm离心20min，弃上清并取样；
3)包涵体的溶解：将洗涤后的0.1g湿重包涵体加入到50ml包涵体溶解缓冲液中，4℃过夜，沉淀溶液变得透明澄清，备用；
4)分别对洗涤过程中的取样进行变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，分析目的蛋白洗涤，溶解情况。
2.4重组人cTnI的纯化
2.4.1包涵体的稀释复性(如图1所示)
将含0.1g湿重包涵体溶解缓冲液50ml脉冲加入到1L复性缓冲液中，整个过程持续2-3h，冰浴磁力搅拌复性18-24h，过0.22um滤膜，经5KD超滤膜包浓缩后，在4℃透析液(Tris:20mM pH＝7.4)中透析，最后经阳离子柱上样。
具体操作步骤如下：
1)用5CVTris缓冲液平衡阳离子柱(5ml，CM-FF)，UV值调零；
2)样品0.5-1ml/min上样，结束后用Tris缓冲液将UV值洗回基线；
3)分别用30％，100％1M Nacl洗脱缓冲液洗脱，流速5ml/min，注意样品的收集以及取样。
2.4.2包涵体的阳离子柱上复性(如图1所示)
基本原理是：用包涵体溶解缓冲液平衡柱子，通过逐渐增大Tris缓冲液/包涵体溶解缓冲液的比例，形成尿素浓度降低线性梯度，变性蛋白质随着尿素浓度的降低而逐渐复性，然后通过增加盐离子的浓度洗脱复性目的蛋白。
具体操作步骤如下:
1)用5CV包涵体溶解缓冲液平衡阳离子柱(5ml，CM-FF)，UV值调零。
2)将含0.1g包涵体变性液45ml过0.22um微孔滤膜，0.5-1ml/min上样，结束后用包涵体溶解缓冲液将UV值洗回基线。
3)逐渐增大Tris缓冲液/包涵体溶解缓冲液的比例由0至100％，流速0.5ml/min，2h内完成。
4)分别用8％，30％，80％1M NaCl洗脱缓冲液洗脱，流速5ml/min，收集第二个蛋白峰。
5)最后用8M Ure洗脱缓冲液洗脱柱子上复性失败的蛋白，整个过程注意取样。
3、重组肌钙蛋白I的高效液相色谱分析(如图2所示)
实验条件：流动相A：超纯水+0.1％TFA；流动相B：乙腈；进样量：10μL；停止时间：30min；柱温：40℃；色谱柱：Agilent SB-Aq C18，150mm×2.1mm×5μm；流速：0.2mL/min；检测器：DAD检测器；流动相比例为A:B＝90:10。
经全波长扫描检测得知，重组肌钙蛋白I的最大吸收波长为210.4nm。在此检测波长下，样品的高效液相色谱图如图3所示。根据峰面积归一化法得出，样品的纯度为97.3％。
5、重组人cTnI稳定性测定(如图3所示)
标准物质的稳定性是指在规定的时间间隔和环境条件下，标准物质的特性量值保持在规定范围内的性质。CTNI标准物质储存在-80℃的冰箱中，在干冰保护下运输。CTNI标准物质的长期稳定性检验采用色谱法，在-80℃的温度下储存24个月，分析1个月，3个月，6个月，9个月，14个月和18个月和24个月的CTNI标准物质值的变化。短期稳定性检验采用ELISA法，在4℃的温度下分别观察1天，2天，3天，4天，5天，6天和7天内CTNI标准物质值的变化及在25℃的温度下观察1小时，2小时，12小时和24小时每个时间点CTNI标准物质值的变化。稳定性测试方法与均质性相同。通过ISO指南35：2006中推荐的回归分析，评估了候选CRM的短期和长期稳定性。
稳定性测试结果图3表明，CTNI标准物质可以在25℃下稳定24小时，在4℃下稳定48小时，并在48小时内具有明显的降解，在-80℃下稳定超过24个月。
以上所述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案作出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
序列表
<110> 中国计量科学研究院
<120> 一种稳定肌钙蛋白I标准物质及其制备方法
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 210
<212> PRT
<213> 肌钙蛋白I(Cardiac Troponin I)
<400> 1
Met Ala Asp Gly Ser Ser Asp Ala Ala Arg Glu Pro Arg Pro Ala Pro
1 5 10 15
Ala Pro Ile Arg Arg Arg Ser Ser Asn Tyr Arg Ala Tyr Ala Thr Glu
20 25 30
Pro His Ala Lys Lys Lys Ser Lys Ile Ser Ala Ser Arg Lys Leu Gln
35 40 45
Leu Lys Thr Leu Leu Leu Gln Ile Ala Lys Gln Glu Leu Glu Arg Glu
50 55 60
Ala Glu Glu Arg Arg Gly Glu Lys Gly Arg Ala Leu Ser Thr Arg Cys
65 70 75 80
Gln Pro Leu Glu Leu Ala Gly Leu Gly Phe Ala Glu Leu Gln Asp Leu
85 90 95
Cys Arg Gln Leu His Ala Arg Val Asp Lys Val Asp Glu Glu Arg Tyr
100 105 110
Asp Ile Glu Ala Lys Val Thr Lys Asn Ile Thr Glu Ile Ala Asp Leu
115 120 125
Thr Gln Lys Ile Phe Asp Leu Arg Gly Lys Phe Lys Arg Pro Thr Leu
130 135 140
Arg Arg Val Arg Ile Ser Ala Asp Ala Met Met Gln Ala Leu Leu Gly
145 150 155 160
Ala Arg Ala Lys Glu Ser Leu Asp Leu Arg Ala His Leu Lys Gln Val
165 170 175
Lys Lys Glu Asp Thr Glu Lys Glu Asn Arg Glu Val Gly Asp Trp Arg
180 185 190
Lys Asn Ile Asp Ala Leu Ser Gly Met Glu Gly Arg Lys Lys Lys Phe
195 200 205
Glu Ser
210
<210> 2
<211> 81
<212> PRT
<213> cTnI片段(Cardiac Troponin I)
<400> 2
Ala Thr Glu Pro His Ala Lys Lys Lys Ser Lys Ile Ser Ala Ser Arg
1 5 10 15
Lys Leu Gln Leu Lys Thr Leu Leu Leu Gln Ile Ala Lys Gln Glu Leu
20 25 30
Glu Arg Glu Ala Glu Glu Arg Arg Gly Glu Lys Gly Arg Ala Leu Ser
35 40 45
Thr Arg Cys Gln Pro Leu Glu Leu Ala Gly Leu Gly Phe Ala Glu Leu
50 55 60
Gln Asp Leu Cys Arg Gln Leu His Ala Arg Val Asp Lys Val Asp Glu
65 70 75 80
Glu

Claims (10)

1.一种稳定肌钙蛋白I标准物质的制备方法，其特征在于：在cTnI稳定片段氨基酸序列基础上，转化BL21(DE3)感受态细胞，超声破碎诱导表达的工程菌获取cTnI包涵体，经1％Triton X-100，2M脲洗涤后溶解在8M脲中，后经CM-FF柱上复性和稀释复性纯化，得到了肌钙蛋白I的标准物质；其中，所述cTnI稳定片段氨基酸序列选自cTnI蛋白序列中第30-第110氨基酸序列的片段，所述cTnI蛋白序列如SEQ No:1所示。
2.根据权利要求1所述的稳定肌钙蛋白I标准物质的制备方法，其特征在于：所述cTnI稳定片段氨基酸序列如SEQ No:2所示。
3.根据权利要求1所述的稳定肌钙蛋白I标准物质的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)人血清样本准备；
(2)稳定心肌肌钙蛋白I标准物质的制备：
1)重组质粒转化BL21(DE3)感受态细胞及筛选；2)重组人cTnI的IPTG诱导表达；3)重组人cTnI包涵体蛋白的裂解，洗涤；4)重组人cTnI的纯化。
4.根据权利要求3所述的稳定肌钙蛋白I标准物质的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)具体为，将采集的人血清样本进行人类免疫缺陷病毒抗体(HIV)、梅毒、乙型肝炎表面抗原(HBV)、丙肝抗体(HCV)及常规生化全套；按照常规方法检测得到的cTnI含量，将血清样本分成低、中、高三个浓度水平，分别记为1-2-1、1-2-2、1-2-3，每个浓度水平的血清混匀后过滤至无菌滤瓶；将血清样本分装，-80摄氏度冰箱冷冻保存。
5.根据权利要求3所述的稳定肌钙蛋白I标准物质的制备方法，其特征在于：所述重组质粒转化BL21(DE3)感受态细胞及筛选步骤具体为，
1)从冰箱中取出一管的感受态细胞(BL21，0.5ml)迅速置于冰上，细胞在冰上融化20min；
2)将1ul的重组PET-32a质粒DNA直接加入细胞中，随后将管重置于冰中，30min；
3)42℃水浴60秒，不可摇动，迅速冰上放置5分钟；
4)加入900ul空白LB培养基，37℃，160rpm，1h，取300ul涂布卡那霉素的LB平板；
5)将平板放于工作台上数分钟以使涂布的液体被吸收，倒置，37℃培养过夜；
次日，用无菌接种环从固体平板上挑取状态好的单个菌落，接种到5ml卡那霉素抗性(K+)LB液体培养基，37℃，230rpm，12-18h，直至OD600约为0.6-0.8，其中一管加入诱导剂IPTG(终浓度为lmM)，另一管不加作对照，37℃，230rpm，5h，5000rpm，离心15min收菌，弃上清，加5ml细菌裂解缓冲液裂解菌体，5000rpm，15min，对上清、沉淀进行变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，鉴定目的蛋白的表达情况；筛选出表达目的蛋白单菌落；并且分析目的蛋白可溶性，-20℃保存含有重组质粒pET-32a-cTnI菌种(800ul菌液+200ul 80％甘油)，作为种子液备用。
6.根据权利要求5所述的稳定肌钙蛋白I标准物质的制备方法，其特征在于：所述SDS-PAGE的具体操作方法为：
1)固定好玻璃槽，可用去离子水检查是否泄漏，配制12％分离胶，混均注入玻璃板间隙中，缓缓加入几毫升去离子水覆盖；
2)室温约30min凝胶聚合完成，倒掉覆盖水，配制5％浓缩胶，混均注入分离胶上端，小心***梳子避免产生气泡；
3)室温约30min浓缩胶聚合，去掉梳子备用；
4)内外槽均加入lx电极缓冲液，检查是否泄漏，同时样品与上样缓冲液混合，100℃煮沸5min，3000rpm，1min，取上清上样；
5)电泳开始时电压为8V/cm凝胶，待染料进入分离胶后，将电压增加到15V/cm凝胶，待染料达分离胶底部，断开电源，取下凝胶；
6)用染色液浸泡凝胶，摇床上室温约1h；
7)换用脱色液浸泡凝胶，缓慢摇动脱色直到清晰，照相，或封闭在20％甘油中。
7.根据权利要求3所述的稳定肌钙蛋白I标准物质的制备方法，其特征在于：所述重组人cTnI的IPTG诱导表达步骤具体为：
1)取50ul甘油保种菌接种到5ml K+抗性的LB液体培养基中，37℃，160rpm，12-16h，使OD600值达到0.6-0.8；
2)将上述5ml菌液加入500ml K+抗性的LB液体培养基中，37℃，230rpm，当OD600值达到0.6-0.8，加入IPTG储藏液(终浓度1mM)，继续培养；
3)诱导5-8h，5000rpm，离心15分钟，弃上清液；
4)经过去离子水重新悬浮后，5000rpm，离心15分钟，弃上清液，-20℃冻存。
8.根据权利要求3所述的稳定肌钙蛋白I标准物质的制备方法，其特征在于：所述重组人cTnI包涵体蛋白的裂解、洗涤步骤具体为，
1)包涵体粗品制备：取出5g贮存的诱导菌，融化后加入250ml细菌裂解缓冲液重新悬浮后，冰浴超声波破碎，超声3s，间隔5s，功率400W，20min，然后经6000rpm离心20min，弃上清，并取样，即得cTnI包涵体粗品；
2)包涵体的洗涤：将包涵体粗品依次重悬在300ml 1％Triton X-100洗涤液，2M Ure洗涤液中，在4℃分别磁力搅拌洗涤1h和0.5h，最后重悬Tris缓冲液中，6000rpm离心20min，弃上清并取样；
3)包涵体的溶解：将洗涤后的0.1g湿重包涵体加入到50ml包涵体溶解缓冲液中，4℃过夜，沉淀溶液变得透明澄清，备用；
4)分别对洗涤过程中的取样进行变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，分析目的蛋白洗涤，溶解情况。
9.根据权利要求3所述的稳定肌钙蛋白I标准物质的制备方法，其特征在于：所述重组人cTnI的纯化步骤包括包涵体的稀释复性及包涵体的阳离子柱上复性；
包涵体的稀释复性具体为：将含0.1g湿重包涵体溶解缓冲液50ml脉冲加入到1L复性缓冲液中，整个过程持续2-3h，冰浴磁力搅拌复性18-24h，过0.22um滤膜，经5KD超滤膜包浓缩后，在4℃透析液(Tris:20mM pH＝7.4)中透析，最后经阳离子柱上样；
具体操作步骤如下：
1)用5CVTris缓冲液平衡阳离子柱(5ml，CM-FF)，UV值调零；
2)样品0.5-1ml/min上样，结束后用Tris缓冲液将UV值洗回基线；
3)分别用30％，100％1M NaCl洗脱缓冲液洗脱，流速5ml/min，注意样品的收集以及取样；
包涵体的阳离子柱上复性具体操作步骤如下：
1)用5CV包涵体溶解缓冲液平衡阳离子柱(5ml，CM-FF)，UV值调零；
2)将含0.1g包涵体变性液45ml过0.22um微孔滤膜，0.5-1ml/min上样，结束后用包涵体溶解缓冲液将UV值洗回基线；
3)逐渐增大Tris缓冲液/包涵体溶解缓冲液的比例由0至100％，流速0.5ml/min，2h内完成；
4)分别用8％，30％，80％1M NaCl洗脱缓冲液洗脱，流速5ml/min，收集第二个蛋白峰；
5)最后用8M Ure洗脱缓冲液洗脱柱子上复性失败的蛋白，整个过程注意取样。
10.权利要求1-9任一所述的制备方法获得的稳定肌钙蛋白I标准物质。
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