CN114989249B - 纳米短肽r-life-1及其在药物、医疗美容和生物医学的应用 - Google Patents

纳米短肽r-life-1及其在药物、医疗美容和生物医学的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了纳米短肽R‑LIFE‑1及其在药物、医疗美容和生物医学的应用，涉及自组装短肽领域，解决如何生产降解抵抗力更强、毒性更弱和原位激活胶原新生等的玻尿酸产品，其氨基酸序列：Arg Leu Glu Cys Lys Ile Asp PheCys Glu，该种自组装短肽提高了传统短肽纳米三维支架的机械强度，可用于药物、生物大分子、蛋白质的载体及佐剂；可作为佐剂与透明质酸联合使用，制备成为比单独使用透明质酸效果更好、更稳定、安全性更好、抵抗降解更强、毒性更小的联合体系；短肽也可以作为单独的填充或者涂抹产品替代透明质酸使用；可联合外泌体或单独使用对紫外线损伤皮肤进行修复。

Description

纳米短肽R-LIFE-1及其在药物、医疗美容和生物医学的应用
技术领域
本发明涉及自组装短肽技术领域，更具体的是涉及自组装短肽在生物学、纳米医学、医疗美容产品及保健品中的应用。
背景技术
短肽在自然界中无处不在，包括激素、信息素、抗菌素、抗真菌剂、毒素和杀虫剂等等。但没有人认为肽可以作为支架水凝胶材料应用。自1990年在酵母蛋白中发现一个非常有趣的重复片段后，人们对于短肽的应用认识已经发生了显著的变化。现在人们认识到，由20种天然氨基酸制成的自组装肽具有真正的材料特性。目前，许多不同的应用已经从简单的自组装短肽发展这些设计的自组装肽支架水凝胶，并在商业上应用。例子包括：（1）真正的3D组织细胞培养不同的组织细胞和各种干细胞，（2）修复和再生医学以及组织工程，（3）3D组织打印，（4）持续释放小分子，生长因子和单克隆抗体，（5）加速伤口愈合皮肤和糖尿病溃疡以及即时止血应用程序。
分子自组装指的是分子在不受外力介入的情况下，能够进行自我组织，自我聚集形成一种规则的结构，即能够从一个杂乱无序的状态转变成一个有序的状态。近几年来，手性自组装短肽，已经发展成为一种新兴的纳米生物材料。它是一种仿ECM的生物支架纳米材料，能够模仿ECM的部分功能，从而影响细胞迁移、增殖、分化等生物学行为，可以作为细胞三维培养的基质材料，同时它在创伤修复、组织损伤修复等方面均有一定的作用。
近年来随着化妆品的普及，化妆品深受广大年轻人的喜爱和关注，美白、抗衰老、抗皱等发展日益迅速它一直受到相关学科领域、特别是医学美容、化妆品科学、护肤保健及皮肤抗衰老等领域的高度重视和普遍关注。
众所周知，透明质酸是人类和其他哺乳动物***的基本成分之一。它是人体表皮、上皮和神经组织中广泛存在的一种物质。透明质酸赋予皮肤独特的抵抗力和保形性。缺乏透明质酸会导致皮肤衰弱，促进皱纹和瑕疵的形成。随着年龄的增长，人体组织中透明质酸的浓度趋于降低，从而削弱了其组织修复功能。随着逐渐衰老并反复暴露于紫外线下，表皮细胞减少了透明质酸的产生，并且衰老速度增加。由于这个原因，基于HA的制剂今天仍然被认为是市场上最好的表皮填充剂，因为它们没有皮肤过敏反应的风险。最初，基于透明质酸的第一种制剂以悬浮在凝胶中的颗粒或微球形式制备。然而，这些基于凝胶微球的填充剂具有随时间推移稳定性差的缺点，在注入皮肤后数月趋于化学降解。因此，随着时间的推移，需要频繁地重新注入填充剂，以维持修复和表皮生长的恒定。近来已经发现通过使用特定的交联剂使透明质酸经历合适的交联步骤的优点，因此基于交联透明质酸的填充剂被用于面部的美容治疗中。然而，由于人体透明质酸酶、自由基降解等原因，导致外源的透明质酸在体内维持存在的时间较短，限制了玻尿酸在皮下组织填充或者皮肤等方面的应用。同时有一些并发症是值得我们注意的，像动脉栓塞、纤维化及肉芽组织的形成、局部的红、肿及疼痛、局部血肿甚至感染、病人的焦虑及异物感等。
按照波长长短，可将阳光分为可见光、紫外线和红外线三部分，紫外线又可以分为长波（UVA）、中波（UVB）和短波（UVC）三种。长波紫外线波长为320-400纳米，中波紫外线波长为280-320纳米，短波紫外线波长为100-280纳米。其中，会对皮肤造成伤害的主要是中波紫外线和长波紫外线，这两种紫外线会使表皮细胞大量死亡，导致皮肤表面粗糙，角质增加，还容易加速皮肤衰老、产生皱纹和晒斑等，带来一系列皮肤问题。其中，中波紫外线会导致皮肤晒伤或晒黑；而长波紫外线可以直达皮肤的真皮层，破坏皮肤里的胶原蛋白和弹力纤维，加速皮肤的老化，这种损伤是不可逆的，日积月累后，皮肤会越来越脆弱，皮肤问题也会全部显现到皮肤的表皮层。
因此，如何构建一个生物相容性更好、真实模拟细胞生长、机械强度更大和成胶更快的细胞三维微环境，如何获得稳定、安全、效果更好，降低毒性或无毒性的，降解抵抗力更强和原位激活胶原新生等的类似于交联与非交联玻尿酸用途的产品，以及如何制备修复紫外线带来的急性皮肤损伤的产品是我们亟待解决的重大问题。
发明内容
本发明的目的在于：为了解决上述技术问题，本发明提供纳米短肽R-LIFE-1及其在细胞三维培养、医疗美容和生物医学的应用。
本发明为了实现上述目的具体采用以下技术方案：一种自组装短肽，其氨基酸序列为：
R-LIFE-1：Arg Leu Glu Cys Lys Ile Asp Phe Cys Glu。
本申请的技术方案中，提供了一种新的自组装短肽，它们都可以与PBS混合后自组装为可注入的水凝胶，作为细胞的三维培养支架，该支架模拟了细胞外基质，不单单是作为一个物理支架，还促进了细胞的成熟及分化，其降解产物为氨基酸具有无毒性；本发明以一种新的自组装短肽作为制备涂抹及注射类美容产品、佐剂的一种新思路，从源头改变化妆品、护肤品及注射用医疗美容产品的成分，其降解产物为氨基酸，不仅能作为保湿剂、缓释剂、润滑剂、抗氧化剂、成膜剂、润肤剂，还可以对皮肤的修复具有辅助的作用，相当于皮肤的养料，同时具有良好的生物相容性，极少引起免疫排斥反应；本申请提供的一种新的自组装短肽，结合其物理性能和微观下的纳米结构，分别与透明质酸联合使用，制备成为比单独使用透明质酸效果更好、更稳定、安全性更好、对降解抵抗力更强、毒性更小的联合体系，短肽也可以作为单独的填充剂使用；本申请提供的一种新型自组装短肽，结合外泌体或单独作为水凝胶敷料或单独作为水凝胶注射原料，制备为对皮肤紫外线损伤造成的泛红、红斑、脱屑、瘙痒、刺痛、发热具有良好缓解作用的敷料或注射美容用品。
进一步的，自组装短肽中的氨基酸为L型，D型或DL型中的一种或多种。
进一步的，自组装短肽中的氨基酸均为L型。
进一步的，自组装短肽的碳端酰胺化。
进一步的，自组短肽形成二级结构，二级结构包括α螺旋、β折叠、β蜷曲和无规则卷曲中的一种或多种。
上述短肽碳端为酰胺化，酰胺化后的序列为：Arg Leu Glu Cys Lys Ile Asp PheCys Glu-NH2。
一种自组装短肽作为透明质酸替代物的应用。
一种自组装短肽作为透明质酸载体的应用。
一种自组装短肽在制备大分子载体材料中的应用，大分子包括蛋白药物、免疫球蛋白、血清白蛋白、P53蛋白、P21蛋白、IgG、糖、单糖、低聚糖、多糖、氨基酸、肽、寡肽、多肽、蛋白质、受体、核酸、核苷酸、寡核苷酸、多核苷酸中一种或多种。
一种自组装短肽在制备细胞三维培养纳米支架材料中的应用。
一种自组装短肽作为主要成分用于制备医疗美容产品或化妆品。
一种自组装短肽的水凝胶。
所述的水凝胶的制备方法，包括如下步骤：
步骤1、将短肽加入灭菌去离子水中配制成母液；
步骤2、向母液中加入离子或PBS制备成自组装短肽水凝胶。
进一步的，离子包括Na+、Mg2+、K+、Al3+、Ca2+、Zn2+、Fe3+、Fe2+、H+、NH4 +、Cl−、SO4 2−、NO3 −、CO3 2−、CH3COO−、HCO3 −、OH−、PO4 3-、HPO4 2-、H2PO4 −、HSO4 −中的一种或多种。
进一步的，制备成的自组装短肽水凝胶的浓度为1ppM及以上。
更进一步的，制备成的自组装短肽水凝胶的浓度为1-10mg/ml。
具体的：将10mg自组装短肽加入1ml灭菌去离子水中配置母液，再取1ml加入3mlPBS制备为自组装短肽水凝胶，浓度为2.5mg/ml，根据以上方法制备水凝胶，浓度可调整为1-10mg/ml。
进一步的，一种生物医学材料，它包含所述的含一种自组装短肽的水凝胶。
本申请的技术方案中，在盐离子环境下触发短肽自组装，其中盐离子包括且不限于：Na+、Mg2+、K+、Al3+、Ca2+、Zn2+、Fe3+、Fe2+、H+、NH4 +、Cl−、SO4 2−、NO3 −、CO3 2−、CH3COO−、HCO3 −、OH−、PO4 3-、HPO4 2-、H2PO4 −、HSO4 −等。
提供一种新型的自组装短肽，负载外泌体在体内持续稳定释放，延长外泌体的半衰期，作为皮肤紫外线损伤修复产品的成分之一。
一种自组装短肽在制备皮肤紫外线损伤修复材料中的应用。
一种自组装短肽联合外分泌体在制备伤口愈合材料和/或皮肤损伤修复材料中的应用。
一种自组装短肽联合外分泌体在制备皮肤紫外线损伤修复材料中的应用。
外分泌体包括人真皮成纤维细胞来源外泌体、人角质形成细胞来源外泌体、黑素细胞来源外泌体、NK细胞来源外泌体、间充质干细胞来源外泌体等等。
提供一种新型的自组装短肽，可单独作为皮肤紫外线损伤修复的敷料产品。
本发明所述短肽在金属盐离子、细胞培养基等环境下，能进行自组装形成纳米纤维。
原子力显微镜、冷冻扫描电镜下所形成的纳米纤维网状结构可应用于化妆品领域，作为其中的缓释剂、抗菌剂、持久保湿剂、润滑剂、流变调节剂、抗氧化剂、成膜剂、润肤剂、稳定剂、缓冲剂等。
本发明所述自组装短肽形成的纳米纤维，细胞能在其上进行三维依附、生长，所以此自组装短肽可应用到人、动、植物细胞三维培养中。
本申请中，作为药物、蛋白质、大分子佐剂、载体的应用，可作为任何化合物的集合的载体及佐剂，所述的集合包含多种结构不同的化合物通过范德华力、氢键、疏水键等连接相互作用。其中所述的化合物具体而言包含且不限于天然存在的分子如：如糖、单糖、低聚糖、多糖、氨基酸、肽、寡肽、多肽、蛋白质、受体、核酸、核苷酸、寡核苷酸、多核苷酸，包括DNA和DNA片段、RNA和RNA片段等，脂质、类固醇、糖肽、糖蛋白、蛋白聚糖等或天然存在的分子类似物和衍生物或通过化学合成技术生成的小分子化合物。本发明所述的自组装短肽可以作为任意化合物组成的药物、大分子、蛋白质等的载体及佐剂。术语“核苷酸”或“核酸”指mRNA、RNA、cRNA、cDNA或DNA。该术语一般指长度至少10个碱基的聚合物形式的核苷酸（核糖核苷酸或脱氧核苷酸或修饰形式的两种类型核苷酸的任一种）。该术语包括单链和双链形式的DNA。
本申请中的“大分子”指相对分子质量在5000以上，甚至超过百万的生物学物质，如大分子包括蛋白药物、免疫球蛋白、血清白蛋白、P53蛋白、P21蛋白、IgG、SIgA、糖、单糖、低聚糖、多糖、氨基酸、肽、寡肽、多肽、蛋白质、受体、核酸、核苷酸、寡核苷酸、多核苷酸中一种或多种等。它与生命活动关系极为密切，由被认为单体的简单分子单位所组成。在溶液中有形成凝胶的物质。一般把相对分子质量超过一万的化合物称为大分子化合物或高分子化合物。它是由许多重复的结构单元组成，一般具有线状结构，有的具有枝状结构。许多具有重要生物作用的物质，如蛋白质和核酸等均属于这类化合物。
本申请中，R-LIFE-1三维培养细胞，其中“细胞”包含不限于：DC细胞（树突状细胞）、NK细胞（自然杀伤细胞）、淋巴细胞、单核/巨噬细胞、粒细胞、肥大细胞、白细胞、吞噬细胞、T淋巴细胞、B淋巴细胞、胚胎干细胞、造血干细胞、骨髓间充质干细胞、神经干细胞、肌肉卫星细胞、皮肤表皮干细胞、肠上皮干细胞、视网膜干细胞、胰腺干细胞等，还包含不限于扁桃体、肾上腺、胆管、膀胱、骨、骨髓、脑、胸、子宫颈、结肠直肠、食管、眼睛、头部和颈部、肾、肝、肺、***、神经***、卵巢、胰腺、***、皮肤、软组织、胃、睾丸、胸腺、甲状腺、子宫等器官中的原代及传代细胞的其中一种或多种。
以上所有细胞的种属包含不限于：包括单细胞真核生物如酵母和真菌以及多细胞真核生物如动物，非限制性例子包括无脊椎动物（例如，昆虫、腔肠动物、棘皮动物、线虫等）；真核寄生体例如，疟疾寄生体，如恶性疟原虫（Plasmodium falciparum)、蠕虫等）；脊椎动物（例如，鱼类、两栖类、爬行类、鸟、哺乳动物）；和哺乳动物（例如，啮齿类、灵长类如人类和非人灵长类）。
本申请中，术语“三维培养”是指将具有三维结构不同材料的载体与各种不同种类的细胞在体外共同培养， 使细胞能够在载体的三维立体空间结构中迁移、生长， 构成三维的细胞－载体复合物，改变或减少细胞在培养的过程贴壁的特性，使细胞在空间上获得更多的生存空间，减少细胞接触抑制，细胞附着与自组装短肽上，在显微镜下一般呈现为圆形。
本发明可维持透明质酸凝胶形态与透明质酸联合使用作为皮肤填充剂，具体而言可联合的填充剂如且不限于：左旋聚乳酸、聚己内酯、透明质酸、胶原蛋白、抗坏血酸、抗坏血酸磷酸酯钠盐和抗坏血酸磷酸酯镁盐等抗坏血酸磷酸酯盐；抗坏血酸单硬脂酸酯、抗坏血酸单棕榈酸酯、抗坏血酸二棕榈酸酯、抗坏血酸四异棕榈酸酯等抗坏血酸脂肪酸酯类；3-O-乙基抗坏血酸、2-O-乙基抗坏血酸、鲸蜡基抗坏血酸、甘油抗坏血酸、己基甘油抗坏血酸等抗坏血酸醚类；抗坏血酸-2-葡糖苷等抗坏血酸葡糖苷及其脂肪酸酯类；抗坏血酸硫酸酯、磷酸抗坏血酸生育酚酯等抗坏血酸衍生物；视黄醇、视黄醇乙酸酯、视黄醇棕榈酸酯、氢化视黄醇等维生素A类；烟酰胺、胡萝卜素、生育酚、生育三烯酚、硫酸软骨素、乙酰葡糖胺、甘油磷脂酰胆碱、甘油葡糖苷、水解透明质酸、胶原蛋白肽、谷甾醇、肌肽、肌酸、植酸、N-甲基丝氨酸、3-甲基环十五酮、皂苷、染料木黄酮、大豆黄酮、叶绿醇；以及墨角兰、辣薄荷、苹果薄荷、紫苏、白苏、柠檬、蒙桑、面包果、楮树、构树、无花果、石莼、欧锦葵、待雪草、黄柏、鱼腥草、蓍、杏仁、山楂、亚麻籽、栀子、荨麻、草莓籽、杨桃、百香果、海葡萄、藏红花、山茶、南瓜、丝瓜、芦笋、绞股蓝、苦参、陈皮、芍药、柿、丹参、积雪草、普洱茶、舞茸、莼菜、木贼、木梨、母菊等具有透明质酸产生促进作用的植物提取物至少其中一种。
本发明可修复皮肤紫外线损伤且与晒伤修复剂联合应用作为抗紫外线损伤剂的制备，具体如且不限于：红没药醇，阿魏酸，白藜芦醇，海藻寡糖，积雪草苷，芦荟、薰衣草、黄瓜、锡兰肉桂、青石莲、仙人掌、光果甘草根、北美金缕梅、玫瑰茄、山茶等植物提取物至少其中一种。
本发明可抗衰老且与抗衰老剂联合应用作为抗衰老剂的制备，具体如且不限于：生育酚（维生素E）、维生素E磷酸酯二钠、生育酚乙酸酯、富勒烯、泛醌、葡萄籽提取物、茶叶提取物、视黄醇、视黄醇乙酸酯、银杏提取物、植物甾醇类、白藜芦醇、神经酰胺、人参根提取物、葛根素、大豆异黄酮等其中至少一种。
本发明所有所述包含自组装短肽字样，且包含自组装短肽功能的，其宏观表现均为水凝胶。
本发明的所述的10个序列为多肽，在这里称为“自组装短肽”。
本发明的有益效果如下：
1、提供了一种新型自组装短肽，增加自组装短肽类型。
2、提供了一种新型自组装短肽，能够形成稳定的纳米纤维，该纳米纤维能够应用于各类干细胞、体细胞的三维培养，模拟细胞内的生存环境，提供细胞体外三维微环境。
3、提供了一种新型自组装短肽，能够形成稳定的纳米水凝胶，该纳米水凝胶能够作为佐剂，支撑透明质酸纤维，维持透明质酸的刚性，延缓透明质酸的降解，同时提高细胞在透明质酸凝胶内的生长活性。
4、提供了一种新型自组装短肽，能够形成稳定的纳米水凝胶，该水凝胶能够作为透明质酸的替代物，应用于各种涂抹及填充类的医疗美容产品中。
5、提供了一种新型自组装短肽，能够形成稳定的纳米水凝胶，该水凝胶能够作为各类皮肤紫外线损伤修复成分的载体，控释其释放，延长其半衰期，协同各类抗炎、抗氧化药物增强其疗效。
6、提供了一种新型自组装短肽，能够形成稳定的纳米水凝胶，该水凝胶能够单独作为皮肤紫外线损伤后的一种修复成分，促进皮肤各类细胞增殖、迁移，减轻皮肤紫外线损伤后的炎症及氧化。
7、提供一种新型应用于美容产品领域的自组装材料，该材料可作为化妆品中的缓释剂、抗菌剂、持久保湿剂、润滑剂、流变调节剂、抗氧化剂、成膜剂、润肤剂、稳定剂、缓冲剂，为美容产品原料提供一种新型生物相容性良好、降解产物有益的水凝胶。
附图说明
图1是本发明自组装短肽R-LIFE-1的圆二色谱图；
图2是本发明自组装短肽R-LIFE-1的透射电镜图；
图3是本发明自组装短肽R-LIFE-1的原子力显微镜图；
图4是本发明自组装短肽R-LIFE-1的冷冻扫描电镜图；
图5是本发明自组装短肽R-LIFE-1中加入人真皮成纤维细胞来源的外泌体后的冷冻扫描电镜图；
图6是本发明自组装短肽R-LIFE-1的刚果红染色图；
图7是本发明自组装短肽R-LIFE-1的苯胺蓝染色图；
图8是本发明自组装短肽R-LIFE-1对人真皮成纤维细胞第七天的二维及三维培养光镜图；
图9是本发明自组装短肽R-LIFE-1对人真皮成纤维细胞第七天的二维及三维培养live/dead染色图
图10是本发明自组装短肽R-LIFE-1、低浓度透明质酸、低浓度胶原蛋白、低浓度PLLA和PCL、低浓度嗨体、低浓度R-LIFE-1、sciobio II、R-LIFE-1联合低浓度透明质酸分别与人真皮成纤维细胞培养图；
图11是本发明自组装短肽R-LIFE-1、中浓度透明质酸、中浓度胶原蛋白、中浓度PLLA和PCL、中浓度嗨体、低浓度R-LIFE-1、sciobio II、R-LIFE-1联合中浓度透明质酸分别与人真皮成纤维细胞培养图；
图12是本发明自组装短肽R-LIFE-1稳定透明质酸凝胶状态的光镜图；
图13是本发明自组装短肽R-LIFE-1、低浓度透明质酸、低浓度胶原蛋白、低浓度PLLA和PCL、低浓度嗨体、低浓度R-LIFE-1、sciobio II、R-LIFE-1联合低浓度透明质酸分别与人真皮成纤维细胞培养的CCK8细胞活性测试图；
图14是本发明自组装短肽R-LIFE-1、中浓度透明质酸、中浓度胶原蛋白、中浓度PLLA和PCL、中浓度嗨体、低浓度R-LIFE-1、sciobio II、R-LIFE-1联合中浓度透明质酸分别与人真皮成纤维细胞培养的CCK8细胞活性测试图；
图15是本发明自组装短肽R-LIFE-1联合人真皮成纤维细胞来源的外泌体促进紫外线损伤后的人真皮成纤维细胞修复的CCK8细胞活性测试图；
图16是本发明自组装短肽R-LIFE-1联合人真皮成纤维细胞来源的外泌体促进大鼠皮肤紫外线损伤修复的大体图；
图17是本发明自组装短肽R-LIFE-1联合人真皮成纤维细胞来源的外泌体促进大鼠皮肤紫外线损伤修复的HE染色图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。
因此，以下对在附图中提供的本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明所述的实施例若没有说明具体浓度，浓度均为2.5mg/ml。
实施例1
本实施例提供由L－氨基酸构成的自组装短肽R-LIFE-1的制备
材料：
按照氨基酸序列备好原料如：Fmoc-L-Arg-OH(9-芴甲氧羰酰基-L-精氨酸-γ-叔丁氧羰酰基)、Fmoc-L- Leu-OH(9-芴甲氧羰酰基-L-亮氨酸-ε-叔丁氧羰酰基)、Fmoc-L-Glu-OH(芴甲氧羰酰基-L-谷氨酸-ε-叔丁氧羰酰基)、Fmoc-L-Cys-OH(9-芴甲氧羰酰基-L-半胱氨酸)、Fmoc-L-Lys-OH(9-芴甲氧羰酰基-L-赖氨酸-γ-叔丁氧羰酰基)、Fmoc-L-Ile(OtBu)-OH(9-芴甲氧羰酰基-L-异亮氨酸-ε-叔丁氧羰酰基)、Fmoc-L-Asp-OH (9-芴甲氧羰酰基-L-天冬氨酸)、Fmoc-L-Phe-OH(9-芴甲氧羰酰基-L-苯丙氨酸-γ-叔丁氧羰酰基)、Fmoc-L-Cys-OH(9-芴甲氧羰酰基-L-半胱氨酸)、Fmoc-L-Glu-OH(芴甲氧羰酰基-L-谷氨酸-ε-叔丁氧羰酰基)、TBTU(O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲四氟硼酸酯)、HBTU(O-苯并***-1-基-N、N、N、N-四甲基尿六氟磷酸脂)和HOBT(1-羟基苯并三氮唑)、哌啶、六氢吡啶、醋酸酐、二氯甲烷；溶剂：DMF(N、N-二甲基甲酰胺)、TFA(三氟乙酸)、ACN(乙腈)、冰***、NMM（N-甲基***啉）。
采用 Fmoc（芴甲氧羰基）保护的固相合成法，工艺步骤简述如下：
（1）称取 0. 5mmol/g Rink amide resin 20g 于肽合成器中，用 200mlDCM（二氯甲烷）浸泡树脂30分钟后，再用400inIDMF分三次清洗树脂，每次清洗时间为3min，抽滤干洗涤液。经过10-20分钟用100ml 20 %哌啶/DMF震荡反应30分，反应结束后，抽滤干洗涤液，用400mIDMF清洗树脂5次，每次清洗3min，洗完后取少许树脂做前三酮检査，树脂呈阳性，然后向反应器中加入原料：
Fomc-L-Leu-OH14.312g
HBTU14.15g
HOBT8.77g
NMM8.27ml
DMF243ml
上述原料加完后，反应40min，抽滤，用30ml DMF洗涤树脂4次，每次3分钟，取少许树脂做前三酮检査，树脂呈阴性。
（2）再用40mlDMF分4次洗涤树脂，然后在取少许树脂做前三酮检查，树脂呈阳性，向反 应器皿中加入以下原料：
（a）Fomc-L-Arg-OH15.122g
（b）HOBT26.30g
（c）NMM7.36ml
（d）DMF247ml
上述原料加完后，震荡反应40分钟，反应结束后，用30mlDMF分4次洗涤，每次3分钟，取少许树脂做前三酮检査，树脂呈阴性。
（3）变换步骤⑵中(a)原料，(b) (c) (d)原料及加入量不变，重复步骤⑵的操作：步骤(2)中(a)原料替为对应的一级结构序列的氨基酸。
再重复一次⑴⑵⑶步骤的操作，各步骤的原料及用量不变，根据R-LIFE-1序列合成；最后一个结朿后，脱出Fmoc-保护基，20%哌啶/DMF(体积浓度)反应30分钟，洗净树脂，加入160ml 50%醋酸酐/DMF(醋酸酐的体积浓度)反应30分钟，用40mlDMF洗净树脂，再用甲醇洗涤树脂 4次，抽滤干，真空干燥8小时。将50ml 90% TFA/DCM(TFA的体积浓度)加入盛有肽树脂的容器中，反应3小时，抽滤，浓缩滤液，向残留液中加***，析出白色固体，抽滤固体，即得到粗肽，通过HPLC(高效液相色谱法)纯化，经冷冻干燥，即得本发明所述短肽R-LIFE-1氨基酸序列为序列表中所述。
实施例2
如图1所示，自组装短肽R-LIFE-1自组装24h的圆二色谱（CD）
在37℃环境下自组装24小时后的自组装短肽在圆二色谱仪中显示，在组装24小时之后，短肽R-LIFE-1均可自组装形成纳米纤维交织的膜状结构，二级结构呈现β折叠结构，如图1所示，图1是自组装短肽R-LIFE-1组装24h时的圆二色谱图；（Wavelength 波长；CD 圆二色性）
实施例3
自组装短肽R-LIFE-1自组装24h的透射电镜（TEM）
1、实验材料
R-LIFE-1，主要溶液有：去离子水H2O；PBS溶液（Na+、K+、PO4 3-、HPO4 2-、H2PO4 -等）。
2、主要的实验仪器
透射电子显微镜（TEM,H-200,Hitachi）
3、实验方法
（1）以去离子水或PBS配制R-LIFE-1至终浓度为100μM的工作液，用于透射电子显微镜的观察；（2）取少量工作液用1%磷钨酸负染：用洁净的吸头吸取一滴约（10-30μl）工作液滴于洁净的载玻片表面，用镊子小心地夹取一块由Formvar膜覆盖TEM的铜网，用铜网蘸取载玻片上的工作液，静置数秒，待工作液与铜网充分结合后，再用铜网蘸取少量1%的磷钨酸，对已吸附的工作液进行负染色；（3）用滤纸吸干铜网上多余的液体，在空气中静置数分钟待铜网干燥。
以TEM扫描铜网，直接观察铜网上的短肽自组装结构。
4、实验结果
在37℃环境下自组装24小时后的自组装短肽在透射电镜中显示，在组装24小时之后，短肽R-LIFE-1可自组装形成纳米纤维交织的膜片状结构，纳米膜片结构大片且致密，可以有效地负载细胞，为细胞生长提供了三维物理支架，支撑了一种自组装短肽在替代透明质酸制备各种涂抹及填充类医疗美容产品中的应用；一种自组装短肽作为佐剂维持透明质酸纤维结构，减缓透明质酸溶解的应用；一种自组装短肽在控制外泌体释放从而增强外泌体修复皮肤紫外线损伤中的应用；一种自组装短肽的水凝胶，自组装短肽水凝胶浓度为1ppM及以上。为如图2（分别为500nm、200nm、100nm）所示，图2是自组装短肽R-LIFE-1组装24h时的透射电子显微镜图，图均显示短肽为纳米纤维网状结构。
实施例4
如图3所示，自组装短肽分别在1μm、400nm、200nm的原子力显微镜图，图均显示短肽为纳米纤维网状结构。
1、实验材料
R-LIFE-1，主要溶液：PBS溶液（Na+、K+、PO4 3-、HPO4 2-、H2PO4 -等）；无菌去离子水H2O；Millipore Milli-Q system，高压灭菌4℃保存备用。
2、主要仪器
原子力显微镜AFM（multimode8）
3、实验方法
用去离子水配置R-LIFE-1的工作液，最终浓度为100μM；分别将配置的R-LIFE-1的工作液5μl滴在新剥光的云母片表面；当涂片完成后约30s，以1000μl去离子水冲洗除去未附着的短肽；将上述各短肽工作液涂片在室温中空气干燥；在气相中对云母片进行AFM扫描，用SPI4000的记录模式收集AFM图像；使用20μm扫描器（400）、Olympus Si-DF20微悬臂，及弹簧常量为12N/M的针（Si，半径10nm，矩形基底200μm）；悬臂的自由共振频率为127KHz；相位图以512×512的像素解析度记录；为显示自组装短肽的纳米纤维结构，以600nm×600nm，200nm×200nm的范围进行扫描。
4、实验结果
在37℃环境下自组装24小时后的自组装短肽在原子力显微镜中显示，在自组装24小时之后，短肽形成密集纤长的纳米纤维，纳米纤维相互交联形成致密的纳米纤维网状支架。更进一步表明，可广泛用于生物医学领域，为制备医美产品，化妆品或保健品提供物理上的纳米支架、药物载体、促细胞成熟剂等，为负载透明质酸、细胞提供了理论基础，支撑了一种自组装短肽在制备透明质酸佐剂中的应用；一种自组装短肽在替代透明质酸制备各种涂抹及填充类医疗美容产品中的应用；一种自组装短肽在制备细胞三维培养纳米支架材料中的应用；一种自组装短肽在控制外泌体释放从而增强外泌体修复皮肤紫外线损伤中的应用；一种自组装短肽的水凝胶，自组装短肽水凝胶浓度为1ppM及以上。
实施例5
如图4所示，自组装短肽R-LIFE-1分别在50μm、20μm、10μm、5μm的冷冻扫描电镜，图显示短肽R-LIFE-1为纤维网状结构。
1、实验材料
R-LIFE-1，主要溶液有：去离子水H2O；PBS溶液（Na+、K+、PO4 3-、HPO4 2-、H2PO4 -等）。
2、主要仪器
Hitachi SU8010冷场发射扫描电子显微镜
3、实验方法
制样：（1）冷冻固定；（2）冷冻断裂；（3）升华；（4）导电性喷涂
上机观察拍照
4、实验结果
在37℃环境下自组装24小时后的短肽水凝胶在冷冻扫描电镜中显示，在自组装24小时之后，短肽形成密集纤长的纳米纤维，纳米纤维相互交联形成致密的纳米纤维网状支架。更进一步表明，可广泛用于生物医学领域，为制备医美产品，化妆品或保健品提供物理上的纳米支架、药物载体、促细胞成熟剂等，为负载透明质酸、细胞提供了理论基础，支撑了一种自组装短肽在制备透明质酸佐剂中的应用；一种自组装短肽在替代透明质酸制备各种涂抹及填充类医疗美容产品中的应用；一种自组装短肽在制备细胞三维培养纳米支架材料中的应用；一种自组装短肽在控制外泌体释放从而增强外泌体修复皮肤紫外线损伤中的应用；一种自组装短肽的水凝胶，自组装短肽水凝胶浓度为1ppM及以上。
实施例6
如图5所示，自组装短肽R-LIFE-1结合人真皮成纤维细胞来源的外泌体分别在2μm、1μm、500nm的冷冻扫描电镜，图显示短肽R-LIFE-1为纤维网状结构。
1、实验材料
R-LIFE-1，人真皮成纤维细胞来源的外泌体，主要溶液有：去离子水H2O；PBS溶液（Na+、K+、PO4 3-、HPO4 2-、H2PO4 -等）。
2、主要仪器
Hitachi SU8010冷场发射扫描电子显微镜
3、实验方法
制样：（1）冷冻固定；（2）冷冻断裂；（3）升华；（4）导电性喷涂
上机观察拍照
4、实验结果
在37℃环境下与人真皮成纤维细胞来源的外泌体共同自组装24小时后的短肽水凝胶在冷冻扫描电镜中显示，在添加了外泌体后，短肽依然自组装形成了密集纤长的纳米纤维，纳米纤维相互交联形成致密的纳米纤维网状支架。更进一步表明，该短肽可广泛应用于生物医学领域，为制备医美产品，化妆品或保健品提供物理上的纳米支架、药物载体、促细胞成熟剂等，为负载透明质酸、细胞提供了理论基础，支撑了一种自组装短肽在制备透明质酸佐剂中的应用；一种自组装短肽在替代透明质酸制备各种涂抹及填充类医疗美容产品中的应用；一种自组装短肽在制备细胞三维培养纳米支架材料中的应用；一种自组装短肽在控制外泌体释放从而增强外泌体修复皮肤紫外线损伤中的应用；一种自组装短肽的水凝胶，自组装短肽水凝胶浓度为1ppM及以上。
实施例7
如图6所示，自组装短肽R-LIFE-1自组装48h刚果红染色
1、实验材料
短肽： R-LIFE-1
混合液成分有：1）配制一定浓度混合液体（含胶原、透明质酸、烟酰胺、胡萝卜素、生育酚、红没药醇、阿魏酸、白藜芦醇、海藻寡糖、积雪草苷），其中组分中最低浓度为1ppM；2）染色液：刚果红染色液。
2、实验方法
将10 mg/ml的短肽溶液母液用PBS溶液稀释为2.5mg/ml置于37℃环境中分别自组装0小时、12 小时、24 小时、48 小时后进行刚果红染色检测。吸取15μl短肽溶液于载玻片上，滴加刚果红染色液染色约30s，于光学显微镜下观察、拍照。
3、实验结果
加入配制定浓度混合液体（含胶原、透明质酸、烟酰胺、胡萝卜素、生育酚、红没药醇、阿魏酸、白藜芦醇、海藻寡糖、积雪草苷），刚果红染色结果显示R-LIFE-1在显微镜下呈现纤维膜片状结构，在0小时已开始组装，在12h基本完成组装、24h完全组装成功、48小时组装稳定，图5是自组装短肽R-LIFE-1组装0小时、12 小时、24 小时、48 小时的刚果红染色。更进一步表明，可广泛用于生物医学领域，为制备医美产品，化妆品或保健品提供物理上的纳米支架、药物载体、促细胞成熟剂等，为负载透明质酸、细胞提供了理论基础，支撑了一种自组装短肽在制备透明质酸佐剂中的应用；一种自组装短肽在替代透明质酸制备各种涂抹及填充类医疗美容产品中的应用；一种自组装短肽在制备细胞三维培养纳米支架材料中的应用；一种自组装短肽在控制外泌体释放从而增强外泌体修复皮肤紫外线损伤中的应用；一种自组装短肽的水凝胶，自组装短肽水凝胶浓度为1ppM及以上。
实施例8
如图7所示，自组装短肽R-LIFE-1自组装48h苯胺蓝染色
1、实验材料
短肽： R-LIFE-1
混合液成分有：1）配制一定浓度混合液体（含胶原、透明质酸、烟酰胺、胡萝卜素、生育酚、红没药醇、阿魏酸、白藜芦醇、海藻寡糖、积雪草苷），其中组分中最低浓度为1ppM；2）染色液：苯胺蓝染色液。
2、实验方法
将10 mg/ml的短肽溶液母液用PBS溶液稀释为2.5mg/ml置于37℃环境中分别自组装0小时、12 小时、24 小时、48 小时后进行苯胺蓝染色检测。吸取15μl短肽溶液于载玻片上，滴加苯胺蓝染色液染色约30s，于光学显微镜下观察、拍照。
3、实验结果
加入配制定浓度混合液体（含胶原、透明质酸、烟酰胺、胡萝卜素、生育酚、红没药醇、阿魏酸、白藜芦醇、海藻寡糖、积雪草苷），苯胺蓝染色结果显示R-LIFE-1在显微镜下呈现纤维膜片状结构，在0小时已开始组装，在12h基本完成组装、24h完全组装成功、48小时组装稳定，与刚果红染色结果一致，图5是自组装短肽R-LIFE-1组装0小时、12 小时、24 小时、48 小时的苯胺蓝染色。更进一步表明，可广泛用于生物医学领域，为制备医美产品，化妆品或保健品提供物理上的纳米支架、药物载体、促细胞成熟剂等，为负载透明质酸、细胞提供了理论基础，支撑了一种自组装短肽在制备透明质酸佐剂中的应用；一种自组装短肽在替代透明质酸制备各种涂抹及填充类医疗美容产品中的应用；一种自组装短肽在制备细胞三维培养纳米支架材料中的应用；一种自组装短肽在控制外泌体释放从而增强外泌体修复皮肤紫外线损伤中的应用；一种自组装短肽的水凝胶，自组装短肽水凝胶浓度为1ppM及以上。
实施例9
如图8所示，选取人真皮成纤维细胞作为通用细胞培养的模型或者代表，在R-LIFE-1构建的三维环境中培养到第七天。
1、实验材料
短肽：R-LIFE-1
DMEM高糖培养基、灭菌PBS、胎牛血清、0.25%胰酶
2、实验方法
将冻存的人真皮成纤维细胞，置于 37℃水浴中迅速溶解；再加入 DMEM（Gibco 公司）培养液，悬浮离心沉淀的细胞；然后接种于 T25培养瓶中，再加入培养液为DMEM的完全培养基。
其主要成分为8-10 %（体积浓度）胎牛血清（Gibco 公司）、DMEM培养基（Gibco 公司），把培养瓶置于37℃、体积分数为5%二氧化碳培养箱中培养；
每3天换液一次，待细胞生长状况良好后即可将细胞分瓶传代；
传代时在超净台内先将培养瓶内培养液用吸管吸出，用灭菌PBS清洗三次，培养瓶内加入0.25%的胰酶 1ml使细胞游离，可以适当振荡；将培养瓶中的细胞悬液移入离心管中，1000转/分，3分钟离心沉淀细胞，弃去上清液，用 DMEM的完全培养基培养液悬浮细胞，分瓶接种；当接种细胞生长状态良好后，备用；
三维培养步骤如下：（1）细胞生长状态良好后进行三维培养；(2)将生长状态良好的细胞消化后离心、重悬，制备为3万个/ml的细胞悬液；（3）将细胞接种到96孔板内（4）加入短肽母液等溶液，混合均匀，形成三维混悬细胞液；置96孔板于恒温培养箱（37℃，5％CO2）进行培养，观察，分析。
3、实验结果
如图7所示，在二维环境中，人真皮成纤维细胞为贴壁生长状态，呈长梭形；在R-LIFE-1所构建的三维环境中培养时，细胞呈球形，散布于短肽水凝胶中；细胞透亮并且边界清晰可见，表现为多层生长。
二维培养的细胞在第七天生长与增殖受到抑制，而在R-LIFE-1构建的三维培养环境中，细胞透亮且细胞数量仍有增长。证明人真皮成纤维细胞作为细胞培养的代表或者模型可以在短肽水凝胶构建的三维培养环境中生长、增殖且状态良好。更进一步表明，该种短肽水凝胶支撑性能良好，生物相容性良好，可用于生物医学领域如细胞培养和干细胞领域治疗，也可对制备某些特殊个性化医美产品提供了支持，支撑了一种自组装短肽在制备细胞三维培养纳米支架材料中的应用；一种自组装短肽在控制外泌体释放从而增强外泌体修复皮肤紫外线损伤中的应用；一种自组装短肽的水凝胶，自组装短肽水凝胶浓度为1ppM及以上。
实施例10
如图9所示，选取人真皮成纤维细胞作为通用细胞培养的模型或者代表，在R-LIFE-1构建的三维环境中培养到第七天，再进行live/dead荧光染色。
1、实验材料
短肽：R-LIFE-1
DMEM高糖培养基、灭菌PBS、胎牛血清、0.25%胰酶、钙黄绿素AM、核酸红色荧光染料碘化丙啶
2、实验方法
三维培养步骤同上。
染色步骤如下：（1）配制calcein AM/PI检测工作液；（2）将二维培养的孔内的废液吸去，用PBS清洗两次，三维培养的孔内直接添加PBS清洗两次；（3）每孔加入100μl检测工作液后置于细胞培养箱内避光孵育30分钟。
染色完成后置于荧光显微镜下观察。
3、实验结果
如图9所示，在二维环境中，绿色荧光呈片状分布，红色荧光数量较多，说明人真皮成纤维细胞为贴壁生长状态，呈长梭形，死细胞较多；在R-LIFE-1所构建的三维环境中培养时，绿色荧光呈散点状分布，红色荧光数量较少，说明细胞呈球形，散布于短肽水凝胶中，死细胞较少。
二维培养的细胞在第七天生长与增殖受到抑制，而在R-LIFE-1构建的三维培养环境中，细胞数量仍有增长且死细胞较少。证明人真皮成纤维细胞作为细胞培养的代表或者模型可以在短肽水凝胶构建的三维培养环境中生长、增殖且状态良好。更进一步表明，该种短肽水凝胶支撑性能良好，生物相容性良好，可用于生物医学领域如细胞培养和干细胞领域治疗，也可对制备某些特殊个性化医美产品提供了支持，支撑了一种自组装短肽在制备细胞三维培养纳米支架材料中的应用；一种自组装短肽在控制外泌体释放从而增强外泌体修复皮肤紫外线损伤中的应用；一种自组装短肽的水凝胶，自组装短肽水凝胶浓度为1ppM及以上。
实施例11
如图10所示，用自组装短肽R-LIFE-1、低浓度透明质酸、低浓度胶原蛋白、低浓度PLLA和PCL、低浓度嗨体、低浓度R-LIFE-1、sciobio II、R-LIFE-1联合低浓度透明质酸分别与人真皮成纤维细胞培养。
1.实验材料
自组装短肽R-LIFE-1、低浓度透明质酸、低浓度胶原蛋白、低浓度PLLA和PCL、低浓度嗨体、低浓度R-LIFE-1、sciobio II
DMEM高糖培养基、灭菌PBS、胎牛血清、0.25%胰酶
2.实验方法
将透明质酸稀释十倍，将胶原蛋白、PLLA+PCL、嗨体稀释二十倍，
将处于生长对数期的人真皮成纤维细胞制备成为细胞悬液；每孔取3000个细胞，铺入96孔板，再在每孔加入100微升DMEM高糖完全培养基；取稀释10倍后的透明质酸50微升/孔加入50微升PBS/孔 共100微升 加入孔内，即原液稀释至20倍；分别将稀释二十倍的胶原蛋白、PLLA+PCL、嗨体加入孔内，每孔添加100微升；将R-LIFE-1母液、sciobio II母液用PBS稀释到2.5毫克/毫升，分别铺入孔中，每孔添加100微升；转入细胞培养箱中培养。
3.实验结果
如图10所示，低浓度的透明质酸、PLLA+PCL、胶原蛋白、嗨体中细胞均贴壁生长，细胞呈现梭型，基质均不能细胞生长的形成三维微环境；自组装短肽R-LIFE-1、 sciobio-II、R-LIFE-1与透明质酸联合组中的细胞三维生长，细胞呈现球型，基质能形成细胞生长的三维微环境；随着培养时间的增长，二维培养的细胞生长空间不足，细胞出现接触抑制，产生较多死亡细胞，细胞生长状态不好，而三维培养的细胞生长空间为立体多层，细胞不会出现接触抑制，细胞透亮，死亡细胞较少。进一步表明短肽形成的三维纳米物理支架优于其他各类填充类美容产品，支持细胞的三维生长。更进一步表明，该种短肽水凝胶可广泛用于生物医学领域，为制备医美产品，化妆品或保健品提供物理上的纳米支架、药物载体、促细胞成熟剂等，为负载透明质酸、细胞提供了理论基础，支撑了一种自组装短肽在制备透明质酸佐剂中的应用；一种自组装短肽在替代透明质酸制备各种涂抹及填充类医疗美容产品中的应用；一种自组装短肽在制备细胞三维培养纳米支架材料中的应用；一种自组装短肽在控制外泌体释放从而增强外泌体修复皮肤紫外线损伤中的应用；一种自组装短肽的水凝胶，自组装短肽水凝胶浓度为1ppM及以上。
实施例12
如图11所示，用自组装短肽R-LIFE-1、中浓度透明质酸、中浓度胶原蛋白、中浓度PLLA和PCL、中浓度嗨体、低浓度R-LIFE-1、sciobio II、R-LIFE-1联合低浓度透明质酸分别与人真皮成纤维细胞培养。
1.实验材料
自组装短肽R-LIFE-1、中浓度透明质酸、中浓度胶原蛋白、中浓度PLLA和PCL、中浓度嗨体、低浓度R-LIFE-1、sciobio II
DMEM高糖培养基、灭菌PBS、胎牛血清、0.25%胰酶
2.实验方法
将透明质酸稀释五倍，将胶原蛋白、PLLA+PCL、嗨体稀释十倍，
将处于生长对数期的人真皮成纤维细胞制备成为细胞悬液；每孔取3000个细胞，铺入96孔板，再在每孔加入100微升DMEM高糖完全培养基；取稀释五倍后的透明质酸50微升/孔加入50微升PBS/孔 共100微升 加入孔内，即原液稀释至十倍；分别将稀释十倍的胶原蛋白、PLLA+PCL、嗨体加入孔内，每孔添加100微升；将R-LIFE-1母液、sciobio II母液用PBS稀释到2.5毫克/毫升，分别铺入孔中，每孔添加100微升；转入细胞培养箱中培养。
3.实验结果
如图11所示，中浓度的透明质酸、PLLA+PCL、胶原蛋白、嗨体中细胞同样均贴壁生长，细胞呈现梭型，基质均不能细胞生长的形成三维微环境；自组装短肽R-LIFE-1、sciobio-II、R-LIFE-1与透明质酸联合组中的细胞三维生长，细胞呈现球型，基质能形成细胞生长的三维微环境；随着培养时间的增长，二维培养的细胞生长空间不足，细胞出现接触抑制，产生较多死亡细胞，细胞生长状态不好，而三维培养的细胞生长空间为立体多层，细胞不会出现接触抑制，细胞透亮，死亡细胞较少。进一步表明短肽形成的三维纳米物理支架优于其他各类填充类美容产品，支持细胞的三维生长。更进一步表明，该种短肽水凝胶可广泛用于生物医学领域，为制备医美产品，化妆品或保健品提供物理上的纳米支架、药物载体、促细胞成熟剂等，为负载透明质酸、细胞提供了理论基础，支撑了一种自组装短肽在制备透明质酸佐剂中的应用；一种自组装短肽在替代透明质酸制备各种涂抹及填充类医疗美容产品中的应用；一种自组装短肽在制备细胞三维培养纳米支架材料中的应用；一种自组装短肽在控制外泌体释放从而增强外泌体修复皮肤紫外线损伤中的应用；一种自组装短肽的水凝胶，自组装短肽水凝胶浓度为1ppM及以上。
实施例13
如图12所示，用中浓度透明质酸、自组装短肽R-LIFE-1联合中浓度透明质酸培养人真皮成纤维细胞，光镜下观察透明质酸水凝胶纤维结构。
1、实验材料
自组装短肽R-LIFE-1、中浓度透明质酸
DMEM高糖培养基、灭菌PBS、胎牛血清
2、实验方法
将处于生长对数期的人真皮成纤维细胞制备成为细胞悬液；每孔取3000个细胞，铺入96孔板，再在每孔加入100微升DMEM高糖完全培养基；取稀释五倍后的透明质酸50微升/孔加入50微升PBS/孔 共100微升 加入孔内，即原液稀释至十倍；将R-LIFE-1母液用PBS稀释到2.5毫克/毫升，分别铺入孔中，每孔添加100微升；转入细胞培养箱中培养。
3、实验结果
如图12所示，单独的中浓度透明质酸并未形成膜片状的凝胶形态，也未形成细胞的三维培养，无法支撑细胞的空间生长。联合R-LIFE-1的中浓度透明质酸即形成了膜片状的凝胶形态，能够支撑细胞三维生长，刚性更强。证明该短肽形成的水凝胶能够支撑透明质酸的水凝胶纤维，增强水凝胶纤维的刚性，减缓透明质酸的分解。进一步证明该种短肽水凝胶可广泛用于生物医学领域，为制备医美产品，化妆品或保健品提供物理上的纳米支架、药物载体、促细胞成熟剂等，为负载透明质酸、细胞提供了理论基础，支撑了一种自组装短肽在制备透明质酸佐剂中的应用；一种自组装短肽在制备细胞三维培养纳米支架材料中的应用；自组装短肽水凝胶浓度为1ppM及以上。
实施例14
如图13所示，用自组装短肽R-LIFE-1、低浓度透明质酸、低浓度胶原蛋白、低浓度PLLA和PCL、低浓度嗨体、低浓度R-LIFE-1、sciobio II、R-LIFE-1联合低浓度透明质酸分别与人真皮成纤维细胞培养，再使用CCK8试剂盒测试细胞活性。
1、实验材料
自组装短肽R-LIFE-1、低浓度透明质酸、低浓度胶原蛋白、低浓度PLLA和PCL、低浓度嗨体、低浓度R-LIFE-1、sciobio II
DMEM高糖培养基、灭菌PBS、胎牛血清、0.25%胰酶、CCK8试剂盒
2、实验方法
三维培养方法同上。
CCK8测试方法：（1）按200微升孔内液体加上20微升CCK8试剂的比例添加CCK8试剂到每个培养孔内；（2）将孔板放入细胞培养箱内孵育两小时；（3）放入酶标仪内，在450nm波长下测试吸光度值。
3、实验结果
如图13所示，第七天和第十四天时，R-LIFE-1组的细胞活性均高于其他各个市面上常见的填充材料（包括透明质酸、胶原蛋白、PLLA+PCL、嗨体），表明R-LIFE-1对提高细胞活力有更优秀的表现，同时在第三、七、十四天时R-LIFE-1联合透明质酸组的细胞活性均高于单独的透明质酸组，证明透明质酸在联合R-LIFE-1后可以更好地提高细胞活力。进一步证明该种短肽水凝胶可广泛用于生物医学领域，为制备医美产品，化妆品或保健品提供物理上的纳米支架、药物载体、促细胞成熟剂等，为负载透明质酸、细胞提供了理论基础，支撑了一种自组装短肽在制备透明质酸佐剂中的应用；一种自组装短肽在替代透明质酸制备各种涂抹及填充类医疗美容产品中的应用；一种自组装短肽在制备细胞三维培养纳米支架材料中的应用； 一种自组装短肽的水凝胶，自组装短肽水凝胶浓度为1ppM及以上。
实施例15
如图14所示，用自组装短肽R-LIFE-1、中浓度透明质酸、中浓度胶原蛋白、中浓度PLLA和PCL、中浓度嗨体、低浓度R-LIFE-1、sciobio II、R-LIFE-1联合中浓度透明质酸分别与人真皮成纤维细胞培养，再使用CCK8试剂盒测试细胞活性。
1、 实验材料
自组装短肽R-LIFE-1、中浓度透明质酸、中浓度胶原蛋白、中浓度PLLA和PCL、中浓度嗨体、低浓度R-LIFE-1、sciobio II
DMEM高糖培养基、灭菌PBS、胎牛血清、0.25%胰酶、CCK8试剂盒
2、实验方法
三维培养方法同上。
CCK8测试方法：（1）按200微升孔内液体加上20微升CCK8试剂的比例添加CCK8试剂到每个培养孔内；（2）将孔板放入细胞培养箱内孵育两小时；（3）放入酶标仪内，在450nm波长下测试吸光度值
3、实验结果
如图14所示，第一天时，R-LIFE-1组的细胞活性均高于其他各个市面上常见的填充材料（包括透明质酸、胶原蛋白、PLLA+PCL、嗨体），在第一、七、十四天均高于透明质酸，表明R-LIFE-1对提高细胞活力有更优秀的表现，同时在第七、十四、二十一天时R-LIFE-1联合透明质酸组的细胞活性均高于单独的透明质酸组，证明透明质酸在联合R-LIFE-1后可以更好地提高细胞活力。进一步证明该种短肽水凝胶可广泛用于生物医学领域，为制备医美产品，化妆品或保健品提供物理上的纳米支架、药物载体、促细胞成熟剂等，为负载透明质酸、细胞提供了理论基础，支撑了一种自组装短肽在制备透明质酸佐剂中的应用；一种自组装短肽在替代透明质酸制备各种涂抹及填充类医疗美容产品中的应用；一种自组装短肽在制备细胞三维培养纳米支架材料中的应用； 一种自组装短肽的水凝胶，自组装短肽水凝胶浓度为1ppM及以上。
实施例16
如图15所示，将人真皮成纤维细胞紫外线损伤造模后，添加包裹了人真皮成纤维细胞来源外泌体的R-LIFE-1短肽凝胶，采用CCK8试剂盒测试细胞活性。
1、实验材料
自组装短肽R-LIFE-1、人真皮成纤维细胞来源外泌体
DMEM高糖培养基、灭菌PBS、胎牛血清、0.25%胰酶、CCK8试剂盒
2、实验方法
细胞造模：（1）将生长良好的人真皮成纤维细胞按7000个/孔接种到96孔板中，置于细胞培养箱内过夜；（2）用PBS清洗三遍细胞后，加入50微升/孔PBS覆盖细胞；（3）将细胞置于UVB灯管下照射60分钟，辐照剂量为1500毫焦；（4）吸去孔内PBS，添加100微升完全培养基
每孔添加50微升包裹了人真皮成纤维细胞来源外泌体的R-LIFE-1短肽凝胶，空白组不添加任何试剂
CCK8测试：（1）吸去孔内液体；（2）每孔加入100微升新鲜完全培养基；（3）每孔加入10微升CCK8试剂；（4）放入细胞培养箱孵育两小时；（5）放入酶标仪内，在450nm波长下测试吸光度值。
3、实验结果
如图15所示，包裹了外泌体的R-LIFE-1短肽凝胶比空白对照组细胞活性明显更好，说明包裹了外泌体的R-LIFE-1短肽凝胶对紫外线损伤的真皮细胞有很好的修复作用。进一步证明一种自组装短肽在控制外泌体释放从而增强外泌体修复皮肤紫外线损伤中的应用；一种自组装短肽的水凝胶，自组装短肽水凝胶浓度为1ppM及以上。
实施例17
如图16所示，SD大鼠紫外线损伤造模后，分别注射PBS、R-LIFE-1、人真皮成纤维细胞来源外泌体、包裹了人真皮成纤维细胞来源外泌体的R-LIFE-1短肽凝胶，分别在第一、四、七天拍照。
1、实验材料
自组装短肽R-LIFE-1、人真皮成纤维细胞来源外泌体、灭菌PBS
2、实验方法
动物造模：（1）取160-200克雌性SD大鼠适应性喂养一周；（2）用脱毛膏将大鼠背部毛发脱净；（3）脱毛后24小时在大鼠背部覆盖锡纸，暴露直径为3厘米的圆形光滑无毛的皮肤；（4）将暴露的皮肤置于UVA、UVB灯管下照射1小时，连续照射3天，总辐照剂量为1800毫瓦每天。
给药：每天照射后分别皮下注射200微升PBS、200微升R-LIFE-1凝胶、200微升人真皮成纤维细胞来源外泌体、400微升包裹了人真皮成纤维细胞来源外泌体的R-LIFE-1短肽凝胶，空白组不给药。
3、实验结果
如图16所示，第一、四、七天R-LIFE-1组及联合组的大鼠背部红斑及痂皮面积均小于空白组和PBS组，且红斑颜色较浅，脱屑较少，渗出较少，表明单独R-LIFE-1水凝胶以及联合外泌体均可改善紫外线损伤后的皮肤炎症反应。进一步证明一种自组装短肽在修复皮肤紫外线损伤中的应用；一种自组装短肽在控制外泌体释放从而增强外泌体修复皮肤紫外线损伤中的应用；一种自组装短肽的水凝胶，自组装短肽水凝胶浓度为1ppM及以上。
实施例18
如图17所示，SD大鼠紫外线损伤造模后，分别注射PBS、R-LIFE-1、人真皮成纤维细胞来源外泌体、包裹了人真皮成纤维细胞来源外泌体的R-LIFE-1短肽凝胶，分别在第一、四、七天取材进行HE染色。
1、实验材料
甲醛、乙醇、石蜡、苏木精染液、伊红染液、二甲苯、中性树脂
2、实验方法
包埋切片：（1）取材；（2）固定三天，固定后的组织水洗三次；（3）75%乙醇脱水1-2小时，80%乙醇脱水1-2小时，90%乙醇脱水1小时，95%乙醇脱水半个小时，无水乙醇脱水20分钟两次，无水乙醇与二甲苯一比一混合后脱水20分钟；（4）透明、浸蜡、包埋；（5）切片
HE染色：（1）将已入蒸馏水后的切片放入苏木***溶液中染色数分钟；（2）酸水及氨水中分色，各数秒钟；（3）流水冲洗1小时后入蒸馏水片刻；（4）入70%、90%乙醇中脱水各10分钟；（5）入酒精伊红染色液染色2-3分钟；（6）染色后的切片经纯酒精脱水，再经二甲苯使切片透明；（7）封固。
3、实验结果
如图16所示，第一、四、七天联合组的大鼠背部皮肤切片HE染色表明联合组的渗出明显少于空白对照组，空白对照组真皮层纤维排列紊乱，联合组真皮层纤维排列整齐，空白对照组炎症细胞浸润较多，联合组炎症细胞浸润较少，空白组较联合组水肿严重，证明R-LIFE-1短肽凝胶联合人真皮成纤维细胞来源外泌体可改善紫外线损伤后的皮肤炎症反应。进一步证明一种自组装短肽在修复皮肤紫外线损伤中的应用；一种自组装短肽在控制外泌体释放从而增强外泌体修复皮肤紫外线损伤中的应用；一种自组装短肽的水凝胶，自组装短肽水凝胶浓度为1ppM及以上。
更进一步表明，可广泛用于生物医学领域，为制备医美产品，化妆品或保健品提供物理上的纳米支架、药物载体、促细胞成熟剂等，为负载透明质酸、细胞提供了理论基础，支撑了一种自组装短肽在制备透明质酸佐剂中的应用；一种自组装短肽在替代透明质酸制备各种涂抹及填充类医疗美容产品中的应用；一种自组装短肽在制备细胞三维培养纳米支架材料中的应用；一种自组装短肽在控制外泌体释放从而增强外泌体修复皮肤紫外线损伤中的应用；一种自组装短肽的水凝胶，自组装短肽水凝胶浓度为1ppM及以上。
进一步的通过以上实施例表明：
我们通过测试短肽的圆二色谱检测了短肽可形成稳定的二级结构，为短肽R-LIFE-1形成稳定的纤维网络状结构奠定了理论基础。我们通过测试短肽的透射电镜图、原子力显微镜、冷冻扫描电镜图表明短肽R-LIFE-1能够形成稳定的纤维网络状结构，其可为细胞提供一个稳定的三维纳米物理支架，进一步的为R-LIFE-1负载透明质酸、细胞等奠定了理论基础。我们通过测试短肽（含药物）的刚果红、苯胺蓝染色表明短肽R-LIFE-1能够与药物、蛋白混合形成纤维网状结构，为R-LIFE-1负载药物、蛋白、大分子提供了直接证据。进一步的我们通过测试短肽R-LIFE-1水凝胶对细胞的三维培养能力，直接验证了短肽可以作为一种稳定的水凝胶支架，为细胞提供持久的三维纳米物理支架，进一步的根据此模型，为我们后续培养包括角质形成细胞、黑素细胞、毛囊干细胞等皮肤相关细胞提供了自信。我们通过对比R-LIFE-1水凝胶与市面上各类填充材料对于细胞培养的活性 ，包括透明质酸、PLLA+PCL、胶原蛋白、嗨体，证明R-LIFE-1在制备透明质酸佐剂；替代透明质酸制备各种涂抹及填充类医疗美容产品具有良好的前景。我们通过测试短肽R-LIFE-1单独以及联合外泌体对皮肤细胞以及大鼠皮肤紫外线损伤模型的修复作用，直接证明了R-LIFE-1可以对皮肤紫外线损伤形成修复作用，同时可以控制外泌体释放从而增强外泌体修复皮肤紫外线损伤。上述实施例中，短肽 R-LIFE-1的碳端为酰胺化。
序列表：
<110>成都赛恩贝外科学研究院
<120>纳米短肽R-LIFE-1及其在药物、医疗美容和生物医学的应用
<160>1
<170>SIPOSequenceListing 1.0
<210>1
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<400>1
Arg Leu Glu Cys Lys Ile Asp Phe Cys Glu
1 5 10
序列表
<110> 成都赛恩贝外科学研究院
<120> 纳米短肽R-LIFE-1及其在药物、医疗美容和生物医学的应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Arg Leu Glu Cys Lys Ile Asp Phe Cys Glu
1 5 10

Claims (11)

1.一种自组装短肽，其特征在于，其氨基酸序列为：
R-LIFE-1：Arg Leu Glu Cys Lys Ile Asp Phe Cys Glu。
2.如权利要求1所述的一种自组装短肽，其特征在于，
上述短肽碳端为酰胺化，酰胺化后的序列为：
Arg Leu Glu Cys Lys Ile Asp Phe Cys Glu-NH2。
3.如权利要求1或2所述的一种自组装短肽作为透明质酸替代物的应用。
4.如权利要求1或2所述的一种自组装短肽在制备透明质酸载体中的应用。
5.如权利要求1或2所述的一种自组装短肽在制备大分子载体中的应用，所述大分子选自蛋白质、糖、肽、核酸中一种或多种。
6.如权利要求5所述的一种自组装短肽在制备大分子载体中的应用，所述大分子进一步选自免疫球蛋白、血清白蛋白、P53蛋白、P21蛋白、受体、多糖、寡肽、多肽、寡核苷酸、多核苷酸中一种或多种。
7.如权利要求1或2所述的一种自组装短肽在制备皮肤紫外线损伤修复产品中的应用。
8.如权利要求1或2所述的一种自组装短肽联合外分泌体在制备伤口愈合产品和/或皮肤损伤修复产品中的应用。
9.如权利要求1或2所述的一种自组装短肽在制备细胞三维培养纳米支架中的应用。
10.如权利要求1或2所述的一种自组装短肽作为主要成分在制备医美产品或化妆品中的应用。
11.含权利要求1或2所述的一种自组装短肽的水凝胶，自组装短肽浓度为1ppM及以上。
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