CN114958853A

CN114958853A - 一种来源于黑曲霉的低糖响应诱导型启动子、方法及其应用

Info

Publication number: CN114958853A
Application number: CN202210672393.5A
Authority: CN
Inventors: 刘浩; 曹威; 谢慧珍
Original assignee: Tianjin University of Science and Technology
Current assignee: Tianjin University of Science and Technology
Priority date: 2022-06-15
Filing date: 2022-06-15
Publication date: 2022-08-30
Anticipated expiration: 2042-06-15
Also published as: CN114958853B

Abstract

本发明公开一种来源于黑曲霉的低糖响应诱导型启动子、方法及其应用，所述启动子的核苷酸序列为SEQ ID NO.3。本发明在不同葡萄糖浓度条件下，筛选出了一个低糖高表达的诱导型启动子，其可以在黑曲霉中调控有效连接的核酸的表达。并进一步以葡萄糖酸氧化酶为应用证实了Pfrd为低糖高表达的诱导型启动子，为有效解决黑曲霉发酵后期因碳源不足而导致目标产物合成降低的问题提供了一种有效的方法。

Description

一种来源于黑曲霉的低糖响应诱导型启动子、方法及其应用

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，尤其是一种来源于黑曲霉的低糖响应诱导型启动子、方法及其应用。

背景技术

黑曲霉(Aspergillus niger)属于曲霉属丝状真菌。其分生孢子梗呈放射状，孢子是球形褐黑色，通常生长在土壤、腐败的植物中等。黑曲霉属于GRAS菌株，遗传背景比较清晰，并可以高效生产有机酸，在工业发酵中广泛应用。目前在黑曲霉发酵生产过程中存在着发酵后期碳源减少而导致目标产物合成能力降低的问题，以及发酵产物分泌动力不足的问题，故对黑曲霉自身启动子进行挖掘鉴定，期望筛选出一些特殊条件(低糖、低pH)响应的启动子元件，丰富基因表达元件库，为工程菌株的构建提供一定的元件支持。

通过检索，尚未发现与本发明专利申请相关的专利公开文献。

发明内容

本发明目的在于克服现有技术中的不足之处，提供一种来源于黑曲霉的低糖响应诱导型启动子、方法及其应用。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

一种来源于黑曲霉的低糖响应诱导型启动子，所述启动子的核苷酸序列为SEQ IDNO.3。

进一步地，所述启动子为富马酸还原酶ANI_1_944144的启动子，命名为Pfrd；

或者，所述低糖为10g/L及以下的浓度环境。

如上所述的启动子在调控基因goxA表达方面中的应用。

利用如上所述的启动子调控基因goxA表达的方法，所述方法是将含有该启动子的载体转化到黑曲霉细胞和/或丝状真菌细胞中，在低糖条件下进行发酵培养；

其中，所述载体中的启动子和异源基因连接，异源基因受该启动子的调控。

进一步地，所述异源基因为goxA基因，goxA基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.1；

或者，通过将含有启动子、异源基因、终止子的表达框转化至宿主细胞中；

或者，所述丝状真菌细胞为米曲霉、里氏木霉。

包含有如上所述的启动子的质粒，其特征在于：所述质粒是以Pfrd为启动子调控goxA基因表达的质粒，goxA基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.1。

包含有如上所述的启动子的表达载体。

包含有如上所述的启动子的改造菌株。

进一步地，所述改造菌是将含有启动子、报告基因goxA序列、终止子的表达框转化到黑曲霉、丝状真菌宿主细胞中获得的；

其中，goxA基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.1；

所述丝状真菌细胞为米曲霉、里氏木霉。

进一步地，所述改造菌株为潮霉素敏感菌株S2361、改造菌米曲霉、改造菌里氏木霉；

其中，所述潮霉素敏感菌株S2361的构建方法如下：

将含有质粒pLH1442的农杆菌与S1691的孢子在IM平板共培养，然后将共培养物转接于含有200μM头孢噻肟，100μg/mL氨苄青霉素，100μg/mL链霉素，250μg/mL潮霉素B的CM平板中，28℃培养直至形成单克隆；挑取单克隆转接于含有潮霉素B的PDA平板，筛选潮霉素B抗性转化子提取基因组验证，收集正确转化子孢子接种于含有30μg/mL多西环素平板上，诱导hph抗性筛选标记从基因组上删除，获得潮霉素敏感菌株S2361；

所述改造菌米曲霉的构建方法如下：

将含有质粒pLH1442的农杆菌与野生型米曲霉的孢子在IM平板共培养，然后将共培养物涂布在含有100μg/mL头孢噻肟，100μg/mL氨苄青霉素、150μg/L潮霉素B的查氏培养基固体平板中，28℃培养直至形成单克隆；挑取单克隆提取基因组验证，获得改造菌米曲霉；

所述改造菌里氏木霉的构建方法如下：

将含有质粒pLH1442的农杆菌与野生型里氏木霉的孢子在IM平板共培养，然后将共培养物涂布在含100μg/mL头孢噻肟和150μg/mL潮霉素B的CM平板中，28℃培养直至形成单克隆；挑取单克隆提取基因组验证，获得改造菌里氏木霉；

其中，所述质粒pLH1442的构建方法如下：

(1)pLH1288质粒的构建：以黑曲霉S469菌株cDNA为模板，goxA-F、goxA-R为引物进行PCR扩增goxA基因序列片段，其核苷酸序列为SEQ ID NO.1，长度为1770bp；以黑曲霉S469菌株基因组为模板，Ttrpc-F、Ttrpc-R为引物扩增Ttrpc片段，核苷酸序列为SEQ ID NO.2，长度为719bp；然后将获得的goxA片段和Ttrpc片段进行重叠PCR；将goxA::Ttrpc片段与经BamH I和Sac I双酶切线性化后的出发载体pLH924进行连接，连接产物经转化大肠杆菌JM109感受态细胞，并均匀涂布于含有100μg/mL卡那霉素的LB培养皿中，37℃过夜培养，挑取单克隆，经单酶切验证获得质粒pLH1288；

其中，goxA-F的序列为SEQ ID NO.5，goxA-R的序列为SEQ ID NO.6，Ttrpc-F的序列为SEQ ID NO.7，Ttrpc-R的序列为SEQ ID NO.8；

(2)pLH1442质粒的构建：

以黑曲霉S469菌株基因组为模板，Pfrd-F、Pfrd-R为引物扩增Pfrd片段，核苷酸序列为SEQ ID NO.3，长度为1023bp；将Pfrd片段与经BglⅡ酶切线性化后的出发载体pLH1288进行连接，连接产物经转化大肠杆菌JM109感受态细胞，并均匀涂布于含有100μg/mL卡那霉素的LB培养皿中，37℃过夜培养，挑取单克隆，经双酶切验证获得质粒pLH1442；

其中，Pfrd-F的序列为SEQ ID NO.9，Pfrd-R的序列为SEQ ID NO.10。

本发明取得的优点和积极效果为：

1、本发明通过转录组分析成功地从黑曲霉中筛选得到一个低糖诱导型启动子，并提供了一种在低糖条件下启动基因表达的方法，为黑曲霉发酵后期因糖量不足而导致目标产物合成降低提供了有效的解决策略。

2、本发明在不同葡萄糖浓度条件下，筛选出了一个低糖高表达的诱导型启动子，其可以在黑曲霉中调控有效连接的核酸的表达。并进一步以葡萄糖酸氧化酶为应用证实了Pfrd为低糖高表达的诱导型启动子，为有效解决黑曲霉发酵后期因碳源不足而导致目标产物合成降低的问题提供了一种有效的方法。

附图说明

图1为本发明中在不同糖量条件下，四种低糖诱导型启动子的相对表达水平图；

图2为本发明中构建的goxA报告基因质粒pLH1288图谱；

图3为本发明中对pLH1288单酶切验证图(MluⅠ，11381bp/3659bp)，其中M为DNAMarker；

图4为本发明中构建的Pfrd::goxA质粒pLH1442图谱；

图5为本发明中对pLH1442双酶切验证图(BamH I/Sal I，14875bp/1182bp)，其中M为DNA Marker；

图6本发明中构建的PpptA::goxA质粒pLH1445图谱；

图7为本发明中对pLH1445双酶切验证图(Hind III/Bgl II，7682bp/5281bp/3173bp)，其中M为DNA Marker；

图8为本发明中S1691、S2351和S2361的显色验证；

图9为本发明中S2361在不同糖量(1g/L、50g/L和100g/L)条件下，goxA基因的表达水平；

图10为本发明中改造菌米曲霉(Pfrd::goxA)在不同糖量(1g/L、50g/L和100g/L)条件下，goxA基因的表达水平；

图11为本发明中改造菌里氏木霉(Pfrd::goxA)在不同糖量(1g/L、50g/L和100g/L)条件下，goxA基因的表达水平。

具体实施方式

下面详细叙述本发明的实施例，需要说明的是，本实施例是叙述性的，不是限定性的，不能以此限定本发明的保护范围。

本发明中所使用的原料，如无特殊说明，均为常规的市售产品；本发明中所使用的方法，如无特殊说明，均为本领域的常规方法。

较优地，所述启动子为富马酸还原酶ANI_1_944144的启动子，命名为Pfrd；

或者，所述低糖为10g/L及以下的浓度环境。

如上所述的启动子在调控基因goxA表达方面中的应用。

较优地，所述异源基因为goxA基因，goxA基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.1；

或者，所述丝状真菌细胞为米曲霉、里氏木霉。

包含有如上所述的启动子的表达载体。

包含有如上所述的启动子的改造菌株。

较优地，所述改造菌是将含有启动子、报告基因goxA序列、终止子的表达框转化到黑曲霉、丝状真菌宿主细胞中获得的；

其中，goxA基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.1；

所述丝状真菌细胞为米曲霉、里氏木霉。

较优地，所述改造菌株为潮霉素敏感菌株S2361、改造菌米曲霉、改造菌里氏木霉；

其中，所述潮霉素敏感菌株S2361的构建方法如下：

所述改造菌米曲霉的构建方法如下：

所述改造菌里氏木霉的构建方法如下：

其中，所述质粒pLH1442的构建方法如下：

(2)pLH1442质粒的构建：

其中，Pfrd-F的序列为SEQ ID NO.9，Pfrd-R的序列为SEQ ID NO.10。

具体地，相关制备及检测实施例如下：

本发明以黑曲霉中葡萄糖酸氧化酶作为初步应用，葡萄糖在葡萄糖酸氧化酶的作用下生成葡萄糖酸和过氧化氢，过氧化氢又经辣根过氧化物酶作用生成氧气，无色的领联茴香胺被氧化生成红色醌亚胺，其颜色的深浅与葡萄糖的含量成正比。在葡萄糖酸氧化酶缺陷体中表达以低糖响应的诱导型启动子控制葡萄糖酸氧化酶编码基因goxA的转录，在不同葡萄糖含量下，根据产物颜色的深浅判断启动子的强度，并以一种强度较弱的启动子色素基因pptA的启动子控制goxA转录的菌株作为对照。

本发明在不同葡萄糖浓度条件下，对黑曲霉S469(中国专利，专利号：ZL201810985901.9)进行转录组和RT-qPCR验证分析获得一个编号为ANI_1_944144基因的启动子，其强度随着外界糖浓度的降低而增加(如图1)。本发明以葡萄糖酸氧化酶编码基因为报告基因，证实了ANI_1_944144启动子为低糖(＜10g/L)高表达的诱导型启动子，为有效解决黑曲霉发酵后期因糖量不足而导致目标产物合成降低的问题提供了一种低糖高表达诱导型启动子。

实施例1——pLH1288质粒(图2)的构建：质粒pLH924(李梦新.黑曲霉中线粒体柠檬酸转运蛋白的鉴定与功能研究[D].天津科技大学，2021.)，其表达框内有淀粉酶基因amyA同源臂，可以实现基因的定点敲除，排除位置效应对启动子强度的干扰。

具体构建过程如下：以黑曲霉S469菌株cDNA为模板，goxA-F、goxA-R为引物进行PCR扩增goxA基因序列片段，其核苷酸序列为SEQ NO.1，长度为1770bp；以黑曲霉S469菌株基因组为模板，Ttrpc-F、Ttrpc-R为引物扩增Ttrpc片段，核苷酸序列为SEQ NO.2，长度为719bp；然后将获得的goxA片段和Ttrpc片段进行重叠PCR。应用诺唯赞C113-ClonExpress-MultiS One Step Cloning Kit试剂盒将goxA::Ttrpc片段与经BamH I和Sac I双酶切线性化后的出发载体pLH924进行连接，连接产物经转化大肠杆菌JM109感受态细胞，并均匀涂布于含有100μg/mL卡那霉素的LB培养皿中，37℃过夜培养，挑取单克隆，经单酶切验证(图3)获得质粒pLH1288。扩增基因序列片段的引物见表1。

实施例2——pLH1442质粒(图4)的构建：

pLH1442由pLH1288载体改造而来，goxA基因由富马酸还原酶基因启动子Pfrd控制转录。

具体构建过程如下：以黑曲霉S469菌株基因组为模板，Pfrd-F、Pfrd-R为引物扩增Pfrd片段，核苷酸序列为SEQ NO.3，长度为1023bp；应用诺唯赞C113-ClonExpress-MultiSOne Step Cloning Kit试剂盒将Pfrd片段与经BglⅡ酶切线性化后的出发载体pLH1288进行连接，连接产物经转化大肠杆菌JM109感受态细胞，并均匀涂布于含有100μg/mL卡那霉素的LB培养皿中，37℃过夜培养，挑取单克隆，经双酶切验证(图5)获得质粒pLH1442。扩增基因序列片段的引物见表1。

实施例3——pLH1445质粒(图6)的构建：

pLH1445由pLH1288载体改造而来，goxA基因由组成型弱启动子PpptA控制转录。

具体构建过程如下：以黑曲霉S469菌株基因组为模板，PpptA-F、PpptA-R为引物扩增PpptA片段，核苷酸序列为SEQ ID NO.4，长度为1000bp；应用诺唯赞C113-ClonExpress-MultiS One Step Cloning Kit试剂盒将PpptA片段与经Bgl Ⅱ和BamH I酶切线性化后的出发载体pLH1288进行连接，连接产物经转化大肠杆菌JM109感受态细胞，并均匀涂布于含有100μg/mL卡那霉素的LB培养皿中，37℃过夜培养，挑取单克隆，经双酶切验证(图7)获得质粒pLH1445。扩增基因序列片段的引物见表1。

实施例4——低糖高表达黑曲霉菌株的构建：出发菌S1691(周宇涛.黑曲霉葡萄糖氧化酶编码基因的鉴定与功能应用[D].天津科技大学，2020.)是goxA缺陷体，不产葡萄糖酸。

将含有质粒pLH1442的农杆菌与S1691的孢子在IM平板共培养，然后将共培养物转接于含有200μM头孢噻肟，100μg/mL氨苄青霉素，100μg/mL链霉素，250μg/mL潮霉素B的CM平板中，28℃培养直至形成单克隆。挑取单克隆转接于含有潮霉素B的PDA平板，筛选潮霉素B抗性转化子提取基因组验证，收集正确转化子孢子接种于含有30μg/mL多西环素平板上，诱导hph抗性筛选标记从基因组上删除，获得潮霉素敏感菌株S2361(Pfrd::goxA)。

实施例5——S2351(PpptA::goxA)菌株的构建：将含有质粒pLH1445的农杆菌与S1691的孢子在IM平板共培养，然后将共培养物转接于含有200μM头孢噻肟，100μg/mL氨苄青霉素，100μg/mL链霉素，250μg/mL潮霉素B的CM平板中，28℃培养直至形成单克隆。挑取单克隆转接于含有潮霉素B的PDA平板，筛选潮霉素B抗性转化子提取基因组验证，收集正确转化子孢子接种于含有30μg/mL多西环素平板上，诱导hph抗性筛选标记从基因组上删除，获得潮霉素敏感菌株S2351(PpptA::goxA)。

实施例6——S2361的显色验证：

首先配制不同葡萄糖含量(1g/L、50g/L和100g/L)固体显色培养基，将灭菌后的培养基倒于培养皿中，待冷却后，把对照菌S1691(goxA缺陷体)、S2351(PpptA::goxA)和S2361(Pfrd::goxA)接种至显色培养基上，倒置于28℃恒温培养箱，2d后取出平板放置于超净工作台内；将10mL含1％琼脂糖的去离子水加热溶化，待冷却到60℃以下立即加入2mL显色溶液Ⅱ、200uL显色溶液Ⅰ、400uL显色溶液Ⅲ，混匀后倒入上述平板内，8h后观察显色情况并拍照保存图片。如图8所示，S2361在浓度为1g/L葡萄糖的显色板上显色明显，然而在50g/L葡萄糖的培养基上显色较弱，100g/L葡萄糖时几乎不显色，说明Pfrd为低糖高表达诱导型启动子。

其中，上述显色溶液具体如下：

1)溶液Ⅰ：0.1g邻联茴香胺溶于10mL甲醇；

2)溶液Ⅱ：18％葡萄糖水溶液；

3)溶液Ⅲ：90uL/mL辣根过氧化物酶。

实施例7——S2361(Pfrd::goxA)在不同糖量条件下，goxA基因的表达水平(如图9)：

在验证低糖诱导型启动子时，考虑低糖条件下菌体生长缓慢，因此先用黑曲霉液体培养基作为种子培养基培养菌体，再转接到不同糖浓度的葡萄糖酸发酵培养基中孵育一段时间后进行后续实验，以确保实验条件最大程度和转录组数据测定条件一致。

具体实验过程如下：将S2361接至PDA培养基4-5d，收集其孢子悬液接种至含有100g/L葡萄糖的种子培养基中，置于28℃摇床，200rpm，培养12h。收集上述菌体分别转接至含1g/L、50g/L和100g/L葡萄糖的葡萄糖酸发酵培养基中，8h后收集不同糖量下的菌体进行RNA的提取，然后以总RNA为模板，使用反转录试剂盒(Prime Script ^TM RT regent Kitwith gDNA)获得cDNA；以cDNA为模板，使用实时荧光定量(RT-qPCR)试剂盒(QuantitativeReal-time PCR with TB Green Premix Ex Taq ^TM II)进行扩增。黑曲霉的肌动蛋白Actin作为内参，以100g/L葡萄糖作为对照，计算在1g/L和50g/L葡萄糖条件下，S2361(Pfrd::goxA)中goxA基因的相对表达量，用2^-ΔΔCт表示。如图9所示，在S2361中，相比100g/L葡萄糖，在1g/L葡萄糖条件下，goxA的相对表达水平上调了40.44倍，然而在50g/L葡萄糖条件下，其goxA的相对表达水平仅上调了3.02倍，Pfrd启动子符合低糖诱导型特征。此结果进一步验证了Pfrd为低糖高表达诱导型启动子。

实施例8——改造菌米曲霉(Pfrd::goxA)的构建以及在不同糖量条件下，goxA基因的表达水平(如图10)：

将含有质粒pLH1442的农杆菌与野生型米曲霉的孢子在IM平板共培养，然后将共培养物涂布在含有100μg/mL头孢噻肟，100μg/mL氨苄青霉素、150μg/L潮霉素B的查氏培养基固体平板中，28℃培养直至形成单克隆。挑取单克隆提取基因组验证，获得改造菌米曲霉(Pfrd::goxA)。将米曲霉(Pfrd::goxA)接至PDA培养基3-4d，收集其孢子悬液接种至含有100g/L葡萄糖的种子培养基中，置于28℃摇床，200rpm，培养12h。收集上述菌体分别转接至含1g/L、50g/L和100g/L葡萄糖的葡萄糖酸发酵培养基中，8h后收集不同糖量下的菌体进行RNA的提取，然后以总RNA为模板，使用反转录试剂盒(Prime Script ^TM RTregent Kit withgDNA)获得cDNA；以cDNA为模板，使用实时荧光定量(RT-qPCR)试剂盒(Quantitative Real-time PCR with TB Green Premix Ex Taq ^TM II)进行扩增。以100g/L葡萄糖作为对照，计算在1g/L和50g/L葡萄糖条件下，米曲霉(Pfrd::goxA)中goxA基因的相对表达量，用2^-ΔΔCт表示。如图10所示，在米曲霉(Pfrd::goxA)中，相比100g/L葡萄糖，在1g/L葡萄糖条件下，goxA的相对表达水平上调了25.71倍，然而在50g/L葡萄糖条件下，其goxA的相对表达水平较低，表明低糖诱导型启动子Pfrd在米曲霉中可以应用，为米曲霉低糖发酵奠定了基础。

实施例9——改造菌里氏木霉(Pfrd::goxA)的构建以及在不同糖量条件下，goxA基因的表达水平(如图11)：

将含有质粒pLH1442的农杆菌与野生型里氏木霉的孢子在IM平板共培养，然后将共培养物涂布在含100μg/mL头孢噻肟和150μg/mL潮霉素B的CM平板中，28℃培养直至形成单克隆。挑取单克隆提取基因组验证，获得改造菌里氏木霉(Pfrd::goxA)。将里氏木霉(Pfrd::goxA)接至PDA培养基5-7d，收集其孢子悬液接种至含有100g/L葡萄糖的种子培养基中，置于28℃摇床，200rpm，培养12h。收集上述菌体分别转接至含1g/L、50g/L和100g/L葡萄糖的葡萄糖酸发酵培养基中，8h后收集不同糖量下的菌体进行RNA的提取，然后以总RNA为模板，使用反转录试剂盒(Prime Script ^TM RT regent Kit with gDNA)获得cDNA；以cDNA为模板，使用实时荧光定量(RT-qPCR)试剂盒(Quantitative Real-time PCR with TBGreen Premix Ex Taq ^TM II)进行扩增。以100g/L葡萄糖作为对照，计算在1g/L和50g/L葡萄糖条件下，里氏木霉(Pfrd::goxA)中goxA基因的相对表达量，用2^-ΔΔCт表示。如图11所示，在里氏木霉(Pfrd::goxA)中，相比100g/L葡萄糖，在1g/L葡萄糖条件下，goxA的相对表达水平上调了23.63倍，然而在50g/L葡萄糖条件下，其goxA的相对表达水平较低，表明低糖诱导型启动子Pfrd在里氏木霉中也可以应用，为里氏木霉低糖发酵奠定了基础。

表1实施例中所用引物序列

本发明所使用到的培养基具体如下：

(1)LB培养基组分为：

1％～2％胰蛋白胨，0.5％～1％酵母粉，1％～2％氯化钠，pH调至7.0-7.2，固体培养基加1.5％琼脂粉。121℃灭菌20min。灭菌完毕冷却至50-60℃左右时加入卡那霉素至终浓度100μg/mL。

(2)PDA培养基组分为：马铃薯50-100g，切成小块，加500-2000mL水煮沸30min左右，用双层纱布过滤后加入5-10g葡萄糖直至完全溶解，加水定容至50-1000mL。固体培养1.5％琼脂粉。121℃，20min高压灭菌。

(3)黑曲霉液体培养基

0.05％～0.1％MgSO₄·7H₂O，1％～2％葡萄糖，0.05％～0.1％KH₂PO₄，0.5％～1％酵母粉，使用4M HCl调节pH为4.0。

(4)葡萄糖酸发酵培养基

0.1％～20％葡萄糖，0.02％～0.05％磷酸二氢钾，0.05％～0.1％玉米浆，0.001％～0.003％七水硫酸镁，0.01％～0.05％尿素，调节PH＝7.0，115℃灭20min。

(5)固体显色培养基

0.1％～10％葡萄糖，0.5％～1％酵母粉，0.05％～0.1％玉米浆，0.01％～0.05％尿素，0.05％～0.1％磷酸二氢钾，0.01％～0.03％硫酸镁，1％～1.5％碳酸钙，1.5％琼脂，调节PH＝7.0，115℃灭20min。

(6)查氏培养基

1％～5％蔗糖，0.1％～0.5％硝酸钠，0.05％～0.5％磷酸氢二钾，0.0005％～0.005％硫酸亚铁，0.01％～0.1％硫酸镁。固体培养1.5％琼脂粉。

本发明中所使用的序列如下：

SEQ.1：goxA的核苷酸序列1770bp

CTGCCACACTACATCAGGAGCAATGGCATTGAAGCCAGCCTCCTGACTGACCCCAAGGATGTCTCCGGCCGCACGGTCGACTACATCATCGCTGGTGGAGGTCTGACTGGACTCACCACCGCTGCTCGTCTGACGGAGAACCCCAACATCAGTGTGCTCGTCATCGAAAGTGGCTCCTACGAGTCGGACAGAGGTCCTATCATTGAGGACCTGAACGCCTACGGCGACATTTTTGGCAGCAGTGTAGACCACGCCTACGAGACCGTTGAGCTCGCTACCAACAATCAAACCGCGCTGATCCGCTCCGGAAATGGTCTCGGTGGCTCTACTCTAGTGAATGGTGGCACCTGGACTCGCCCCCACAAGGCACAGGTTGATTCTTGGGAGACTGTCTTTGGAAATGAGGGCTGGAACTGGGACAATGTGGCCGCCTACTCCCTCCAGGCTGAGCGTGCTCGCGCACCAAATGCCAAACAGATCGCTGCTGGCCACTACTTCAACGCATCCTGTCATGGTACCAATGGTACTGTCCATGCCGGACCCCGTGACACCGGCGATGACTATTCCCCCATCGTCAAGGCTCTCATGAGCGCTGTCGAAGACCGGGGCGTTCCCACCAAGAAGGACTTCGGATGCGGTGACCCTCATGGTGTGTCCATGTTCCCCAACACCTTGCACGAAGACCAAGTTCGCTCCGATGCCGCTCGCGAATGGCTCCTTCCCAACTACCAACGTCCCAACCTGCAAGTCCTGACCGGACAATATGTTGGTAAGGTGCTCCTTAGCCAGAACGGCACCACCCCTCGTGCCGTCGGCGTGGAATTCGGCACCCACAAGGGCAACACCCACAACGTTTACGCTAAGCACGAGGTCCTCCTGGCTGCTGGCTCGGCTGTCTCTCCCACCATCCTCGAATATTCCGGTATCGGAATGAAGTCCATCCTGGAACCCCTTGGTATCGACACCGTCGTTGACCTGCCCGTCGGCCTGAACCTGCAGGACCAGACCACCGCTACCGTCCGCTCCCGCATCACCTCTGCTGGTGCCGGACAGGGACAGGCCGCTTGGTTCGCCACCTTCAACGAGACCTTTGGTGACTATGCCGAAAAGGCACACGAGCTGCTCAACACCAAGCTGGAGCAGTGGGCCGAAGAGGCCGTCGCCCGTGGCGGATTCCACAACACCACCGCCTTGCTCATCCAGTACGAGAACTATCGCGACTGGATTGTCAATCACAACGTCGCGTACTCGGAACTCTTCCTCGACACTGCCGGAGTGGCCAGCTTCGATGTGTGGGACCTTCTGCCCTTCACGAGAGGATACGTCCACATCCTCGACAAGGACCCCTACCTCCACCACTTTGCCTACGACCCTCAGTACTTCCTCAACGAGCTCGACCTGCTCGGTCAGGCTGCCGCTACTCAGCTGGCCCGTAACATCTCCAACTCCGGTGCTATGCAGACCTACTTCGCTGGCGAGACTATCCCCGGTGATAACCTCGCGTATGATGCCGATTTGAGCGCCTGGACTGAGTACATCCCGTACCACTTCCGTCCTAACTACCATGGCGTGGGTACTTGCTCCATGATGCCGAAGGAGATGGGCGGTGTTGTCGATAATGCTGCCCGTGTGTACGGTGTGCAGGGACTGCGTGTCATTGATGGTTCTATTCCCCCTACGCAGATGTCGTCCCATGTCATGACTGTGTTCTACGCCATGGCGTTGAAGATTGCGGATGCTATTTTGGAGGACTACGCTTCTATGCAGTGA

SEQ.2：Ttrpc的核苷酸序列719bp

CTTAACGTTACTGAAATCATCAAACAGCTTGACGAATCTGGATATAAGATCGTTGGTGTCGATGTCAGCTCCGGAGTTGAGACAAATGGTGTTCAGGATCTCGATAAGATACGTTCATTTGTCCAAGCAGCAAAGAGTGCCTTCTAGTGATTTAATAGCTCCATGTCAACAAGAATAAAACGCGTTTTCGGGTTTACCTCTTCCAGATACAGCTCATCTGCAATGCATTAATGCATTGACTGCAACCTAGTAACGCCTTNCAGGCTCCGGCGAAGAGAAGAATAGCTTAGCAGAGCTATTTTCATTTTCGGGAGACGAGATCAAGCAGATCAACGGTCGTCAAGAGACCTACGAGACTGAGGAATCCGCTCTTGGCTCCACGCGACTATATATTTGTCTCTAATTGTACTTTGACATGCTCCTCTTCTTTACTCTGATAGCTTGACTATGAAAATTCCGTCACCAGCNCCTGGGTTCGCAAAGATAATTGCATGTTTCTTCCTTGAACTCTCAAGCCTACAGGACACACATTCATCGTAGGTATAAACCTCGAAATCANTTCCTACTAAGATGGTATACAATAGTAACCATGCATGGTTGCCTAGTGAATGCTCCGTAACACCCAATACGCCGGCCGAAACTTTTTTACAACTCTCCTATGAGTCGTTTACCCAGAATGCACAGGTACACTTGTTTAGAGGTAATCCTTCTTTCTAGAC

SEQ.3：Pfrd的核苷酸序列1023bp

GGTCCCTGTCTTTGTGTGTATGTATGTATGGGGTAATTCGGATACTTAAATAAGGTGTATTGAATACTAATTATGATAGTTCTTATTGATAGTGTTTGTGTTTGTTGTTGTAGTGAATGTATATATATATAATGTGAGATCAACCAGTTCCAGGTACTATCTAAGCTTCAGATGAAAAGCTACCTTCACTTCACTAAATAGACATCTCATTCATGAAATCTAGATGGAGCAGACATCCCGATCATCTAGGTAACCCCAAAATTGAGACGAATCTGAATCCGGGGACAGAGTTTAAATCGAAGAGCATGACGTGCCGCGCTGACTTAAGCCTACGATTTCATTTGCTGAAAGGCTGCTGCTGGGGTTTCCAGGCATGTGAAAGCCTGGGAGTCTCTCTCTTGCCCTCAGGTATGCTTGTAGTATAATATGTCATGGGAAGGAACCGCAGGGTCAGCTTGCAGCTCCTGGTGACGCTCTGCATGTGATGGACCCCTGGTCTGCTGGAAACTCACTAGTATTCTGTCAACGACAGGGGAGTGATTTTTGAATGTCTACTGCCTATTGATAACTCGACTGTAGTACCTATACTAAGTAGAACCCGTCATTCAGTCAGTCAAGAAGCACAGGCCAGAGACAGACAAAAGAAGGACCCATCGAATCCACTTAAGACAGGCTGAACATTCGTTGATCCCCTCAAAAAGTAGAAGAGAAGATACCGGACCGGAAAAGGGAGAGGAGGGAGGAGGGGGTCATAGAACGGTAATCGTACGGTACATACCCGAGTTGAATGAATTGAATGGGGAAGAAATGAGCCTCGGCCGAGTGAGTGAGTCTCTCCCCCGTCGGCTTCTGAATGCCTGGCTCTACTCTTCTTCCCCCGGATCTCCTGGTGCTTAAAGATCTACTTGTTCCTACCTGCTTTTTGACCCTTTAATCTCCTCTTCTCATCTCTCCCCCATTCATCTTTGAATTTCTCTTCTCATCCTTGTCTCCCTTCCCTCTACATCTTCCTCCCACACGATG

SEQ.4：PpptA的核苷酸序列1000bp

GTGAGGGAGGATTTTCTCCACGACGGGTGCGCGGATAAAGACGGCGGGGAAAGCGGGTTGATTAGCGCCCAGGAAGGGCAAGTCGAGAGGAGCCTGGAAACTCTCCGTCTGACGGCCAAAATGATTGCGATTGACGCGCACGTCCAGCCCACCGATCAGATCCTGGCCACCCTTCTTTGTGCGGTTGGCTGACTCGGCGAGGAGGATCAGACCGGCGCAGGTACCCCAAGTAGGCCTCCGGTGGACCCTGAGATGGTAATTAGCATACACATAGAGCAACTGTGCAGAACACCGATAAGACATACTTGACAAAGTCTCGCAAAGGCTCCAAGAGGTTGGACCTGGCGGCAACAAGGGCCATGGTTGTGCTTTCACCTCCGGGCAGCACCAGCGCATCGCATCGCTCGAGTTCCTGCGGGGTGCGCACTTCGATGAAGTCCCATTGCGAGGCGGAACTGCGGTCTTTGGCGGGCAAATCGGCGGCCGCACTCTTCAGCAATTGGATATGTTCGTAGAAGGCGCCTTGCAAGGCGAGCACGCCGACGGTGATGCAGCCCATGGCGAAGTATAGGATCTGAGAGTGTGGCGGCAGCAACAGAACTATGACTCCAAACTCTCTATACTTTATTTGATGGGAGCAACGCCGCCTTATGTCAGCGGATCAATGTCGGACCGCTTATCACCACGTGCTGCCCCGCGTTCAGCCTCGGACATTTGGGGGCCATCATTAACATCATGAGTTCAATGTCTTTTTTGCTTTGCTGTGATAATACGCTGGTTGCGGTCTTTAACATAAGACTCCGAGATTCGTCATTAGAACAGTTTAATCTCAGAATGTATCAATGACCCTCGTGGAGAACTAACCCAACCCCTCACTTCACCTCATCTCACCTCCGCATAGACGCCCGATCTCCTCACATCAGCTACACCACTACATCTCACTCAATTGAACACACCACCACCACAACAGCCTCATACCCAACCCAACCAACCCACAATG

SEQ.5：goxA-F的核苷酸序列54bp

ATTCAATTCGAGCTCAGATCTGGATCCTACGTACTGCCACACTACATCAGGAGC

SEQ.6：goxA-R的核苷酸序列35bp

TTCAGTAACGTTAAGTCACTGCATAGAAGCGTAGT

SEQ.7：Ptrpc-F的核苷酸序列37bp

GCTTCTATGCAGTGACTTAACGTTACTGAAATCATCA

SEQ.8：Ptrpc-R的核苷酸序列37bp

TCAATATCAGTTAACGTCTAGAAAGAAGGATTACCTC

SEQ.9：Pfrd-F的核苷酸序列40bp

TTCGAGCTCAGATCTGGATCCGGTCCCTGTCTTTGTGTGT

SEQ.10：Pfrd-R的核苷酸序列34bp

AGATCGGAACGACATCATCGTGTGGGAGGAAGAT

SEQ.11：PpptA-F的核苷酸序列41bp

ATTCAATTCGAGCTCAGATCTGTGAGGGAGGATTTTCTCCA

SEQ.12：PpptA-R的核苷酸序列37bp

CATTACGTAGGATCCCATTGTGGGTTGGTTGGGTTGG

尽管为说明目的公开了本发明的实施例，但是本领域的技术人员可以理解：在不脱离本发明及所附权利要求的精神和范围内，各种替换、变化和修改都是可能的，因此，本发明的范围不局限于实施例所公开的内容。

序列表

<110> 天津科技大学

<120> 一种来源于黑曲霉的低糖响应诱导型启动子、方法及其应用

<160> 12

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1770

<212> DNA

<213> goxA的核苷酸序列(Unknown)

<400> 1

ctgccacact acatcaggag caatggcatt gaagccagcc tcctgactga ccccaaggat 60

gtctccggcc gcacggtcga ctacatcatc gctggtggag gtctgactgg actcaccacc 120

gctgctcgtc tgacggagaa ccccaacatc agtgtgctcg tcatcgaaag tggctcctac 180

gagtcggaca gaggtcctat cattgaggac ctgaacgcct acggcgacat ttttggcagc 240

agtgtagacc acgcctacga gaccgttgag ctcgctacca acaatcaaac cgcgctgatc 300

cgctccggaa atggtctcgg tggctctact ctagtgaatg gtggcacctg gactcgcccc 360

cacaaggcac aggttgattc ttgggagact gtctttggaa atgagggctg gaactgggac 420

aatgtggccg cctactccct ccaggctgag cgtgctcgcg caccaaatgc caaacagatc 480

gctgctggcc actacttcaa cgcatcctgt catggtacca atggtactgt ccatgccgga 540

ccccgtgaca ccggcgatga ctattccccc atcgtcaagg ctctcatgag cgctgtcgaa 600

gaccggggcg ttcccaccaa gaaggacttc ggatgcggtg accctcatgg tgtgtccatg 660

ttccccaaca ccttgcacga agaccaagtt cgctccgatg ccgctcgcga atggctcctt 720

cccaactacc aacgtcccaa cctgcaagtc ctgaccggac aatatgttgg taaggtgctc 780

cttagccaga acggcaccac ccctcgtgcc gtcggcgtgg aattcggcac ccacaagggc 840

aacacccaca acgtttacgc taagcacgag gtcctcctgg ctgctggctc ggctgtctct 900

cccaccatcc tcgaatattc cggtatcgga atgaagtcca tcctggaacc ccttggtatc 960

gacaccgtcg ttgacctgcc cgtcggcctg aacctgcagg accagaccac cgctaccgtc 1020

cgctcccgca tcacctctgc tggtgccgga cagggacagg ccgcttggtt cgccaccttc 1080

aacgagacct ttggtgacta tgccgaaaag gcacacgagc tgctcaacac caagctggag 1140

cagtgggccg aagaggccgt cgcccgtggc ggattccaca acaccaccgc cttgctcatc 1200

cagtacgaga actatcgcga ctggattgtc aatcacaacg tcgcgtactc ggaactcttc 1260

ctcgacactg ccggagtggc cagcttcgat gtgtgggacc ttctgccctt cacgagagga 1320

tacgtccaca tcctcgacaa ggacccctac ctccaccact ttgcctacga ccctcagtac 1380

ttcctcaacg agctcgacct gctcggtcag gctgccgcta ctcagctggc ccgtaacatc 1440

tccaactccg gtgctatgca gacctacttc gctggcgaga ctatccccgg tgataacctc 1500

gcgtatgatg ccgatttgag cgcctggact gagtacatcc cgtaccactt ccgtcctaac 1560

taccatggcg tgggtacttg ctccatgatg ccgaaggaga tgggcggtgt tgtcgataat 1620

gctgcccgtg tgtacggtgt gcagggactg cgtgtcattg atggttctat tccccctacg 1680

cagatgtcgt cccatgtcat gactgtgttc tacgccatgg cgttgaagat tgcggatgct 1740

attttggagg actacgcttc tatgcagtga 1770

<210> 2

<211> 719

<212> DNA

<213> Ttrpc的核苷酸序列(Unknown)

<400> 2

cttaacgtta ctgaaatcat caaacagctt gacgaatctg gatataagat cgttggtgtc 60

gatgtcagct ccggagttga gacaaatggt gttcaggatc tcgataagat acgttcattt 120

gtccaagcag caaagagtgc cttctagtga tttaatagct ccatgtcaac aagaataaaa 180

cgcgttttcg ggtttacctc ttccagatac agctcatctg caatgcatta atgcattgac 240

tgcaacctag taacgccttn caggctccgg cgaagagaag aatagcttag cagagctatt 300

ttcattttcg ggagacgaga tcaagcagat caacggtcgt caagagacct acgagactga 360

ggaatccgct cttggctcca cgcgactata tatttgtctc taattgtact ttgacatgct 420

cctcttcttt actctgatag cttgactatg aaaattccgt caccagcncc tgggttcgca 480

aagataattg catgtttctt ccttgaactc tcaagcctac aggacacaca ttcatcgtag 540

gtataaacct cgaaatcant tcctactaag atggtataca atagtaacca tgcatggttg 600

cctagtgaat gctccgtaac acccaatacg ccggccgaaa cttttttaca actctcctat 660

gagtcgttta cccagaatgc acaggtacac ttgtttagag gtaatccttc tttctagac 719

<210> 3

<211> 1023

<212> DNA

<213> Pfrd的核苷酸序列(Unknown)

<400> 3

ggtccctgtc tttgtgtgta tgtatgtatg gggtaattcg gatacttaaa taaggtgtat 60

tgaatactaa ttatgatagt tcttattgat agtgtttgtg tttgttgttg tagtgaatgt 120

atatatatat aatgtgagat caaccagttc caggtactat ctaagcttca gatgaaaagc 180

taccttcact tcactaaata gacatctcat tcatgaaatc tagatggagc agacatcccg 240

atcatctagg taaccccaaa attgagacga atctgaatcc ggggacagag tttaaatcga 300

agagcatgac gtgccgcgct gacttaagcc tacgatttca tttgctgaaa ggctgctgct 360

ggggtttcca ggcatgtgaa agcctgggag tctctctctt gccctcaggt atgcttgtag 420

tataatatgt catgggaagg aaccgcaggg tcagcttgca gctcctggtg acgctctgca 480

tgtgatggac ccctggtctg ctggaaactc actagtattc tgtcaacgac aggggagtga 540

tttttgaatg tctactgcct attgataact cgactgtagt acctatacta agtagaaccc 600

gtcattcagt cagtcaagaa gcacaggcca gagacagaca aaagaaggac ccatcgaatc 660

cacttaagac aggctgaaca ttcgttgatc ccctcaaaaa gtagaagaga agataccgga 720

ccggaaaagg gagaggaggg aggagggggt catagaacgg taatcgtacg gtacataccc 780

gagttgaatg aattgaatgg ggaagaaatg agcctcggcc gagtgagtga gtctctcccc 840

cgtcggcttc tgaatgcctg gctctactct tcttcccccg gatctcctgg tgcttaaaga 900

tctacttgtt cctacctgct ttttgaccct ttaatctcct cttctcatct ctcccccatt 960

catctttgaa tttctcttct catccttgtc tcccttccct ctacatcttc ctcccacacg 1020

atg 1023

<210> 4

<211> 1000

<212> DNA

<213> PpptA的核苷酸序列(Unknown)

<400> 4

gtgagggagg attttctcca cgacgggtgc gcggataaag acggcgggga aagcgggttg 60

attagcgccc aggaagggca agtcgagagg agcctggaaa ctctccgtct gacggccaaa 120

atgattgcga ttgacgcgca cgtccagccc accgatcaga tcctggccac ccttctttgt 180

gcggttggct gactcggcga ggaggatcag accggcgcag gtaccccaag taggcctccg 240

gtggaccctg agatggtaat tagcatacac atagagcaac tgtgcagaac accgataaga 300

catacttgac aaagtctcgc aaaggctcca agaggttgga cctggcggca acaagggcca 360

tggttgtgct ttcacctccg ggcagcacca gcgcatcgca tcgctcgagt tcctgcgggg 420

tgcgcacttc gatgaagtcc cattgcgagg cggaactgcg gtctttggcg ggcaaatcgg 480

cggccgcact cttcagcaat tggatatgtt cgtagaaggc gccttgcaag gcgagcacgc 540

cgacggtgat gcagcccatg gcgaagtata ggatctgaga gtgtggcggc agcaacagaa 600

ctatgactcc aaactctcta tactttattt gatgggagca acgccgcctt atgtcagcgg 660

atcaatgtcg gaccgcttat caccacgtgc tgccccgcgt tcagcctcgg acatttgggg 720

gccatcatta acatcatgag ttcaatgtct tttttgcttt gctgtgataa tacgctggtt 780

gcggtcttta acataagact ccgagattcg tcattagaac agtttaatct cagaatgtat 840

caatgaccct cgtggagaac taacccaacc cctcacttca cctcatctca cctccgcata 900

gacgcccgat ctcctcacat cagctacacc actacatctc actcaattga acacaccacc 960

accacaacag cctcataccc aacccaacca acccacaatg 1000

<210> 5

<211> 54

<212> DNA

<213> goxA-F(Unknown)

<400> 5

attcaattcg agctcagatc tggatcctac gtactgccac actacatcag gagc 54

<210> 6

<211> 35

<212> DNA

<213> goxA-R(Unknown)

<400> 6

ttcagtaacg ttaagtcact gcatagaagc gtagt 35

<210> 7

<211> 37

<212> DNA

<213> Ttrpc-F(Unknown)

<400> 7

gcttctatgc agtgacttaa cgttactgaa atcatca 37

<210> 8

<211> 37

<212> DNA

<213> Ttrpc-R(Unknown)

<400> 8

tcaatatcag ttaacgtcta gaaagaagga ttacctc 37

<210> 9

<211> 40

<212> DNA

<213> Pfrd-F(Unknown)

<400> 9

ttcgagctca gatctggatc cggtccctgt ctttgtgtgt 40

<210> 10

<211> 34

<212> DNA

<213> Pfrd-R(Unknown)

<400> 10

agatcggaac gacatcatcg tgtgggagga agat 34

<210> 11

<211> 41

<212> DNA

<213> PpptA-F(Unknown)

<400> 11

attcaattcg agctcagatc tgtgagggag gattttctcc a 41

<210> 12

<211> 37

<212> DNA

<213> PpptA-R(Unknown)

<400> 12

cattacgtag gatcccattg tgggttggtt gggttgg 37

Claims

1.一种来源于黑曲霉的低糖响应诱导型启动子，其特征在于：所述启动子的核苷酸序列为SEQ ID NO.3。

2.根据权利要求1所述的来源于黑曲霉的低糖响应诱导型启动子，其特征在于：所述启动子为富马酸还原酶ANI_1_944144的启动子，命名为Pfrd；

或者，所述低糖为10g/L及以下的浓度环境。

3.如权利要求1或2所述的启动子在调控基因goxA表达方面中的应用。

4.利用如权利要求1或2所述的启动子调控基因goxA表达的方法，其特征在于：所述方法是将含有该启动子的载体转化到黑曲霉细胞和/或丝状真菌细胞中，在低糖条件下进行发酵培养；

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述异源基因为goxA基因，goxA基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.1；

或者，所述丝状真菌细胞为米曲霉、里氏木霉。

6.包含有如权利要求1或2所述的启动子的质粒，其特征在于：所述质粒是以Pfrd为启动子调控goxA基因表达的质粒，goxA基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.1。

7.包含有如权利要求1或2所述的启动子的表达载体。

8.包含有如权利要求1或2所述的启动子的改造菌株。

9.根据权利要求8所述的改造菌株，其特征在于：所述改造菌是将含有启动子、报告基因goxA序列、终止子的表达框转化到黑曲霉、丝状真菌宿主细胞中获得的；

其中，goxA基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.1；

所述丝状真菌细胞为米曲霉、里氏木霉。

10.根据权利要求8所述的改造菌株，其特征在于：所述改造菌株为潮霉素敏感菌株S2361、改造菌米曲霉、改造菌里氏木霉；

其中，所述潮霉素敏感菌株S2361的构建方法如下：

所述改造菌米曲霉的构建方法如下：

所述改造菌里氏木霉的构建方法如下：

其中，所述质粒pLH1442的构建方法如下：

(2)pLH1442质粒的构建：

其中，Pfrd-F的序列为SEQ ID NO.9，Pfrd-R的序列为SEQ ID NO.10。