CN114940980A

CN114940980A - 一类倍半萜聚酮合成基因及其应用

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Publication number: CN114940980A
Application number: CN202210625464.6A
Authority: CN
Inventors: 高昊; 胡丹; 陈国栋; 吕建明; 王传喜; 李韶阳; 谢超
Original assignee: Jinan University
Current assignee: Jinan University
Priority date: 2022-06-02
Filing date: 2022-06-02
Publication date: 2022-08-26
Anticipated expiration: 2042-06-02
Also published as: WO2023232124A1; CN114940980B

Abstract

本发明属于基因工程和生物合成领域，特别涉及一类倍半萜聚酮化合物的生物合成。本发明提供了在一类倍半萜聚酮化合物生物合成中对异戊烯链环化以及后修饰具有关键作用的基因，分别命名为myrD、myrF、myrJ和myrK及其编码的多肽。提供了上述多肽在该类倍半萜聚酮化合物生物合成中的应用。

Description

一类倍半萜聚酮合成基因及其应用

技术领域

本发明属于基因工程和生物合成领域，特别涉及一类倍半萜聚酮化合物的生物合成。

背景技术

式(I)是Xu等人在2018年从一株植物内生真菌Myrothecium sp.OUCMDZ-2784中分离得到的倍半萜部分环化成Aureane型骨架的倍半萜聚酮化合物，具有α-葡萄糖苷酶抑制活性，IC₅₀值为0.20mM^[1]，因此如何实现该类化合物的高效制备对于其进一步开发与应用具有重要意义。生物合成方法操作简单、绿色环保，在合成具有复杂结构的活性化合物方面有极大的应用潜力。但是，此类倍半萜聚酮化合物的生物合成尚未被阐明。

前期，Li等发现一个由聚酮合酶基因stbA、异戊烯基转移酶基因stbB与NRPS-like还原酶基因stbC组成的基因簇负责上述倍半萜聚酮化合物生物合成前体LL-Z1272β的合成^[2]。但是，LL-Z1272β的倍半萜部分是如何形成Aureane型骨架，以及其聚酮部分是如何被进一步修饰，这些关键问题仍未被解决。因此本领域迫切需要鉴定出此类倍半萜聚酮化合物生物合成过程中能够催化倍半萜部分环化以及聚酮部分后修饰的关键基因，从而为该类化合物的高效合成奠定基础。

发明内容

本发明的目的在于提供一类倍半萜聚酮化合物的生物合成基因，同时提供了该类化合物的生物合成方法。

本发明的第一方面提供了一种分离的多肽，其包含：

(a)SEQ ID NO:1所示的多肽序列或者与其具有至少70％序列同一性，优选具有80％、85％、90％、93％、95％、97％、98％、99％序列同一性的多肽序列；或者

由SEQ ID NO:5所示的核酸序列或者与其具有至少70％序列同一性，优选具有80％、85％、90％、93％、95％、97％、98％、99％序列同一性的核酸序列编码的多肽序列；和/或

(b)SEQ ID NO:2所示的多肽序列或者与其具有至少70％序列同一性，优选具有80％、85％、90％、93％、95％、97％、98％、99％序列同一性的多肽序列；或者

由SEQ ID NO:6所示的核酸序列或者与其具有至少70％序列同一性，优选具有80％、85％、90％、93％、95％、97％、98％、99％序列同一性的核酸序列编码的多肽序列；和/或

c)SEQ ID NO:3所示的多肽序列或者与其具有至少70％序列同一性，优选具有80％、85％、90％、93％、95％、97％、98％、99％序列同一性的多肽序列；或者

由SEQ ID NO:7所示的核酸序列或者与其具有至少70％序列同一性，优选具有80％、85％、90％、93％、95％、97％、98％、99％序列同一性的核酸序列编码的多肽序列；和/或

d)SEQ ID NO:4所示的多肽序列或者与其具有至少70％序列同一性，优选具有80％、85％、90％、93％、95％、97％、98％、99％序列同一性的多肽序列；或者

由SEQ ID NO:8所示的核酸序列或者与其具有至少70％序列同一性，优选具有80％、85％、90％、93％、95％、97％、98％、99％序列同一性的核酸序列编码的多肽序列。

本发明的第二方面提供了一种编码第一方面多肽的分离的多核苷酸，

在优选的实施方案中，所述多核苷酸包含：

(i)SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列或者与其具有至少70％序列同一性，优选具有80％、85％、90％、93％、95％、97％、98％、99％序列同一性的核酸序列；和/或

(ii)SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列或者与其具有至少70％序列同一性，优选具有80％、85％、90％、93％、95％、97％、98％、99％序列同一性的核酸序列；和/或

(iii)SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列或者与其具有至少70％序列同一性，优选具有80％、85％、90％、93％、95％、97％、98％、99％序列同一性的核酸序列；和/或

(iv)SEQ ID NO:8所示的核苷酸序列或者与其具有至少70％序列同一性，优选具有80％、85％、90％、93％、95％、97％、98％、99％序列同一性的核酸序列。

本发明的第三方面提供了一种表达盒，其包含根据本发明第二方面的多核苷酸。

本发明的第四方面提供了一种载体，如表达载体，其包含了本发明第二方面所述的多核苷酸或第三方面所述的表达盒。

本发明的第五方面提供了一种细胞，包含本发明第二方面所述的多核苷酸、第三方面所述的表达盒或第四方面所述的载体。

在一个实施方案中，所述细胞为真菌细胞。

在一个优选实施方案中，所述细胞为漆斑属真菌，例如Myrothecium sp.ZLW0801-19，在另一个优选实施方案中，所述细胞为米曲霉细胞。

本发明的第六方面提供了一类倍半萜聚酮化合物的生物合成方法，其包括将本发明第一方面所述的多肽与连有C15异戊烯链的苔色酸类化合物接触。

在一个实施方案中，所述连有C15异戊烯链的苔色酸类化合物的C-1位连接有

结构；

在一个优选实施方案中，所述连有C15异戊烯链的苔色酸类化合物是LL-Z1272β，其结构如下式所示：

本发明的第七方面提供了本发明第一方面所述的多肽、第二方面所述的多核苷酸、第三方面所述的表达盒、第四方面所述的载体或第五方面所述的细胞在一类倍半萜聚酮化合物合成中的用途。

本发明的第八方面提供了一种试剂盒，其包含本发明第一方面所述的多肽、第二方面所述的多核苷酸、第三方面所述的表达盒、第四方面所述的载体或第五方面所述的细胞。

本发明的技术效果：本发明从Myrothecium sp.ZLW0801-19中发现了合成以式(I)为代表的一类倍半萜聚酮化合物的合成基因myrD、myrF、myrJ和myrK，其中myrD和myrJ编码的多肽具有相同的功能。将myrD、myrF和myrK，以及负责LL-Z1272β合成的stbA，stbB和stbC同时在米曲霉中表达，可获得此类倍半萜聚酮化合物，具有过程简单、立体选择专一性高、环境污染小等优点。

附图说明

图1A显示了一类倍半萜聚酮化合物式(I)和式(II)的结构；图1B显示了本发明鉴定的来自Myrothecium sp.ZLW0801-19的一类倍半萜聚酮生物合成基因。

图2显示了myr基因敲除菌株提取物的HPLC检测图谱。

图3显示了myr基因在米曲霉中异源表达的代谢产物分析。图3A显示了在三基因米曲霉菌株(包含stbABC)中表达myr基因的米曲霉菌株提取物HPLC检测图谱；图3B显示了表达myr基因的米曲霉菌株中分离获得的结构。

具体实施方式

还可进一步通过实施例来理解本发明，然而，要理解的是，这些实施例不限制本发明。现在已知的或进一步开发的本发明的变化被认为落入本文中描述的和以下要求保护的本发明范围之内。

术语“倍半萜聚酮化合物”，是一类由倍半萜和聚酮杂合而成的天然化学成分，其中根据倍半萜部分环化后形成的骨架，可分为Drimane型、Aureane型、AvaraneΔ³型、AvaraneΔ⁴⁽¹³⁾型与AvaraneΔ⁴⁽¹⁴⁾型(见下式)。

术语“一类倍半萜聚酮化合物”，为真菌生成的一类Aureane型倍半萜聚酮化合物，其聚酮部分来源于苔色酸类化合物(如下式所示)。

其中，R₁选自：甲基，羟甲基，乙酰羟甲基，乙酰氧基，醛基，羧基，二甲氧基甲基；

R₂选自：甲基，羟甲基，乙酰羟甲基，乙酰氧基，醛基，羧基，二甲氧基甲基；

或者R₁，R₂与苯环组成5元内酰胺环或内酯环。

本发明所提供的MyrD蛋白与MyrJ蛋白是功能相同的黄素依赖型单加氧酶，MyrF是一种杂萜环化酶，MyrK是一种P450氧化酶。

在一种具体实施方案中，将myrD、myrF和myrK，与负责LL-Z1272β合成的stbA，stbB和stbC同时在米曲霉中表达，可获得式(I)。

在另一种具体实施方案中，将myrD和myrF，以及负责LL-Z1272β合成的stbA，stbB和stbC同时在米曲霉中表达，可获得倍半萜聚酮化合物式(II)。

实施例1：候选基因的获得

Myrothecium sp.ZLW0801-19室温保存在土豆琼脂(PDA)培养基上，取少量菌丝接种到土豆液体(PDB)培养基中，28℃，转速220转/分钟，振荡培养3天。过滤收集菌丝，液氮研磨，苯酚氯仿法提取总DNA。使用测序平台Illumina HiSeq 2500***完成测序。使用分析软件SOAPdenovo(version 2.04,http://soap.genomics.org.cn/soapdenovo.html)完成序列分析。共获得348个contigs，总长度约22.0Mb。基因预测使用软件AUGUSTUS(http://bioinf.uni-greifswald.de/augustus/)。

通过AUGUSTUS软件基因功能预测获得了与式(I)生物合成相关的基因(图1B)，其中myrA、myrB、myrC与文献报道的负责LL-Z1272β合成的stbA、stbB、stbC同源性很高，具有相同的功能。剩余的myrD(多肽序列如SEQ ID NO：1所示，核酸序列如SEQ ID NO：5所示)、myrF(多肽序列如SEQ ID NO：2所示，核酸序列如SEQ ID NO：6所示)、myrJ(多肽序列如SEQID NO：3所示，核酸序列如SEQ ID NO：7所示)和myrK(多肽序列如SEQ ID NO：4所示，核酸序列如SEQ ID NO：8所示)作为研究目标基因。

实施例2：在原始菌株基础上构建基因突变菌株

利用CRISPR/Cas9敲除***对myrD、myrF、myrJ进行敲除。具体方法如下：

(1)原生质体制备及Cas9表达菌株构建

1)将野生型Myrothecium sp.ZLW0801-19接种到10mL PDB培养基中，28℃，220rpm震荡培养2天。

2)将种子液接种到100mL新的PDB培养基中28℃，220rpm培养24小时。

3)利用灭菌好的注射筒过滤器进行过滤，将菌体压干，用灭菌后的竹签将菌体取出，放入新的50mL离心管中，加入10mL含0.7M NaCl的磷酸盐缓冲液中(pH 6.0，含1％snailase、0.5％driselase和0.25％lywallzyme)。

4)在30℃恒温箱中震荡3小时，利用注射筒过滤器，将酶解后的菌液过滤到50mL的试管中，如发生堵塞，可用竹签挑一下棉花表面，切忌强用力，以免破坏原生质体。

5)加入等量的TF solution 2(山梨醇87.4g，二水氯化钙2.94g，氯化钠0.82g，1MTris-HCl(pH 7.5)4mL，去离子水定容至400mL，121℃高温灭菌30分钟)(10mL)，上下颠倒试管，轻轻混匀，4℃，1500rpm，离心10分钟。

6)除去上清，加入5mL的TF solution 2，吹打混悬后4℃，1500rpm，离心10分钟，除去上清，加入适量的TF solution 2，使得原生质体浓度为1-5×10⁷/mL，吹打混悬。

7)取200μL的原生质体溶液至15mL的离心管中，加入浓度为1μg/μL的pBSKII-PtrPC-Cas9-TtrPC^[3]10μL，轻轻地混匀。

8)在冰上静置30分钟。期间将含0.7M NaCl的PDA培养基在微波炉中溶解，在50℃水浴中保温，使用前加入hygromycin(潮霉素)至终浓度100μg/mL。

9)向7中的混悬液中分三次分别加入250μL，250μL，850μL的TF solution 3(PEG4000 120g，二水氯化钙1.47g，1M Tris-HCl(pH 7.5)2mL，去离子水定容至200mL，121℃灭菌30分钟)，每次加入后，使用枪头吹打混匀，在室温下静置20分钟。

10)加入5mL的TF solution 2，上下颠倒试管，轻轻混匀。

11)4℃，1500rpm，10分钟离心，除去上清，加入200μL的TF solution 2，用1mL的枪轻轻地混悬，加入到培养皿的中央。在培养皿的周围迅速加入5mL 50℃保温的8中的溶液，快速混匀。

12)平板表面充分干燥后，用封口膜缠好，倒置培养5天。

13)将获得转化体在普通PDA培养基上传代1-3次，让转化体稳定。

(2)gRNA的体外合成与纯化

1)以质粒pUCm-gRNAscaffold-eGFP^[3]为模板，通过引物eGFP-R(SEQ ID NO:9)和gRNA-MyrD-F(SEQ ID NO:10)、gRNA-MyrF-F(SEQ ID NO:11)、gRNA-MyrJ-F(SEQ ID NO:12)扩增含有T7启动子、20bp靶位点序列、gRNA骨架序列的片段，连接于pUCm-T载体(生工生物(上海)股份有限公司，货号B522211)，得到相应的gRNA质粒。然后以这些gRNA质粒为模板，通过引物pUCm-F(SEQ ID NO:13)和gRNA-R(SEQ ID NO:14)扩增获得gRNA体外转录模板DNA片段。最后使用试剂盒T7 RiboMAX TM Express Large Scale RNA Production System(Promega,货号P1320)进行体外转录，获得gRNA。

2)使用试剂盒RNeasy MinElute Cleanup Kit(Qiagen，货号74204)进行RNA纯化。

3)以质粒pBSKII-PtrPC-neo-TtrPC^[3]为模板，利用引物PtrpC-XbaI-F(SEQ IDNO:15)和TtrpC-HindШ-R(SEQ ID NO:16)扩增线性筛选基因片段。

4)按前述方法制备Cas9表达菌株原生质体，然后取200μL的原生质体溶液至15mL的离心管中，加入40-60μg gRNA与2-3μg neo抗性片段，轻轻地混匀。在冰上静置30min。向混悬液中分三次分别加入250μL，250μL，850μL的TF solution 3，每次加入后，都用1mL枪头轻轻吹吸。室温下静置20min。加入5mL的TF solution 2，上下颠倒试管，轻轻混匀。1500rpm，4℃离心10min，除去上清，加入200μL的TF solution 2，用1mL的枪轻轻地混悬，加入含有200μg/mL G418(遗传霉素)的下层培养基中。然后迅速加入5mL 50℃保温的上层培养基(含有等浓度G418)，快速混匀。平板表面充分干燥后，用封口膜缠好，倒置培养5天。将获得转化株在普通PDA培养基上传代1-3次，获得稳定敲除菌株ΔmyrD，ΔmyrF，ΔmyrJ。

5)野生型Myrothecium sp.ZLW0801-19以及对应的基因敲除突变菌株接种到10mLPDB培养基中，28℃，200rpm振荡培养2天作为种子液。然后将种子液接种到盛有100mLmaltose培养基(麦芽糖3％，麦芽提取粉0.25％，酵母提取物0.15％，磷酸二氢钾0.2％，碳酸钙0.4％，硫酸镁0.1％)的500mL培养瓶中，28℃，220rpm振荡培养5天。发酵液加入等体积的乙酸乙酯超声萃取两次，合并乙酸乙酯提取液，减压旋干得浸膏。浸膏用甲醇溶解为2mg/mL进行HPLC分析。结果如图2所示，ΔmyrF与ΔmyrJ不再合成式(I)，但是ΔmyrD依然可合成式(I)。

HPLC条件如下：

仪器：戴安UltiMate 3000配备UltiMate 3000Diode Array Detector(DIONEX,USA)以及amaZon SL离子阱电喷雾质谱(BRUKER，Germany)，Alltech(Grace)2000ESevaporative light scattering detector(ELSD)(Alltech Co.,Ltd.,Portland,USA)

液相柱：Phenomenex Gemini 5μC18 column(5μm,4.6×250mm)

流动相A:水(0.1％甲酸)；流动相B:乙腈(0.1％甲酸)

梯度设置：0-20min 10％-60％B,20-30min 60％-70％B,30-40min 70％-80％B,40-50min 80％-100％B

流速：1mL/min

实施例3：构建米曲霉表达菌株

(1)myrD，myrF，myrJ和myrK以菌株Myrothecium sp.ZLW0801-19基因组DNA为模板，通过相应的引物对Inf-pUSA-myrD-F(SEQ ID NO:17)/Inf-pUSA-myrD-R(SEQ ID NO:18)、Inf-pTAex3-myrF-F(SEQ ID NO:19)/Inf-pTAex3-myrF-R(SEQ ID NO:20)、Inf-pUSA-myrJ-F(SEQ ID NO:21)/Inf-pUSA-myrJ-R(SEQ ID NO:22)、Inf-pTAex3-myrK-F(SEQ IDNO:23)/Inf-pTAex3-myrK-R(SEQ ID NO:24)扩增，使用In fusion连接方法，连接到米曲霉(A.oryzae NSAR1，日本东京大学阿部郁朗教授提供)表达质粒pTAex3或者pUSA质粒(日本东京大学阿部郁朗教授提供)中，形成重组质粒(pUSA-MyrD、pTAex3-MycF、pUSA-MyrJ和pTAex3-MyrK)。以重组质粒pTAex3-MycF为模板，通过引物Inf-pUSA-Pamy-F(SEQ ID NO:25)/Inf-pUSA-Tamy-R(SEQ ID NO:26)扩增含有淀粉酶amyB启动子和终止子的DNA表达框，使用In fusion连接方法，连接到XbaI酶切后的pUSA-MyrD质粒中构建两基因表达质粒pUSA-MyrD-MyrF。以重组质粒pTAex3-MyrK为模板，通过引物Inf-pBARI-Pamy-F(SEQ IDNO:27)/Inf-pBARI-Tamy-R(SEQ ID NO:28)扩增含有淀粉酶amyB启动子和终止子的DNA表达框，使用In fusion连接方法，连接到HindIII酶切后的pBARI质粒(日本东京大学阿部郁朗教授提供)中构建表达质粒pBARI-MyrK。

(2)含有stbABC三基因米曲霉原生质体制备及转染。

1)取三基因米曲霉^[2]的孢子保存液100μL加入到含有10mL DPY培养基的50mL试管中，30℃，220rpm，震荡培养2天。

2)将10mL的培养液加入到装有100mL DPY培养基的500ml锥形瓶中，充分混合均匀，30℃，220rpm，震荡培养24小时。

3)取15mL左右的菌液，利用灭菌好的注射筒过滤器进行过滤，将菌体压干，用灭菌后的药勺将菌体取出，放入新的50mL离心管中，加入10mL TF solution 1(马来酸0.058g，硫酸铵0.79g，Yatalase 0.1g，pH 5.5)。

4)在30度的恒温箱中震荡3小时，至上清明显秽浊且呈淡红色。利用注射筒过滤器，将原生质体过滤到50ml的试管中，如发生堵塞，可用竹签挑一下棉花表面。

5)加入等量的TF solution 2(10mL)，上下颠倒试管，轻轻混匀，4℃，1500rpm，离心10分钟。

6)除去上清，加入5mL的TF solution 2，4℃，1500rpm，离心10分钟，除去上清，加入适量的TF solution 2，使原生质体浓度为1-5×10⁷/mL，上下颠倒混悬。

7)用1000μL的枪头，取200μL的原生质体溶液至15mL的离心管中，加入浓度为1μg/μL的质粒(pUSA-MyrD；pUSA-MyrJ；pUSA-MyrD-MyrF；pUSA-MyrD-MyrF和pBARI-MyrK)10μL，轻轻地混匀。

8)在冰上静置30分钟。期间将Top agar在微波炉中溶解，在50℃水浴中保温。

9)向7中的混悬液中分三次分别加入250μL，250μL，850μL的TF solution 3，每次加入后，都枪头吹打混匀，在室温下静置20分钟。

10)加入5mL的TF solution 2，上下颠倒试管，轻轻混匀。

11)4℃，1500rpm，离心10分钟，除去上清，加入200μL的TF solution 2，用1mL的枪轻轻地混悬，加入到培养皿的中央。在培养皿的周围迅速加入5mL50℃保温的Top agar，快速混匀。

12)平板表面充分干燥后，用封口膜缠好，倒置培养4-7天。

13)将获得转化体在不含sorbitol的筛选培养基上传代1-3次，让转化体稳定。

(3)表达目标基因的米曲霉转化菌株接种到5mL DPY培养基中，28℃，220rpm振荡培养2天作为种子液。然后将种子液接种到盛有100ml CD-starch培养基的500mL培养瓶中，28℃，200rpm振荡培养5天。发酵完成后抽滤，分离菌丝和菌液。菌液用等体积乙酸乙酯萃取两次，合并乙酸乙酯层，减压旋干，浸膏用2mL甲醇溶解后进行HPLC分析。菌丝体用100mL丙酮超声提取一次，减压旋至无丙酮，加入少量水后用适量乙酸乙酯萃取3次，合并乙酸乙酯萃取液，减压旋干得浸膏，浸膏用2mL甲醇溶解后进行HPLC分析。结果如图3所示，myrD和myrJ在米曲霉中发挥相同的功能，可催化LL-Z1272β进行环氧化，然后自发水解产生式(III)。myrD和myrF在米曲霉中共同作用产生环化产物式(II)，确定myrF负责催化倍半萜部分环化成Aureane型骨架。myrD、myrF和myrK共同作用可催化生成式(I)，表明myrK催化式(II)氧化生成羟基。

HPLC条件如下：

仪器：戴安UltiMate 3000配备UltiMate 3000 Diode Array Detector(DIONEX,USA)以及amaZon SL离子阱电喷雾质谱(BRUKER，Germany)，Alltech(Grace)2000ESevaporative light scattering detector(ELSD)(Alltech Co.,Ltd.,Portland,USA)。

液相柱：Phenomenex Gemini 5μC18 column(5μm,4.6×250mm)

流动相A:水(0.1％甲酸)；流动相B:乙腈(0.1％甲酸)

流速：1mL/min

实施例4：化合物的分离纯化和结构鉴定

上述实施例2，3中涉及到的化合物分析纯化的方法及结果汇总如下：

实施例4.1化合物分离纯化

式(I)化合物分离：2L野生型Myrothecium sp.ZLW0801-19菌株的maltose培养基发酵液用等体积的乙酸乙酯萃取2次，合并乙酸乙酯层，减压旋干得浸膏4g。经硅胶柱色谱分离二氯甲烷-甲醇梯度洗脱(20:1-5:1,v/v)得到7个子流分a-g。流分d经半制备HPLC[等度洗脱H₂O(A)and CH₃CN(B)；3mL/min；58％B]纯化得到式(I)化合物(15mg)。

式(II)化合物分离：2L转基因米曲霉菌株(stbABC+myrDF)菌株的CD-starch培养基发酵液用等体积的乙酸乙酯萃取2次，合并乙酸乙酯层，减压旋干得浸膏5g。经硅胶柱色谱分离二氯甲烷-甲醇梯度洗脱(20:1-5:1,v/v)得到8个子流分a-g。流分c,d经半制备HPLC[等度洗脱H₂O(A)and CH₃CN(B)；3mL/min；62％B]纯化得到式(II)化合物(9mg)。

式(III)化合物分离：2L转基因米曲霉菌株(stbABC+myrD)菌株的CD-starch培养基发酵液用等体积的乙酸乙酯萃取2次，合并乙酸乙酯层，减压旋干得浸膏5g。经硅胶柱色谱分离二氯甲烷-甲醇梯度洗脱(20:1-5:1,v/v)得到10个子流分a-g。流分b经半制备HPLC[等度洗脱H₂O(A)and CH₃CN(B)；3mL/min；53％B]纯化得到式(III)化合物(7mg)。

实施例4.2实施例涉及的化合物的结构、名称、编号以及核磁确认数据

式(I)化合物核磁数据：¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆):δ_H＝12.79(1H,s),9.95(1H,s),6.50(1H,s),5.38(1H,s),4.88(1H,m),4.71(2H,d,J＝3.6Hz),4.14(1H,d,J＝4.4Hz),3,31(1H,m),2.62(1H,d,J＝12.8Hz),2.48(1H,d,J＝12.8Hz),2.45(1H,m),1.78(1H,m),1.73(1H,m),1.70(1H,m),1.52(1H,m),1.51(1H,m),1.28(1H,m),1.11(1H,m),1.02(3H,d,J＝6.8Hz),0.95(3H,s),0.91(3H,s),0.59(3H,s)；¹³C NMR(100MHz,DMSO-d₆):δ_C＝193.4,164.7,164.6,145.4,143.1,116.3,111.3,110.1,107.3,71.5,59.9,43.7,43.7,42.8,36.9,31.6,30.3,26.7,25.2,23.3,22.9,17.2,14.8。

式(II)化合物的核磁数据归属(¹H for 400MHz and ¹³C for 100MHz in DMSO-d₆)

式(III)化合物核磁数据：¹H NMR(400MHz,CDCl₃):δ_H＝12.73(1H,s),10.06(1H,s),6.20(1H,s),5.18(1H,t,J＝8.0,4.0Hz),5.14(1H,t,J＝8.0,4.0Hz),3.41(2H,m),3,36(1H,m),2.48(3H,s),2.10(2H,m),2.09(2H,m),2.09(2H,m),1.76(3H,s),1.59(3H,s),1.44(2H,m),1.23(3H,s),1.19(3H,s)；¹³C NMR(100MHz,CDCl₃):δ_C＝192.9,163.6,162.6,141.8,137.7,135.1,124.7,122.1,113.1,112.2,110.7,78.3,73.4,39.2,36.5,29.2,26.4,25.4,23.4,21.0,18.0,16.0,16.0。

参考文献：

[1]Xu Y,Wang C,Liu H,et al.Meroterpenoids and isocoumarinoids from amyrothecium fungus associated with Apocynum venetum.Marine Drugs,2018,16:363.

[2]Li C,Matsuda Y,Gao H,et al.Biosynthesis of LL-Z1272β:Discovery ofa new member of NRPS-like enzymes for aryl-aldehyde formation.ChemBioChem,2016,17:904-907.

[3]Zheng Y-M,Lin F-L,Gao H,et al.Development of a versatile andconventional technique for gene disruption in filamentous fungi based onCRISPR-Cas9 technology.Scientific Reports,2017,7:9250.

序列表

<110> 暨南大学

<120> 一类倍半萜聚酮合成基因及其应用

<130> 1

<160> 28

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 432

<212> PRT

<213> Unknown

<400> 1

Met Ser Lys Phe His Ala Ile Ile Ile Gly Gly Gly Pro Val Gly Leu

1 5 10 15

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Pro Ile Asp Gly Gly Val Arg Val Ile Cys Ala Asp Gly Thr Glu Tyr

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Thr Gly Ser Val Val Ile Gly Ala Asp Gly Val His Ser Lys Thr Arg

145 150 155 160

His Ile Leu His Glu Leu Ala Gly Asp Gly Gly Gly Phe Ser Pro Ile

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Glu Lys Thr Pro Phe Asn Ala Glu Tyr Arg Thr Leu Phe Cys Ser Phe

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Glu Arg Ile Pro Thr Ile Lys Lys Asp Tyr Ala Ala Ser Ala Met Val

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<213> Unknown

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Val Leu Glu Arg Arg Pro Asn Val Val Glu Asp Met Gly Ala Ser Ile

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Arg Val Ala Cys Asp Asp Gly Thr Ser Tyr Glu Gly His Ile Val Leu

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Glu Leu Glu Asn Ala Arg Asp Asn Gly Glu Leu Ser Ser Ile Val Thr

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atcctcatct ttttcatcga gccgatgtcg tccgaaccct ctacgaaaac ctctccgaga 420

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taatacgact cactataggc agggccgtac ttgatgggtt ttagagctag aaatagc 57

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taatacgact cactataggt gcgtgtccac tcattgggtt ttagagctag aaatagc 57

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<212> DNA

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<400> 13

tcgcgcgttt cggtgatgac 20

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> Unknown

<400> 14

aaaagcaccg actcggtgcc 20

<210> 15

<211> 28

<212> DNA

<213> Unknown

<400> 15

gctctagagc gcaattaacc ctcactaa 28

<210> 16

<211> 35

<212> DNA

<213> Unknown

<400> 16

cccaagcttc agggctggtg acggaatttt catag 35

<210> 17

<211> 35

<212> DNA

<213> Unknown

<400> 17

cgcgcggcag ccataatgtc caagtttcat gccat 35

<210> 18

<211> 35

<212> DNA

<213> Unknown

<400> 18

gtgcggccgc aagcttcacg ctgttgtatg aaccc 35

<210> 19

<211> 35

<212> DNA

<213> Unknown

<400> 19

tcgagctcgg tacccatgca gccctttctc ggtga 35

<210> 20

<211> 35

<212> DNA

<213> Unknown

<400> 20

ctactacaga tccccttatt tgcctgcaat agcct 35

<210> 21

<211> 35

<212> DNA

<213> Unknown

<400> 21

tcgagctcgg tacccatggc cgctcctgtt ctcaa 35

<210> 22

<211> 35

<212> DNA

<213> Unknown

<400> 22

ctactacaga tcccctcatg tcgagctgat ggggt 35

<210> 23

<211> 35

<212> DNA

<213> Unknown

<400> 23

tcgagctcgg tacccatgaa ttactcaggc ctcgc 35

<210> 24

<211> 35

<212> DNA

<213> Unknown

<400> 24

ctactacaga tcccctcagt actgcctctt ggtga 35

<210> 25

<211> 35

<212> DNA

<213> Unknown

<400> 25

gaaaggatcc tctagcgact ccaatcttca agagc 35

<210> 26

<211> 35

<212> DNA

<213> Unknown

<400> 26

ccaagatgac tctaggtaag atacatgagc ttcgg 35

<210> 27

<211> 35

<212> DNA

<213> Unknown

<400> 27

tgattacgcc aagctcgact ccaatcttca agagc 35

<210> 28

<211> 35

<212> DNA

<213> Unknown

<400> 28

gcaggcatgc aagctgtaag atacatgagc ttcgg 35

Claims

1.分离的一种或多种多肽，其特征在于，所述多肽选自：a)包含SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的MyrD多肽，b)包含SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的MyrF多肽，c)包含SEQ ID NO:3所示氨基酸序列的MyrJ多肽，d)包含SEQ ID NO:4所示氨基酸序列的MyrK多肽。

2.一种分离的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸编码权利要求1所述的多肽。

3.根据权利要求2所述的分离的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸为：

(i)SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列；或

(ii)SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列；或

(iii)SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列；或

(iii)SEQ ID NO:8所示的核苷酸序列。

4.载体，其特征在于，所述载体包含权利要求2或3所述的多核苷酸。

5.宿主细胞，其特征在于，所述细胞包含权利要求4所述的载体；所述细胞为真菌细胞或细菌细胞；优选地，所述真菌细胞选自漆斑属真菌、米曲霉细胞、酿酒酵母细胞；所述细菌细胞为大肠杆菌细胞。

6.一类倍半萜聚酮的合成方法，其包括将权利要求1所述的一种或多种多肽与连有C15异戊烯链的苔色酸类化合物接触；优选地，所述连有C15异戊烯链的苔色酸类化合物的C-1位连接有

结构；例如，所述连有C15异戊烯链的苔色酸类化合物的结构如下式所示：

7.权利要求1所述的多肽、权利要求2或3所述的多核苷酸、权利要求4所述的载体和/或权利要求5所述的宿主细胞在该类倍半萜聚酮合成中的用途。

8.一种试剂盒，其特征在于，包含权利要求1所述的多肽、或权利要求2或3所述的多核苷酸、或权利要求4所述的载体、或权利要求5所述的宿主细胞。