CN114934010A - 红细胞膜在增加外泌体产量中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于外泌体制备技术领域，具体涉及红细胞膜在增加外泌体产量中的应用。本发明通过在培养制备外泌体的试剂中增加红细胞膜，利用细胞对红细胞膜的内吞作用和膜成分补充，促进外泌体的生成，可以显著增加外泌体的产量，是采用未添加红细胞膜的常规试剂制备得到的外泌体产量的近7倍，且此外泌体的装载效率、递送效率和治疗效果与采用常规培养基培养得到的外泌体不存在差异。

Description

红细胞膜在增加外泌体产量中的应用

技术领域

本发明属于外泌体制备技术领域，具体涉及红细胞膜在增加外泌体产量中的应用。

背景技术

外泌体是由细胞产生的一种纳米级囊泡，具有良好的生物相容性，可携带多种生物活性物质并在细胞间进行信息传递，因此在药物递送方面发挥重要的作用。作为一种药物递送载体，在临床转化中面临的关键问题是外泌体产量低，难以进行量产实现临床转化。

外泌体是起源于细胞内吞过程中形成的内体。细胞膜向内出芽脱落后形成胞内囊泡，这些囊泡会与细胞中早期内体结合，成为早期内体的一部分，早期内体在多种蛋白质作用及pH改变的情况下逐渐成熟为晚期内体，晚期内体继续成熟形成多囊泡体(MVBs)，MVBs内陷在腔内形成腔内囊泡(ILVs)，最终当MVB与质膜融合时释放ILVs，即为外泌体。

现有的用于制备外泌体的试剂有很多，如不断改进的各种商用试剂盒，且均已经较为成熟。但是现有技术中用于提取制备外泌体的试剂多存在外泌体产量较低，或虽然外泌体产量相对较高，但装载效率或递送效率较低的问题。

发明内容

本发明的目的在于提供红细胞膜在增加外泌体产量中的应用，采用添加红细胞膜的试剂制备外泌体，可以显著增加外泌体的产量，保证外泌体的装载效率、递送效率和治疗效果。

本发明提供了红细胞膜在增加外泌体产量中的应用。

本发明还提供了一种增加外泌体产量的试剂，所述试剂包括红细胞膜和试剂领域可接受的辅料。

优选的，所述红细胞膜与辅料的质量体积比为20～80μg：1mL。

优选的，所述红细胞膜与辅料的质量体积比为80μg：1mL。

优选的，所述红细胞膜的粒径为0～400nm。

优选的，所述试剂包括培养基或试剂盒。

优选的，所述辅料包括细胞培养基。

本发明还提供了一种增加外泌体产量的方法，采用上述技术方案所述的试剂培养外泌体供体细胞，收集外泌体。

优选的，将外泌体供体细胞在所述试剂中第一培养12h，将得到的培养组分于无外泌体血清培养基中第二培养，48h后收集外泌体。

优选的，所述外泌体供体细胞包括AmL12细胞。

有益效果：

本发明提供了红细胞膜在增加外泌体产量中的应用，通过在培养制备外泌体的试剂中添加红细胞膜，利用细胞对红细胞膜的内吞作用和膜成分补充，促进外泌体的生成。采用本发明提供的试剂对外泌体供体细胞进行培养，可以显著增加外泌体的产量，是采用未添加红细胞膜的常规试剂制备得到的外泌体产量的近7倍。

其次，红细胞膜来源广泛，取材容易，安全性高，没有众多的细胞器，制备工作简单，且具有膜的所有功能；同时，红细胞膜与外泌体膜具有非常显著的相似性，生物相容性高，对受体细胞影响小，进而可解决因增加外泌体产量而导致的外泌体装载效率和递送效率的问题。因此，本发明所述的技术方案是解决外泌体产量低的一种有效方法，为解决外泌体递药功能面临的瓶颈问题提供了有效手段。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1～4分别为采用实施例1、实施例2、实施例3和对照组中培养基制备的外泌体的NTA检测结果图；

图5为外泌体表征分析结果，其中Ctrl@Exo^Ldlr和RCM@Exo^Ldlr分别代表未治疗组，对照外泌体负载Ldlr和量产外泌体负载Ldlr；

图6～8为采用实施例1中培养基制备得到的外泌体的三个生物学重复的产量结果；

图9～11为采用对照组中培养基制备得到的外泌体的三个生物学重复的产量结果；

图12为qPCR检测外泌体装载Ldlr的效率结果图，其中PBS、Ctrl@Exo^Ldlr和RCM@Exo^Ldlr分别代表对照组，对照外泌体负载Ldlr组和量产外泌体负载Ldlr组；

图13为肝脏油红O染色结果，其中第一排中的标尺为200μm，放大倍数为5.0×，第二排图片中的标尺为50μm，放大倍数为20.0×，从左到右PBS、Ctrl@Exo^Ldlr和RCM@Exo^Ldlr分别代表对照组，对照外泌体负载Ldlr组和量产外泌体负载Ldlr组；

图14为血管总动脉油红O染色结果，其中PBS、Ctrl@Exo^Ldlr和RCM@Exo^Ldlr分别代表未治疗组，对照外泌体负载Ldlr治疗组和量产外泌体负载Ldlr治疗组。

图15为HE染色法进行毒性分析结果，其中PBS、Ctrl@Exo^Ldlr和RCM@Exo^Ldlr分别代表对照组，对照外泌体负载Ldlr组和量产外泌体负载Ldlr组，从上到下依次代表主动脉根部组织、心脏组织、肝组织、脾组织、肺组织和肾组织。

具体实施方式

本发明提供了红细胞膜在增加外泌体产量中的应用。本发明通过在试剂中增加红细胞膜，利用细胞对红细胞膜的内吞作用和膜成分补充，促进外泌体的生成。采用本发明提供的试剂对外泌体供体细胞进行培养，可以显著增加外泌体的产量，是采用未添加红细胞膜的常规试剂制备得到的外泌体产量的近7倍。

本发明还提供了一种增加外泌体产量的试剂，所述试剂包括红细胞膜和试剂领域可接受的辅料。

本发明所述试剂中红细胞膜与辅料的质量体积比优选为20～80μg：1mL，进一步优选为40～80μg：1mL，更优选为80μg：1mL。本发明所述红细胞膜优选为红细胞膜碎片颗粒，所述红细胞膜碎片颗粒的粒径优选为0～400nm，进一步优选为40～200nm，更优选为150nm。本发明所述粒径大小的红细胞碎片颗粒更容易被细胞内吞，促进外泌体的生成。本发明所述试剂优选包括培养基或试剂盒，更优选包括培养基。本发明所述辅料优选包括细胞培养基。本发明对所述细胞培养基的类型没有特殊限定，根据外泌体的制备需要常规调整即可，如本发明下述实施例中以商用常规DMEM培养基为辅料与红细胞膜混合共同制备本发明所述增加外泌体产量的试剂，但不能仅将其认定为本发明中的全部保护范围。

本发明还提供了所述增加外泌体产量的试剂的制备方法，包括如下步骤：将重悬的红细胞颗粒溶液与辅料混合，得到所述增加外泌体产量的试剂。

本发明所述辅料优选包括常规细胞培养基，进一步优选包括DMEM培养基或1640培养基，更优选为DMEM培养基。本发明对所述混合的方式没有特殊限定，采用本领域常规混合方式即可。本发明制备所述重悬的红细胞颗粒溶液的重悬剂优选为PBS缓冲液，更优选为1×PBS缓冲液。本发明对所述红细胞膜的提取方法没有特殊限定，采用本领域中红细胞的常规制备方法即可。

本发明还提供了一种增加外泌体产量的方法，采用上述技术方案所述的试剂培养外泌体供体细胞，收集外泌体。

本发明采用所述试剂培养外泌体供体细胞前，优选还包括将所述外泌体供体细胞培养至密度为80％～85％，更优选培养至80％。本发明对所述培养的培养基和条件没有特殊限定，采用本领域中的常规培养基和培养条件即可，如在本发明的实施例中采用的培养基为DMEM培养基，培养温度为37℃，CO₂的体积百分含量5％。本发明培养至密度为80％～85％的外泌体供体细胞的状态更好，能够内吞的细胞数量较多，可辅助提高外泌体的产量。本发明所述外泌体供体细胞优选包括AmL12细胞。

将所述外泌体供体细胞培养至密度为80％～85％后，本发明优选将密度培养至80％～85％的外泌体供体细胞在所述增加外泌体产量的试剂中第一培养12h，得到培养组分。本发明所述密度培养至80％～85％的外泌体供体细胞与所述试剂的数量体积比优选为8×10⁵个：3mL。本发明所述第一培养的温度优选为37℃；CO₂的体积百分含量优选为5％。

得到所述培养组分后，本发明将所述培养组分于无外泌体血清培养基中第二培养，48h后收集细胞上清。

得到所述细胞上清后，本发明优选对所述细胞上清进行离心和过滤，得到滤过物即为外泌体。本发明对所述离心的转速优选为1000～3000rpm，更优选为1000rpm或3000rpm；所述离心的时间优选为10～20min，更优选为10min或20min。本发明用于所述过滤的滤器的孔径优选为0.22～0.45μm，更优选为0.22μm或0.45μm。

为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明提供的技术方案进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。

下述实施例中所使用的试剂和试验方法，如无特殊说明，均采用的是本领域常规的试剂和试验方法。

实施例1

1、一种增加外泌体产量的培养基，由以下组分组成：

3mL DMEM培养基(Gibco公司，美国)中添加240μg的PBS重悬的红细胞膜颗粒。

2、一种增加外泌体产量的培养基的制备方法，由以下步骤组成：

2.1红细胞膜的提取

1)采用EDTA抗凝取血，然后4℃，3000rpm/min，10min离心，收集红细胞后用1×PBS洗涤5次；

2)按PBS：蒸馏水＝1：9的体积比配制裂解液，将步骤1)得到的红细胞在4℃放置2h使红细胞溶血；

3)4℃，12000rpm/min，15min离心后弃上清，将得到的沉淀采用裂解液洗涤3～5次后用1×PBS重悬；

4)冰水浴下，用手持式高速匀浆机10000rpm/min，15min进行剪切，随后收集产物，通过粒径测量将红细胞膜碎片控制在200nm以内，PBS重悬后的产物一部分用于上述测量其大小，一部分用于定量检测其浓度，浓度为2μg/μL。

2.2增加外泌体产量的培养基的制备

将120μL 2.1中得到的浓度为2μg/μL的PBS重悬的红细胞颗粒与3mL DMEM培养基混合，得到增加外泌体产量的培养基，培养基中红细胞膜颗粒的浓度为80μg/mL。

实施例2

1、一种增加外泌体产量的培养基，由以下组分组成：

3mL DMEM培养基(Gibco公司，美国)中添加120μg的PBS重悬的红细胞膜颗粒和60μL 1×PBS缓冲液(实施例2和实施例3中添加PBS缓冲液是为了保证量筛时，添加的总体积保持一致)。

2、一种增加外泌体产量的培养基的制备方法与实施例1中相同，制备得到的培养基中，红细胞膜颗粒的浓度为40μg/mL。

实施例3

1、一种增加外泌体产量的培养基，由以下组分组成：

3mL DMEM培养基(Gibco公司，美国)中添加60μg的PBS重悬的红细胞颗粒和90μL 1×PBS缓冲液。

2、一种增加外泌体产量的培养基的制备方法与实施例1中相同，制备得到的培养基中，红细胞膜颗粒的浓度为20μg/mL。

实施例4

一种增加外泌体产量的方法，由以下步骤组成：

1)将AmL12细胞于DMEM培养基中培养至密度为80％，培养温度为37℃，CO₂的体积百分含量为5％；

2)分别采用实施例1～3中的培养基对步骤1)中得到的外泌体供体细胞进行培养，对照组以DMEM培养外泌体供体细胞；实施例1～3和对照组中外泌体供体细胞与培养基的数量体积比均为8×10⁵个：3mL；

3)培养第12h时，分别给细胞换无外泌体血清培养基；

4)48h后收集细胞上清，离心去除细胞碎片，然后用0.22μm的滤器过滤，滤过物即为外泌体；

5)将收集到的外泌体进行NTA检测，其中采用实施例1～3和对照组中收集到的外泌体分别记为RCM-Exo、RCM-Exo-1、RCM-Exo-2和Exo。

实施例5

采用纳米颗粒跟踪分析仪(ZetaView,Particle Metrix)对实施例4中收集到的外泌体RCM-Exo、RCM-Exo-1、RCM-Exo-2和Exo分别进行NTA检测，具体步骤如下：

1、打开仪器电源、电脑软件，确认连接正常；

2、向样品管道中注入1mL纯净水清洗管道；

3、加入1mL标准品仪器校准；

4、使用1mLPBS冲掉标准品；

5、取出收集好的上清，每组样本分别稀释100倍，吸取1mL后加入样品管道；

6、样品聚焦；

7、点击“Checkparticle Drift at 0V”确定样品进行布朗运动；

8、点击“Measurement”，在SOP中选择EV此项参数，进行测量。

其中RCM-Exo、RCM-Exo-1、RCM-Exo-2和Exo的结果分别如图1～4所示：

由图1～4中左下角的峰值图显示可以得出，横坐标为粒径大小，纵坐标为外泌体的数量，由此可以看出RCM-Exo、RCM-Exo-1、RCM-Exo-2和Exo的依次在140nm、150nm、140nm和140nm处达到最高峰值，即RCM-Exo、RCM-Exo-1、RCM-Exo-2和Exo的依次在140nm、150nm、140nm和140nm处的外泌体的数量最多，尤其是采用实施例1中制备得到的外泌体产量更高(通过峰图面积识别得到，峰图面积越大，说明外泌体产量更高)。而本领域公知粒径在40-400nm均可认为是外泌体，由此可以得出，采用实施例1～3中的培养基制备得到的外泌体与采用对照组中的常规培养基制备得到的外泌体粒径均在公知粒径范围内，采用本发明提供的培养基制备外泌体不会影响外泌体的物理特征。

实施例6

外泌体RCM-Exo的装载效率、递送效率和治疗效果的验证

家族性高胆固醇血症(FH)是一种单基因(Ldlr基因)遗传病，基因治疗是该疾病治疗的一种有效手段。本实施例以此疾病为例，验证采用本发明培养基制备得到的外泌体的装载效率、递送效率和治疗效果。

1)以过表达Ldlr的AML12细胞(AML12细胞购买于武汉普诺赛生命科技有限公司(Procell)，货号为CL-0602)为外泌体供体细胞，分别向密度为80％的过表达Ldlr的AML12细胞中添加PBS、实施例1和对照组中的培养基，分组为：PBS，RCM@Exo^ldlr和Ctrl@Exo^ldlr，每一组设置3个生物学重复；

其中，过表达Ldlr的AML12细胞的制备方法如下：

1.体外构建Ldlr质粒,

2.AML12细胞进行铺板，待细胞密度达到80％时，进行转染(即过表达)，转染具体步骤如下：

将3μg的Ldlr质粒稀释于200μL的PBS缓冲液中，得到Ldlr溶液；取7.2μLHigene转染试剂(普利莱基因技术有限公司，C1506)加至Ldlr溶液中，立即震荡混匀，低速瞬时离心将液体甩至管底；室温放置15min；将转染混合物直接加至细胞培养基中,轻摇晃培养皿混匀。

2)通过超速离心收集外泌体，观察：Ctrl@Exo^ldlr和RCM@Exo^ldlr组中外泌体的形态、大小和产量变化；外泌体表征分析结果如图5所示，发现外泌体形态和大小没有变化，其中图5中Ctrl@Exo^Ldlr和RCM@Exo^Ldlr分别代表对照外泌体负载Ldlr组和量产外泌体负载Ldlr组。

RCM@Exo^ldlr和Ctrl@Exo^ldlr组的产量结果分别如图6～8和9～11所示：由图6～8和9～11中original concentration部分的数据可以得出，RCM@Exo^ldlr组中3个生物学重复得到的外泌体的含量分别为9.3×10⁹Particles/mL、1.6×10¹⁰Particles/mL和9.2×10⁹Particles/mL，平均值为1.15×10¹⁰Particles/mL；Ctrl@Exo^ldlr组中3个生物学重复得到的外泌体的含量分别为2.6×10⁹Particles/mL、1.7×10⁹Particles/mL和9.5×10⁸Particles/mL，平均值为1.75×10⁹Particles/mL，RCM-Exo^Ldlr组较Exo^Ldlr组中的外泌体产量提高了6.57倍。

3)qPCR检测外泌体装载Ldlr的效率。

以GAPDH作为内参基因，采用常规qPCR检测步骤对外泌体装载Ldlr的效率进行检测，其中检测外泌体装载Ldlr的上游引物为5’-TGACTCAGACGAACAAGGCTG-3’(SEQ ID NO.1)下游引物为5’-ATCTAGGCAATCTCGGTCTCC-3’(SEQ ID NO.2)，结果如图12所示。由以上结果可以得出，采用本发明提供的培养基制备得到的外泌体装载Ldlr的效率与采用常规培养基制备得到的外泌体的装载效率没有差异，证明采用本发明培养基制备得到的外泌体不会影响其本身的装载率。

4)对高脂饲养的Ldlr^-/-小鼠进行治疗，具体步骤如下：

将PBS、收集的RCM@Exo^ldlr和Ctrl@Exo^ldlr组外泌体BCA定量后分别以每克Ldlr^-/-小鼠(江苏集萃药康生物科技股份有限公司；编号：T001464，高脂饲养采用本领域中常规高脂饲养方法)注射10微克外泌体的剂量通过每周左、右交替腹腔给药，并确定每周注射时间(在此治疗中，每周一进行给药治疗)，连续注射8周。

通过肝脏的油红O和血管总动脉的大体油红染色指标对小鼠治疗效果进行验证，其中结果如图13～14所示，其中图13中第一排中的标尺为200μm，放大倍数为5.0×，第二排图片中的标尺为50μm，放大倍数为20.0×；从左到右，PBS、Ctrl@Exo^Ldlr和RCM@Exo^Ldlr分别代表对照组，对照外泌体负载Ldlr组和量产外泌体负载Ldlr组。

采用HE染色法进行毒性分析，结果如图15所示，由图15可以看出，采用PBS、RCM@Exo^ldlr和Ctrl@Exo^ldlr组对对高脂饲养的Ldlr^-/-小鼠进行治疗后，从各个组织中的细胞形态、大小观察无明显差异，说明外泌体无毒副作用。

根据图13～15发现，采用本发明提供的培养基制备得到的外泌体对具有家族性高胆固醇血症的小鼠的治疗效果与普通条件获得的外泌体效果一致，且无毒性。

由以上实施例可以得出：采用本发明提供的试剂对外泌体供体细胞进行培养，可以显著增加外泌体的产量，为采用未添加红细胞膜的常规试剂制备得到的外泌体产量的近7倍，同时，此外泌体装载效率、递送效率以及对疾病的治疗效果并没有受到影响。

尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。

Claims (10)

1.红细胞膜在增加外泌体产量中的应用。

2.一种增加外泌体产量的试剂，其特征在于，所述试剂包括红细胞膜和试剂领域可接受的辅料。

3.根据权利要求2所述的试剂，其特征在于，所述红细胞膜与辅料的质量体积比为20～80μg：1mL。

4.根据权利要求3所述的试剂，其特征在于，所述红细胞膜与辅料的质量体积比为80μg：1mL。

5.根据权利要求2所述的试剂，其特征在于，所述红细胞膜的粒径为0～400nm。

6.根据权利要求2所述的试剂，其特征在于，所述试剂包括培养基或试剂盒。

7.根据权利要求2～6任一项所述的试剂，其特征在于，所述辅料包括细胞培养基。

8.一种增加外泌体产量的方法，其特征在于，采用权利要求2～7任一项所述的试剂培养外泌体供体细胞，收集外泌体。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，将外泌体供体细胞在所述试剂中第一培养12h，将得到的培养组分于无外泌体血清培养基中第二培养，48h后收集外泌体。

10.根据权利要求8或9所述的方法，其特征在于，所述外泌体供体细胞包括AmL12细胞。

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