CN114921378B - 一种屎肠球菌及其复合制剂在缓解溃疡性结肠炎中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种屎肠球菌及其复合制剂在缓解溃疡性结肠炎中的应用，属于微生物技术领域。本发明的屎肠球菌NSP004及其复合制剂能恢复结肠炎小鼠结肠组织的长度与改善溃疡性结肠炎小鼠的结肠萎缩，缓解结肠炎症，调节炎症因子分泌及氧化应激水平，并促进肠道短链脂肪酸的生成，改善菌群功能恢复肠道健康。同时，还能够有效降低结肠炎临床诊断标志物的水平，效果优于临床药物美沙拉嗪。本发明所述的屎肠球菌NSP004及其复合制剂用于制备缓解溃疡性结肠炎的食品、药物组合物、保健品及饲料添加剂，具有非常广泛的应用前景。

Description

一种屎肠球菌及其复合制剂在缓解溃疡性结肠炎中的应用
技术领域
本发明涉及一种屎肠球菌及其复合制剂在缓解溃疡性结肠炎中的应用，属于微生物技术领域。
背景技术
溃疡性结肠炎病变通常位于结肠黏膜层和黏膜下层，累及直肠和乙状结肠，呈连续性分布。临床上以持续的便血、腹痛、里急后重为典型症状，病程长，较难治愈。随着近些年来发病率的增高，而受到广泛的关注和重视，且因传统药物治疗的并发症多，易反复发作，极大的影响了患者的生活质量。通过对UC患者的临床大数据分析显示，肠道菌群结构的异变与UC的发病密切相关，并且影响伴随着结肠炎的发生和发展全过程，因此通过益生菌、膳食纤维等干预可能实现对肠道菌群的有效调节，从而预防和缓解结肠炎。
研究表明肠球菌具有抑制食源性致病菌如金黄色葡萄球菌、单增李斯特菌、大肠杆菌和沙门氏菌等的作用(Xiaoxiao Qiao,Renpeng Du,Yu Wang,Ye Han,ZhijiangZhou.Purification, characterization and mode of action of enterocin,a novelbacteriocin produced by Enterococcus faecium TJUQ1[J].International Journalof Biological Macromolecules,2020,144:151-159)。此外，专利CN113604405A公开了一株屎肠球菌CGMCC No.18047，具有较强的耐酸、耐胆盐、耐高温以及粘附性强等特性，并且显著抑制大肠杆菌和沙门氏菌。
而目前，由于膳食纤维干预可能导致少数腹胀、腹鸣等不适的症状，挖掘一种既能够降解纤维素缓解腹胀、腹鸣症状，又能够有效改善溃疡性结肠炎的肠球菌或其组合物，能够拓宽肠球菌的应用范围，为缓解溃疡性结肠炎的食品、药物组合物、保健品及饲料添加剂的开发提供新思路。
发明内容
本发明总结现有技术的基础尝试，通过大量实验研究，筛选出了一种具有缓解溃疡性结肠炎的屎肠球菌，并证明该菌株以及菌株与果胶的复合剂在动物模型中可降低氧化应激水平，同时调节肠道菌群产短链脂肪酸的水平，帮助重建肠道微生态平衡。进一步考察了其在食品、药物组合物、保健品及饲料添加剂中的应用，在溃疡性结肠炎的干预方面具有重要意义和广阔前景。
本发明提供了一株屎肠球菌(Enterococcus faecium)NSP004，已于2021年1月19日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，保藏编号为GDMCC No:61442。
所述屎肠球菌(Enterococcus faecium)NSP004是从来源于江西南昌地区的健康人体粪便样本中分离得到的，该菌株经测序分析，其16S rDNA序列如SEQ ID NO.1所示，并将测序得到的序列在NCBI中进行核酸序列比对，结果显示，与肠球菌属的核酸序列相似度高达98％，因此，该菌株为屎肠球菌，将其命名为：屎肠球菌(Enterococcus faecium)NSP004。
所述屎肠球菌(Enterococcus faecium)NSP004具有下列性质：
菌体特征：革兰氏阳性球状细菌，无孢子，无鞭毛，直径0.8～1.0μm。
菌落特征：在培养基上形成明显地菌落，直径在0.3～2mm之间，正面形态圆形，中间凸起，边缘整齐，微白，不透明，表面湿润光滑。
生长特性：该菌株为兼性厌氧菌，最适生长温度是36℃～38℃，最适生长pH值为6.6～7.0，在含有葡萄糖的培养基中生长良好，16～24h可进入对数后期或稳定前期。
本发明还提供了上述屎肠球菌(Enterococcus faecium)NSP004在制备预防和/或治疗溃疡性结肠炎的产品中的应用。
在本发明的一种实施方式中，所述产品中，屎肠球菌(Enterococcus faecium)NSP004的活菌数不低于1×106CFU/mL或1×106CFU/g。
在本发明的一种实施方式中，所述产品中还包含益生元。
在本发明的一种实施方式中，所述益生元为果胶，所述果胶的酯化度低于50％，并且果胶在该产品中的添加量不少于总质量的20％。
在本发明的一种实施方式中，所述产品形式为食品、药物组合物、保健品或饲料添加剂。
在本发明的一种实施方式中，所述食品、药物组合物、保健品或饲料添加剂为，含有上述微生物菌剂或复合制剂以及可接受的载体和/或辅料。
在本发明的一种实施方式中，所述可接受的辅料包括一种或多种通常使用的增稠剂、抗氧化剂、酸碱调节剂、乳化剂、防腐剂、填充剂、粘合剂、润湿剂、崩解剂、润滑剂及矫味剂等。
本发明的一种实施方式中，所述填充剂为淀粉、蔗糖、乳糖、硫酸钙和/或微晶纤维素。
在本发明的一种实施方式中，所述粘合剂为纤维素衍生物、藻酸盐、明胶和/或聚乙烯吡咯烷酮。
在本发明的一种实施方式中，所述润湿剂为水、乙醇、淀粉和/或糖浆。
在本发明的一种实施方式中，所述崩解剂为羧甲基淀粉钠、羧丙纤维素、交联羧甲基纤维素、琼脂、碳酸钙和/或碳酸氢钠。
在本发明的一种实施方式中，所述润滑剂为滑石粉、硬脂酸钙、硬脂酸镁、微粉硅胶和/ 或聚乙二醇。
在本发明的一种实施方式中，所述矫味剂为单糖浆、蔗糖、卵磷脂、橙皮糖浆、樱桃糖浆、柠檬、茴香、薄荷油、海藻酸钠、***胶、明胶、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、柠檬酸、酒石酸和/或碳酸氢钠。
在本发明的一种实施方式中，所述食品、药物组合物、保健品或饲料添加剂的剂型，包括颗粒剂、胶囊剂、片剂、丸剂或口服液等剂型。
本发明还提供了一种微生物菌剂，所述微生物菌剂含有上述屎肠球菌(Enterococcus faecium)NSP004或其发酵液，或其提取物。
在本发明的一种实施方式中，所述微生物菌剂中，屎肠球菌(Enterococcusfaecium)NSP004 的活菌数不低于1×106CFU/mL或1×106CFU/g。
本发明还提供了一种复合制剂，所述复合制剂中，包括上述屎肠球菌(Enterococcus faecium) NSP004及益生元。
在本发明的一种实施方式中，所述复合制剂中，屎肠球菌(Enterococcusfaecium)NSP004 的活菌数不低于1×106CFU/mL或1×106CFU/g。
在本发明的一种实施方式中，所述复合制剂中，所述益生元为果胶，所述果胶的酯化度低于50％，并且果胶在复合制剂中的添加量不少于总质量的20％。
本发明还提供了一种产品，所述产品中含有上述屎肠球菌(Enterococcusfaecium)NSP004，或含有上述微生物菌剂，或含有上述复合制剂。
在本发明的一种实施方式中，所述产品中，屎肠球菌(Enterococcus faecium)NSP004的活菌数不低于1×106CFU/mL或1×106CFU/g。
在本发明的一种实施方式中，所述产品中，含有上述复合制剂，所述复合制剂中的益生元为果胶，所述果胶的酯化度低于50％，并且不少于总质量的20％。
在本发明的一种实施方式中，所述产品形式为食品、药物组合物、保健品或饲料添加剂。
在本发明的一种实施方式中，所述食品、药物组合物、保健品或饲料添加剂，含有上述微生物菌剂或复合制剂以及可接受的载体和/或辅料。
在本发明的一种实施方式中，所述可接受的辅料，包括一种或多种通常使用的增稠剂、抗氧化剂、酸碱调节剂、乳化剂、防腐剂、填充剂、粘合剂、润湿剂、崩解剂、润滑剂及矫味剂等。
本发明的一种实施方式中，所述填充剂为淀粉、蔗糖、乳糖、硫酸钙和/或微晶纤维素。
在本发明的一种实施方式中，所述粘合剂为纤维素衍生物、藻酸盐、明胶和/或聚乙烯吡咯烷酮。
在本发明的一种实施方式中，所述润湿剂为水、乙醇、淀粉和/或糖浆。
在本发明的一种实施方式中，所述崩解剂为羧甲基淀粉钠、羧丙纤维素、交联羧甲基纤维素、琼脂、碳酸钙和/或碳酸氢钠。
在本发明的一种实施方式中，所述润滑剂为滑石粉、硬脂酸钙、硬脂酸镁、微粉硅胶和/ 或聚乙二醇。
在本发明的一种实施方式中，所述矫味剂为单糖浆、蔗糖、卵磷脂、橙皮糖浆、樱桃糖浆、柠檬、茴香、薄荷油、海藻酸钠、***胶、明胶、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、柠檬酸、酒石酸和/或碳酸氢钠。
在本发明的一种实施方式中，所述食品、药物组合物、保健品或饲料添加剂的剂型包括颗粒剂、胶囊剂、片剂、丸剂或口服液等剂型。
在本发明的一种实施方式中，所述饲料添加剂的应用方式为：所述微生物菌剂添加量为 0.4％-1.1％(饲料添加量)或0.4％-0.8％(饮用水添加量)；所述复合制剂添加量为0.6％-1.5％ (饲料添加量)或0.6％-1％(饮用水添加量)。
本发明还提供了上述屎肠球菌(Enterococcus faecium)NSP004、上述微生物菌剂或复合制剂在预防和/或治疗溃疡性结肠炎方面的应用。
本发明还提供了上述屎肠球菌(Enterococcus faecium)NSP004、上述微生物菌剂或复合制剂在制备预防和/或治疗溃疡性结肠炎的产品中的应用。
在本发明的一种实施方式中，所述产品为为食品、药物组合物、保健品或饲料添加剂。
有益效果
本发明筛选出了一株能快速利用果胶的屎肠球菌(Enterococcus faecium)NSP004，该菌株或在与果胶复配后能够缓解溃疡性结肠炎，具体体现在：
1)能够降低溃疡性结肠炎小鼠血清中的一氧化氮合成酶(iNOS)水平；
2)能够增加溃疡性结肠炎小鼠的结肠内容物中丁酸的浓度；
3)能够降低溃疡性结肠炎临床诊断标志物-结肠内容物中钙防卫蛋白的水平；
4)本发明的屎肠球菌(Enterococcus faecium)NSP004能够快速利用果胶，采用其同果胶进行复配后得到的复合制剂，能够缓解溃疡性结肠炎，效果优于果胶及阳性药物美沙拉嗪，能够避免某些个体对直接补充果胶等膳食纤维容易出现胀气等症状。
因此，本发明的屎肠球菌(Enterococcus faecium)NSP004可用于制备能够缓解溃疡性结肠炎的食品、药物组合物、保健品或饲料添加剂，具有非常广泛的应用前景。
生物材料保藏
一株屎肠球菌(Enterococcus faecium)NSP004，分类学命名为：Enterococcusfaecium，已于2021年1月19日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No:61442，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，广东省微生物研究所。
附图说明
图1：屎肠球菌(Enterococcus faecium)NSP004在固体培养基上生长的菌落形态。
图2：屎肠球菌(Enterococcus faecium)NSP004在以果胶为唯一碳源培养基中的生长情况。
图3：屎肠球菌(Enterococcus faecium)NSP004及其复合制剂干预溃疡性结肠炎小鼠后一氧化氮合成酶(iNOS)水平的变化。
图4：屎肠球菌(Enterococcus faecium)NSP004及其复合制剂干预溃疡性结肠炎小鼠后结肠内容物中钙防卫蛋白的水平变化。
其中，模型组为DSS结肠炎小鼠组，NSP004为DSS+屎肠球菌NSP004组，NSP004+果胶为DSS+屎肠球菌NSP004+果胶组，果胶为DSS+果胶组，美沙拉嗪为DSS+阳性药物美沙拉嗪组。
“*”表示与模型组(M)具有显著性差异(*：p<0.05；**：p<0.01；***：p<0.001)；“#”表示与正常组(NC)具有显著性差异(#：p<0.05；##：p<0.01；###：p<0.001)。
具体实施方式
下述实施例中所涉及的葡聚糖硫酸钠(DSS)购自MPBio公司，美沙拉嗪颗粒购自法国爱的发制药有限公司。
下述实施例中所涉及的屎肠球菌(Enterococcus faecium)S2PL24、屎肠球菌(Enterococcus faecium)S2PLA27保藏于实验室菌种库中。
下述实施例中所涉及的果胶为酯化度低于50％的果胶，购自CPKelco公司。
下述实施例中所涉及的培养基如下：
脑心浸液BHI液体培养基：脑心浸液BHI液体培养基为青岛海博生物公司产品；将上述产品按说明溶解于蒸馏水中，混合均匀，然后调整其pH为7.0±0.2，115-121℃灭菌15-20min 后，即得到所述液体培养基。
脑心浸液BHI固体培养基：在脑心浸液BHI液体培养基的基础上，加入1.5～2％的琼脂，混合均匀，然后调整其pH为7.0±0.2，115～121℃灭菌15-20min后，即得到所述固体培养基。
肠球菌液体培养基的制备：配制脑心浸液BHI液体培养基(例如青岛海博生物技术有限公司的产品)，溶解于蒸馏水中，混合均匀，然后调整其pH为6.8-7.2，115-121℃灭菌15-20 min后，即得到所述肠球菌液体培养基。
肠球菌固体培养基的制备：按照肠球菌液体培养基的配方，再加入1.5-2％的琼脂，混合均匀，然后调整其pH为6.8-7.2，115-121℃灭菌15-20min后，即得到所述肠球菌固体培养基。
下述实施例中所涉及的溶液的配制方法如下：
3％DSS的灭菌蒸馏水的配制方法为：称取30g的DSS，溶于蒸馏水中，采用高压蒸汽灭菌锅，121℃灭菌15min后，即得到所述3％DSS的灭菌蒸馏水。
下述实施例中所涉及的检测方法如下：
疾病活动指数(DAI)的判断标准如表1所示：
表1疾病活动指数(DAI)评分
注：正常粪便：成形粪便；松散粪便：不黏附于***的糊状、半成形粪便；稀便：黏附于***的稀水样粪便。
下述实施例中所涉及的短链脂肪酸的含量的检测方法：
称取100mg小鼠结肠内容物，加入0.8mL生理盐水，匀浆后，于4℃下14000r离心15min，取上清过膜0.22μm水系滤头。取200μL过膜后的上清，加入0.1mL 50％(v/v)硫酸和400μL***，涡旋后静置2min，4℃，14000r离心1min，取上清通过6890N气相色谱仪测定。
实施例1：屎肠球菌(Enterococcus faecium)NSP004的分离筛选
1、样品采集
采集江西南昌地区的健康人体粪便样本，样本置于保藏管中，保存于装有冰袋的保温盒中，带回实验室后迅速置于-80℃冰箱待分离筛选。
2、屎肠球菌的分离纯化
(1)粪便样品梯度稀释：在无菌厌氧环境中，取约1g步骤1采集到的粪便样本，加入到9mL生理盐水，得到第一梯度稀释液，吸取1mL第一梯度稀释液于9mL生理盐水，得到第二梯度稀释液，以此类推，共配制9个梯度稀释液；
(2)涂布培养：分别吸取100μL上述所有梯度稀释液分别置于肠球菌固体培养基上，涂布后至于37℃厌氧条件下培养48h，得到稀释涂布平板；
(3)纯化培养：挑取肠球菌固体培养基上不同形态的菌落进行划线分离，直至得到边缘整齐，微白，不透明，表面湿润光滑，且形态一致的纯的单菌落(如图1所示)；挑取肠球菌固体培养基上的纯菌落接种于5mL肠球菌液体培养基中，至于37℃厌氧条件下培养24h，得到纯化培养液。
3、菌种保藏与鉴定
将步骤2获得的纯化培养液混匀，在8000rpm条件下离心10min，弃上清得菌体。用细菌16S rDNA引物(见表2)进行PCR。
表2引物名称
PCR产物经核酸电泳分析确认后，扩增产物送至公司进行测序，其16S rDNA序列如SEQ ID NO.1所示，测序结果与NCBI数据库中序列进行比对分析；比对结果发现编号NSP004的菌株为屎肠球菌(Enterococcus faecium)，命名为：屎肠球菌(Enterococcus faecium)NSP004。
实施例2：屎肠球菌(Enterococcus faecium)NSP004对果胶的降解作用
1、以果胶为唯一碳源的培养基配制
按比例称取蛋白胨20g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 5g/L，K2HPO4 0.05g/L，KH2PO40.05 g/L，果胶5g/L，溶解于蒸馏水中，并调整pH至6.8～7.4，121℃灭菌15min后，即得到以果胶为唯一碳源的培养基。
2、实验方法
分别将屎肠球菌(Enterococcus faecium)NSP004、屎肠球菌(Enterococcusfaecium)S2PL24、屎肠球菌(Enterococcus faecium)S2PLA27在脑心浸液BHI固体培养基上划线，长出单菌落后，挑取单菌落接种至步骤1配制得到的以果胶为唯一碳源的培养基进行适应性生长，在37℃下培养18～24h，制备得到种子液；
将上述种子液以2％(v/v)的接种量接种至新的步骤1配制得到的以果胶为唯一碳源的培养基中，在37℃下培养48h，分别在0h、24h、36h、48h测定培养液在λ＝600nm波长下的吸光度，计算不同肠球菌在以果胶为唯一碳源的培养基中的增长量(分别采用24h、36h、48h测定培养液的吸光度-0h测定培养液的吸光度得到)，结果如图2所示。
结果显示，经过48小时的培养，屎肠球菌NSP004的OD600增长量能够达到87.2％，显著高于S2PL24的增长量28.9％及S2PLA27的增长量55.5％。
以上结果表明，本发明的屎肠球菌NSP004相比其它肠球菌能够更加快速高效地利用果胶。
实施例3：屎肠球菌(Enterococcus faecium)NSP004及其复合制剂对溃疡性结肠炎小鼠血清中氧化应激水平的影响
1、屎肠球菌NSP004冻存剂的制备：
(1)培养方法：在无菌环境中，将屎肠球菌NSP004菌种在脑心浸液BHI固体培养基上划线，37℃下培养48h，形成单菌落后，挑取单菌落，并将其接种至脑心浸液BHI液体培养基，在37℃下培养16-24h，制备得到屎肠球菌NSP004种子液。
(2)保护剂的制备：取200～300g甘油，均匀溶解于1L蒸馏水中，115-121℃灭菌15-20 min。
(3)保存方法：将步骤(1)制备得到的屎肠球菌NSP004种子液在4℃下5000rpm离心10min后，取沉淀为屎肠球菌NSP004菌体，将屎肠球菌NSP004菌体用无菌的磷酸盐缓冲液(pH 7.2)清洗1～2次后，采用步骤(2)制备的保护剂重悬屎肠球菌NSP004菌体，得到重悬液，调整重悬液中菌浓为5.0×108CFU/mL，即得所述屎肠球菌NSP004冻存剂，于-80℃保存备用。
2、果胶溶液的制备
根据小鼠体重称取果胶，溶于水后即为果胶溶液。灌胃剂量为每千克小鼠体重300mg果胶，灌胃体积为0.2mL。
3、美沙拉嗪溶液的制备
根据小鼠体重称取美沙拉嗪颗粒(如法国爱的发制药有限公司产品)，溶于质量分数为 5％的羧甲基纤维素钠水溶液后即为美沙拉嗪溶液。灌胃剂量为每千克小鼠体重300mg美沙拉嗪，灌胃体积为0.2mL。
4、实验方法：
取5周龄健康雄性C57BL/6小鼠60只，随机分为六组：正常组、DSS结肠炎组(模型组)、DSS+屎肠球菌NSP004组(NSP004组)、DSS+屎肠球菌NSP004+果胶组(NSP004+果胶组)、DSS+果胶组(果胶组)及DSS+美沙拉嗪组(阳性药物对照组，美沙拉嗪组)，每组含小鼠10只。
小鼠饲养于25±2℃、相对湿度50±5％、12h光照12h黑暗的标准化实验室中，所有小鼠经一周适应期后开始持续14天的实验。
实验流程如表3所示，全程(1～14天)NSP004组小鼠每24小时灌胃一次0.2mL步骤1制备的屎肠球菌NSP004冻存剂(菌浓为5.0×108CFU/mL)，NSP004+果胶组小鼠每24小时各灌胃一次0.2mL步骤1制备的屎肠球菌NSP004冻存剂(5.0×108CFU/mL)和0.2mL步骤2制备的果胶溶液(300mg/kg bw)，果胶组小鼠每24小时各灌胃一次0.2mL步骤2制备的果胶溶液(300mg/kg bw)，美沙拉嗪组小鼠每24小时灌胃一次0.2mL步骤3制备的美沙拉嗪溶液(300mg/kg bw)。第1～7天：所有小鼠均自由饮用灭菌蒸馏水。第8～14天：除正常组小鼠自由饮用灭菌蒸馏水，其余组小鼠均改为自由饮用含3％DSS的灭菌蒸馏水。
表3实验流程
每日监测记录各组小鼠的状态，实验结束后，处死所有小鼠，收集所有小鼠的血清样品，采用ELISA试剂盒(南京森贝伽生物科技有限公司产品)测定一氧化氮合成酶iNOS的浓度，实验结果如图3所示。
结果显示，模型组小鼠血清中一氧化氮合成酶iNOS的浓度从2.40μmol/L(正常组)提高至5.93μmol/L(p<0.001)。
经屎肠球菌NSP004干预后，小鼠血清中一氧化氮合成酶iNOS的浓度降低至3.70μmol/L (p<0.001)。
NSP004+P组小鼠血清中一氧化氮合成酶iNOS的浓度则降低至3.00μmol/L(p<0.001)，并且低于单独果胶干预的P组小鼠血清中一氧化氮合成酶iNOS的浓度(3.33μmol/L)及阳性药物组小鼠血清中一氧化氮合成酶iNOS的浓度(3.36μmol/L)。
以上结果表明，本发明屎肠球菌NSP004及其与果胶的复合物均能够降低溃疡性结肠炎小鼠的氧化应激水平，从而缓解过氧化引起的机体损伤，并且屎肠球菌NSP004与果胶复配制剂的效果优于果胶及临床药物美沙拉嗪。
实施例4：屎肠球菌(Enterococcus faecium)NSP004及其复合制剂对溃疡性结肠炎小鼠结肠内容物中短链脂肪酸的调节作用
具体实施方式同实施例3，在实验结束后，收集所有小鼠的结肠内容物，采用GC技术分别检测其中丁酸的组成变化，实验结果如表4所示。
表4小鼠结肠内容物中丁酸含量(mmol/g)
结果显示，相比正常组小鼠，模型组小鼠结肠内容物中的丁酸从0.1277mmol/g(正常组) 降低至0.0815mmol/g(p<0.01)。经屎肠球菌NSP004干预后，小鼠结肠内容物中的丁酸增加至0.1309mmol/g(p<0.01)，并且高于果胶组小鼠结肠内容物中的丁酸含量(0.1065mmol/g) 及阳性药物组小鼠结肠内容物中的丁酸含量(0.1178mmol/g)。
以上结果表明，本发明屎肠球菌NSP004能够增加溃疡性结肠炎小鼠具有抑炎作用的丁酸含量，其效果优于市售果胶及临床药物美沙拉嗪，起到恢复肠道微生态平衡的作用。同时短链脂肪酸在维持肠道健康、预防和改善多种非传染性疾病方面中发挥了重要作用，推测屎肠球菌NSP004还可以有效预防结肠炎并发症的发生。
实施例5：屎肠球菌(Enterococcus faecium)NSP004及其复合制剂对溃疡性结肠炎诊断标志物的影响。
具体实施方式同实验例3，在实验后处死全部小鼠，收集结肠内容物样本，采用ELISA 试剂盒(安迪生物科技有限公司)其中钙防卫蛋白的含量，实验结果如图4所示。
结果显示，模型组小鼠结肠内容物中的钙防卫蛋白含量从3.37pg/mL(正常组)显著上升18.89pg/mL(p<0.001)。
经屎肠球菌NSP004干预后，小鼠结肠内容物中的钙防卫蛋白含量降低为14.96pg/mL，低于阳性药物美沙拉嗪组小鼠结肠内容物中的钙防卫蛋白含量(16.56pg/mL)。
NSP004+果胶组小鼠结肠内容物中的钙防卫蛋白含量显著降低为10.42pg/mL(p<0.05)，低于单独果胶干预的果胶组小鼠结肠内容物中的钙防卫蛋白含量(11.07pg/mL)及阳性药物美沙拉嗪组小鼠结肠内容物中的钙防卫蛋白含量(16.56pg/mL)。
以上结果表明，本发明的屎肠球菌NSP004及其与果胶的复合物能够降低溃疡性结肠炎临床诊断标志物水平，并且效果优于果胶及临床药物。
实施例6：屎肠球菌(Enterococcus faecium)NSP004菌剂的应用
屎肠球菌NSP004菌剂可用于制备胶囊制品，胶囊制品的具体制备过程如下：
(1)将实施例1获得的屎肠球菌NSP004纯化后的培养液以3％(v/v)的接种量接种到培养基中，37℃培养36h，6000rpm离心20min，收集菌泥；使用无菌水对菌泥进行清洗后，用脱脂乳重悬至浓度为2×1010CFU/mL，得到悬浮液；
(2)将步骤(1)制得的悬浮液添加至浓度为3％的海藻酸钠溶液中至浓度为2×109CFU/mL后，充分搅拌，使得屎肠球菌NSP004的细胞均匀地分散于海藻酸钠溶液中，得到混合液；将混合液挤压到浓度为2％的氯化钙溶液中形成胶粒；待形成的胶粒静止固化30min 后，过滤收集胶粒；将收集得到的胶粒进行冷冻干燥48h，得到粉剂；将粉剂装入到药用胶囊中，得到胶囊制品。
实施例7：屎肠球菌(Enterococcus faecium)NSP004复合制剂的应用
屎肠球菌NSP004复合制剂可用于制备胶囊制品，胶囊制品的具体制备过程如下：
(1)将实施例1获得的屎肠球菌NSP004纯化后的培养液以3％(v/v)的接种量接种到培养基中，37℃培养36h，6000rpm离心20min，收集菌泥；使用无菌水对菌泥进行清洗后，用脱脂乳重悬至浓度为2×1010CFU/mL，得到悬浮液；
(2)将步骤(1)制得的悬浮液添加至浓度为3％的海藻酸钠溶液中至浓度为2×109CFU/mL后，充分搅拌，使得屎肠球菌NSP004的细胞均匀地分散于海藻酸钠溶液中，得到混合液；将混合液挤压到浓度为2％的氯化钙溶液中形成胶粒；待形成的胶粒静止固化30min 后，过滤收集胶粒；将收集得到的胶粒进行冷冻干燥48h，得到粉剂；
(3)将步骤(2)制得的粉剂与果胶粉末一起装入到药用胶囊中，得到胶囊制品。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
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<110> 南昌大学
<120> 一种屎肠球菌及其复合制剂在缓解溃疡性结肠炎中的应用
<130> BAA211685A
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 681
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
atgggggcgg ggcctaatac atgcaaagtc gaacgcttct ttttccaccg gagcttgctc 60
caccggaaaa agaggagtgg cgaacgggtg agtaacacgt gggtaacctg cccatcagaa 120
ggggataaca cttggaaaca ggtgctaata ccgtataaca atcaaaaccg catggttttg 180
atttgaaagg cgctttcggg tgtcgctgat ggatggaccc gcggtgcatt agctagttgg 240
tgaggtaacg gctcaccaag gccacgatgc atagccgacc tgagagggtg atcggccaca 300
ttgggactga gacacggccc aaactcctac gggaggcagc agtagggaat cttcggcaat 360
ggacgaaagt ctgaccgagc aacgccgcgt gagtgaagaa ggttttcgga tcgtaaaact 420
ctgttgttag agaagaacaa ggatgagagt aactgttcat cccttgacgg tatctaacca 480
gaaagccacg gctaactacg tgccagcagc cgcggtaata cgtaggtggc aagcgttgtc 540
cggatttatt gggcgtaaag cgagcgcatg cggtttctta agtctgatgt gaaagccccc 600
ggctcaaccg gggagggtca ttggaaactg ggagacttga gtgcagatta tgagagtgga 660
atttcttgtg tagtgtgcga c 681

Claims (8)

1.一株屎肠球菌（Enterococcus faecium）NSP004，已于2021年1月23日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，保藏编号为GDMCCNo: 61442。
2.一种复合制剂，其特征在于，所述复合制剂中含有权利要求1所述的屎肠球菌及益生元，所述益生元为果胶。
3.如权利要求2所述的复合制剂，其特征在于，所述的复合制剂中，屎肠球菌NSP004的活菌数不低于1×106 CFU/mL或1×106 CFU/g；所述果胶的酯化度低于50%，所述果胶的添加量不少于总质量的20%。
4.一种包含权利要求1所述的解屎肠球菌NSP004，或权利要求2-3任一项所述的复合制剂的产品。
5.如权利要求4所述的产品，其特征在于，所述产品为微生物菌剂、食品、药物组合物、保健品或饲料添加剂。
6.如权利要求4或5所述的产品，其特征在于，所述产品中，屎肠球菌NSP004的活菌数不低于1×106 CFU/mL或1×106 CFU/g。
7.权利要求1所述的屎肠球菌NSP004，或权利要求2或3所述的复合制剂在制备预防和/或治疗溃疡性结肠炎的产品中的应用。
8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述产品为药物组合物或饲料添加剂。
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