CN114929856A

CN114929856A - Ipsc衍生的肺泡细胞的高通量培养

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Publication number: CN114929856A
Application number: CN202080091135.7A
Authority: CN
Inventors: H·C·奥特; S·杰夫斯
Original assignee: General Hospital Corp
Current assignee: General Hospital Corp
Priority date: 2019-10-30
Filing date: 2020-10-30
Publication date: 2022-08-19
Also published as: WO2021087354A1; US20220372446A1; AU2020373099A1; EP4051783A1; JP2022553792A; CA3159195A1

Abstract

本文提供能够扩展将干细胞衍生的肺泡上皮细胞(AEC)扩增至与大型动物或人全肺工程相匹配的数量的漂浮型水凝胶液滴培养方法、以及用于产生所述液滴的模具及其使用方法。

Description

IPSC衍生的肺泡细胞的高通量培养

优先权声明

本申请要求2019年10月30日提交的美国临时申请系列号62/927,797和2019年12月9日提交的62/945,834的权益，将前述的全部内容在此通过引用并入本文。

技术领域

本文提供能够扩展将干细胞衍生的肺泡上皮细胞(alveolar epithelial cell,AEC)扩增至与大型动物或人全肺工程相匹配的数量的漂浮型水凝胶液滴培养方法、以及用于产生液滴的模具及其使用方法。

背景技术

诱导性多能干细胞衍生的肺泡上皮细胞(iPSC-AEC)是用于人肺上皮的生物工程的患者特异性细胞来源。疾病建模和治疗应用需要具有成本效益且技术上可行的分化和扩增方案。

发明内容

本文提供能够扩展将干细胞衍生的肺泡上皮细胞(AEC)扩增至与大型动物或人全肺工程相匹配的数量的漂浮型水凝胶液滴培养方法。通过培养扩增和仿生肺培养二者证明了稳定细胞表型。这些方法可用于人类规模的全器官肺产生。

因此，本文提供了产生扩增的肺泡上皮细胞(AEC)群体的方法。所述方法包括(a)提供第一AEC群体；(b)将第一AEC群体混合至水凝胶前体；(c)使得或促进水凝胶前体凝胶化以形成液滴；和(d)在足以扩增第一群体的运动培养基(moving media)中悬浮培养液滴，从而产生扩增的AEC群体。在一些实施方案中，在步骤(b)后，所述方法包括将混合物转移至如本文所述的模具装置，然后，在步骤(c)中的水凝胶前体凝胶化后，从模具装置移除液滴。

在一些实施方案中，第一AEC群体包括诱导性多能干细胞(iPSC)衍生的AEC。

在一些实施方案中，iPSC衍生的AEC是通过包括以下的方法获得的：提供初始iPSC群体；将所述iPSC在足以用于定型内胚层分化(definitive endodermaldifferentiation)的条件下培养、接着在足以用于前化内胚层分化(anteriorizedendodermal differentiation)的条件下培养、然后在足以用于腹侧化内胚层分化(ventralized endodermal differentiation)的条件下培养，从而获得iPSC衍生的AEC的群体。

在一些实施方案中，液滴的最大直径为2-10mm。

在一些实施方案中，水凝胶是天然或合成水凝胶支架。在一些实施方案中，天然水凝胶支架包括细胞外基质(ECM)、胶原、纤维蛋白、骨涎蛋白、玻连蛋白、藻酸盐、或层粘连蛋白。在一些实施方案中，合成水凝胶支架包括选自以下的合成聚合物支架：聚(2-(甲基丙烯酰氧基)乙基二甲基-(3-磺丙基)氢氧化铵)(PMEDSAH)、聚丙烯酰胺(PAM)、聚(4-苯乙烯磺酸钠)(PSS)、聚(甲基乙烯基醚-alt-马来酸酐)、和聚(乙二醇)(PEG)水凝胶。

在一些实施方案中，使得或促进水凝胶的凝胶化包括提供足以引发水凝胶支架的交联的温度、化学品、或光。

在一些实施方案中，运动培养基是旋转或流动培养物。

在一些实施方案中，扩增的AEC群体包括表达Nkx2.1和水通道蛋白5(AQP5)或表面活性蛋白C(SPC)的细胞。

本文还提供了通过本文所述方法产生的扩增的AEC群体。

此外，本文提供了用于提供生物人工肺器官的方法。所述方法包括提供通过本文所述方法产生的扩增的AEC群体；提供包括气道和脉管***的(无细胞)肺组织基质(例如，来自人或猪)；通过气道用扩增的AEC群体接种肺组织基质、通过脉管***用内皮细胞接种肺组织基质、和通过气道和脉管***的一者或两者用间充质细胞接种肺组织基质；和将基质维持在足以形成气道中的功能性上皮和功能性脉管***的条件下。本文还提供了通过本文所述方法产生的生物人工肺器官。

此外，本文提供一种模具装置，其包括：包括聚合物材料的模具主体，所述模具主体限定第一模腔和第二模腔，所述第一和第二模腔各自具有0.5mm和5mm之间的半径并配置成接收组合物，所述模具主体还限定沿贯穿所述第一和第二模腔的纵轴延伸的第一通道，其中所述第一通道由配置成限制所述第一和第二模腔中的组合物的体积量的深度尺寸所限定。在一些实施方案中，聚合物材料为柔性的。还提供了一种模具装置，其包括：限定多个模腔的柔性主体，所述多个模腔形成包括至少第一行和第二行的阵列图案，其中各行包括分别沿第一和第二纵轴排列的至少两个以上的模腔，所述第一和第二纵轴以分隔距离彼此间隔，其中各模腔配置成形成半球形组合物，并且所述模腔各自具有0.5mm和5mm之间的半径并配置成接收组合物，其中所述模腔由配置成限制所述第一和第二模腔中的组合物的体积量的深度尺寸所限定。

在一些实施方案中，柔性主体由聚合物材料形成。

在一些实施方案中，柔性材料选自由有机硅和聚氨酯组成的组。在一些实施方案中，聚合物材料包括聚二甲基硅氧烷(PDMS)。

在一些实施方案中，各模腔(例如，各模腔的底部)由半球形表面限定。在一些实施方案中，各模腔配置成形成球形组合物或半球形组合物。在一些实施方案中，第一通道从模具主体的一侧边缘延伸至第二相对侧边缘。

在一些实施方案中，深度尺寸配置成将各模腔中的组合物的体积限制为约50μL至约150μL的最大体积量。

本文还提供了用于形成成形凝胶组合物的方法，所述方法包括：将组合物添加至如本文所述的模具装置的模腔，所述组合物为含有生物制剂(biologic)的液体；在模具的模腔中形成多个半固体或固体组合物；和从模具的模腔移除所述半固体或固体组合物。

在一些实施方案中，液体是水凝胶前体，和生物制剂包括细胞。

在一些实施方案中，半固体或固体组合物是水凝胶。

在一些实施方案中，移除步骤包括弯曲模具的主体。

在一些实施方案中，半固体或固体组合物例如在旋转培养中保持预定形状至少1天、至少5天、或至少10天。

在一些实施方案中，半固体或固体组合物为球形或半球形。

除非另外特别指出，否则本文所用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域普通技术人员通常所理解的相同的含义。本文描述了用于本发明的方法和材料；也可使用本领域已知的其它的合适的方法和材料。材料、方法、和实例仅为说明性的并不旨在进行限制。本文提及的所有出版物、专利申请、专利、序列、数据库条目、和其它参考文献以其全部引入以作参考。在冲突的情况下，本说明书，包括限定，将占主导。

本发明的其它特征和优点将从以下详细描述和附图、以及从权利要求书中显而易见。

附图说明

图1.显示12孔板中载细胞MATRIGEL液滴的MATRIGEL贴壁型液滴培养方法。

图2A-F.iPSC-AEC扩增后培养组的比较。(A)漂浮型液滴法(n＝4)和贴壁型液滴法(n＝4)之间每Matrigel液滴的培养细胞产量的比较表明由漂浮型液滴培养方法的显著较大的细胞扩增。(B)扩增期后即刻，来自各液滴培养方法的细胞中的相对Ki67基因表达显示由漂浮型液滴培养方法的Ki67基因表达的显著增加(p＝0.33)。(C)扩增后，定量PCR比较培养方法之间Nkx2.1和SPC的相对基因表达。贴壁型液滴培养(板培养)表明显著较高的Nkx2.1基因表达(p＝0.041)，同时培养方法之间有类似的SPC基因表达。(D-F)分别在4x、20x、和40x放大率下的、来自漂浮型液滴培养的iPSC衍生的肺泡细胞(alveolarpneumocyte)的H&E染色图像表明自发形成称为肺泡球(alveolar sphere)的球形细胞形态。数据表示为平均值±SEM。

图3A-D.扩增后iPSC-AEC的表型比较。(A)来自贴壁型液滴培养方法的iPSC-AEC的流式细胞术分析表明保留的Nkx2.1和SPC表达。(B)来自漂浮型液滴培养方法的iPSC-AEC的流式细胞术分析表明与贴壁型液滴培养细胞类似的表型。(C-D)分别来自贴壁型液滴和漂浮型液滴培养方法的iPSC-AEC的流式细胞术分析表明对于任一培养条件无可察觉的AQP5表达。

图4A-J.仿生肺培养后组织蛋白表达和组织学外观。(A)通过IHC染色后的每细胞的组织荧光测定的Nkx2.1蛋白表达表明了任一组(每组n＝5)中的肺之间无显著差异。(B)通过IHC染色后的每细胞的组织荧光测定的SPC蛋白表达表明了由漂浮型液滴细胞培养的肺中显著降低的SPC表达(p<0.01)。(C)通过IHC染色后的每细胞的组织荧光测定的AQP5蛋白表达表明了由漂浮型液滴细胞培养的肺中显著增加的AQP5表达(p<0.001)。(D-F)仿生肺培养后来自由漂浮型液滴细胞培养的肺的分别对于Nkx2.1、SPC、和AQP5的IHC染色图像。蓝色原子核染色用于各图像。(G)扩增期后即刻(来自图2，呈现在此用于直接比较)、仿生肺培养的第6天、和仿生肺培养的第12天的来自各液滴培养方法的细胞中的相对Ki67基因表达，表明了Ki67表达随着细胞进展在仿生肺培养期内持续增加。(H-J)分别在4x、20x、和40x放大率下的、仿生肺培养后来自由漂浮型液滴细胞培养的肺的H&E染色图像。数据表示为平均值±SEM。

图5A-D.来自仿生肺培养的条件培养基分析。(A)仿生肺培养期间培养基碳酸氢盐的变化显示所有时间点处类似的碳酸氢盐消耗。(B)来自仿生肺培养的培养基中观察到的乳酸(lactate)产生显示所有时间点处类似的乳酸产生。(C)仿生肺培养中葡萄糖消耗显示所有时间点处类似的葡萄糖消耗。(D)在仿生肺培养的第6天和第12天通过刃天青试验(resazurin assay)测定的细胞代谢活性表明接种在来自两种培养方法的肺支架上的细胞的类似的细胞代谢活性。数据表示为平均值±SEM。

图6A-D.描述的漂浮型液滴培养方法的合理性。(A)每载细胞Matrigel液滴的培养细胞产量的比较表明，与由高速机械刺激(35RPM搅拌，SP35)的培养相比，由无机械刺激的漂浮型液滴培养方法的显著较大的细胞扩增，但细胞仍比由中等机械刺激时较少(参见图3)。(B)在由贴壁型液滴培养方法扩增后的iPSC-衍生的肺泡细胞的流式细胞术分析表明扩增后保留的Nkx2.1和SPC表达(包括来自图3a的用于直接比较)。(C)在由无机械刺激或搅拌的漂浮型液滴培养方法扩增后的iPSC-衍生的肺泡细胞的流式细胞术分析表明扩增后Nkx2.1和SPC表达。(D)在由具有高速(35RPM)机械刺激的漂浮型液滴培养方法扩增后的iPSC-衍生的肺泡细胞的流式细胞术分析表明扩增后降低的Nkx2.1和SPC表达。

图7是用于自人iPSC产生和表征肺泡球的方法的示例性说明。在该实例中，使用BU3-NGST hiPSC(Nkx2.1-GFP，SPC-TdTomato)细胞。

图8A-8D显示示例性模具装置。具体地，图8A提供模具的透视图。图8B和8C分别提供了模具的俯视图和侧视图。图8C提供了模具的截面图。

图9A-9F显示本文所述模具装置的各种实例的图像。图9A显示具有100uL的孔的柔性12孔聚二甲基硅氧烷(PDMS)模具，设计用于载细胞水凝胶液滴形成用于漂浮型培养方法。图9B-9D提供设计用于重复移液和快速填充的96孔模具的图像；用于液滴形成的该示例性的96孔模具为96孔构造，这可用于多通道移液使用。图9D显示在无菌模具内固化的液体凝胶。模具展示了96个液滴，在6mm直径孔内各100μL。其后，将模具置于37℃培养箱20分钟以允许水凝胶固化。图9E显示已从模具移除的水凝胶球。图9F显示在细胞培养基中含有载细胞水凝胶漂浮型液滴的具有磁性搅拌棒的烧瓶；球形水凝胶液滴在旋转培养中在7天内维持球形。

具体实施方式

当前，在美国超过1300名患者在等待救命的肺移植(1)。这1300名患者中，约300名患者将在等待肺移植的过程中死亡(2)。接受肺移植的幸运的患者仍需要加强的免疫抑制，这与显著的发病率有关(3)。利用患者特异性细胞群的用于增强或替代的肺生物工程具有为供体肺提供替代物并解决供体器官短缺和免疫抑制需求二者的潜力。

旨在替代气体交换组织的任何疗法，无论是器官工程还是细胞疗法的递送，都依赖于是否有足够数量的人肺上皮细胞。需要数十亿的来自诱导性多能干细胞(iPSC)的远端肺上皮细胞以充分再细胞化整个器官肺构建体。可利用iPSC向肺谱系定型细胞的定向分化来满足该需求。我们实验室改编了最近公开的方案以通过定向分化和荧光分选已基因修饰以携带荧光肺谱系标志物的iPSC谱系，可再生产地产生II型肺泡上皮细胞(AEC)(4-6)。所得细胞在包封在贴壁型3D Matrigel液滴内时形成肺泡球，从而由人iPSC产生II型AEC(iPSC-AEC)。II型肺泡细胞分泌表面活性物质，所述表面活性物质通过降低水系表面张力而支持肺泡维持，并且所述II型肺泡细胞还起到用于促进气体交换的I型肺泡细胞的储蓄祖细胞群的作用(7)。

先前报道了大鼠或人肺的灌注-去细胞化以产生适用于由iPSC-AEC再细胞化的细胞外基质(ECM)支架(8,9)。将这一概念推广至人肺需要约105亿个上皮细胞(10)。在培养时间和资源方面，确立的贴壁型水凝胶液滴培养(4)限制了目前大规模器官再细胞化的能力。

本文所述的方法是用于可扩展用于大型动物或人肺生物工程的iPSC-AEC扩增的简单易懂的细胞培养方法。Matrigel已知支持iPSC-AEC的分化和增殖，但存在与其使用相关的挑战(8,9,14)。Matrigel仅在低温下为液态并且在37℃下快速经历凝胶转变(geltransition)，使得难以对其进行处理(14)。与其中花费90秒来形成各液滴的前述方法相比，本方法加速液滴形成、同时维持三维液滴结构(4)。此外，漂浮型液滴法允许较大的细胞扩增。这是对先前所述的iPSC-AEC培养方法的改进，减少了劳动力和物理材料花费，同时增加细胞产量。

本方法可扩展至各种细胞大小。对于不同应用，容易地增加或减小漂浮型液滴培养容器或培养基的体积。培养方法可对于商业应用的大型iPSC衍生的细胞农场为自动化的。该漂浮型液滴培养***中的细胞的表型稳定性是重要的。扩增iPSC衍生的细胞时的明显问题是转分化。在来自两种培养方法的细胞之间证实了类似的代谢活性和SPC表达，而在漂浮型液滴培养中看到细胞培养产量和增殖标志物(Ki67表达)二者的显著增加。对来自漂浮型液滴培养的细胞的组织学检查也保留了自发形成肺泡球状体的偏好。当这些细胞接种在天然ECM仿生肺培养物上时，它们以具有类似代谢活性的柱状上皮细胞适当地生长在远端气道，如通过刃天青试验和生化标志物碳酸氢盐、乳酸、和葡萄糖所证明的。

引发iPSC-AEC分化

对于iPSC-衍生的I型AEC的可靠分化无确立的方案。Yamamoto等描述了在描述II型AEC分化方案时附带鉴定的iPSC-衍生的I型AEC的亚群，但这属于非常小部分的分化细胞(15)。本研究中一个有趣的发现是仿生肺培养组织中SPC和AQP5表达的差异。

干细胞衍生的肺泡细胞的产生方法

本文提供了用于干细胞衍生的肺泡细胞的产生的可扩展性方法。所述方法包括在使用本文所述方法形成的matigel液滴中培养细胞。

本方法可使用起始的干细胞群进行，所述干细胞为例如来自人胚胎干细胞系(例如，H9、H1)或胚胎干细胞样(ESC样)诱导性多能干细胞(iPSC)的细胞，例如由使用本文所述方法处理的受试者自体的原代细胞产生的。可使用例如气道基底细胞、谱系阴性肺祖细胞、俱乐部细胞(club cell)或II型肺泡细胞。

本领域已知产生iPSC的方法。在一些实施方案中，产生hiPSC的方法可包括获得来自受试者、例如患有PD或需要PD的治疗的受试者的原代体细胞的群体。优选受试者为哺乳动物，例如人。在一些实施方案中，体细胞为成纤维细胞。成纤维细胞可例如使用已知的活组织检查方法等从哺乳动物体内的***获得，例如从皮肤，例如来自眼睑、耳后、伤疤(例如腹部剖腹产手术)、或腹股沟的皮肤获得(参见，例如，Fernandes等,Cytotechnology.2016Mar；68(2):223–228)。用于hiPSC的体细胞的其它来源包括头发角质化细胞(Raab等,Stem Cells Int.2014；2014:768391)、血细胞、或骨髓间充质干细胞(MSC)(

等,Eur Heart J.2013Sep；34(33):2618-29)。在一些实施方案中，原代细胞(例如，成纤维细胞)暴露于足以诱导重编程为iPSC的因子(在足以诱导重编程为iPSC的因子的存在下培养)。外周血衍生的单核细胞可分离自患者血液样品并用于产生诱导性多能干细胞。在其它实例中，诱导性多能干细胞可通过用优化Oct4、Sox2、Klf4、c-MYC与小分子如转化生长因子β(SB431542)、MEK/ERK(PD0325901)和Rho-激酶信号传导(噻唑维素(Thiazovivin))的高共表达的构建体重编程获得。参见Groβ等,Curr Mol Med.13:765-76(2013)和Hou等,Science 341:651:654(2013)。由干细胞产生内皮细胞的方法综述于Reed等,Br J Clin Pharmacol.2013Apr；75(4):897-906。脐带血干细胞可分离自新鲜或冷冻脐带血。间充质干细胞可分离自例如原始未纯化的骨髓或ficoll纯化的骨髓。根据本领域已知的方法，上皮细胞和内皮细胞可分离并收集自活供体或尸体供体，例如来自将接受生物人工肺的受试者。例如，上皮细胞可获得自皮肤组织样品(例如，钻取式活组织检查)，内皮细胞可获得自脉管组织样品。

尽管可使用用于编程的其它方案(例如，如本领域中已知的或本文所述的)，在优选实施方案中，本方法可包括引入(在细胞内接触或表达)四种转录因子，即Oct4、Sox2、Klf4、和L-Myc，俗称山中4因子(Yamanaka 4factors,Y4F)。参见，例如Takahashi和Yamanaka,Cell.2006；126(4):663–676；Takahashi等,Cell.2007；131(5):861–872；Yu等.Science.2007；318(5858):1917–1920；Park等,Nature.2008；451(7175):141–146。在一些实施方案中，方法还包括在细胞内接触或表达一种以上的miRNA，例如，(i)至少一种miR-302簇成员和(ii)至少一种miR-200簇成员，参见US 20160298089和Song等,J ClinInvest.2020；130(2):904-920。

干细胞的起始群体通过定向分化分化为肺泡上皮细胞(AEC)，例如如图7中所示。首先，在TGFb拮抗剂(例如，A8301)和BMP拮抗剂(例如，IWR-1)的存在下，细胞经历定型内胚层分化约4天，接着经历约4天的前化内胚层分化。然后，在生长因子如成纤维细胞生长因子如FGF-7和FGF-10、和GSK3抑制剂/WNT通路激活剂(例如，CHIR99021)的存在下，细胞经历腹侧化内胚层分化约7天。下表A和B提供许多用于分化的替代方案；用于下文中实施例中的示例性方案表明为优选方案。

表A.基础培养基

表B.诱导因子

1:Mou,H.,Zhao,R.,Sherwood,R.,Ahfeldt,T.,Lapey,A.,Wain,J.,Sicilian,L.,Izvolsky,K.,Lau,F.H.,Musunuru,K.and Cowan,C.,2012.Generation of multipotentlung and airway progenitors from mouse ESCs and patient-specific cysticfibrosis iPSCs.Cell stem cell,10(4),pp.385-397.

2:Huang,S.X.,Islam,M.N.,O'neill,J.,Hu,Z.,Yang,Y.G.,Chen,Y.W.,Mumau,M.,Green,M.D.,Vunjak-Novakovic,G.,Bhattacharya,J.and Snoeck,H.W.,2014.Efficient generation of lung and airway epithelial cells from humanpluripotent stem cells.Nature biotechnology,32(1),pp.84-91.

3:Jacob,A.,Morley,M.,Hawkins,F.,McCauley,K.B.,Jean,J.C.,Heins,H.,Na,C.L.,Weaver,T.E.,Vedaie,M.,Hurley,K.and Hinds,A.,2017.Differentiation ofhuman pluripotent stem cells into functional lung alveolar epithelialcells.Cell stem cell,21(4),pp.472-488.

4:Dye,B.R.,Hill,D.R.,Ferguson,M.A.,Tsai,Y.H.,Nagy,M.S.,Dyal,R.,Wells,J.M.,Mayhew,C.N.,Nattiv,R.,Klein,O.D.and White,E.S.,2015.In vitro generationof human pluripotent stem cell derived lung organoids.elife,4,p.e05098.

这些步骤例如在培养皿中使用标准培养方法进行。腹侧化后，可将细胞进行荧光激活细胞分选(FACS)用于纯化；例如在表达报告蛋白的细胞中，可使用报告蛋白(本文例示了Nkx2.1-GFP阳性细胞的分选)。

然后，将细胞混合于天然或合成水凝胶支架，例如包括天然细胞外基质(ECM)，例如MATRIGEL(Corning,Corning,NY)、GELTREX无LDEV低生长因子基底膜基质(LDEV-FreeReduced Growth Factor Basement Membrane Matrix)(GIBCO/ThermoFisher)、或CULTREX基底膜提取物(Basement Membrane Extract,BME)(Trevigen)；天然支架，包括胶原(例如，和IV型胶原)、纤维蛋白、骨涎蛋白、玻连蛋白(例如，玻连蛋白XFTM(STEMCELLTechnologies)、藻酸盐、或层粘连蛋白；合成聚合物支架，例如包括聚(2-(甲基丙烯酰氧基)乙基二甲基-(3-磺丙基)氢氧化铵)(PMEDSAH)、聚丙烯酰胺(PAM)、聚(4-苯乙烯磺酸钠)(PSS)、聚(甲基乙烯基醚-alt-马来酸酐)、或聚(乙二醇)(PEG)水凝胶(例如，光交联或酶交联的PEG-乙烯基砜(PEG-VS)、具有半胱氨酸侧翼的MMP敏感交联的光聚合性PEG硫醇-烯水凝胶支架、或MMP可降解的RGD-功能化PEG水凝胶支架因子-XIIa-介导的交联肽-功能化PEG单体)、或其组合。在一些实施方案中，包含附加的因子如硫酸乙酰肝素如基底膜聚糖(perlecan)，或肽用于促进细胞生长或粘附至合成或天然支架，例如，层粘连蛋白衍生肽(YIGSR)或纤连蛋白衍生Arg-Gly-Asp(RGD)肽、线性或环化(环(Arg-Gly-Asp-d-Phe-Lys)(cRGDfK))，例如SYNTHEMAX，一种由RGD功能化的合成玻连蛋白支架(Corning)。本领域已知许多合适的支架。参见，例如

和García,Matrix Biol.2017Jan；57-58():324-333；Murrow等,Development.2017；144:998–1007；Murphy等,Nat Mater.2014；13:547–557；Nguyen等,Nat Biomed Eng.2017；1:0096；和Aisenbrey和Murphy,Nature ReviewsMaterials 5:539–551(2020)，和其中引用的参考文献。在一些实施方案中，水凝胶支架组合物包括一种以上的生长因子，例如VEGF、FGF(例如，bFGF)、TGFβ抑制剂、kir、Wnt抑制剂。

将细胞混入水凝胶支架前体(例如，液态或半液态，即足够流动以易于转移)，然后将混合物转移至如本文所述的液滴模具，使得或促进凝胶化，例如通过引发对所选水凝胶支架的适当交联。水凝胶具有足以维持形成的液滴的形状的弹性和剪切模量(刚性)。

液滴为三维的。在一些实施方案中，液滴为大致球形体、卵形体、圆柱体、立方体、或长方体。在一些实施方案中，液滴的体积为约50-150μL。在一些实施方案中，液滴的直径或宽度为1-10mm，例如3-9mm、5-7mm、或约6mm。在一些实施方案中，液滴各自包含约1,000-50,000个细胞，例如约10,000-30,000个，例如约20,000个细胞。

凝胶化后，将液滴从模具移除并置于足以支持细胞的扩增的培养基中的悬浮培养物，例如旋转或流动培养物。液滴可在培养中维持足够长的时间以允许细胞群体增殖(扩增)至期望的水平。

使用方法

扩增的细胞群体可用于例如移植方案。细胞可直接移植、或可用于再细胞化整个或部分器官肺构建体。本领域已知用于制备肺构建体的方法，参见，例如，US 20170326273；US 20170073645；US 10,624,992。

例如，细胞可用于接种肺组织基质，例如通过气道(气管)管线(上皮细胞)引入至基质。例如，可以以任何合适的细胞密度用体外扩增的AEC接种组织基质。此外，可通过气道用AEC接种包括气道和脉管***的基质、通过脉管***用内皮细胞接种包括气道和脉管***的基质、和通过气道和脉管***的一者或两者用间充质细胞接种包括气道和脉管***的基质。例如，用于接种基质的细胞密度可为至少1x10³个细胞/克基质。细胞密度的范围可在约1x10⁵至约1x10¹⁰个细胞/克基质之间(例如，至少100,000、1,000,000、10,000,000、100,000,000、1,000,000,000、或10,000,000,000个细胞/克基质)。

在一些情况下，例如通过重力流或灌注接种，如本文所提供的去细胞化或人工肺组织基质可接种有如上所述的细胞类型和细胞密度。例如，流动灌注***可用于通过保留在组织基质中的脉管***(例如，通过动脉管)接种去细胞化肺组织基质。在一些情况下，可在适当的条件下使用自动流动灌注***。这样的灌注接种方法可改善接种效率和提供整个组合物中更均匀的细胞分布。定量生化和图像分析技术可用于在静态或灌注接种方法后评价接种的细胞的分布。

在一些情况下，可以用一种以上的生长因子浸渍或灌注组织基质以刺激接种的细胞的扩增。例如，可用适于本文所提供的方法和材料的生长因子浸渍或灌注组织基质，例如，血管内皮生长因子(VEGF)、TGF-β生长因子、骨形态发生蛋白(例如，BMP-1、BMP-4)、血小板来源的生长因子(PDGF)、碱性成纤维细胞生长因子(b-FGF)如FGF-10、***(IGF)、表皮生长因子(EGF)、或生长分化因子-5(GDF-5)。参见，例如Desai和Cardoso,Respire.Res.3:2(2002)。可包封这些生长因子从而控制瞬时释放(temporal release)。可以用不同的生长因子增强支架的不同部分从而增加生长因子刺激的空间控制。在本方法中，可用notch抑制剂如γ分泌酶抑制剂灌注接种气道的细胞。

可以在接种后培养接种的组织基质一段时间(例如，从几小时至约14天或更多)以改善组织基质中细胞的粘附和渗透。可在其中可使至少一些再生细胞在无细胞组织基质内和无细胞组织基质上增殖和/或分化的条件下维持接种的组织基质。这样的条件可包括但不限于，合适的温度(35-38摄氏度)和/或压力(例如，大气压)、电和/或机械活性(例如，经由正压或负压通气，其中呼气末正压(positive end expiratory pressure)为1-20cmH₂O、平均气道压为5-50cmH₂O、和吸气峰压(peak inspiratory pressure)为5-65cmH₂O)、合适的气体如O₂(1-100％FiO₂)和/或CO₂(0-10％FiCO₂)、合适量的湿度(10-100％)、和无菌或接近无菌条件。这样的条件还可包括湿式通气、湿式至干式通气和干式通气。在一些情况下，可以将营养补充剂(例如，营养物和/或碳源如葡萄糖)、外源激素、或生长因子添加至接种的组织基质。在优选实施方案中，将notch抑制剂如γ分泌酶抑制剂添加至通过气道接种的细胞(参见，例如，美国专利号10,624,992)。可以进行组织学和细胞染色以检验接种细胞的保留和增殖。可进行任何合适的方法以检验接种细胞分化。通常，本文所述的方法将在例如如本文所述的气道器官生物反应器装置中进行。

因此，本文所述的方法可用于产生可移植的生物人工肺组织，例如，用于移植至人受试者中。如本文所述，可移植的组织将优选保留足够完整的脉管***，其可以与患者的脉管***连接。

本文所述的生物人工肺组织可以与包装材料组合以产生制品或试剂盒。公知用于生产制品的组分和方法。除了生物人工组织以外，制品或试剂盒可进一步包括，例如，一种以上的抗粘合剂(anti-adhesive)、无菌水、药物载体、缓冲液、和/或用于促进体外和/或移植后功能性肺组织的发育的其它试剂。此外，此类制品中可包含描述可如何使用其中含有的组合物的印刷说明。制品或试剂盒中的组分可包装在各种合适的容器中。

前述所有的全部公开内容在此通过引用并入本文。

生物人工肺的使用方法

本文还提供使用生物人工肺组织和在一些情况下促进肺功能的方法和材料。在一些实施方案中，本文提供的方法可用于恢复具有损害或降低肺容量的疾病(例如，囊性纤维化病、COPD、肺气肿、肺癌、哮喘、肺动脉高压、肺创伤，或其它遗传性或先天性肺异常，例如支气管囊肿、肺发育不全和低常增生(pulmonary agenesis and hypoplasia)、多肺泡叶、肺泡毛细血管发育异常、隔离症包括动静脉畸形(AVM)和弯刀综合征、肺***扩张(pulmonary lymphangiectasis)、先天性肺叶性肺气肿(CLE)、和囊性腺瘤样畸形(CAM)和其它肺囊肿)的患者中的一些肺功能。本文提供的方法还包括如下的那些，其中受试者鉴定为需要特定的规定治疗，例如升高的肺功能、或增加或改善的肺容量。

可根据本文提供的方法产生生物人工肺组织(例如，完整器官或其部分)。在一些实施方案中，所述方法包括将如本文所提供的生物人工肺组织移植至有需要的受试者(例如，人类患者)。在一些实施方案中，将生物人工肺组织移植至患病或受损组织的部位。例如，生物人工肺组织可移植至受试者的胸腔，替换(或配合)不发挥功能或发挥功能不良的肺；本领域已知用于进行肺移植的方法，参见，例如Boasquevisque等,SurgicalTechniques:Lung Transplant and Lung Volume Reduction,Proceedings of theAmerican Thoracic Society 6:66-78(2009)；Camargo等,Surgical maneuvers for themanagement of bronchial complications in lung transplantation,Eur JCardiothorac Surg2008；34:1206-1209(2008)；Yoshida等,“Surgical Technique ofExperimental Lung Transplantation in Rabbits,”Ann Thorac Cardiovasc Surg.11(1):7-11(2005)；Venuta等,Evolving Techniques and Perspectives in LungTransplantation,Transplantation Proceedings 37(6):2682-2683(2005)；Yang和Conte,Transplantation Proceedings 32(7):1521-1522(2000)；Gaissert和Patterson,Surgical Techniques of Single and Bilateral Lung Transplantation in TheTransplantation and Replacement of Thoracic Organs,第2版Springer Netherlands(1996)。

所述方法可包括在部分或完全除去受试者的肺的手术过程期间和/或在肺切除期间移植如本文所提供的生物人工肺或其部分。所述方法还可包括从活的供体或尸体收获肺或其部分，并在本文所述的生物反应器中保存或再生肺。在一些情况下，本文提供的方法可用于替换或补充肺组织并在例如人或动物受试者等受试者中起作用。

可进行任何合适的方法(一种以上)以检验移植之前或之后的肺功能。例如，可进行方法以评价组织愈合、评价功能性、和评价细胞向内生长(in-growth)。在一些情况下，可收集组织部分，并用固定剂例如中性缓冲***等处理。此类组织部分可脱水、包埋在石蜡中、并用切片机切片用于进行组织学分析。可用苏木精和伊红(H&E)染色切片，然后安放于玻璃载玻片上用于进行形态学和细胞性的显微镜评价。例如，可进行组织学和细胞染色以检测接种的细胞增殖。检验可包括移植的组织基质的功能性评价或成像技术(例如，计算机断层成像(CT)、超声、或磁共振成像(例如，造影剂增强的MRI))。检验可进一步包括在静息和生理应激下的功能性试验(例如，身体体积描记法、肺功能测试)。可使用本领域已知的方法如组织学、电子显微镜术、和机械测试(例如，体积和顺从性(compliance)的)来检验接种有细胞的基质的功能性。可测定气体交换作为另一功能性检验。为了检验细胞增殖，可通过例如检测胸苷掺入来测量胸苷激酶活性。在一些情况下，基于血液中的氧水平，可进行血液试验来评价肺的功能。

为了促进培养期间的功能性检验，本文所述的生物反应器装置的任何系列可包括取样口以允许对功能性参数(例如，pH、葡萄糖、乳酸、Na、K、Ca、Cl、碳酸氢盐(bicarb)、O₂、CO₂、sat)的单次或实时测量。代谢物也可用于使用比色分析来监测细胞数和生存力，并且生物化学分析可用于监测细胞成熟(例如，测定表面活性蛋白等)。例如，增加的表面活性物质浓度可表明培养物肺具有承受干式通气的足够的上皮细胞。在一些情况下，内皮屏障功能可用作血管成熟的标志物。可用不同大小的分子(例如，限定大小的右旋糖酐和白蛋白)、和微珠(将大小从0.2增加至5um)、以及分离的红细胞灌注肺。然后，可取样支气管肺泡灌洗液以评价这些标志物向肺泡腔中的泄露。例如，500kDa右旋糖酐可与支气管肺泡灌洗检验组合使用，从而确定保留在血管隔室内的右旋糖酐的百分比。保留的右旋糖酐的百分比的增加表明屏障功能的改善，这是因为对右旋糖酐的屏障功能依赖于存活的且功能的内皮，而右旋糖酐将在持续灌注期间随时间扩散穿过裸露的血管基底膜(例如，在无细胞肺中)。例如，尸体的肺可基本上保留血管隔室内的所有右旋糖酐，而无细胞肺可保留小百分比的右旋糖酐(例如，10.0％±8.0％)。大于容许的最小值(例如，>10％的4um微珠、或大于20％的0.2um微珠)的这些标志物向肺泡腔的泄露可用于表明肺不足够成熟，无法承受干式通气。

在一些情况下，例如RT-PCR等分子生物学技术可用于量化代谢物(例如，表面活性蛋白、粘蛋白-1)和分化标志物(例如，TTF-1、p63、表面活性蛋白C)的表达。可使用任何合适的RT-PCR方案。简言之，可通过如下收集总RNA：均质化生物样品(例如，腱样品)，进行氯仿提取，并使用旋转柱(例如，

微量旋转柱(QIAGEN,Valencia,CA))或其它核酸结合底物提取总RNA。在其它情况下，可使用抗体和标准免疫分析来检测与肺细胞类型和此类细胞类型的不同分化阶段相关的标志物。

气道器官生物反应器装置

示例性的气道器官生物反应器及其使用方法描述于WO 2015/138999，将其全部内容在此通过引用并入本文。其它示例性的生物反应器描述于Charest等,Biomaterials.2015Jun；52:79-87.doi:10.1016/j.biomaterials.2015.02.016；Gilpin等,Ann Thorac Surg.2014Nov；98(5):1721-9；discussion 1729.doi:10.1016/j.athoracsur.2014.05.080；Price等,Tissue Eng Part A 2010；16(8):2581–91；Petersen等,Cell Transplant 2011；20(7):1117–26；Bonvillain等,J Vis Exp2013；(82):e50825；Nichols等,J Tissue Eng Regen Med.2016Jan 12.doi:10.1002/term.2113。

模具装置

本文提供了配置用于形成多种含有生物制剂(例如，细胞)的成形固体或半固体组合物的模具装置。例如，本文所述的具有多个模腔(孔)的模具主体可配置用于高通量形成半固体或固体生物制剂组合物(例如，凝胶)，例如如本文所述的载细胞水凝胶液滴。本文所述的模具装置的主体可由有利地允许模具弯曲的柔性材料制成，这反过来有助于模腔内成形组合物的释放。在一些情况下，本文所述的模具装置可由生物相容性的材料制成，以有利地产生成形材料而不引入可导致受试者中的不良反应的组分。在一些情况下，模具装置由具有能够承受压力或热致工艺(thermal-incurring process)如灭菌(例如，使用高压釜工艺)的化学、热、和/或机械性质的材料制成。

图8A-8D显示本文提供的模具装置800的实例。图8A提供模具装置800的透视图。图8A的模具装置800的整体形状为包括多个模腔单元或模腔(本文中也称为“孔”)的矩形块。所述块具有可根据需要调整的长度、宽度和高度尺寸。在一些情况下，模具装置的整体形状可形成为各种形状，例如多边的(例如，正方形)或曲线的(例如，卵形或球形)形状。

在一些实施方案中，模具装置800由一种以上的耐热性材料构成。例如，在一些情况下，模具可由在约135℃以上(例如，约121℃以上、约127℃以上)的温度下不塑性变形的一种以上的材料制成。在一些实施方案中，模具装置由一种以上的耐压性材料制成。例如，在一些情况下，模具可由在承受约15psi以上(例如，约10psi以上、或约12psi以上)的压力时不塑性变形的材料制成。模具可由有利地使模具与热或化学灭菌工艺如高压釜或其它灭菌工艺相容的材料制成。在一些实施方案中，模具可由生物学和/或化学惰性的材料制成。

在各种实施方案中，本文提供的模具可为柔性模具；可选地，模具可为刚性的。在一些实施方案中，模具的材料可包括一种以上的聚合物。在一些实施方案中，材料可包括一种以上的弹性体。在一些实施方案中，材料为聚氨酯，例如热塑性聚氨酯(TPU)。在一些实施方案中，材料为有机硅或硅基，例如聚二甲基硅氧烷(PDMS)。在一些实施方案中，材料为聚(甲基丙烯酸甲酯)(PMMA)、聚碳酸酯、聚苯乙烯、聚(乙二醇)二丙烯酸酯(PEGDA)、环状烯烃共聚物(COP)、或环状烯烃聚合物(COP)。当模具为刚性时，可使用替代方法以从孔移除液滴，例如，包含从各孔的底部延伸至模具的背面或底部的窄通道，允许***线、针、或活塞以将液滴从孔推出，或引入气压以将凝胶化液滴从孔吹出。

仍参照图8A-8D，模具装置800包括许多构建在模具装置800的第一表面802(例如，上表面)中的半球形孔810。孔810可以沿上表面802的长度以平行行配置。例如，如图所示，图8A的模具装置800包括各自六个孔的两个平行行，总计12个孔810。可包括任何数量的孔，例如，12、48、和96个等；可选择孔的数量以匹配用于将水凝胶前体和细胞引入至孔的自动等分加样设备。线性通道813可贯穿模具装置800的上表面802，连接上表面802的边缘并二等分各行的孔810，将各孔810与相邻行的相邻孔810相连接。在一些实施方案中，通过通道813，孔810a连接至孔810b，并且模具800的右上边缘经由通道813连接至左边缘。通道813可从模具810的上表面802延伸至小于孔810的深度的深度，使得在将液体置于孔810中时，液体填充各孔810至对应于孔810的深度和通道813的深度之间的差的最大高度。超过该最大高度的液体可沿通道813流动至相连的孔810、或流动至模具800的边缘。通过该方法，各孔810可有利地填充有几乎相同量的液体，产生几乎相同大小的多个液滴。可将材料(例如，含有细胞和水凝胶前体的液体组合物)沉积在孔810中并固化为(例如，通过凝胶化、聚合)由孔810的内壁成形的半固体或固体形式。在一些情况下，可将材料沉积在半球形孔中并在材料固化后形成为半球形。模具装置800的孔810可成形为各种不同形状，包括几何形状或曲线形状。例如，孔810可成形为立方体、圆柱体、矩形棱柱、半卵形、或半椭圆形。

图8A的示例性的模具装置800进一步包括与通道813平行延伸并将孔810分为亚组的沟槽(trenche)814。例如，模具装置800包括将12个孔810分为4个亚组、每组4个孔910的两个沟槽814。沟槽814具有比通道813更大的深度和宽度，并从模具装置800的一侧表面延伸至相对侧表面。垂直于模具800的纵轴排列的沟槽814提供沿该轴的柔性。

可根据需要调整模具装置800或其组件的尺寸。例如，在一些情况下，模具装置800的尺寸可在毫米或厘米规模的范围内。例如，模具装置800的纵向长度和宽度的范围可为约10mm至约100mm、多至约10-20cm。在一些情况下，模具的长度的范围可为约30mm至约60mm，宽度的范围可为约10至约40mm。在一些情况下，模具的长度的范围可为约8cm至约10cm，宽度可为约4cm至约8cm。通道813的宽度w_c的范围可为约0.1mm至约3mm(例如，约0.5至约2mm、或约0.1至约1mm)，沟槽814的宽度w_T的范围可为约0.1mm至约3mm(例如，约0.5至约1mm、约1mm至约2mm、或约0.75至约1.5mm)。模具装置800的沟槽814可距离模具800的相应端部约10mm至约25mm。模具装置800的各孔810可具有相同的横向尺寸(例如，半径)。半径r可为0.5mm和5mm之间，例如，2mm和4mm之间(例如，2.5mm和4mm之间、3mm和4mm之间、3.5mm和4mm之间、2mm和3.5mm之间、2mm和3mm之间、或2mm和2.5mm之间)。孔的中心轴线可距离相邻孔的中心轴线(例如，中心至中心距离、分隔距离、或节距(pitch))约5至约20mm。在一些实施方案中，模具装置800的各孔810可具有约等于孔810的直径(例如，2x r)的深度，例如约0.5-5mm，任选地加上通道813的深度。

仍参照图8A-8D，模具装置800可包括延伸穿过模具800的宽度的通道813。在一些实施方案中，模具装置800还可任选地包括从上表面802延伸至小于模具装置800的总高度的期望的深度的沟槽814。在一些实施方案中，沟槽814可从上表面802延伸至模具主体中的约等于孔810的深度的深度。沟槽814可有利地提供沿所选的孔行、在平行方向上延伸的伸长的弯曲线。模具800可在横向于沟槽的方向上压紧弯曲以帮助释放孔中所含有的组合物(例如，将凝胶表面从模具的表面分离)并有助于其后从孔移除组合物。在一些情况下，可弯曲模具800以释放孔壁内的组合物，并颠倒反转以有助于从模具800移除组合物。

图8D提供了沿图8C中所示线130的模具装置800截面图。如图所示，模具装置800的半球形孔810a延伸至模具800的上表面802中并构成两个几何部分–上部811和下部812。上部811在模具的孔810与通道813相交的部分中呈圆柱形。下部812在通道813下方呈半球形(尽管未示出，在一些实施方案中，通道813下方的下部包括半球形部分上方的圆柱形部分)。沟槽814可延伸至模具装置800的上表面802中至约等于孔810的深度。孔810的圆柱形的上部811的半径可约等于孔810的半球形的下部812的半径。孔，例如孔810与通道810相交的下方的部分(包括半球形部分812和任选地一部分的圆柱形部分811)，可具有约50μL至约150μL的(例如，约60μL至约150μL的、约80μL至约150μL的、约800μL至约150μL的、约120μL至约150μL的、约140μL至约150μL的、约50μL至约140μL的、约50μL至约120μL的、约50μL至约800μL的、约50μL至约80μL的、或约50μL至约60μL的)内部体积。

图9A-9F显示本文所述模具装置的各种实例的图像。如上文中所指出，模具可构造成不同尺寸和具有不同数量的孔。例如，图9A显示由PDMS构成的模具900，其包括12个具有约100uL的内部体积的孔910。在另一实例中，图9B显示具有包括96个孔910的矩形块的模具901。在一些实施方案中，模具可任选地包括在所选的平行孔行之间的沟槽(如图9A中作为元件914示出的)。孔910可配制有可容纳多通道移液器的节距(pitch)深度，例如在9mm和14mm之间。孔910的节距可配置成允许重复移液和快速填充。

本文所述的模具装置可任选地限定附加的开口，所述开口配置成接收移液。例如，如图9C所示，示例性的模具装置901设计成接收并保持与模具901的一末端处的孔910的行对齐的8个移液器吸头940。

使用以下步骤，本文所述的模具可用于形成半固体或固体成形组合物。模具装置901的孔910(参见图9B)可填充有液体组合物950，如图9C中所示。填充孔910后，允许组合物950以预定量的时间固化并形成半固体或固体组合物，例如凝胶(例如，水凝胶)。在一些实施方案中，可培养填充的模具预定的时间。一旦组合物950固化，组合物950可成形为期望的形状。在一些情况下，组合物950可固化成半球形或球形。在一些情况下，组合物950可形成水凝胶球。图9C的模具901显示的是在将一定体积的组合物950置于88个孔之后的。在一些实施方案中，凝胶材料是如本文所述的水凝胶支架(例如，MATRIGEL)，如图9C-9F中所示。

在一些实施方案中，可通过弯曲模具装置910而从孔取出组合物950，从而使孔910形状变形并取出组合物950。

在一些实施方案中，如图9E中所示，提取工具960可用于从模具装置901移除固化的组合物950。固化组合物950在从半球形孔移除后显示保持球形。在一些情况下，固化组合物950在从模具移除后维持其形状一定时间。在一些情况下，可对固化组合物950进行进一步的加工，例如暴露于旋转培养指定的时间，例如如本文所述。如图9F中所示，MATRIGEL组合物950可以在悬转培养中7天后维持球形。在一些实施方案中，组合物950可维持它们的预定形状至少一天或更长(例如，5天以上、或10天以上)。

实施例

在以下实施例中进一步描述本发明，以下实施例不限制权利要求书中所描述的本发明的范围。

材料和方法

除非另外指出，以下材料和方法用于下文中的实施例。

iPSC分化

携带Nkx2.1-GFP和SPC-TdTomato报告基因的BU3 iPSC系获得自DarrellN.Kotton,M.D.(4,5)。这些细胞源自不具有已知基因异常的供体(11)。该细胞系在基因编辑之前和之后具有通过G-显带(G-banding)测定的正常核型(5)。

iPSC的分化根据经过修改的先前公开的方法进行(4,12)。简言之，将分别携带两种对于肺上皮祖细胞标志物和肺泡2型细胞标志物的荧光报告基因Nkx2.1-GFP和表面活性蛋白C(SPC)-TdTomato的BU3-NGST iPSC维持在TESR培养基(Stemcell Technologies,Vancouver,Canada)中。当细胞达到60-70％汇合度时，起始模拟肺发育阶段的逐步分化程序。用于所有分化步骤的基础培养基是补充有B-27(Gibco,Waltham,MA)的杜氏改良伊格尔培养基(Dulbeco’s Modified Eagle’s Medium,DMEM)/F21(Gibco,Waltham,MA)。首先，使用StemDiff试剂盒(Stemcell Technologies,Vancouver,Canada)，细胞经历定型内胚层分化4天，接着使用1μM A8301(Sigma,St.Louis,MO)和1μM IWR-1(Sigma,St.Louis,MO)4天用于进行前化内胚层分化。然后，通过将细胞暴露于10ng/mL FGF-7(Peprotech,Rocky Hill,NJ)、10ng/mL FGF-10(Peprotech,Rocky Hill,NJ)、和3μM CHIR99021(Tocris,Bristol,UK)持续7天，细胞经历腹侧化内胚层分化。在腹侧化后，用DAPI(Sigma,St.Louis,MO)染色细胞，荧光激活细胞分选术(FACS)用于纯化Nkx2.1-GFP阳性细胞。

将分选的Nkx2.1+细胞包埋在100％Matrigel(Corning,Corning,NY)液滴中用于形成肺泡球。将均质液前体以100μL液滴等分至12孔塑料培养板。用于肺泡球的形成、维持、和扩增(扩增培养基)的培养基具有以下组成：50％Medium 199(Life Technologies,Carlsbad,CA)、49％DMEM/F12(Life Technologies,Carlsbad,CA)、2％胎牛血清(FBS)(Hyclone,Logan,UT)、B-27(Life Technologies,Carlsbad,CA)、10ng/mL FGF-7、10ng/mLFGF-10、3μM CHIR99021、0.1mM IBMX(Sigma,St.Louis,MO)、0.1mM 8-溴代-cAMP(Sigma,St.Louis,MO)、50nM***(Sigma,St.Louis,MO)、10μM Y-27632(Cayman Chemical,AnnArbor,MI)、和50μg/mL抗坏血酸(Stemcell Technology,Vancouver,Canada)。培养液滴7-14天，接着用分散酶(Dispase)(Corning,Corning,NY)消化Matrigel液滴。胰蛋白酶化剩余的细胞球并对于GFP+TdTomato+细胞进行FACS。这些iPSC-AEC用于进一步的扩增。

尸体大鼠肺

所有的动物研究经由麻省总医院机构动物护理和使用委员会方案#2014N000261(Massachusetts General Hospital Institutional Animal Care and Use CommitteeProtocol#2014N000261)批准、并根据实验动物护理和使用指南(The Guide for the Careand Use of Laboratory Animals)进行。大鼠肺外植自远交系成年雄性Sprague-Dawley大鼠(300-400g,Charles River Laboratories,Wilmington,MA)。所有的大鼠在使用前成对饲养并允许无限制地获取食物和水。根据批准的方案，用5％异氟醚麻醉动物，进行剖腹手术，通过下腔静脉血管内施用肝素，并通过放血处死动物。然后，进行胸骨切开术，如先前所述外植肺(13)。

漂浮型液滴细胞培养

将具有悬浮细胞的Matrigel等分为各自含有约20,000个细胞的100μL液滴。将液滴置于定制的聚二甲基硅氧烷(PDMS)(Sigma,St.Louis,MO)模具(图9A、C-D)中并允许在37℃下凝胶20分钟。将凝胶化的、载细胞的球状体转移至磁性旋转瓶(magnetic spinnerflask)，其后，所述磁性旋转瓶填充有1mL/液滴扩增培养基(图9F)。在0、17.5每分钟转数(RPM)和35RPM下测试漂浮型液滴培养方法。基于可接受的表型稳定性和细胞扩增性，选择17.5RPM的旋转速度(图6A-D)。在各8天扩增期中培养来自17.5RPM设定的50个液滴用于肺支架再细胞化实验。8天的培养后，在分析和肺支架接种前，用分散酶消化Matrigel液滴并胰蛋白酶化肺泡球以产生单细胞悬浮液。

贴壁型液滴细胞培养

将具有悬浮细胞的Matrigel基均质液前体等分为各含有约20,000个细胞的100μL液滴。将液滴置于12孔板的单个孔中的组织培养塑料(plastic)上并在37℃下允许其凝胶化20分钟(图1)。在确定凝胶液滴的稳定性后，将1mL的扩增培养基添加至各孔并将板置于37℃、5％CO₂培养箱中。在各8天扩增期中培养50个液滴。8天的培养后，在分析和肺支架接种前，用分散酶(Corning,Corning,NY)消化Matrigel液滴并胰蛋白酶化肺泡球以产生单细胞悬浮液。

大鼠肺去细胞化

如先前所述去细胞化尸体大鼠肺(13)。简言之，大鼠肺外植自远交系成年雄性Sprague-Dawley大鼠。对肺动脉(PA)通过右心室流出道插管，然后进行气管插管。通过PA插管、用0.1％十二烷基硫酸钠(SDS)(Fisher Scientific,Waltham,MA)溶液灌注肺2小时。然后，将肺支架用无菌去离子水灌注15分钟，接着用1％Triton X-100(Fisher Scientific,Waltham,MA)灌注，全部通过PA插管。最后，在随后的48小时内，在使用前，用最少3L磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤去细胞化肺支架。

接种肺用于培养

在左肺切除术后，将大鼠肺支架安放在预填充有100mL肺泡球扩增培养基的定制的生物反应器中，在37℃、5％CO₂培养箱中以1mL/分钟的流速灌注最少1小时。通过气管插管、用50mL扩增培养基将四千万个iPSC-AEC重力接种至各右肺的气道。接种后，暂停PA灌注90分钟以允许促进细胞附着至支架的静置培养期。对于接下来的16小时，以1mL/分钟重新开始灌注，然后，对于剩余的仿生培养期，增加至3mL/分钟。对于12天培养期，每48小时更换培养基。在接种后第6天，进行右上和中部肺叶切除术。用于RNA分析的组织储存于Trizol(Fisher Scientific,Waltham,MA)，用4％多聚甲醛(PFA)(Westnet,Canton,MA)固定用于组织学分析的组织24小时。在接种后第12天，用4％PFA通过气管插管灌注固定下叶和副叶24小时。

刃天青试验

如先前所述进行刃天青细胞代谢试验(7)。简言之，将80mL用过的培养基(spentmedia)与PrestoBlue(Invitrogen,Waltham,MA)以1:20稀释混合。将PrestoBlue混合物的一式四份的样品保存在96孔平底板中作为对照。然后，在实验第12天，允许混合物灌注仿生肺培养物1小时。完成后，一式四份地取样用过的培养基并在SpectraMax M3多模式微孔板读板机(multi-mode microplate reader)(Molecular Devices,Sunnyvale,CA)中测定。样品和对照之间的荧光的差异与代谢活性相关。

组织学染色和分析

将肺泡球包埋在Histogel(ThermoFisher,Waltham,MA)中并在切片前石蜡包埋。将固定的组织切片石蜡包埋并切片。用苏木精和伊红染色安放在玻璃载玻片上的组织或细胞切片用于明视场成像。用于免疫荧光染色的安放在玻璃载玻片上的组织切片在高温和压力下经历用柠檬酸钠溶液的抗原修复并用0.2％Triton X-100透化。然后，用10％胎牛血清(FBS)和5％驴血清(DS)(Sigma,St.Louis,MO)封闭切片。在具有0.5％DS溶液的tris缓冲盐水(TBS)中、在4℃下培养一抗过夜，然后用TBS洗涤(1:50,Nkx2.1:ab72876,Abcam,Cambridge,UK；1:200SPC:ab3786,Abcam；1:100AQP5:ab92320,Abcam)。在室温下培养二抗2小时，然后用TBS洗涤(分别地，Alexa Fluor驴抗兔594或647:ab150064或ab150075，Invitrogen)。用DAPI Fluoromount-G(Fisher Scientific,Waltham,MA)封片。使用NikonTi-PFS倒置显微镜(Nikon,Tokyo,Japan)捕捉图像。由恒定曝光时间和仪器增益捕捉给定蛋白的所有荧光图像。ImageJ软件(National Institutes of Health,Bethesda,MD)用于分析。通过以下获得细胞计数：分离DAPI颜色通道，减去背景信号，将图像转换为二值图像，限定细胞边界，和计数分离的细胞核。通过以下获得图像荧光：分离合适的荧光通道，由恒定亮度和对比度分析来自特定蛋白染色的各图像，然后计算平均荧光。产生定量数据作为每细胞的平均荧光。

来自仿生肺培养的用过的培养基分析

每48小时更换仿生肺培养基，并使用具有CG4+盒(Abbott,Chicago,IL)和G盒(Abbott,Chicago,IL)的iSTAT(Abbott,Chicago,IL)即时分析仪对其分析pH、碳酸氢盐、乳酸、和葡萄糖浓度。

相对基因表达分析

通过Trizol分离RNA，然后通过SuperScript Vilo Master Mix(LifeTechnologies,Carlsbad,CA)逆转录为cDNA。使用One Step Plus(Applied Biosystems,Foster City,CA)***、通过Taqman探针检验(关于探针详情，参见关键资源表(KeyResources Table))(Life Technologies,Carlsbad,CA)定量基因表达。使用delta-delta法、通过归一化至管家基因β-肌动蛋白来分析基因表达。

流式细胞术分析

使用FACSAria II(BD Biosciences,Franklin Lakes,NJ)进行Nkx2.1-GFP+/tdTomato+细胞的荧光激活细胞分选。对于表型分析，使用BD Cytofix/Cytoperm(BDBiosciences,Franklin Lakes,NJ)试剂盒固定并透化细胞。在4℃下用一抗(1:250,SPC:ab40879,Abcam；1:200AQP5:ab92320,Abcam)染色细胞30分钟，洗涤，然后在4℃下用二抗(1:200,分别地，Alexa Fluor驴抗兔350或594:A10039或ab150064,Invitrogen)染色细胞30分钟。使用FlowJo软件(BD Biosciences,Franklin Lakes,NJ)进行流式细胞术分析。

统计学方法

数据表示为平均值±SEM。对于显著性检验，不等方差单尾学生t检验用于比较两个群体。如果p≤0.05，确定为显著的。除非由星号(*)标出，否则图中示出的数据假设为非显著的。对于qPCR数据，当描述性统计计算中包含所有数据点时，如果单个数据点确定为比平均值大3个标准差，则排除这些单个数据点。使用Visual Basic for Applications进行所有统计学计算。

实施例1.漂浮型培养方法

为了实现漂浮型液滴培养，我们设计了可高温高压(autoclavable)的硅模具(图9A、C-D)。模具的圆孔与多通道移液器对齐允许快速转移均质的载细胞凝胶前体液滴。也进行了先前描述的手工液滴形成方法，其中凝胶在使用前必须在移液器吸头中温热90秒(图1)(4)。固化后，在无菌条件下将载细胞Matrigel液滴转移至烧瓶用于继续细胞扩增和培养(图9E-F)。图9E中示出了具有单个的载细胞MATRIGEL液滴的无菌刮刀，所述液滴具有约20,000个细胞。图9F中示出了在细胞培养基中含有载细胞MATRIGEL漂浮型液滴的具有无磁性搅拌棒的烧瓶。

实施例2.iPSC-AEC扩增的定量

在8天期间，漂浮型液滴培养方法比贴壁型液滴培养方法产生显著更多的细胞(分别地，2.86百万(M)个细胞/液滴vs 1.66M个细胞/液滴,p<0.01,图2A)。与较高和较低搅拌速度相比，在17.5RPM的机械搅拌速率下培养的漂浮型液滴显示较大的细胞扩增(图6A)。相对基因表达分析显示，与贴壁型液滴培养细胞相比，漂浮型液滴培养细胞中Ki-67表达显著增加(p＝0.033)(图2B)。

实施例3.扩增的iPSC-AEC的表征

定量聚合酶链式反应(PCR)分析表明，贴壁型和漂浮型培养方法之间类似的SPC表达，但在漂浮型液滴培养中显示较低的Nkx2.1基因表达(p＝0.041)(图2C)。流式细胞术表征表明了培养方法之间相对保留的Nkx2.1和SPC表达，但注意到漂浮型培养方法中降低的Nkx2.1表达(图3A-B)。Nkx2.1表达中的这种降低与Nkx2.1的PCR数据中注意到的显著差异相关(图2C)。根据先前的工作，来自漂浮型液滴法的iPSC-AEC自发形成肺泡球(4,9)(图2D-F)。用流式细胞术分析I型AEC标志物水通道蛋白5(AQP5)，自任一培养条件无可觉察的AQP5表达(图3C-D)。在优化漂浮型液滴培养方法机械搅拌速率时，发现II型肺泡细胞标志物SPC在高搅拌速度下趋于较低(图6B-D)。

实施例4.仿生肺培养后的基因表达

仿生培养后的肺的免疫组织化学染色揭露了具有贴壁型液滴培养细胞的肺中趋于较高的Nkx2.1表达的趋势(p＝0.059)，这与来自细胞扩增期结束时的PCR数据一致(图4A、D；图2C)。具有漂浮型液滴培养细胞的肺显示显著降低的SPC表达(p<0.01)和显著增加的AQP5表达(p<0.001)(图4B-C、E-F)。定量PCR表明Ki67表达自培养期至仿生肺培养结束时持续增加，各组之间具有类似的表达(图4G)。

实施例5.仿生肺培养期间的细胞代谢

来自仿生肺培养的用过的培养基表明在整个培养期期间，来自两组的碳酸氢盐变化、乳酸产生、和葡萄糖消耗中类似的趋势(图5A-C)。所述趋势支持扩增在整个培养期期间连续的数据(图4G)。培养第6天和第12天的刃天青细胞活力检验显示类似的刃天青至试卤灵的线粒体转换，如通过荧光读板机所检测的，表明两组之间类似的细胞能量消耗(图5D)。

实施例6.自另外的iPSC系产生AEC

为了试验我们的可扩展性培养方案是否适用于其它人诱导性多能干细胞衍生的肺泡上皮细胞(iPSC-AEC)，我们从两种其它的人iPSC系产生AEC。iPSC-17细胞系携带Nkx2.1-GFP和表面活性蛋白(SPC)-TdTomato报告基因，而SPC2细胞系仅携带SPC-TdTomato报告基因。在4周的逐步分化和2次流式细胞术分选后，我们分别从iPSC-17和SPC2细胞系纯化表达SPC-TdTomato的AEC。将100％Matrigel与AEC混合，然后等分至各含有约20,000个细胞的100μL液滴，用于后续的由每液滴1ml培养基的液滴或板培养，同时每隔一天更换培养基。

收获培养了8天的细胞并计数用于不同方法之间的细胞产量比较，然后固定细胞用于AT2细胞标志物SPC、AT1细胞标志物AQP5、和肺上皮祖细胞标志物Nkx2.1的流式细胞术分析。收获的细胞用于AEC标志物基因的实时PCR分析和H&E染色。产生自另外两种iPSC-17-AEC和SPC2-AEC产生数据以证实我们的可扩展性方法可在不同iPSC-AEC细胞系中促进增殖、同时保持AT2表型。

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其它实施方案

应理解，尽管已结合本发明的详细描述来说明本发明，前述描述旨在进行说明而不限制本发明的范围，本发明的范围由所附权利要求书的范围限定。其它方面、优点、和修改在所附权利要求书的范围内。

Claims

1.一种产生扩增的肺泡上皮细胞(AEC)群体的方法，所述方法包括：

(a)提供第一AEC群体；

(b)将所述第一AEC群体混合至水凝胶前体；

(c)使得或促进所述水凝胶前体凝胶化来形成液滴；和

(d)在足以扩增第一群体的运动培养基中悬浮培养所述液滴，从而产生扩增的AEC群体。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述第一AEC群体包括诱导性多能干细胞(iPSC)衍生的AEC。

3.根据权利要求2所述的方法，其中所述iPSC衍生的AEC是通过包括以下的方法获得的：

提供初始iPSC群体；

将所述iPSC在足以用于定型内胚层分化的条件下培养、接着在足以用于前化内胚层分化的条件下培养、然后在足以用于腹侧化内胚层分化的条件下培养，从而获得iPSC衍生的AEC群体。

4.根据权利要求1所述的方法，其中所述液滴的最大直径为2-10mm。

5.根据权利要求1-4所述的方法，其中所述水凝胶是天然或合成水凝胶支架。

6.根据权利要求5所述的方法，其中所述天然水凝胶支架包括细胞外基质(ECM)、胶原、纤维蛋白、骨涎蛋白、玻连蛋白、藻酸盐、或层粘连蛋白。

7.根据权利要求5所述的方法，其中所述合成水凝胶支架包括选自以下的合成聚合物支架：聚(2-(甲基丙烯酰氧基)乙基二甲基-(3-磺丙基)氢氧化铵)(PMEDSAH)、聚丙烯酰胺(PAM)、聚(4-苯乙烯磺酸钠)(PSS)、聚(甲基乙烯基醚-alt-马来酸酐)、和聚(乙二醇)(PEG)水凝胶。

8.根据权利要求1所述的方法，其中使得或促进所述水凝胶凝胶化包括提供足以引发水凝胶支架的交联的温度、化学品、或光。

9.根据权利要求1所述的方法，其中所述运动培养基是旋转或流动培养物。

10.根据权利要求1所述的方法，其中所述扩增的AEC群体包括表达Nkx2.1和水通道蛋白5(AQP5)或表面活性蛋白C(SPC)的细胞。

11.一种扩增的AEC群体，其通过根据权利要求1-10所述的方法产生。

12.一种提供生物人工肺器官的方法，所述方法包括：

提供根据权利要求12所述的扩增的AEC群体；

提供包括气道和脉管***的(无细胞)肺组织基质；

通过所述气道用所述扩增的AEC群体接种所述肺组织基质、通过所述脉管***用内皮细胞接种所述肺组织基质、和通过所述气道和所述脉管***的一者或两者用间充质细胞接种所述肺组织基质；和

将所述基质维持在足以形成所述气道中的功能性上皮和功能性脉管***的条件下。

13.一种模具装置，其包括：

包括聚合物材料的模具主体，所述模具主体限定第一模腔和第二模腔，所述第一和第二模腔各自具有0.5mm和5mm之间的半径并配置成接收组合物，

所述模具主体还限定沿着与所述第一和第二模腔相交的纵轴延伸的第一通道，其中所述第一通道由配置成限制所述第一和第二模腔中的组合物的体积量的深度尺寸所限定。

14.根据权利要求13所述的模具装置，其中所述聚合物材料为柔性的。

15.一种模具装置，其包括：

限定多个模腔的柔性主体，所述多个模腔形成包括至少第一行和第二行的阵列图案，其中各行包括分别沿第一和第二纵轴排列的至少两个以上的模腔，所述第一和第二纵轴以分隔距离彼此间隔，其中各模腔配置成形成半球形组合物，和所述模腔各自具有0.5mm和5mm之间的半径并配置成接收组合物，其中所述模腔由配置成限制所述第一和第二模腔中的组合物的体积量的深度尺寸所限定。

16.根据权利要求15所述的模具装置，其中所述柔性主体由聚合物材料形成。

17.根据权利要求13-15中任一项所述的模具装置，其中所述柔性材料选自由有机硅和聚氨酯组成的组。

18.根据权利要求17所述的模具装置，其中所述聚合物材料包括聚二甲基硅氧烷(PDMS)。

19.根据权利要求13-18中任一项所述的模具装置，其中各模腔由半球形表面限定。

20.根据权利要求13-19中任一项所述的模具装置，其中各模腔配置成形成球形组合物或半球形组合物。

21.根据权利要求13-20中任一项所述的模具装置，其中所述第一通道从所述模具的主体的一侧边缘延伸至第二相对侧边缘。

22.根据权利要求13-21中任一项所述的模具装置，其中所述深度尺寸配置成将各模腔中的组合物的体积限制为约50μL至约150μL的最大体积量。

23.一种形成成形凝胶组合物的方法，所述方法包括

将组合物添加至根据权利要求13-22中任一项所述的模具装置的模腔，所述组合物为含有生物制剂的液体；

在所述模具的所述模腔中形成多个半固体或固体组合物；和

从所述模具的所述模腔移除所述半固体或固体组合物。

24.根据权利要求23所述的方法，其中所述液体是水凝胶前体，和所述生物制剂包括细胞。

25.根据权利要求23或24所述的方法，其中所述半固体或固体组合物是水凝胶。

26.根据权利要求23-25中任一项所述的方法，其中所述移除步骤包括弯曲所述模具的所述主体。

27.根据权利要求23-26中任一项所述的方法，其中所述半固体或固体组合物保持预定形状。

28.根据权利要求23-27中任一项所述的方法，其中所述半固体或固体组合物在旋转培养中保持预定形状。

29.根据权利要求23-28中任一项所述的方法，其中所述半固体或固体组合物保持预定形状至少1天、至少5天、或至少10天。

30.根据权利要求23-29中任一项所述的方法，其中所述半固体或固体组合物为球形或半球形。

31.根据权利要求1-10所述的方法，其还包括：

在步骤(b)后，将混合物转移至根据权利要求13-22所述的模具装置，然后在步骤(c)中的所述水凝胶前体凝胶化后，从所述模具装置移除所述液滴。

32.一种扩增的AEC群体，其通过根据权利要求31所述的方法产生。

33.一种提供生物人工肺器官的方法，所述方法包括：

提供根据权利要求32所述的扩增的AEC群体；

提供包括气道和脉管***的(无细胞)肺组织基质；

通过所述气道用扩增的AEC群体接种所述肺组织基质、通过所述脉管***用内皮细胞接种所述肺组织基质、和通过所述气道和所述脉管***的一者或两者用间充质细胞接种所述肺组织基质；和