CN114929723A - 使用酶制备核酸序列的方法 - Google Patents

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Abstract

一种使用酶制备核酸序列的方法，包括：(1)提供具有预处理表面的反应基片。(2)借由反应酶将具有末端保护基的核苷酸配置于预处理表面，且反应温度为45℃～105℃。(3)借由照光或加热将核苷酸的末端保护基去除。(4)借由反应酶将具有末端保护基的另一核苷酸连接至核苷酸，且反应温度为45℃～105℃。(5)判断核酸序列是否完成，若是则获得核酸序列，若未完成则重复步骤(3)及(4)。本发明的使用酶制备核酸序列的方法能提升制备核酸序列的效率。

Description

使用酶制备核酸序列的方法
技术领域
本发明涉及一种制备生物分子结构的方法，且特别是涉及一种使用酶制备核酸序列的方法。
背景技术
在20世纪中期，几个基因及生化研究的突破性进展导致了今日医药领域上的发展。这些一连串事件的起源是1941年的X射线诱导的基因剔除研究，从结果上得知基因直接地参与了酶(enzyme)的功能。紧接着发现到基因是由核酸(DNA)所组成，并且双螺旋为核酸的一种结构，带有遗传信息，且可以精确地通过DNA聚合酶来复制。
核酸合成对现代生物技术而言至关重要。科学界人工合成DNA、RNA及蛋白质的能力使生物技术领域快速地发展。人工DNA合成，一个商机无限且不断增长的市场，使生技与制药公司能够开发一系列肽疗法，例如用于治疗糖尿病的胰岛素。它使得研究人员能够表征细胞蛋白，从而开发新的小分子疗法，以治疗当今人口老龄化所面临的疾病，如心脏病及癌症等。
然而，现今的DNA合成技术并无法满足生物技术产业的需求。尽管DNA合成的好处很多，但人工DNA合成产业的发展中仍具有瓶颈，从而阻碍了生物技术领域的发展。尽管DNA合成是一项成熟的技术，但实际上合成长度超过200个核苷酸的DNA链非常困难，并且大多数DNA合成公司最多只能提供120个核苷酸。相较之下，平均蛋白质编码基因的数量级为2000-3000个核苷酸，而真核基因组的平均数量为数十亿个核苷酸。因此，现今所有主要的基因合成公司都是使用“合成与粘合”的技术方式，大约40-60元(40-60-mer)重叠的序列片段通过PCR合成并粘合在一起(Young,L.et al.(2004)Nucleic Acid Res.32,e59)。基因合成公司提供的公知方法通常允许长达3000个碱基对的长度用于常规生产。
现今核酸的合成方式主要有两类：化学合成与酶合成。最常见的核酸化学合成方法是Adams等人(1983,J.Amer,Chem Soc.,105:661)以及Froehler等人(1983,TetrahedronLett 24:3171)所描述的亚磷酰胺法(phosphoramidite method)。在此方法中，要添加的每种核苷酸均在5'-OH基上配置有保护基团，以避免相同类型的核苷酸会产生不受控的聚合反应，通常5'-OH基团的保护基团可使用三苯甲基。为避免使用强力反应剂而可能引起的降解作用，也可以进一步保护核苷酸携带的含氮碱基，通常所使用的保护基团包含异丁酰基(isobutyryl group)(Reddy et al.,1997,Nucleosides&Nucleotides,16:1589)。每次加入新的核苷酸后，链的最后一个核苷酸的5'-OH基团都要进行去保护反应，以使其可用于下一聚合步骤。核苷酸所带的含氮碱基仅在所有聚合反应完成后才进行去保护。
WO 95/00530 A1公开了一种通过使用光刻法在基片上原位合成寡核苷酸探针来制备核苷酸阵列的方法。将寡核苷酸固定在基片上，并使用5'末端羟基上的光敏型保护基在3'至5'方向上逐一合成碱基。在每个合成周期中，通过用光刻掩模照射表面来选择性除去保护基。去保护的羟基与选定的5'-受光保护的脱氧核苷亚磷酰胺偶联，而表面未照射区域中的增长中核酸序列保持受保护且无法反应。根据需要用不同的脱氧核苷重复一轮照光及偶联，直到获得所需的寡核苷酸探针组合。
美国专利US 20160184788 A1公开了一种在表面上选择性掩蔽一或多个位点的方法以及一种合成分子阵列的方法。其将核苷酸固定在基片上，并使用5'末端羟基上的热敏型保护基在3'至5'方向上逐一合成碱基。通过在不同的位点进行加热，可以去除位于位点上的核苷酸的热敏型保护基，去保护的羟基与选定的5'-受光保护的脱氧核苷亚磷酰胺偶联，因此可以制备出大量且不同的核酸序列。
然而，如上所述的化学合成方法需要大量的具不稳定性、危险且昂贵的反应剂，这些反应剂会影响环境和健康。此外，这种化学合成方法所使用的设备非常复杂，需要大量投资，并且必须由专业的技术员进行操作。这种化学合成方法的主要缺点之一在于较低的产率。在每个循环中，偶联反应的成功率仅在98％到99.5％，使得制备中的核酸序列可能无法拥有正确的序列。随着合成过程的进展，会使反应介质中充满了不正确的序列片段。这种缺失类型的错误会因此带来严重的影响，造成核酸片段的阅读框(reading frame)改变。
举例而言，为了使偶联反应的正确率在99％，一个包含70个核苷酸的核酸的合成产率会低于50％。这表示在加入核苷酸步骤的70个循环后，反应介质中包含的错误序列片段会多于正确序列片段，进而使得合成反应不适合继续进行。
因此，化学合成核酸的方法对于较长片段的合成效率并不高，因为它们会产生大量具有错误序列的片段。实际上，化学合成方法能有效产生的片段的长度大约为50至100个核苷酸。
另一方面，酶合成与化学合成方式差异在于，酶合成是使用酶来进行核苷酸的偶联步骤。公知上常使用DNA聚合酶来合成DNA。DNA聚合酶根据其胺基酸序列分为七个进化家族：A、B、C、D、X、Y及RT。DNA聚合酶的家族之间并无相关，即一个家族的成员与任何其他家族的成员都不同源。通过DNA聚合酶与家族的原型成员的同源性，可以确定为家族的成员。举例而言，A家族的成员与大肠杆菌DNA聚合酶I同源；B家族的成员与大肠杆菌DNA聚合酶II同源；C家族的成员与大肠杆菌DNA聚合酶III同源；D家族的成员与激烈热球菌(Pyrococcusfuriosus)DNA聚合酶同源；X家族的成员与真核DNA聚合酶β同源；Y家族的成员与真核RAD30同源；以及RT家族的成员与逆转录酶同源。
许多文件(Ud-Dean et al.(2009)Syst.Synth.Boil.2,67-73、US 5763594及US8808989)已公开使用末端脱氧核苷酸转移酶(terminal deoxynucleotidyl transferase，TdT)来进行受控的从头单链DNA合成。另一方面，不受控制的从头单链DNA合成，利用了末端脱氧核苷酸转移酶在单链DNA上的脱氧核苷酸三磷酸(dNTP)3'拖尾特性来创造例如用于下一代定序文库制备的均聚物衔接子序列(Roychoudhur R.et al.(1976)Nucleic AcidsRes.3,10-116及WO 2003/050242)。
然而，由于末端脱氧核苷酸转移酶原本主要目的是增加抗原受体的多样性，其可能较难表现出如同其他聚合酶的正常、可预测的行为。这代表末端脱氧核苷酸转移酶在核苷酸合成循环中要达到高产量自动化的效果仍须面临许多挑战。
综上所述，核酸的化学合成方式能够大量合成核酸，然而其所使用的反应剂成本过高且会污染环境，而且合成过程中产生错误的机率较高。核酸的酶合成方式造价便宜，并且核酸序列的正确度较高，然而由于酶的反应速率的关系，并无法进行大量合成。因此，现今仍没有一个较佳的核酸合成方式，能够解决正确且大量合成核酸的问题。
发明内容
本发明提供一种使用酶制备核酸序列的方法，能提升制备核酸序列的效率。
本发明一实施例所提供的使用酶制备核酸序列的方法包括：(1)提供具有预处理表面的反应基片。(2)借由反应酶将具有末端保护基的核苷酸配置于预处理表面，且反应温度为45℃～105℃。(3)借由照光或加热将核苷酸的末端保护基去除。(4)借由反应酶将具有末端保护基的另一核苷酸连接至核苷酸，且反应温度为45℃～105℃。(5)判断核酸序列是否完成，若是则获得核酸序列，若未完成则重复步骤(3)及(4)。
在本发明的一实施例中，上述的反应酶为DNA聚合酶。
在本发明的一实施例中，上述的反应酶为A家族DNA聚合酶。
在本发明的一实施例中，上述的反应酶为B家族DNA聚合酶。
在本发明的一实施例中，上述的反应酶为X家族DNA聚合酶。
在本发明的一实施例中，上述的借由照光或加热将核苷酸的末端保护基去除的方法包括以图案化方式局部去除。
在本发明的一实施例中，上述的借由照光将核苷酸的末端保护基去除的方法包括使用紫外线数字光处理(digital light processing，DLP)芯片进行照光。
在本发明的一实施例中，上述的反应温度为50℃～85℃。
在本发明的一实施例中，上述的反应温度为55℃～75℃。
在本发明的一实施例中，上述的预处理表面具有多个引子，将具有末端保护基的核苷酸配置于预处理表面的方法包括借由反应酶将具有末端保护基的核苷酸连接至这些引子。
在本发明的一实施例中，上述的使用酶制备核酸序列的方法更包括：(6)借由限制酶将核酸序列从预处理表面切割。
本发明实施例的使用酶制备核酸序列的方法中，由于是使用酶来合成核酸序列，相较于化学合成的方式，较不易污染环境且能降低成本，而反应温度设置于45℃～105℃，相较于公知在37℃下使用酶的作法，本发明实施例在45℃以上使用酶能显示出较佳活性，因此能提升制备核酸序列的效率。
本发明的其他目的、特征和优点将从本发明的实施例公开的进一步技术特征中得到进一步理解，其中显示和描述了本发明的优选实施例，仅通过最适合于的模式的说明的方式实施本发明。
附图说明
在阅读以下详细描述和附图之后，本领域普通技术人员将更加容易理解本发明，其中：
图1是本发明一实施例的使用酶制备核酸序列的方法的流程示意图。
图2A及图2B是本发明一实施例的将核苷酸的末端保护基去除的示意图。
图3A及图3B是本发明另一实施例的将核苷酸的末端保护基去除的示意图。
图4A及图4B是本发明另一实施例的将核苷酸的末端保护基去除的示意图。
图5A至图5I是本发明一实施例的使用酶制备核酸序列的方法的步骤示意图。
具体实施方式
参考以下实施例更具体地描述本发明，需要注意的是，本发明的优选实施例的以下描述仅用于说明和描述的目的，它并非旨在详尽无遗或限于所公开的精确形式。
图1是本发明一实施例的使用酶制备核酸序列的方法的流程示意图。请参考图1，本实施例的使用酶制备核酸序列的方法包括以下步骤：进行步骤S101：提供反应基片，反应基片具有预处理表面，接着，进行步骤S102：借由反应酶将具有末端保护基的核苷酸配置于预处理表面，且反应温度为45℃～105℃，较佳为50℃～85℃，更佳为55℃～75℃，具体而言，用于制备核酸序列的反应温度例如为55℃、56℃、57℃、58℃、59℃、60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃、66℃、67℃、68℃、69℃、70℃、71℃、72℃、73℃、74℃或75℃，但不以此为限。
反应基片的材料例如包括硅、玻璃(二氧化硅)、金属或聚合物，如聚碳酸酯或聚甲基丙烯酸甲酯等，但不以此为限。具体而言，反应基片例如为芯片或平板等板状结构，预处理表面则为板状结构的平面。
在本实施例中，例如是以合成去氧核糖核酸(DNA)序列为例，具体而言，其合成所需的核苷酸的含氮碱基又可分为四类：腺嘌呤(A)、胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)、鸟嘌呤(G)，因此会使用四种不同类型的核苷酸(dAMP、dTMP、dCMP、dGMP)。当合成核糖核酸(RNA)序列时，还需使用含氮碱基为尿嘧啶(U)的核苷酸(UMP)。反应酶例如为DNA聚合酶，特别是耐热型的DNA聚合酶，但不以此为限。DNA聚合酶例如包括A家族DNA聚合酶、B家族DNA聚合酶及X家族DNA聚合酶，其实例包括Taq聚合酶、古菌DNA聚合酶(archaeal DNA polymerase)、耐热型反转录酶等。这些DNA聚合酶在温度45℃以上时，相较于公知在37℃使用的末端脱氧核苷酸转移酶(terminal deoxynucleotidyl transferase，TdT)，可以具有更佳的活性，提升核酸序列的合成效率。
本发明全文中所述的“反应酶”、“具有末端保护基的核苷酸”、“核苷酸”、“限制酶”等应视为对这些物质的总称，而非代表其实际数量，例如进行反应的反应酶与具有末端保护基的核苷酸的数量皆为多个。
借由反应酶将具有末端保护基的核苷酸配置于预处理表面的方法例如包括含浸法或以液体流过的方式。具体而言，是将反应酶及具有末端保护基的核苷酸调制为配方溶液。在含浸法中，使反应基片浸入配方溶液中，并且使溶液的温度维持在45℃～105℃，等待反应完成。以液体流过的方式则是将配方溶液流过反应基片的预处理表面，并且使反应基片的温度维持在45℃～105℃。上述的方式仅为本发明的实施态样，并非用以限制本发明的范围。
预处理表面例如具有多个引子(primer)，但不以此为限。将具有末端保护基的核苷酸配置于预处理表面的方法包括借由反应酶将具有末端保护基的核苷酸连接至这些引子。以本实施例而言，合成脱氧核糖核酸序列时借由引子的协助能使DNA聚合酶(反应酶)更容易将具有末端保护基的核苷酸配置于预处理表面，这些引子例如是单股DNA，但不以此为限。在另一实施例中，预处理表面例如也可以不具有引子。
接着，进行步骤S103：借由照光或加热将核苷酸的末端保护基去除。末端保护基例如分为光敏型及热敏型，末端保护基的实例包括甲基、2-硝基芐基、3'-O-(2-氰乙基)、烯丙基、胺、叠氮甲基(azidomethyl)、叔丁氧基乙氧基(tert-butoxy ethoxy，TBE)等，但不以此为限。光敏型的末端保护基可借由照光去除，而热敏型的末端保护基则可借由加热去除。去除末端保护基后的核苷酸后可继续连接下一个核苷酸，以将序列延伸。以下将配合图式进一步说明去除核苷酸的末端保护基的具体实施态样，但本发明的借由照光或加热将核苷酸的末端保护基去除的具体方法不限于以下所列举的实施例。
图2A及图2B是本发明一实施例的将核苷酸的末端保护基去除的示意图。请参考图2A及图2B，本实施例是使用光敏型的末端保护基PG，因此可借由发光元件100对预处理表面200进行照光，连接于引子210的核苷酸220在被光线L照射后其末端保护基PG会分解，如图2B所示。发光元件100例如为发光二极体或雷射二极体，但不以此为限。照光处理并不限于使用发光元件100，例如也可以是使用自然光照射。由于预处理表面200可以同时配置多个核苷酸220，因此可以一次性地制备多个核酸序列，提升制备效率。
此外，也可以将预处理表面200划分为多个区域，每个区域中包括一个制备中的核酸序列，以图案化方式局部去除末端保护基PG，达到同时制备多个不同的核酸序列的效果。图3A及图3B是本发明另一实施例的将核苷酸的末端保护基去除的示意图。请参考图3A及图3B，本实施例同样是使用光敏型的末端保护基PG，差异在于本实施例是使用紫外线数字光处理(digital light processing，DLP)芯片进行照光。具体而言，紫外线数字光处理芯片包括发光元件300及反射式光阀310。图3A及图3B中多个区域以虚线隔开示意，当发光元件300发出光线L传递至反射式光阀310后，反射式光阀310经由图案化方式而局部照光于预处理表面400的其中几个区域，使得这些区域的连接于引子410的核苷酸420在被光线L照射后其末端保护基PG会分解，而能连接下一个核苷酸420，如图3B所示。借由设计图案化的方式，可以同时在每一个区域中制备不同的核酸序列。
图4A及图4B是本发明另一实施例的将核苷酸的末端保护基去除的示意图。请参考图4A及图4B，本实施例的方式与上述的方式相似，差异仅在于本实施例是使用热敏型的末端保护基PG，因此是借由加热元件500对预处理表面600进行加热(热能传递以曲线箭头示意)，连接于引子610的核苷酸620在加热后其末端保护基PG会分解，如图4B所示。加热处理例如也能以图案化方式局部去除末端保护基PG，即区域加热的形式。举例而言，当使用硅芯片作为反应基片时，可将电路分布于每一个区域中，借由控制通过的电流，以达到区域加热的效果。
请再参考图1，在核苷酸的末端保护基去除后，接着进行步骤S104：借由反应酶将具有末端保护基的另一核苷酸连接至配置于预处理表面的核苷酸。步骤S104的反应与步骤S102相似，差异在于具有末端保护基的核苷酸是连接于先前已连接在引子上的核苷酸。依据所需合成的核酸序列的长度的不同，接着进行步骤S105：判断设计的核酸序列是否完成，若是则获得核酸序列，若未完成则重复步骤S103及S104，继续将核酸序列的长度延伸，直到完成设计的核酸序列。重复步骤时若步骤S103是以图案化方式局部去除不同区域中的末端保护基，则不同区域中的核酸序列的长度可能会不同。以下将配合图式进一步说明使用酶制备核酸序列的方法的具体实施态样，但本发明的使用酶制备核酸序列的方法的具体方式不限于以下所列举的实施例。
图5A至图5I是本发明一实施例的使用酶制备核酸序列的方法的步骤示意图。请参考图1、图5A至图5I，图5A中进行步骤S101：提供具预处理表面700的反应基片，预处理表面700上具有多个引子710，在本实施例中，这些引子710例如是单股DNA，但不以此为限。此处的预处理表面700划分为4个区域：I、II、III、IV。每个区域均具有多个引子710，并且区域I、II、III、IV分别被设计为制备出不同的核酸序列。
图5B中进行步骤S102：借由反应酶将具有末端保护基PG的核苷酸720c配置至预处理表面700上的多个引子710，且反应温度为45℃～105℃。本实施例中所使用的核苷酸720包括核苷酸720a、720c、720g、720t，其分别对应于腺嘌呤核苷酸(dAMP)、胞嘧啶核苷酸(dCMP)、鸟嘌呤核苷酸(dGMP)、胸腺嘧啶核苷酸(dTMP)。图5B中所配置的核苷酸720c为胞嘧啶核苷酸。
图5C中进行步骤S103：借由照光或加热将核苷酸720的末端保护基PG去除。此处是以图案化方式局部去除不同区域中的末端保护基PG，照光或加热的实施方式已详细说明，在此不再重述。图5C中去除了区域II、III的核苷酸720c的末端保护基PG。
图5D中进行步骤S104：借由反应酶将具有末端保护基PG的另一核苷酸720连接至配置于预处理表面700的核苷酸720。图5D中仅有区域II、III的核苷酸720c借由反应酶额外连接了另一个核苷酸720g。
接着进行步骤S105：判断核酸序列是否完成，当判断核酸序列尚未完成时，会重复进行步骤S103、S104，图5E中再次进行步骤S103，去除了区域I的核苷酸720c的末端保护基PG以及区域III的核苷酸720g的末端保护基PG。接着，图5F再次进行步骤S104，借由反应酶将具有末端保护基PG的另一核苷酸720t连接于区域I的核苷酸720c及区域III的核苷酸720g。
之后会再次进行步骤S105，判断核酸序列是否完成，若尚未完成则重复进行步骤S103、S104，图5G去除了区域I的核苷酸720t的末端保护基PG以及区域IV的核苷酸720c的末端保护基PG。图5H借由反应酶将具有末端保护基PG的另一核苷酸720a连接于区域I的核苷酸720t及区域IV的核苷酸720c。
步骤S103、S104会重复直到判断区域I、II、III、IV中的不同核酸序列S皆分别合成完成，如图5I所示。以上即为以图案化方式局部借由照光或加热去除不同区域I、II、III、IV中的末端保护基PG的实施态样，通过这种作法，可以在短时间内制备出大量并且不同的核酸序列S。当这些不同的核酸序列S属于同一基因的序列片段时，借由后续的序列片段粘合，即可量产出相较于公知技术长度较长的核酸序列。
在核酸序列S合成结束后，使用酶制备核酸序列的方法例如还包括步骤S106：借由限制酶将核酸序列S从预处理表面700切割。当限制酶配置于预处理表面后，限制酶会将合成完的核酸序列S从预处理表面700切割。之后再将核酸序列S收集起来，即完成核酸序列S的制备过程。限制酶的实例包括尿嘧啶-DNA糖基化酶(uracil DNA glycosylase，UDG)、核酸内切酶VIII、USER酶(NEB#M5508)等及其组合。举例而言，当使用切位于尿嘧啶核苷酸(UMP)的限制酶时，在反应酶将具有末端保护基PG的核苷酸720配置于引子710之前，会先在引子710上配置一个尿嘧啶核苷酸，当核酸序列完成时，由于是合成脱氧核糖核酸序列，因此序列中并不会包含尿嘧啶核苷酸，限制酶仅针对具有先前配置的单一尿嘧啶核苷酸切位加以切割，进而能够正确地将核酸序列S切割。不同的限制酶会具有不同的切位，本发明并不特别限制。
上述的预处理表面200、400、600、700仅为区别不同实施例而使用不同的数字符号，彼此之间可以交换使用于各不同实施例，引子210、410、610、710以及核苷酸220、420、620、720a、720c、720g、720t的使用方式亦相同。
综上所述，本发明实施例的使用酶制备核酸序列的方法中，由于是使用酶来合成核酸序列，相较于化学合成的方式，较不易污染环境且能降低成本，而反应温度设置于45℃～105℃，相较于公知在37℃下使用酶的作法，本发明实施例在45℃以上使用酶能显示出较佳活性，因此能提升制备核酸序列的效率。
虽然本发明已以实施例揭露如上，然其并非用以限定本发明，本发明所属技术领域中的普通技术人员，在不脱离本发明的精神和范围内，当可作些许的更动与润饰，因此本发明的保护范围当视后附的权利要求书所界定者为准。

Claims (11)

1.一种使用酶制备核酸序列的方法，其特征在于，包括：
(1)提供反应基片，所述反应基片具有预处理表面；
(2)借由反应酶将具有末端保护基的核苷酸配置于所述预处理表面，且反应温度为45℃～105℃；
(3)借由照光或加热将所述核苷酸的所述末端保护基去除；
(4)借由所述反应酶将具有所述末端保护基的另一核苷酸连接至所述核苷酸，且反应温度为45℃～105℃；以及
(5)判断核酸序列是否完成，若是则获得所述核酸序列，若未完成则重复步骤(3)及(4)。
2.如权利要求1所述的使用酶制备核酸序列的方法，其特征在于，所述反应酶为DNA聚合酶。
3.如权利要求2所述的使用酶制备核酸序列的方法，其特征在于，所述反应酶为A家族DNA聚合酶。
4.如权利要求2所述的使用酶制备核酸序列的方法，其特征在于，所述反应酶为B家族DNA聚合酶。
5.如权利要求2所述的使用酶制备核酸序列的方法，其特征在于，所述反应酶为X家族DNA聚合酶。
6.如权利要求1所述的使用酶制备核酸序列的方法，其特征在于，借由照光或加热将所述核苷酸的所述末端保护基去除的方法包括以图案化方式局部去除。
7.如权利要求1所述的使用酶制备核酸序列的方法，其特征在于，借由照光将所述核苷酸的所述末端保护基去除的方法包括使用紫外线数字光处理芯片进行照光。
8.如权利要求1所述的使用酶制备核酸序列的方法，其特征在于，反应温度为50℃～85℃。
9.如权利要求1所述的使用酶制备核酸序列的方法，其特征在于，反应温度为55℃～75℃。
10.如权利要求1所述的使用酶制备核酸序列的方法，其特征在于，所述预处理表面具有多个引子，将具有所述末端保护基的所述核苷酸配置于所述预处理表面的方法包括借由所述反应酶将具有所述末端保护基的所述核苷酸连接至所述引子。
11.如权利要求1所述的使用酶制备核酸序列的方法，其特征在于，所述使用酶制备核酸序列的方法更包括：(6)借由限制酶将所述核酸序列从所述预处理表面切割。
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