CN114929255A - DKK3b的肽模拟物及使用方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了高度有效且稳定的人DKK3b的肽模拟物，其具有许多改进的特性。本发明的肽模拟物可用作治疗多种疾病的治疗剂，其中抑制β‑连环蛋白的核易位是治疗性的，所述疾病包括但不限于癌症/增殖性疾病、代谢疾病、骨质疏松症、神经疾病、免疫疾病、内分泌疾病、心血管疾病、血液疾病和炎性疾病。

Description

DKK3b的肽模拟物及使用方法

相关申请的交叉引用

本申请要求2019年10月29日提交的美国临时申请号62/927,328的权益。上述申请的全部内容通过引用并入本文。

背景技术

Wnt/β-连环蛋白信号传导是影响胚胎发生、器官发生和维持组织和器官稳态的重要细胞调节途径。它在一些生理事件如分化、增殖、存活、氧化应激、形态发生等中也是不可或缺的。

然而，该途径的异常激活是造成多种病理状况的原因。β-连环蛋白稳定和随后易位至细胞核(通常响应于Wnt激活卷曲蛋白(Frizzled)受体)是在各种β-连环蛋白相关疾病如癌症/增殖性疾病、代谢疾病、骨质疏松症、神经疾病、免疫疾病、内分泌疾病、心血管疾病、血液疾病和糖尿病中失调的关键步骤。β-连环蛋白相关障碍是一类β-连环蛋白信号传导途径失调的疾病，最通常伴随导致向细胞核的易位增加和靶基因激活升高的胞浆β-连环蛋白水平增加。

人DKK3b是β-连环蛋白信号传导的38kDa细胞内调节物，并且是包括DKK1、DKK2和DKK4在内的Wnt调节物的4成员家族之一。所有家族成员共有定义该家族的两个50至70个残基长的富含半胱氨酸的结构域(N-1和C-1)。DKK3b与其他家族成员的不同之处在于它是细胞内蛋白质，而不是分泌性多肽，并且不阻断Wnt受体激活。与其家族成员不同，其相关的分泌糖蛋白DKK3也不能阻断Wnt与其同源受体卷曲蛋白的结合。

DKK3b位于Wnt调节的降解复合物的下游，在那里它调节β-连环蛋白向细胞核的运输，并且具有通过阻断泛素化和通过将β-连环蛋白重定向到肌动蛋白细胞骨架来保护β-连环蛋白免受蛋白水解的能力。使用肌球蛋白马达和肌动蛋白纤维，DKK3b在星形胶质细胞的核周空间和质膜的细胞质表面之间快速穿梭。DKK3b通过在与含有β-转导素重复的蛋白(β-TrCP)的复合物中捕获去往细胞核的β-连环蛋白，使β-连环蛋白结合至肌动蛋白细胞骨架并因此不可用于核易位来发挥对β-连环蛋白及其信号传导途径的调节。

除β-连环蛋白外，DKK3b还更广泛地调节共有降解决定子(degron)结构的其他β-TrCP靶底物，包括NF-kB、p38、Decaptor和Erkl/2。NF-kB、p38和Erkl/2蛋白也与稳定的DKK3b依赖性复合物中的细胞质微丝结合。在NF-kB和Decaptor的情况下，这种隔离防止了NF-kB和mTOR信号传导途径激活所需的基于泛素的降解，并由此抑制两种信号传导途径的信号传导。

作为β-连环蛋白核进入的看门者，DKK3b是产生影响Wnt/β-连环蛋白信号传导级联的新治疗形式的有吸引力的靶标，并且扩展了干预该关键途径以阻止异常β-连环蛋白信号传导和治疗各种β-连环蛋白相关疾病的治疗局面。DKK3b及其发现和其在调节β-连环蛋白和β-连环蛋白信号传导途径中的作用描述于WO 2013/148224和WO 2017/070092中。在WO2013/148224和WO 2017/070092中还描述了DKK3b的肽模拟物和DKK3b的变体(具有例如细胞信号传导肽和细胞穿透肽)，适合于重组生产并适合于在疾病的治疗中用作治疗剂。

术语“肽模拟物”和“模拟肽”在本文中可互换地用于描述通过各种研究发现的化合物。肽模拟物可以是分子，如生物学上模拟用作产生肽模拟物的起始参考点的亲本蛋白质或肽的生物功能的肽、修饰的肽或任何其他分子。由于肽模拟物通常被工程化为比亲本分子小，因此它们通常比亲本分子更稳定，制造更容易且更便宜，可引起更少的副作用，并且可被工程化为比靶分子更有效，仅列举这几个优点。尽管在现有技术中存在术语“肽模拟物”和“模拟肽”暗示相对大小的一些情况，但除非另外指明，否则本文所用的这些术语不应被认为是对本文所提及的并涵盖在本发明中的各种基于多肽的分子的大小的限制。

可用作治疗与β-连环蛋白失调相关的疾病的治疗剂的DKK3b的肽模拟物将期望提供与此类工程化肽相关的许多优点中的一个或多个。

发明内容

本发明提供了高度有效且稳定的人DKK3b的肽模拟物，其与现有技术的DKK3b治疗剂相比具有许多改进的特性。本发明的肽模拟物可用作治疗多种疾病的治疗剂，其中抑制β-连环蛋白的核易位是治疗性的，所述疾病包括但不限于癌症/增殖性疾病、代谢疾病、骨质疏松症、神经疾病、免疫疾病、内分泌疾病、心血管疾病、血液疾病和炎性疾病。

肽模拟物包含本文所述的N末端结构域、本文所述的N-1结构域和本文所述的C末端结构域。任选地，肽模拟物可包含在N末端结构域与N-1结构域之间的氨基酸接头和/或在N-1结构域与C末端结构域之间的氨基酸接头。

本发明的肽模拟物包含：

i)N末端结构域，其具有包含无规卷曲、α螺旋或β折叠片层的氨基酸序列且在所述N末端结构域的前6个氨基酸内包含约2至约3个带负电荷的氨基酸；

ii)N-1结构域，其与具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的人DKK1的N-1结构域，具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的人DKK2的N-1结构域，具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的人DKK3b的N-1结构域或具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的人DKK4的N-1结构域至少80％相同，并且其中所述N-1结构域进一步包含细胞穿透肽；以及

iii)C末端结构域，其具有包含无规卷曲、α螺旋或β折叠片层的氨基酸序列，在所述C末端结构域的最后6个氨基酸内包含约2至约3个带负电荷的氨基酸；

其中肽模拟物是β-连环蛋白核易位或β-连环蛋白信号传导途径的抑制剂。优选地，细胞穿透结构域包含具有约4至约8个氨基酸的肽。优选地，细胞穿透结构域包含具有约4至约8个精氨酸残基的肽。优选地，其中DKK1、DKK2、DKK3b或DKK4 N-1结构域的一个或多个半胱氨酸残基被保守氨基酸取代。优选地，N-1结构域包含与SEQ ID NO:7、8、45和46中的一个至少80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约97％、至少约98％或至少约99％相同的氨基酸序列。优选地，N-1结构域包含与SEQ ID NO:45至少80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约97％、至少约98％或至少约99％相同的氨基酸序列。

在又另外的优选方面，本发明的肽模拟物包含：

i)N末端结构域，其具有包含无规卷曲、α螺旋或β折叠片层的氨基酸序列且在所述N末端结构域的前6个氨基酸内包含约2至约3个带负电荷的氨基酸；

ii)如下N-1结构域，其为人DKK1的N-1结构域(例如，具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列)的变体、人DKK2的N-1结构域(例如，具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列)的变体、人DKK3b的N-1结构域(例如，具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列)的变体、或人DKK4的N-1结构域(例如，具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列)的变体；其中所述变体包含细胞穿透肽，并且与人DKK1的N-1结构域、人DKK2的N-1结构域、人DKK3b的N-1结构域或人DKK4的N-1结构域(例如，SEQ IDNO:3、4、5和6中的一个)具有至少约75％、至少约76％、至少约77％、至少约78％、至少约79％或至少约80％序列同一性；或

如下N-1结构域，其与SEQ ID NO:7、8、45、46或69的氨基酸序列具有至少约80％序列同一性并且其中所述N-1结构域包含细胞穿透肽；以及

iii)C末端结构域，其具有包含无规卷曲、α螺旋或β折叠片层的氨基酸序列且在所述C末端结构域的最后6个氨基酸内包含约2至约3个带负电荷的氨基酸；

其中肽模拟物是β-连环蛋白核易位或β-连环蛋白信号传导途径的抑制剂。优选地，细胞穿透结构域是具有约4至约8个氨基酸的肽。优选地，细胞穿透结构域是具有约4至约8个精氨酸残基的肽。例如，约4至约8个连续精氨酸残基。优选地，其中DKK1、DKK2、DKK3b或DKK4 N-1结构域的一个或多个半胱氨酸残基被保守氨基酸取代。优选地，N-1结构域包含与SEQ ID NO:7、8、45和46中的一个至少80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约97％、至少约98％或至少约99％相同的氨基酸序列。优选地，N-1结构域包含与SEQ IDNO:45至少80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约97％、至少约98％或至少约99％相同的氨基酸序列。

优选地，肽模拟物包含N末端结构域、N-1结构域和C末端结构域中的一个或多个之间的氨基酸接头。肽模拟物可包含在N末端结构域与N-1结构域之间的氨基酸接头和/或在N-1结构域与C末端结构域之间的氨基酸接头。优选地，氨基酸接头的长度为约1至约150个氨基酸。在某些方面，肽模拟物包含在N末端结构域与N-1结构域之间的氨基酸接头，其中氨基酸接头的长度在约1个与约70个氨基酸之间；或长度为约1个至约50个氨基酸；或长度为约1至约30个氨基酸；或长度为约1个至约20个氨基酸。在某些另外的方面，肽模拟物包含在N-1结构域与C末端结构域之间的氨基酸接头，其中氨基酸接头的长度在约1个至约150个氨基酸之间；或长度为约1个至约100个氨基酸；或长度为约1个至约75个氨基酸；或长度为约1个至约50个氨基酸；或长度为约1个至约30个氨基酸；或长度为约1个至约20个氨基酸。在某些方面，氨基酸接头的长度为约1个至约2个氨基酸。

优选地，N末端结构域在氨基酸位置2、4和5处包含带负电荷的氨基酸。优选地，N末端结构域包含与SEQ ID NO:59至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约97％、至少约98％或至少约99％相同的氨基酸序列或由其组成。而且，优选地，N末端结构域包含与SEQ ID NO:48至少约80％相同的氨基酸序列或由其组成。在又另外的方面，N末端结构域包含SEQ ID NO:59的氨基序列或由其组成。

优选地，C末端结构域在C末端结构域的最后6个氨基酸内包含两个连续的带负电荷的氨基酸。优选地，C末端结构域在C末端结构域的最后6个氨基酸内包含两个连续的带电荷氨基酸，其中一个带电荷氨基酸带负电荷，并且其中一个带电荷氨基酸带正电荷。优选地，带负电荷的氨基酸正好位于C末端结构域的最后一个氨基酸之前。优选地，两个连续的带电荷氨基酸正好位于C末端结构域的最后一个氨基酸之前。优选地，C末端结构域包含与SEQ ID NO:60至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约97％、至少约98％或至少约99％相同的氨基酸序列或由其组成。而且，优选地，C末端结构域包含与SEQ IDNO:49至少80％相同的氨基酸序列或由其组成。在又另外的方面，C末端结构域包含SEQ IDNO:60的氨基酸序列或由其组成。

优选地，肽模拟物包含与SEQ ID NO:1的氨基酸序列至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约97％、至少约98％或至少约99％相同的氨基酸序列或由其组成。在又另外的方面，肽模拟物包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列或由其组成。在另外的方面，肽模拟物包含SEQ ID NO:70的氨基酸序列或由其组成。

在又另外的方面，肽模拟物包含与SEQ ID NO:66、67或68的氨基酸序列至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约97％、至少约98％或至少约99％相同的氨基酸序列或由其组成。在又另外的方面，肽模拟物包含SEQ ID NO:66、67或68的氨基酸序列。

本发明涵盖包含药学上可接受的赋形剂和本文所述的肽模拟物的药物组合物。

本发明还提供了在患者中抑制β-连环蛋白核易位的方法，所述方法包括向有需要的患者施用至少一种本发明的肽模拟物。优选地，肽模拟物被作为药物配制品的一部分递送。优选地，药物配制品包含至少一种赋形剂。

优选地，至少一种肽模拟物的递送选自皮下递送、口服递送、局部递送、玻璃体内递送、鼻递送、静脉内递送、动脉内递送、肌内递送、腹膜内递送和经粘膜递送中的一种或多种。

优选地，所述方法用于治疗患者中由β-连环蛋白信号传导途径的失调引起的疾病。优选地，所述方法用于治疗选自由癌症/增殖性疾病、代谢疾病、骨质疏松症、神经疾病、免疫疾病、内分泌疾病、心血管疾病、血液疾病和炎性疾病组成的疾病和障碍群组的疾病。

本发明包括在有需要的患者中治疗癌症的方法，其包括向有需要的患者施用本发明的肽模拟物。优选地，至少一种肽模拟物被作为药物配制品的一部分递送，并且任选地包括共同施用治疗性抗癌治疗方案。

本发明还包括治疗患者的疾病的方法，其中所述疾病可通过抑制β-连环蛋白核易位或β-连环蛋白途径来治疗，所述方法包括向所述患者施用治疗有效量的本文所述的肽模拟物。例如，所述疾病可选自疾病和障碍的群组，所述疾病和障碍选自癌症/增殖性疾病、代谢疾病、骨质疏松症、神经疾病、免疫疾病、内分泌疾病、心血管疾病、血液疾病和炎性疾病。

优选地，用于本文所述的方法的肽模拟物具有与SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约97％、至少约98％或至少约99％同一性的氨基酸序列。优选地，所述肽包含SEQ ID NO:1、66、67和68的氨基酸序列。优选地，所述方法用于治疗患者中由β-连环蛋白信号传导途径的失调引起的疾病。优选地，本发明的方法进一步包括共同施用治疗性抗癌治疗方案。

本发明还包括编码本文所述的肽模拟物的核酸分子以及包含所述核酸分子的载体或宿主细胞。在又另外的方面，宿主细胞包含载体，所述载体包含编码本文所述的肽模拟物的核酸分子。宿主细胞可选自哺乳动物细胞、细菌细胞、酵母细胞、昆虫细胞和植物细胞。在某些具体方面，核酸分子编码包含SEQ ID NO:1、66、67、68和70的氨基酸序列的肽模拟物。载体可以是例如病毒载体，如慢病毒、逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒。宿主细胞可以是哺乳动物细胞，例如包含本文所述的载体的哺乳动物细胞表达***；所述哺乳动物细胞表达***可以例如选自CHO细胞和HEK293细胞。

本发明另外包括通过化学合成方法制备肽模拟物的方法以及通过此类方法制备的肽模拟物。

在某些方面，肽模拟物可进一步包含纯化标签。例如，纯化标签可以是聚组氨酸(His)标签、cMyc标签或FLAG标签。本发明还包括进一步包含信号分泌肽的肽模拟物；例如，信号分泌肽选自IL-2信号肽、IgG信号肽、Igκ信号肽和azuricidin信号肽。

附图说明

图1是人野生型(wt)DKK3b的注释序列的示意图，其示出N末端结构域、N-1结构域、N-1结构域的推定环2和C末端结构域的氨基酸位置。

图2是示出TopFlash Reporter细胞中AC1(SEQ ID NO:1)与cpDKK3b(SEQ ID NO:2)之间关于β-连环蛋白沉默活性的比较的图。

图3是示出卵巢癌细胞(OVCAR3)和结直肠癌细胞(Colo205)中，AC1(SEQ ID NO:1)和cpDKK3b(SEQ ID NO:2)之间关于β-连环蛋白沉默活性的比较的图。

图4是示出AC1(SEQ ID NO:1)在携带OVCAR3细胞的异种移植肿瘤的裸鼠中的生物利用度的图。

图5是示出在植入表达β连环蛋白依赖性萤光素酶cDNA的卵巢癌(OVCAR3)细胞并用1μg AC2治疗的小鼠中，随时间(注射后天数)的肿瘤β-连环蛋白信号传导(作为未治疗对照的百分比)的图。

具体实施方式

定义

本文可互换使用的术语“氨基酸”，或当与肽相关时，“氨基酸残基”或“残基”包括所有天然存在的氨基酸。氨基酸被分类为疏水性、极性和带电荷的。表1示出了最常见氨基酸的分类，并且当描述本发明的肽模拟物时将在本文中提及。

表1非极性氨基酸(疏水性)

<u>氨基酸</u>	<u>三字母代码</u>	<u>单字母代码</u>
			甘氨酸	Gly	G
丙氨酸	Ala	A
			缬氨酸	Val	V
亮氨酸	Leu	L
			异亮氨酸	Ile	I
甲硫氨酸	Met	M
			苯丙氨酸	Phe	F
色氨酸	Trp	W
			脯氨酸	Pro	P

极性(亲水性)

丝氨酸	Ser	S
			苏氨酸	Thr	T
半胱氨酸	Cys	C
			酪氨酸	Tyr	Y
天冬酰胺	Asn	N
			谷氨酰胺	Gln	Q

带电荷(负电荷)

天冬氨酸	Asp	D
			谷氨酸	Glu	E

带电荷(正电荷)

赖氨酸	Lys	K
			精氨酸	Arg	R
组氨酸	His	H

除了表1中发现的那些之外的氨基酸可以用于本发明的肽模拟物。例如，通过天然过程如通过翻译后加工或通过本领域熟知的化学修饰技术修饰的氨基酸。

如本文所用，短语“β-连环蛋白核易位的蛋白抑制剂的肽模拟物”是指合理设计的本发明的肽，其能够在与含有β-转导素重复的蛋白(β-TrCP)的复合物中特异性结合去往细胞核的β-连环蛋白，从而使得β-连环蛋白不可用于核易位。

如本文所用，短语“β-连环蛋白途径的蛋白抑制剂的肽模拟物”是指合理设计的本发明肽，其能够特异性地与β-连环蛋白途径的组分相互作用，导致减少或抑制β-连环蛋白对生物***的作用。如本文所用，“β-连环蛋白途径”是指β-连环蛋白上游或下游的任何信号转导途径(例如包括Wnt/β-连环蛋白信号传导途径)。本发明的肽模拟物对β-连环蛋白途径的抑制优选通过在多组分复合物中靶向β-连环蛋白捕获来防止核易位，从而使β-连环蛋白引导的基因表达沉默来直接抑制β-连环蛋白。

“分泌识别肽”(SRP)在本文中也称为“信号分泌肽”，其包括能够接合ER膜中的SRP受体(易位子)的任何肽，这是移动生长中的多肽链穿过ER膜进行分泌所需的。

如本文所用，术语“特异性结合”、“特异性识别”或“特异性相互作用”当提及β-连环蛋白核易位的蛋白抑制剂的肽模拟物时，是指优先将β-连环蛋白的降解决定子锁定至β-TrCP的WD40结构域的肽模拟物，优选以与例如为了抑制β-连环蛋白或β-连环蛋白途径而引入肽模拟物的细胞中存在的其他生物分子相比高的亲和力。同样，本发明的肽模拟物还可以以高亲和力优先结合β-连环蛋白途径中的结合配偶体或其他靶标以间接抑制β-连环蛋白。优选地，本发明的肽模拟物应理想地特异性结合人野生型DKK3b蛋白的靶分子。这意味着人DKK3b的肽模拟物应理想地以与人野生型DKK3b蛋白结合其靶标的亲和力相比相似的亲和力或更高的亲和力结合靶分子如β-连环蛋白，但不应以任何显著的程度结合野生型DKK3b不结合的分子。

“人野生型DKK3b”在本文中也可称为“wthDKK3b”、“hDKK3b”或“DKK3b”。人野生型DKK3b具有SEQ ID NO:47的氨基酸序列。如本文所用，“hDKK3b的N末端结构域”包含SEQ IDNO:47的范围为1至约20或21的氨基酸。如本文所用，hDKK3b的C末端结构域包含SEQ ID NO:47的范围为约266至约279的氨基酸。如本文所用，hDKK3的N-1结构域包含范围为约74至126的氨基酸。

“保守”氨基酸取代是指多肽中的一个氨基酸被另一个具有类似特性如大小或电荷的氨基酸取代。在某些实施方案中，包含保守氨基酸取代的多肽保持未取代多肽的至少一种活性。

如本文所用，术语“共同施用”(“co-administration”和“co-administering”)是指向受试者施用至少两种药剂或疗法。在一些实施方案中，两种或更多种药剂或疗法的共同施用是并行的。在其他实施方案中，第一药剂/疗法在第二药剂/疗法之前施用。本领域技术人员理解，所使用的各种药剂或疗法的配制品和/或施用途径可以变化。共同施用的适当剂量可由本领域技术人员容易地确定。在一些实施方案中，当共同施用药剂或疗法时，各药剂或疗法以比适于其单独施用的剂量更低的剂量施用。因此，在药剂或疗法的共同施用降低潜在有害(例如，毒性)药剂的必需剂量的实施方案中，和/或当两种或更多种药剂的共同施用通过另一种药剂的共同施用导致受试者对一种药剂的有益作用敏感时，共同施用是尤其期望的。

如本文所用，术语“药物组合物”是指活性剂(例如，结合剂)与惰性或活性载体的组合，使得组合物尤其适用于体外、体内或离体的诊断或治疗用途。

如本文所用，“诊断”或“诊断测试”包括检测、鉴定或表征受试者的疾病状态或病症。例如，可以表征疾病或病症以确定患有疾病或病症的受试者将对特定疗法有反应的可能性，确定患有疾病或病症的受试者的预后(或其可能的进展或消退)，确定治疗对患有疾病或病症的受试者的影响，或确定未来的治疗作用历程。

根据本发明的治疗或方法的术语“功效”可以基于响应于根据本发明的用途或方法的疾病或病症历程中的变化来测量。例如，根据本发明的治疗或方法的功效可以通过其对i)不同的相关临床终点和/或对ii)替代标记物的影响来测量，例如治疗化合物在不同动物或体外***中的影响。

如本文所用，术语“有效量”是指至少一种根据本发明的模拟肽或其药物配制品在被施用本发明的肽模拟物的受试者中引起所治疗疾病的症状的可检测减轻的量。

如本文所用，在“抑制β-连环蛋白核易位”或“抑制β-连环蛋白信号传导途径”的上下文中，“抑制”(“inhibiting”或“inhibition”或“to inhibit”)通常意指减少、降低、抑制、阻断或拮抗靶标的活性。特别地，“调节”(“modulating”或“to modulate”)可以意指与在相同条件下在相同测定中但不存在本发明的肽模拟物的情况下靶标的活性(即基线)相比，将靶标(例如，β-连环蛋白)的(相关的或预期的)生物活性(例如，β-连环蛋白核易位)的活性降低或抑制至少5％、至少10％、至少25％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、或90％或更多。

如本文所用，术语“药学上可接受的”或“药理学上可接受的”是指当向受试者施用时基本上不产生不良反应，例如毒性、过敏性或免疫反应的组合物。

如本文所用，术语“药学上可接受的载体”是指任何标准药物载体，包括但不限于磷酸盐缓冲盐水溶液、水、乳液(例如，油/水或水/油乳液)和各种类型的润湿剂、任何和所有溶剂、分散介质、包衣、月桂基硫酸钠、等渗剂和吸收延迟剂、崩解剂(例如，马铃薯淀粉或淀粉乙醇酸钠)等。所述组合物还可以包括稳定剂和防腐剂。关于载体、稳定剂和佐剂的例子，参见例如Martin,Remington's Pharmaceutical Sciences,第15版,Mack Publ.Co.,Easton,Pa.(1975)。

如本文所用，术语“序列同一性”是指两个聚合物序列(例如，肽、多肽、核酸等)具有相同的单体亚单位顺序组成的程度。术语“序列相似性”是指两个聚合物序列(例如，肽、多肽、核酸等)具有相似聚合物序列的程度。例如，相似的氨基酸是具有相同生物物理特征的那些，并且可以被分组为家族(参见上文)。“序列同一性百分比”(或“序列相似性百分比”)通过以下计算：(1)在比较窗口(例如，较长序列的长度、较短序列的长度、指定窗口等)上比较两个最佳比对的序列，(2)确定含有相同(或相似)单体(例如，相同的氨基酸出现在两个序列中，相似的氨基酸出现在两个序列中)的位置的数目以产生匹配位置的数目，(3)将匹配位置的数目除以比较窗口(例如，较长序列的长度、较短序列的长度、指定窗口)中的位置总数，和(4)将结果乘以100以产生序列同一性百分比或序列相似性百分比。例如，如果肽A和B的长度都是20个氨基酸，并且除了1个位置之外都具有相同的氨基酸，则肽A和肽B具有95％序列同一性。如果在不同位置的氨基酸具有相同的生物物理特征(例如，两者都是酸性的)，则肽A和肽B将具有100％序列相似性。作为另一个例子，如果肽C的长度为20个氨基酸，肽D的长度为15个氨基酸，并且肽D中15个氨基酸中的14个与肽C的一部分的那些相同，则肽C和D具有70％序列同一性，但是肽D与肽C的最佳比较窗口具有93.3％序列同一性。出于在本文中计算“序列同一性百分比”(或“序列相似性百分比”)的目的，将比对序列中的任何空位视为该位置处的错配。优选地，比较窗口是参考序列的连续区段，具有约且优选约20个氨基酸至约40个氨基酸、约40个氨基酸至约60个氨基酸、约60个氨基酸至约80个氨基酸、约80个氨基酸至约100个氨基酸、约100个氨基酸至约120个氨基酸、约120个氨基酸至约140个氨基酸、约140个氨基酸至约150个氨基酸、约150个氨基酸至约155个氨基酸、约155个氨基酸直至参考序列的全长。用于确定氨基酸序列同一性百分比的目的的比对可以以本领域技术范围内的多种方式来实现，例如，使用公众可获得的计算机软件，如BLAST、BLAST-2、ALIGN、ALIGN-2或Megalign(DNASTAR)软件。

如本文所用，术语“受试者”或“患者”是指可以施用根据本公开文本的组合物的任何生物体，例如，用于实验、诊断、预防和/或治疗目的。典型受试者包括动物(例如，哺乳动物，如小鼠、大鼠、兔、非人灵长类动物和人)和/或植物。优选地，“患者”是指可能寻求或可能需要治疗、需要治疗、正在接受治疗、将要接受治疗的人受试者，或者由受过训练的职业人员针对特定疾病或病症进行护理的受试者。

如本文所用，术语“预防”是指部分或完全延迟感染、疾病、障碍和/或病症的发作；部分或完全延迟特定感染、疾病、障碍和/或病症的一种或多种症状、特征或临床表现的发作；部分或完全延迟特定感染、疾病、障碍和/或病症的一种或多种症状、特征或表现的发作；部分或完全延迟从感染、特定疾病、障碍和/或病症的进展；和/或降低发展与感染、疾病、障碍和/或病症相关的病理的风险。

如本文所用，术语“蛋白质”或“肽”是指通过肽键连接在一起的至少两个或更多个氨基酸残基。蛋白质或肽中的氨基酸序列以标准形式，即从氨基末端(N末端)到羧基末端(C末端)显示。

如本文所用，术语“治疗有效量”意指要递送的药剂(例如，核酸、蛋白质或肽、药物、治疗剂、诊断剂、预防剂等)在施用于患有或易患感染、疾病、障碍和/或病症的受试者时，足以治疗所述感染、疾病、障碍和/或病症，改善所述感染、疾病、障碍和/或病症的症状，诊断所述感染、疾病、障碍和/或病症，预防所述感染、疾病、障碍和/或病症，和/或延迟所述感染、疾病、障碍和/或病症的发作的量。例如，在癌症或与失调的细胞***相关的病理中，治疗有效量是指具有以下作用的量：(1)减小肿瘤的大小，(2)抑制(即，在一定程度上减缓，优选地停止)异常细胞***，例如癌细胞***，(3)诱导癌症或肿瘤细胞死亡和/或抑制癌症或肿瘤细胞增殖，(4)预防或减少癌细胞的转移，和/或，(5)在一定程度上缓解(或，优选地，消除)与病理相关的一种或多种症状，所述病理与失调的或异常的细胞***相关或部分由其引起，包括例如癌症或血管生成。

如本文所用，术语疾病(或病症或障碍)的“治疗”(“treating”或“treatment”)是指防止疾病在可能易患疾病但尚未经历或展现疾病症状的人受试者或动物受试者中发生(预防性治疗)，抑制疾病(减缓或阻止其发展)，提供疾病症状或副作用的缓解(包括姑息治疗)，以及引起疾病消退。例如，对于癌症，这些术语还意味着受癌症累及的个体的预期寿命可能增加或疾病的一种或多种症状将减少。例如，对于癌症，“治疗”还包括增强或延长受试者的抗肿瘤反应。

如本文所用，“组合”、“组合疗法”和/或“组合治疗方案”的任何形式的施用或共同施用是指用至少两种治疗活性药物或组合物治疗疾病，所述至少两种治疗活性药物或组合物可以在分开的或组合的配制品中同时地施用或共同施用，或在按分钟、小时或天数隔开的不同时间依序地施用或共同施用，但以某种方式一起作用以提供所需治疗反应。

如本文所用，如应用于一个或多个目的值的术语“约”或“大约”是指与所陈述的参考值类似的值。在某些实施方案中，除非另外陈述或者上下文另有明确含义，否则术语“大约”或“约”是指落在所陈述参考值的任一方向(大于或小于)上的10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％或更小百分比内的值的范围(这个数字会超过可能值的100％的情况除外)。

术语“变体”是指氨基酸序列与天然或参考序列不同的分子。如与天然或参考序列相比，氨基酸序列变体可以在氨基酸序列内的某些位置具有取代、缺失和/或***。基本上同源是指除了1、2、3、4、5或6个氨基酸残基的缺失、***和/或取代以外与参考肽序列相同的变体氨基酸序列。两个氨基酸序列的同一性可以通过目测和/或数学计算来确定，或更容易地通过使用用于序列比较的已知计算机程序比较序列信息来确定。变体可以包含具有至少一个保守取代的氨基酸的序列，这意味着给定的氨基酸残基被具有相似物理化学特征的残基替代。所需的氨基酸取代(无论是保守的还是非保守的)可由本领域技术人员在需要此类取代时确定。优选地，变体将与天然或参考序列具有至少约50％同一性(同源性)，并且优选地，变体将与天然或参考序列是至少约75％、至少约80％、更优选至少约90％相同的(同源的)。

如本文所用，术语“保守氨基酸取代”是指用大小、电荷或极性类似的不同氨基酸取代正常存在于序列中的氨基酸。保守取代的例子包括用非极性(疏水)残基(如异亮氨酸、缬氨酸和亮氨酸)取代另一个非极性残基。同样，保守取代的例子包括用一个极性(亲水)残基取代另一个极性残基，如在精氨酸与赖氨酸之间、在谷氨酰胺与天冬酰胺之间以及在甘氨酸与丝氨酸之间的取代。另外，用碱性残基(如赖氨酸、精氨酸或组氨酸)取代另一个碱性残基，或者用一个酸性残基(如天冬氨酸或谷氨酸)取代另一个酸性残基，是保守取代的其他例子。非保守取代的例子包括用非极性(疏水)氨基酸残基(如异亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸、丙氨酸、甲硫氨酸)取代极性(亲水)残基(如半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸或赖氨酸)，和/或用极性残基取代非极性残基。

如本文所用，术语“重组体”通常是指非天然存在的核酸、核酸构建体或多肽。此类非天然存在的核酸可以包括已经被修饰的天然核酸(例如具有缺失、取代、倒位、***等的天然核酸)，和/或使用分子生物学技术连接的不同来源的核酸序列的组合(例如，编码融合蛋白(例如，由两种不同蛋白质或蛋白质片段的组合形成的蛋白质或多肽)的核酸序列，编码多肽的核酸与启动子序列的组合-其中编码序列和启动子序列来自不同的来源或原本通常不会天然地一起出现(例如，核酸和组成型启动子)，等等)。重组体也指由重组核酸编码的多肽。非天然存在的核酸或多肽包括人为修饰的核酸和多肽。

如本文所用，“融合蛋白”是指由至少两种不同蛋白质或蛋白质片段的组合形成的蛋白质。融合蛋白由重组DNA分子编码。

下表A列出了本文提及的一些氨基酸序列以及它们相应的SEQ ID NO，其中Φ₁、Φ₂和ω各自如下所定义：

肽模拟物

本发明提供了作为β-连环蛋白核易位和β-连环蛋白信号传导途径的蛋白抑制剂的DKK3b的肽模拟物。本发明的肽是模拟人野生型DKK3b(本文也称为“wtDKK3b”或“hDKK3b”)功能的工程化肽。野生型人DKK3b具有SEQ ID NO:47的氨基酸序列：

MEAEEAAAKASSEVNLANLPPSYHNETNTDTKVGNNTIHVHREIHKITNNQTGQMVFSETVITSVGDEEGRRSHECIIDEDCGPSMYCQFASFQYTCQPCRGQRMLCTRDSECCGDQLCVWGHCTKMATRGSNGTICDNQRDCQPGLCCAFQRGLLFPVCTPLPVEGELCHDPASRLLDLITWELEPDGALDRCPCASGLLCQPHSHSLVYVCKPTFVGSRDQDGEILLPREVPDEYEVGSFMEEVRQELEDLERSLTEEMALREPAAAAAALLGGEEI(SEQ ID NO:47)

图1是包括N末端结构域、C末端结构域、N-1结构域和N-1结构域的环2区域的人wtDKK3b的示意图。

以前发现DKK3b是DKK蛋白家族的新型细胞内成员。先前的研究显示DKK3b特异性结合E3泛素连接酶组分(含有β-转导素重复的蛋白β-TrCP)，并且该复合物又结合未磷酸化的β-连环蛋白，从而阻止其核输入。基于该发现，人DKK3b执行至少两个作用：1)β-连环蛋白隔离；和2)β-连环蛋白易位。

在先前的研究中，测试了DKK3b作为癌症治疗剂的潜力。通过将细胞穿透(cp)肽以及聚His标签融合到DKK3b的N末端并在细菌中重组产生融合蛋白，产生具有细胞穿透能力的人DKK3b用于治疗性递送。所得融合蛋白在本文中称为“cpDKK3b”。cpDKK3b融合蛋白具有SEQ ID NO:58的氨基酸序列：

MRGSLKHHHHHHLKGMASMTGGQQMKLGDIYARAAARQARADIGGSTMEAEEAAAKASSEVNLANLPPSYHNETNTDTKVGNNTIHVHREIHKITNNQTGQMVFSETVITSVGDEEGRRSHECIIDEDCGPSMYCQFASFQYTCQPCRGQRMLCTRDSECCGDQLCVWGHCTKMATRGSNGTICDNQRDCQPGLCCAFQRGLLFPVCTPLPVEGELCHDPASRLLDLITWELEPDGALDRCPCASGLLCQPHSHSLVYVCKPTFVGSRDQDGEILLPREVPDEYEVGSFMEEVRQELEDLERSLTEEMALREPAAAAAALLGGEEI(SEQ ID NO:58).

另一种融合蛋白由SEQ ID NO:2表示：

MRGSLKHHHHHHLKGMASMTGGQQMKLGDIYARAAARQARADIGGSTMEAEEAAAKASSEVNLANLPPSYHNETNTDTKVGNNTIHVHREIHKITNNQTGMVFSETVITSVGDEEGRRSHECIIDEDCGPSMYCQFASFQYTCQPCRGQRMLCTRDSECCGDQLCVWGHCTKMATRGSNGTICDNQRDCQPGLCCAFQRGLLFPVCTPLPVEGELCHDPASRLLDLITWELEPDGALDRCPCASGLLCQPHSHSLVYVCKPTFVGSRDQDGEILLPREVPDEYEVGSFMEEVRQELEDLERSLTEEMALREPAAAAAALLGGEEI(SEQ ID NO:2).

未折叠蛋白的纯化产生线性多肽链，当将所述线性多肽链在体外添加至细胞或在体内注射至荷瘤小鼠中时，所述线性多肽链迅速且选择性地阻止癌细胞增殖并快速引发肿瘤细胞凋亡(WO 2013/148224；其内容明确地并入本文)。重要的是，当每天两次给药持续35天时，cpDKK3b融合蛋白在小鼠中没有显现出具有任何副作用。

后续研究(WO2017/070092；其内容明确地并入本文)通过设计具有改进特征(包括改进的细胞穿透肽(cp)和分泌识别肽(SRP))的DKK3b变体聚焦于优化人DKK3b以用于治疗用途。基于来自这些研究的数据和信息，使用各种细胞穿透肽和SRP产生几种另外的变体并进行测试。

这些研究发现，人wtDKK3b的N末端122个氨基酸和C末端最后10个残基具有一个或多个对于抑制β-连环蛋白易位至细胞核和相关肿瘤抑制功能必不可少的结构域。N末端122个氨基酸与C末端最后10个残基的融合产生完全功能性的肿瘤抑制物。进一步的分析揭示，人野生型DKK3b的氨基酸12至氨基酸70之间的残基对于抑制β-连环蛋白易位和相关的肿瘤抑制活性也不是必需的。

本发明人发现，通过工程化能够抑制β-连环蛋白核易位或能够抑制β-连环蛋白信号传导途径的DKK3b的肽模拟物，可以显著改进先前的DKK3b融合蛋白和变体。具有DKK3b抑制功能的本发明的工程化肽模拟物提供了相对于例如先前描述的cpDKK3b(SEQ ID NO:2)及其变体的另外的改进和增强。本发明的蛋白质模拟物优于例如cpDKK3b及其变体，因为它们可以被工程化以消除不必要的序列，减少或消除抗原性，改进和简化蛋白质模拟物的重组生产，增加膜渗透性和细胞信号传导，增加稳定性，增加生物半衰期和/或增加作为β-连环蛋白抑制剂或作为β-连环蛋白途径抑制剂的效力。

例如，本发明的肽模拟物还提供了与例如变性的线性cpDKK3b融合蛋白相比具有折叠构象的蛋白。本发明的肽模拟物的效力比cpDKK3b的效力高出多达10,000倍(图2和图3)。

根据本发明的肽模拟物已被工程化为包括以下特征：

1)消除cpDKK3b的外源性细胞穿透性cp肽；

2)用随机氨基酸替代cpDKK3b的N和C末端结构域，所述随机氨基酸形成无规卷曲、α螺旋或β折叠片层，并且在N末端结构域的前约6个氨基酸内含有约2至约3个带负电荷的残基并且在C末端结构域的最后6个氨基酸内含有约2至约3个带负电荷的氨基酸；

3)消除wtDKK3b中的除了N-1结构域之外的所有其他结构域；

4)用DKK1、DKK2或DKK4中任一个的N-1结构域任选取代cpDKK3b N-1结构域；

5)修饰所选择的N-1结构域以包括细胞穿透肽；

6)任选地修饰N-1结构域以去除一个或多个半胱氨酸残基；以及

7)在肽模拟物的结构域中的一个或多个之间约1至约150、约1至约100、约1至约75、约1至约50、约1至约30、约1至约20个氨基酸的任选接头，优选约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、40、50、60、70、75、80、90、100、110、120、130、140、或150个氨基酸的接头，并且优选地在N末端或C末端结构域的区域处的那些接头包含有助于形成无规卷曲、α螺旋或β折叠片层的二级结构。

外源性细胞穿透肽的消除去除了DKK3b的工程化蛋白质模拟物中的潜在抗原靶标。发现细胞穿透肽可替代地掺入蛋白质模拟物的N-1结构域中，如下文所讨论的。

用优选约19至约22个随机氨基酸替代cpDKK3b的N末端66个氨基酸(SEQ ID NO:58的氨基酸1-66)消除了肽模拟物内的糖基化位点。本发明人已经发现，任何人DKK3b蛋白或其变体以及DKK3b的任何工程化肽模拟物的糖基化使其作为β-连环蛋白核易位或β-连环蛋白信号传导途径的抑制剂的功能失活。这对于在其中发生翻译后糖基化的细胞系如哺乳动物细胞系中通过重组技术产生的肽模拟物特别重要。通过细胞分泌机制消除翻译后糖基化允许在任何期望的细胞***(包括哺乳动物细胞)中产生肽模拟物。

与cpDKK3b相比，肽模拟物的N末端结构域的功能可被概括。在整个本公开文本中，参考N末端结构域的氨基酸位置。在使用细胞表达***(包括哺乳动物重组***)产生的大多数肽中，蛋白质位置1处的氨基酸是甲硫氨酸。在某些细菌***中，位置1处的氨基酸是N-甲酰甲硫氨酸(fMet)。在通过化学肽合成(包括，例如，液相和固相化学肽合成)产生的肽中，N末端可缺少起始甲硫氨酸和/或被另一种氨基酸替代。本发明所涵盖的N末端结构域包括其中位置1处的氨基酸是甲硫氨酸的N末端结构域以及其中位置1的氨基酸位置不是甲硫氨酸的N末端结构域。在某些方面，本文所述的肽和肽模拟物包含其中N末端结构域的位置1处的氨基酸是丝氨酸、苏氨酸或除脯氨酸之外的非极性氨基酸的N末端结构域。在另外的方面，N末端结构域的位置1处的氨基酸是甲硫氨酸。在某些另外的方面，N末端结构域的位置1是丙氨酸或异亮氨酸。N末端结构域和肽模拟物的位置1处的氨基酸也可以是甲硫氨酸、fMet、或丝氨酸、苏氨酸或除脯氨酸和甲硫氨酸之外的非极性氨基酸，包括例如丙氨酸和异亮氨酸。N末端结构域的氨基酸序列可以在N末端结构域的位置1处的起始氨基酸之后(例如在位置1处的起始甲硫氨酸之后)是随机的，只要随机氨基酸序列形成无规卷曲、α螺旋或β折叠片层并且在N末端结构域的前6个氨基酸内包括至少两个或三个带负电荷的氨基酸。优选地，形成无规卷曲、α螺旋或β折叠片层的氨基酸不包括脯氨酸，因为脯氨酸不能稳定螺旋或β折叠片层。该策略可进一步通过将带负电荷的氨基酸中的至少一个恰好定位在N末端序列的位置1处的氨基酸例如起始甲硫氨酸之后来优化。该策略可以通过将带负电荷的氨基酸定位在N末端结构域的位置2、4和5来进一步优化。

优选的N末端结构域包含以下氨基酸序列或由其组成：MDAEDLLLKLNLAATVGTAPP(SEQ ID NO:59)。在又另外的方面，N末端结构域由SEQ ID NO:59组成。另一个示例性N末端结构域具有以下氨基酸序列：MEADELLLKLNLAATVGFAPP(SEQ ID NO:48)。还考虑了具有一个或多个氨基酸添加、缺失和/或保守取代的SEQ ID NO:48或SEQ ID NO:59变体，其保留了对β-连环蛋白核易位的抑制活性。一个或多个氨基酸添加、缺失和/或取代对任何变体活性的影响可以使用本领域已知的和实施例中描述的常规方法和测定来测试。优选地，本发明的肽模拟物可包括与SEQ ID NO:59的序列具有至少约70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性或相似性的N末端结构域。优选地，本发明的肽模拟物可包括在SEQ ID NO:59的约20个氨基酸直至全长的连续区段上与SEQ ID NO:59的序列具有至少约70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性或相似性的N末端结构域。在另外的方面，本发明的肽模拟物可包括与SEQ ID NO:48的序列具有至少约70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性或相似性的N末端结构域。在另外的实施方案中，本发明的肽模拟物可包括在SEQ ID NO:48的约20个氨基酸直至全长的连续区段上与SEQ ID NO:48的序列具有至少约70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性或相似性的N末端结构域。

另一个优选的N末端结构域包含以下氨基酸序列：DAEDLLLKLNLAATVGTAPP(SEQ IDNO:61)(始于第二个氨基酸)。在又另外的方面，N末端结构域包含以下氨基酸序列或由其组成：Φ₁DAEDLLLKLNLAATVGTAPP(SEQ ID NO:62)，其中Φ₁是除脯氨酸之外的非极性氨基酸(包括例如甲硫氨酸、丙氨酸和异亮氨酸)，或是丝氨酸或苏氨酸；在某些方面，Φ₁是苏氨酸、丝氨酸或除脯氨酸和甲硫氨酸之外的非极性氨基酸。在另外的方面，Φ₁是丙氨酸或异亮氨酸。在又另外的方面，N末端结构域由SEQ ID NO:62组成。在某些优选的方面，N末端结构域包含以下氨基酸序列之一或由其组成：ADAEDLLLKLNLAATVGTAPP(SEQ ID NO:63)或IDAEDLLLKLNLAATVGTAPP(SEQ ID NO:64)。还考虑了SEQ ID NO:61、62、63和64中任一个的具有一个或多个氨基酸添加、缺失和/或保守取代的变体，其保留了对β-连环蛋白核易位的抑制活性，并且可用作N末端结构域。一个或多个氨基酸添加、缺失和/或取代对任何变体活性的影响可以使用本领域已知的和实施例中描述的常规方法和测定来测试。优选地，本发明的肽模拟物可包括与SEQ ID NO:61、62、63和64中任一个的序列具有至少约70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性或相似性的N末端结构域。优选地，本发明的肽模拟物可包括在SEQ ID NO:61、62、63和64中任一个的约20个氨基酸直至全长的连续区段上与SEQ ID NO:61、62、63和64中任一个的序列具有至少约70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性或相似性的N末端结构域。

肽模拟物可包含本文所述的N末端结构域，例如，当肽模拟物从N末端开始(或换句话说，从肽模拟物的第一个氨基酸开始)的氨基酸序列对应于本文所述的特定N末端结构域的序列(例如，SEQ ID NO:59、62、63、或64)时。例如，当肽模拟物的氨基酸1至21是SEQ IDNO:59、62、63、或64时。

C末端结构域也可以以类似于N末端结构域的方式被概括。cpDKK3b的C末端152个氨基酸残基(例如，SEQ ID NO:2的氨基酸174至326)被约12至约14个随机氨基酸替代，只要序列形成无规卷曲、α螺旋或β折叠片层并且在C末端结构域的最后6个氨基酸内包括至少两个或三个带负电荷的氨基酸即可。

该策略可通过在最后6个氨基酸中包括至少两个连续的带负电荷的氨基酸残基或至少两个连续的氨基酸残基(其中一个是带负电荷的氨基酸，其中一个是带正电荷的氨基酸)来进一步优化。优选地，连续的带电荷氨基酸正好位于C末端结构域的最后一个氨基酸之前。例如，如果C末端的最后一个氨基酸的氨基酸位置是ψ，则“恰好在最后一个氨基酸之前”的两个连续带电荷氨基酸在位置ψ-1和ψ-2处。类似地，如果该序列包括“恰好在最后一个氨基酸之前”的三个连续带电荷氨基酸，则这三个连续带电荷氨基酸位于位置ψ-1、ψ-2、和ψ-3处。优选的C末端结构域包含以下氨基酸序列或由其组成：TAALLIILGGDDI(SEQ IDNO:60)。C末端结构域的另一个例子包含以下氨基酸或由其组成：TSQLLIILGGDDI(SEQ IDNO:49)。

肽模拟物可包含如本文所述的C末端结构域，例如，当肽模拟物的C末端的氨基酸序列(终止于最后一个氨基酸)是本文所述的特定C末端结构域的序列(例如，SEQ ID NO:60)时；或者换句话说，肽模拟物的最后13个氨基酸是SEQ ID NO:60。

还考虑了SEQ ID NO:60或SEQ ID NO:49的具有一个或多个氨基酸添加、缺失和/或保守取代的变体，其保留了对β-连环蛋白核易位的抑制活性。一个或多个氨基酸添加、缺失和/或取代对任何变体活性的影响可以使用本领域已知的和实施例中描述的常规方法和测定来测试。优选地，本发明的肽模拟物可包括与SEQ ID NO:60的序列具有至少约70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性或相似性的C末端结构域。优选地，本发明的肽模拟物可包括在SEQ ID NO:60的约20个氨基酸直至全长的连续区段上与SEQ ID NO:60的序列具有至少约70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性或相似性的N末端结构域。在另外的方面，本发明的肽模拟物可包括与SEQ ID NO:49的序列具有至少约70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性或相似性的C末端结构域。在另外的方面，本发明的肽模拟物可包括在SEQ ID NO:49的约20个氨基酸直至全长的连续区段上与SEQ ID NO:49的序列具有至少约70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性或相似性的C末端结构域。

关于本发明的肽模拟物的N和C末端的上述概括，并且不限于任一种科学理论，缺失分析揭示可以消除人野生型DKK3b(图1，SEQ ID NO:47)的残基10-70而不使蛋白质失活。选择20-21个残基的序列长度是因为脯氨酸二聚***于人野生型人DKK3b(SEQ ID NO:47)中离N末端20个残基的位置，并且将在蛋白质中引入可能关键的“扭结”。在人野生型DKK3b的位置2、4或5处的带负电荷残基中的一个或多个的缺失使蛋白质失活，因此在这些位置的负电荷显现是必需的。

DKK3b的N-1结构域是β-连环蛋白信号传导沉默所需的关键结构域。所有人DKK家族成员的N-1结构域的比对揭示了相当大的组织保守性，提高了所有家族成员中该结构域可能像人野生型DKK3b那样起作用的可能性。评价将DKK3b的N-1结构域交换为另一家族成员的影响的实验表明，这是可行的，同时保留了修饰的蛋白质对β-连环蛋白的抑制。本文所述的肽模拟物的N-1结构域可选自例如天然人DKK1、天然人DKK2、天然人DKK3b和天然人DKK4的N-1结构域，或者可以是天然人DKK1、天然人DKK2、天然人DKK3b和天然人DKK4的N-1结构域的变体。每个人DKK家族成员的对应N-1结构域的氨基酸序列如下：

DKK1残基74-141(GenBank:AAQ89364)

QTIDNYQPYPCAEDEECGTDEYCASPTRGGDAGVQICLACRKRRKRCMRHAMCCPGNYCKNGICVSS(SEQ ID NO:3)；

DKK2残基78-130(GenBank:AAQ88780)-

CSSDKECEVGRYCHSPHQGSSACMVCRRKKKRCHRDGMCCPSTRCNNGICIPV(SEQ ID NO:4)；

DKK3b残基74-126

HECIIDEDCGPSMYCQFASFQYTCQPCRGQRMLCTRDSECCGDQLCVWGHCTK(SEQ ID NO:5)；以及

DKK4残基31-91(GenBank:NP_055235)

DLHGARKGSQCLSDTDCNTRKFCLQPRDEKPFCATCRGLRRRCQRDAMCCPGTLCVNDVCT(SEQ IDNO:6).

还考虑了这些序列的具有一个或多个氨基酸添加、缺失和/或保守取代的变体，其保留了对β-连环蛋白核易位的抑制活性。一个或多个氨基酸添加、缺失和/或取代对任何变体活性的影响可以使用本领域已知的和实施例中描述的常规方法和测定来测试。优选地，本发明的肽模拟物可包括与SEQ ID NO:3、4、5和6的序列具有至少约70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性或相似性的N-1结构域。优选地，SEQ ID NO:3、4、5和6的对应变体具有在SEQ ID NO:3、4、5和6的约20个氨基酸直至全长的连续区段上具有约75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列。

工程化肽模拟物的N-1结构域的一个重要特征是在N-1结构域内包含细胞穿透肽，而不是将外源性细胞穿透肽与例如肽模拟物的N末端结构域融合。在肽模拟物“内部”包括肽结构域降低了肽模拟物的抗原性。

细胞穿透肽(cp)包含已知具有细胞穿透能力的氨基酸序列。术语“细胞穿透结构域”、“细胞穿透区域”和“细胞穿透肽”在本文中可互换使用。细胞穿透肽是能够穿过细胞膜的短肽(通常约4-40个氨基酸)。称为“核定位序列”的肽是细胞穿透肽的子集。细胞穿透肽通常是水溶性的、带阳离子的或两亲性的，并且富含碱性氨基酸(例如，赖氨酸和/或精氨酸残基)。细胞穿透肽还可以是带正电荷的两亲性肽、或仅含有具有低净电荷或疏水性氨基酸基团的非极性残基的疏水性肽。

优选地，细胞穿透氨基酸序列是在人野生型DKK家族成员(为分泌蛋白)中发现的那些。单独的人DKK家族成员的天然/内在细胞穿透结构域列于表2中。

表2

其他代表性但非限制性的细胞穿透氨基酸序列示于表3中。

表3

因为细胞穿透肽的功能取决于它们的物理特征而不是序列特异性相互作用，所以细胞穿透肽可以具有表2中提供的和/或本领域已知的那些的反向序列；因此，例如，SEQ IDNO:53的反向序列是ARAQRAAARAY(从左到右为N末端侧到C末端侧读氨基酸)，其可用作细胞穿透肽。这些序列的具有一个或多个氨基酸添加、缺失和/或保守取代的变体保留了穿过细胞膜的能力并且也适用于本发明。可以使用本领域已知的常规方法测试一个或多个氨基酸添加、缺失和/或取代对CPP介导细胞穿透的能力的影响。

一种优选的细胞穿透肽是包含约4至约8个氨基酸，并且优选约6个氨基酸的聚精氨酸肽；包括例如SEQ ID NO:25。优选地，细胞穿透肽位于DKK蛋白家族的N-1结构域中。优选地，细胞穿透肽位于N-1结构域的环2中。N-1结构域的环2出现在SEQ ID NO:47即人野生型DKK3b的氨基酸100至114周围。类似地，N-1结构域的环2出现在人野生型DKK2(Gen Bank登录号AAQ88780.1)的氨基酸99至117周围。

肽模拟物的另一个优选特征是肽模拟物的N-1结构域是缺乏半胱氨酸的。如本文所用，当野生型或天然存在的N-1结构域中的半胱氨酸残基中的至少一个被保守氨基酸替代时，N-1结构域是“缺乏半胱氨酸的”。优选地，一个或多个半胱氨酸残基优选被丙氨酸、苏氨酸或丝氨酸替代；在又其他优选的方面，一个或多个半胱氨酸残基被丙氨酸或丝氨酸替代。例如，人DKK1的N-1结构域、人DKK2的N-1结构域、人DKK3b的N-1结构域或人DKK4的N-1结构域的一个或多个半胱氨酸残基被丙氨酸或丝氨酸替代。优选地，N-1结构域中存在的至少3、4、5、6、7、8、9或10个半胱氨酸残基被取代，优选被丙氨酸或丝氨酸取代。一个或多个半胱氨酸残基的替代减少或消除了在重组生产过程中由于二硫键桥接引起的蛋白质模拟物的聚集。已发现聚集是在原核和真核蛋白表达***中重组生产DKK3b蛋白质及其变体期间常规观察到的混淆问题。

因此，肽模拟物的N-1结构域可以是人DKK1、人DKK2、人DKK3b和人DKK4的N-1结构域中的一个(例如，SEQ ID NO.3、4、5和6中的一个)的变体，其中将细胞穿透肽添加到人DKK1、人DKK2、人DKK3b和人DKK4的N-1结构域中。在优选的方面，细胞穿透结构域是SEQ IDNO:25；任选地，其中细胞穿透结构域是六个连续精氨酸残基(RRRRRR)。例如，人DKK2的N-1结构域是SEQ ID NO:4：CSSDKECEVGRYCHSPHQGSSACMVCRRKKKRCHRDGMCCPSTRCNNGICIPV。

在某些方面，肽模拟物的N-1结构域是SEQ ID NO:4的变体，其中将细胞穿透结构域RRRRRR添加到环2。例如，环2中包含细胞穿透肽的SEQ ID NO:4的示例性变体是：CSSDKECEVGRYCHSPHQGSSACMVCRRRRRRCHRDGMCCPSTRCNNGICIPV(SEQ ID NO:73)。在SEQ ID NO:73中，SEQ ID NO:4的下划线部分(如上所示)被RRRRRR替代。

在又另外的方面，肽模拟物是人DKK1、人DKK2、人DKK3b和人DKK4的N-1结构域中的一个(例如，SEQ ID NO.3、4、5和6中的一个)的变体，其中(人DKK1、人DKK2、人DKK3b和人DKK4的)N-1结构域中的一个或多个半胱氨酸残基被保守氨基酸例如丝氨酸或丙氨酸替代。在又另外的方面，肽模拟物是人DKK1、人DKK2、人DKK3b和人DKK4的N-1结构域中的一个(例如，SEQ ID NO.3、4、5和6中的一个)的变体，其中将细胞穿透肽添加到人DKK1、人DKK2、人DKK3b和人DKK4的N-1结构域中，并且其中(人DKK1、人DKK2、人DKK3b和人DKK4的)N-1结构域中的一个或多个半胱氨酸残基被保守氨基酸例如丝氨酸或丙氨酸替代。在优选的方面，细胞穿透结构域是SEQ ID NO:25；任选地，其中细胞穿透结构域是六个连续精氨酸残基(RRRRRR)。例如，SEQ ID NO:73中所示的带下划线的半胱氨酸残基中的一个或多个被丝氨酸或丙氨酸替代：

CSSDKECEVGRYCHSPHQGSSACMVCRRRRRRCHRDGMCCPSTRCNNGICIPV(SEQ ID NO:73)。

作为SEQ ID NO:4的变体的N-1结构域的具体例子是：

ASSDKESEVGRYSHSPHQGSSACMVARRRRRRAHRDGMACPSTRSNNGIAIPV(SEQ ID NO:69)，其中带下划线的残基是替代SEQ ID NO:73中半胱氨酸残基的丙氨酸或丝氨酸残基。作为SEQ ID NO:4的变体的N-1结构域的另一个例子是：

ASSDKESEVGRYSHSPHQGSSAωMVARRRRRRAHRDGMAωPSTRSNNGIAIPV(SEQ ID NO:74)，其中每个ω独立地是丙氨酸或丝氨酸，并且其中带下划线的残基是替代SEQ ID NO:73中半胱氨酸残基的丙氨酸或丝氨酸残基。

已被修饰为缺乏半胱氨酸并包括细胞穿透肽的肽模拟物的优选N-1结构域包括以下：

DKK3b-

HEAIIDEDSGPSMYSQFASFQYTCQPARRRRRRATRDSESCGDQLAVWGHSTK(SEQ ID NO:7)；

DKK1

-QTIDNYQPYPAAEDEESGTDEYSASPTRGGDAGVQICLAARRRRRRAMRHAMSCPGNYAKNGIAVSS(SEQ ID NO:8)；

DKK2

-KGKNLGQAYPASSDKESEVGRYSHSPHQGSSACMVARRRRRRAHRDGMACPSTRSNNGIAIPV(SEQID NO:45)；

以及

DKK4

-DLHGARKGSQALSDTDSNTRKFSLQPRDEKPFCATARRRRRRAQRDAMSCPGTLSVNDVAT(SEQ IDNO:46)。

在另外的方面，缺乏半胱氨酸并且包括细胞穿透结构域的肽模拟物的优选N-1结构域包含以下或由以下组成：ASSDKESEVGRYSHSPHQGSSACMVARRRRRRAHRDGMACPSTRSNNGIAIPV(SEQ ID NO:69)。

在一些实施方案中，肽模拟物的N-1结构域是来自人DKK1、人DKK2、人DKK3b或人DKK4的N-1结构域的变体，例如SEQ ID NO:3、4、5和6中任一个的变体。例如，变体可包含细胞穿透肽。在另外的实施例中，变体可以包含一个或多个氨基酸取代，其中人DKK1、人DKK2、人DKK3b或人DKK4的N-1结构域的一个或多个半胱氨酸残基被另一种氨基酸，例如保守氨基酸替代/取代，包括例如被丙氨酸或丝氨酸取代。

在某些方面，肽模拟物的N-1结构域是来自人DKK1、人DKK2、人DKK3b或人DKK4的N-1结构域的变体，例如SEQ ID NO:3、4、5和6中任一个的变体，其中：

i)所述变体包含细胞穿透肽；并且任选地，其中人DKK1、人DKK2、人DKK3b或人DKK4的N-1结构域的至少一个半胱氨酸被另一种氨基酸，例如保守氨基酸替代/取代，包括例如被丙氨酸或丝氨酸取代；以及

ii)任选地，所述变体与来自人DKK1、人DKK2、人DKK3b或人DKK4的N-1结构域具有至少约75％、至少约76％、至少约77％、至少约78％、至少约79％或至少约80％序列同一性，或与SEQ ID NO:3、4、5和6中的一个具有至少约75％、至少约76％、至少约77％、至少约78％、至少约79％或至少约80％序列同一性。

变体包含细胞穿透肽，例如，当将细胞穿透肽添加至或掺入人DKK1、人DKK2、人DKK3b或人DKK4的N-1结构域的氨基酸序列中时；例如，细胞穿透肽可位于N末端或C末端，或细胞穿透肽可位于N-1结构域内，例如，如下文更详细描述的环2内。变体可进一步包括用保守氨基酸对人DKK1、人DKK2、人DKK3b或人DKK4的N-1结构域的至少一个半胱氨酸的取代。在某些方面，变体与SEQ ID NO:3、4、5、和6中的一个具有至少约75％、至少约76％、至少约77％、至少约78％、至少约79％或至少约80％序列同一性、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性。

在某些方面，肽模拟物的N-1结构域是来自人DKK1、人DKK2、人DKK3b或人DKK4的N-1结构域的变体，其中：

i)所述变体包含细胞穿透肽，并且任选地，其中人DKK1、人DKK2、人DKK3b或人DKK4的N-1结构域的至少一个半胱氨酸被另一种氨基酸，例如保守氨基酸替代/取代，包括例如被丙氨酸或丝氨酸取代；以及

ii)任选地，与SEQ ID NO:7、8、45、46或69中的一个具有至少约80％序列同一性。

在又另外的方面，肽模拟物的N-1结构域与SEQ ID NO:7、8、45、46或69的氨基酸序列具有至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约98％或至少约99％序列同一性，并且其中N-1结构域进一步包含细胞穿透肽。在某些优选的方面，N-1结构域与SEQ ID NO:45中的一个具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性。在另外的方面，N-1结构域与SEQ ID NO:69中的一个具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性。

在某些方面，细胞穿透肽位于上文更详细描述的N-1结构域的环2内。

还考虑了这些序列的具有一个或多个氨基酸添加、缺失和/或保守取代的变体，其保留了对β-连环蛋白核易位的抑制活性。一个或多个氨基酸添加、缺失和/或取代对任何变体活性的影响可以使用本领域已知的和实施例中描述的常规方法和测定来测试。优选地，本发明的肽模拟物可包括与SEQ ID NO:7、8、45和46的序列具有至少约70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的N-1结构域。

优选地，本发明的肽模拟物包含具有SEQ ID NO:59的氨基酸序列的N末端结构域。优选地，本发明的肽模拟物包含具有SEQ ID NO:60的氨基酸序列的C末端结构域。优选地，本发明的肽模拟物包含具有SEQ ID NO:45的氨基酸序列的N-1结构域或由其组成。优选的肽模拟物在本文中称为“AC1”，并且包含如下SEQ ID NO:1的氨基酸序列或由其组成：MDAEDLLLKLNLAATVGTAPPKGKNLGQAYPASSDKESEVGRYSHSPHQGS SACMVARRRRRRAHRDGMACPSTRSNNGIAIPVPTAALLIILGGDDI(SEQ ID NO:1)。在又另外的方面，肽模拟物与SEQ ID NO:1具有至少约80％、至少约81％、至少约82％、至少约83％、至少约84％、至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、或至少约99％同一性。另一种优选的肽模拟物包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列或由其组成，其中起始甲硫氨酸被丝氨酸、苏氨酸或除脯氨酸和甲硫氨酸之外的非极性氨基酸替代。例如，优选的肽模拟物可包含如下SEQ ID NO:65：DAEDLLLKLNLAATVGTAPPKGKNLGQAYPASSDKESEVGRYSHSPHQGSSACMVARRRRRRAHRDGMACPSTRSNNGIAIPVPTAALLIILGGDDI(SEQ ID NO:65)(起始于氨基酸2)。在又另外的方面，优选的肽模拟物包含以下序列或由其组成：Φ₂DAEDLLLKLNLAATVGTAPPKGKNLGQAYPASSDKESEVGRYSHSPHQGSSACMVARRRRRRAHRDGMACPSTRSNNGIAIPVPTAALLIILGGDDI(SEQ ID NO:66)，其中Φ₂是除脯氨酸之外的非极性氨基酸(包括例如甲硫氨酸、丙氨酸和异亮氨酸)，或是丝氨酸或苏氨酸；在某些方面，Φ₂是苏氨酸、丝氨酸或除脯氨酸和甲硫氨酸之外的非极性氨基酸。在又另外的方面，肽模拟物包含以下序列中的一个或由其组成：ADAEDLLLKLNLAATVGTAPPKGKNLGQAYPASSDKESEVGRYSHSPHQGSSACMVARRRRRRAHRDGMACPSTRSNNGIAIPVPTAALLIILGGDDI(SEQ ID NO:67)或IDAEDLLLKLNLAATVGTAPPKGKNLGQAYPASSDKESEVGRYSHSPHQGSSACMVARRRRRRAHRDGMACPSTRSNNGIAIPVPTAALLIILGGDDI(SEQ ID NO:68)。优选地，本发明的肽模拟物包含具有SEQ ID NO:45的氨基酸序列的N-1结构域。在又另外的方面，肽模拟物与SEQ ID NO:66、67或68具有至少约80％、至少约81％、至少约82％、至少约83％、至少约84％、至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、或至少约99％同一性。

在另外的优选实施方案中，肽模拟物包含以下或由其组成：

Φ₂DAEDLLLKLNLAATVGTAPPKGKNLGQAYPASSDKESEVGRYSHSPHQGSSAωMVARRRRRRAHRDGMAωPSTRSNNGIAIPVPTAALLIILGGDDI(SEQ ID NO:70)，其中Φ₂如上定义并且其中每个ω独立地是丝氨酸或丙氨酸。在又另外的方面，肽模拟物包含以下序列中的一个或由其组成：

ADAEDLLLKLNLAATVGTAPPKGKNLGQAYPASSDKESEVGRYSHSPHQGSSAωMVARRRRRRAHRDGMAωPSTRSNNGIAIPVPTAALLIILGGDDI(SEQ ID NO:71)或IDAEDLLLKLNLAATVGTAPPKGKNLGQAYPASSDKESEVGRYSHSPHQGSSAωMVARRRRRRAHRDGMAωPSTRSNNGIAIPVPTAALLIILGGDDI(SEQ ID NO:72)。在又另外的方面，肽模拟物具有选自以下的序列：

IDAEDLLLKLNLAATVGTAPPKGKNLGQAYPASSDKESEVGRYSHSPHQGSSASMVARRRRRRAHRDGMAAPSTRSNNGIAIPVPTAALLIILGGDDI(SEQ ID NO:75)；

IDAEDLLLKLNLAATVGTAPPKGKNLGQAYPASSDKESEVGRYSHSPHQGSSAAMVARRRRRRAHRDGMASPSTRSNNGIAIPVPTAALLIILGGDDI(SEQ ID NO:76)；

ADAEDLLLKLNLAATVGTAPPKGKNLGQAYPASSDKESEVGRYSHSPHQGSSASMVARRRRRRAHRDGMAAPSTRSNNGIAIPVPTAALLIILGGDDI(SEQ ID NO:77)；

ADAEDLLLKLNLAATVGTAPPKGKNLGQAYPASSDKESEVGRYSHSPHQGSSAAMVARRRRRRAHRDGMASPSTRSNNGIAIPVPTAALLIILGGDDI(SEQ ID NO:78)；

MDAEDLLLKLNLAATVGTAPPKGKNLGQAYPASSDKESEVGRYSHSPHQGSSASMVARRRRRRAHRDGMAAPSTRSNNGIAIPVPTAALLIILGGDDI(SEQ ID NO:79)；或MDAEDLLLKLNLAATVGTAPPKGKNLGQAYPASSDKESEVGRYSHSPHQGSSAAMVARRRRRRAHRDGMASPSTRSNNGIAIPVPTAALLIILGGDDI(SEQ IDNO:80)。

在又另一方面，本发明的肽模拟物包含具有SEQ ID NO:48的氨基酸序列的N末端结构域。优选地，本发明的肽模拟物包含具有SEQ ID NO:49的氨基酸序列的C末端结构域。优选地，本发明的肽模拟物包含具有SEQ ID NO:45的氨基酸序列的N-1结构域。

还考虑了SEQ ID NO:1的具有一个或多个氨基酸添加、缺失和/或保守取代的变体，其保留了对β-连环蛋白核易位的抑制活性。一个或多个氨基酸添加、缺失和/或取代对任何变体活性的影响可以使用本领域已知的和实施例中描述的常规方法和测定来测试。优选地，本发明的肽模拟物包含与SEQ ID NO:1具有至少约70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性或相似性的氨基酸序列。优选地，同一性或相似性在确定长度的连续氨基酸上计算(例如，“比较窗口”)。例如，比较窗口可以是SEQ ID NO:1的约20个氨基酸直至全长的连续区段。

还考虑了SEQ ID NO:65、66、67、68、69、70、71和72的具有一个或多个氨基酸添加、缺失和/或保守取代的变体，其保留了对β-连环蛋白核易位的抑制活性。一个或多个氨基酸添加、缺失和/或取代对任何变体活性的影响可以使用本领域已知的和实施例中描述的常规方法和测定来测试。优选地，本发明的肽模拟物包含与SEQ ID NO:65、66、67和68具有至少约70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性或相似性的氨基酸序列。优选地，同一性或相似性在确定长度的连续氨基酸上计算(例如，“比较窗口”)。例如，比较窗口可以是SEQ ID NO:65、66、67、68、69、70、71和72的约20个氨基酸直至全长的连续区段。

在某些方面，肽模拟物包含：

i)N末端结构域，其与SEQ ID NO:59、62、63和64具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约98％或至少约99％序列同一性；

ii)N-1结构域，其与SEQ ID NO:7、8、45、46或69具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约98％或至少约99％序列同一性；优选地，与SEQ ID NO:45和69具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约98％或至少约99％序列同一性；以及

iii)C末端结构域，其与SEQ ID NO:60具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约98％或至少约99％序列同一性。

肽模拟物还可包含N末端结构域、N-1结构域和C末端结构域中的一个或多个之间的氨基酸接头。例如，肽模拟物可包含在N末端结构域与N-1结构域之间的氨基酸接头和/或在N-1结构域与C末端结构域之间的氨基酸接头。优选地，氨基酸接头的长度为约1至约150个氨基酸。在某些方面，肽模拟物包含在N末端结构域与N-1结构域之间的氨基酸接头，其中氨基酸接头的长度在约1个与约70个氨基酸之间；或长度为约1个至约50个氨基酸；或长度为约1至约30个氨基酸；或长度为约1个至约20个氨基酸。在又其他方面，在N末端结构域与N-1结构域之间的氨基酸接头的长度为约1或2个氨基酸。在某些另外的方面，肽模拟物包含在N-1结构域与C末端结构域之间的氨基酸接头，其中所述氨基酸接头的长度在约1至约150个氨基酸之间；或长度为约1至约125个氨基酸；或长度为约1至约100个氨基酸；或长度为约1至约75个氨基酸；或长度为约1至约50个氨基酸；或长度为约1至约30个氨基酸；或长度为约1至约20个氨基酸。在某些方面，在N-1结构域与C末端结构域之间的氨基酸接头的长度为约1至约2个氨基酸。

本发明的肽模拟物还可以如下表征。能够抑制β-连环蛋白核易位或能够抑制β-连环蛋白信号传导途径的DKK3b的肽模拟物从N末端到C末端包含：

i)包含式1的肽的N末端结构域：

NH₂-Met-Y-X-Y-Y-X₁

式1

其中：

Y是带负电荷的氨基酸；

X是任何非极性氨基酸或带负电荷的氨基酸；

X₁为约4至约70个氨基酸、约4至约20个氨基酸、或约4至约15个氨基酸的肽，其形成无规卷曲、α螺旋或β折叠片层；以及

Met是氨基酸甲硫氨酸；

ii)N-1结构域，其包含与DKK1、DKK2、DKK3b或DKK4的N-1结构域至少约80％相同的氨基酸序列，其中所述N1结构域进一步包含细胞穿透结构域；以及

iii)包含式2的肽的C末端结构域

X₂-Gly-Gly-X₃-Ile-COOH

(式2)

其中：

X₂为形成无规卷曲、α螺旋或β折叠片层的约4至约40个、约4至约20个氨基酸、约4至约15个氨基酸或约4至约8个氨基酸的肽；

Gly是氨基酸甘氨酸；以及

X₃是长度为2个连续氨基酸的肽，其包含2个带负电荷的氨基酸或一个带负电荷的氨基酸和一个带正电荷的氨基酸；

优选地其中Y是谷氨酸(Glu)或天冬氨酸(Asp)；优选地，其中X₁的长度为约15-17个氨基酸；优选地，其中N末端结构域的长度为约19至约22个氨基酸；优选地X是丙氨酸；优选地，其中N末端结构域包含式3的肽：

NH₂-Met-Glu-X₄-Asp-Glu-X₁

式3a；或

NH₂-Met-Asp-X₄-Glu-Asp-X₁

式3b

其中X₄是任何疏水性氨基酸；且X₁是形成无规卷曲、α螺旋或β折叠片层的约4至约70个氨基酸的肽；优选地，其中式3a或式3b的X₄是丙氨酸；优选地，其中式3a或式3b的X₁的长度为15-17个氨基酸；优选地，其中式3a或式3b的肽具有SEQ ID NO:59的氨基酸序列；或替代性地，其中式3a或式3b的肽具有SEQ ID NO:48的氨基酸序列；优选地，其中DKK1、DKK2、DKK3b或DKK4的N-1结构域被修饰为通过保守氨基酸取代来取代DKK1、DKK2、DKK3b或DKK4的天然N-1结构域中存在的半胱氨酸残基中的至少一个；优选地保守氨基酸取代选自丙氨酸(Ala)和丝氨酸(Ser)；优选地，其中细胞穿透肽的长度为约4至约8个氨基酸；优选地，其中细胞穿透肽的长度为约6个氨基酸；优选地，其中细胞穿透肽包含6个精氨酸残基或由其组成；优选地其中N-1包含DKK2的N-1结构域；优选地，其中DKK2的N-1结构域被修饰为通过保守氨基酸取代来取代半胱氨酸残基中的至少1个；优选地，其中DKK2的N-1结构域的半胱氨酸残基中的至少8个通过保守氨基酸取代被取代；优选地，其中N-1结构域的所有半胱氨酸残基通过保守氨基酸取代被取代；优选地其中保守氨基酸取代选自丙氨酸(Ala)和丝氨酸(Ser)；优选地，其中N-1结构域的氨基酸序列选自SEQ ID NO:7、8、45、46、和69，优选地，其中X₂的长度为约8个氨基酸；优选地，其中C末端结构域包含约12至约14个氨基酸；优选地，其中X₃包含至少两个连续的带负电荷的氨基酸，其中每个带负电荷的氨基酸独立地选自Asp和Glu；或者替代性地，其中X₃包含至少两个连续的带电荷氨基酸，其中一个氨基酸残基是带正电荷的并且选自赖氨酸(Lys)和精氨酸(Arg)，并且其中一个氨基酸残基是带负电荷的并且选自天冬氨酸(Asp)和谷氨酸(Glu)；优选地，C末端结构域具有SEQ ID NO:60的氨基酸序列；或替代性地，其中式2的C末端结构域具有SEQ ID NO:49的氨基酸序列。

在另外的实施方案中，本发明的肽模拟物还可以如下表征。能够抑制β-连环蛋白核易位或能够抑制β-连环蛋白信号传导途径的DKK3b的肽模拟物从N末端到C末端包含：

i)包含式4的肽的N末端结构域

NH₂-Φ-Y-X-Y-Y-X₁

式4

其中：

每个Y独立地为带负电荷的氨基酸；

X是任何非极性氨基酸或带负电荷的氨基酸；

X₁为约4至约70个、约4至约20个氨基酸、或约4至约15个氨基酸的肽，其形成无规卷曲、α螺旋或β折叠片层；以及

φ是除脯氨酸以外的非极性氨基酸，或是苏氨酸或丝氨酸；在一些实施方案中，φ是甲硫氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、丝氨酸或苏氨酸。

ii)N-1结构域，其为具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的人DKK1的N-1结构域的变体，具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的DKK2的N-1结构域的变体，具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的DKK3b的N-1结构域的变体，或具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的DKK4的N-1结构域的变体；其中所述变体包含细胞穿透肽，并且其中所述变体与SEQ ID NO:3、4、5和6中的一个具有至少约80％序列同一性，或

N-1结构域，其与SEQ ID NO:7、8、45、46和69的氨基酸序列具有至少约80％序列同一性，其中所述N-1结构域进一步包含细胞穿透肽；以及

iii)包含式2的肽的C末端结构域

X₂-Gly-Gly-X₃-Ile-COOH

(式2)

其中：

X₂为形成无规卷曲、α螺旋或β折叠片层的约4至约40个、约4至约20个氨基酸、约4至约15个氨基酸或约4至约8个氨基酸的肽；

Gly是氨基酸甘氨酸；以及

X₃是长度为2个连续氨基酸的肽，其包含2个带负电荷的氨基酸或一个带负电荷的氨基酸和一个带正电荷的氨基酸；

优选地其中Y是谷氨酸(Glu)或天冬氨酸(Asp)；优选地，其中X₁的长度为约15-17个氨基酸；优选地，其中N末端结构域的长度为约19至约22个氨基酸；优选地X是丙氨酸；优选地，其中φ是甲硫氨酸、丙氨酸或异亮氨酸；优选地，其中N末端结构域包含式3的肽：

NH₂-φ-Glu-X₄-Asp-Glu-X₁

式3a；或

NH₂-Φ-Asp-X₄-Glu-Asp-X₁

式3b

其中X₄是任何疏水性氨基酸；且X₁是形成无规卷曲、α螺旋或β折叠片层的约4至约70个氨基酸的肽；优选地，其中式3a或式3b的X₄是丙氨酸；优选地，其中式3a或式3b的X₁的长度为15-17个氨基酸；优选地，其中式3a或式3b的肽具有SEQ ID NO:62、63或64的氨基酸序列；优选地，其中N-1结构域与SEQ ID NO:45具有至少约80％序列同一性并包含细胞穿透结构域；或优选地，其中DKK1、DKK2、DKK3b或DKK4的N-1结构域被修饰为通过保守氨基酸取代来取代DKK1、DKK2、DKK3b或DKK4的天然N-1结构域中存在的半胱氨酸残基中的至少一个；优选地保守氨基酸取代选自丙氨酸(Ala)和丝氨酸(Ser)；优选地，其中细胞穿透肽的长度为约4至约8个氨基酸；优选地，其中细胞穿透肽的长度为约6个氨基酸；优选地，其中细胞穿透肽包含6个精氨酸残基或由其组成；优选地其中N-1结构域包含DKK2的N-1结构域；优选地，其中DKK2的N-1结构域被修饰为通过保守氨基酸取代来取代半胱氨酸残基中的至少一个；优选地，其中DKK2的N-1结构域的半胱氨酸残基中的至少8个通过保守氨基酸取代被取代；优选地，其中N-1结构域的所有半胱氨酸残基通过保守氨基酸取代被取代；优选地其中保守氨基酸取代选自丙氨酸(Ala)和丝氨酸(Ser)；优选地，其中N-1结构域的氨基酸序列包含SEQ ID NO:7、8、45、46和69中的一个或由其组成；优选地，其中X₂的长度为约8个氨基酸；优选地，其中C末端结构域包含约12至约14个氨基酸；优选地，其中X₃包含至少两个连续的带负电荷的氨基酸，其中每个带负电荷的氨基酸独立地选自Asp和Glu；优选地，C末端结构域包含SEQ ID NO:60的氨基酸序列或由其组成；或替代性地，其中式2的C末端结构域包含SEQID NO:49的氨基酸序列或由其组成。

在某些方面，N-1结构域与SEQ ID NO:7、8、45、46、和69中的一个具有至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性。

治疗用途

抑制β-连环蛋白核易位和/或信号传导途径

Dkk3基因座编码第二基因产物DKK3b(一种直接调节β-连环蛋白运输的重要细胞内蛋白)的发现解决了关于β-连环蛋白信号传导途径的此重要组分的分子功能的长期困惑。DKK3b在β-连环蛋白信号传导途径中提供新的调节水平，其独立于Wnt配体并且对于胚胎发生是至关重要的。DKK3b位于Wnt调节的降解复合物的下游，在那里它调节β-连环蛋白向细胞核的运输，并且具有通过将β-连环蛋白重定向到肌动蛋白细胞骨架来保护β-连环蛋白免受蛋白水解的能力。使用肌球蛋白马达和肌动蛋白纤维，DKK3b在星形胶质细胞中的核周空间和质膜的细胞质表面之间快速穿梭。DKK3b的这种细胞内循环可以提供功能性穿梭服务，其能够将β-连环蛋白从细胞核附近重新定位回到其质膜贮库，从而闭合调节环的先前未识别的臂。DKK3b是Wnt/β-连环蛋白途径的必需组分，并且直接拮抗促增殖性β-连环蛋白信号传导分子，提供了重要的新控制点，其影响负责分化、谱系规范、多能性和癌发生的调节途径。

除β-连环蛋白外，DKK3b还更广泛地调节其他β-TrCP靶底物，包括NF-kB、p38、Decaptor和Erkl/2。这为细胞中研究最多的泛素-蛋白酶体***(UPS)中的一种增加了新的调节维度。

作为β-TrCP底物降解和核进入的调节物，DKK3b是产生用于干预β-连环蛋白稳定和随后易位至核的新药物的有吸引力的靶标，所述β-连环蛋白稳定和易位通常是在各种β-连环蛋白相关疾病如癌症/增殖性疾病、代谢疾病、骨质疏松症、神经疾病、免疫疾病、内分泌疾病、心血管疾病、血液疾病和糖尿病中失调的关键步骤。

因此，本发明提供了抑制β-连环蛋白核易位或β-连环蛋白信号传导途径的方法，其包括向患有β-连环蛋白相关疾病的患者施用治疗有效量的本发明的肽模拟物。

癌症治疗

优选地，本发明提供了通过抑制β-连环蛋白核易位或β-连环蛋白信号传导途径治疗癌症的组合物和方法。包含本发明的肽模拟物的组合物可用于治疗许多类型的癌症。本发明提供了向有需要的癌症患者施用治疗有效量的包含本发明的肽模拟物的药物组合物的方法。本文描述了用于治疗癌症的药物组合物、给药和组合疗法。

如本文所用，术语“癌症”应被赋予其普通含义，为其中异常细胞不受控制地***的疾病的通用术语。特别地，并且在本发明的实施方案的上下文中，癌症是指血管生成相关的癌症。癌细胞可以侵入附近的组织并且可以通过血流和淋巴***扩散到身体的其他部位。存在几种主要类型的癌症，例如，癌是在皮肤或在作为内部器官衬里或覆盖内部器官的组织中开始的癌症。肉瘤是在骨、软骨、脂肪、肌肉、血管或其他结缔或支持组织中开始的癌症。白血病是在血液形成组织如骨髓中开始的癌症，并导致大量异常血细胞产生并进入血流。淋巴瘤是在免疫***的细胞中开始的癌症。

当正常细胞丧失其作为指定、受控和协调单位表现的能力时，会形成肿瘤。通常，实体瘤是通常不包含囊肿或液体区域的异常组织块(一些脑肿瘤确实具有囊肿和充满液体的中心坏死区域)。单个肿瘤甚至可以在其内具有不同的细胞群，其中不同的过程出错。实体瘤可以是良性的(不是癌性的)或恶性的(癌性的)。不同类型的实体瘤以形成它们的细胞类型命名。实体瘤的例子是肉瘤、癌和淋巴瘤。白血病(血癌)通常不形成实体瘤。

代表性癌症包括但不限于成人急性淋巴母细胞白血病；儿童急性淋巴母细胞白血病；成人急性髓系白血病；肾上腺皮质癌；儿童肾上腺皮质癌；AIDS相关淋巴瘤；AIDS相关恶性肿瘤；***癌；儿童小脑星形细胞瘤；儿童大脑星形细胞瘤；肝外胆管癌；膀胱癌；儿童膀胱癌；骨癌，骨肉瘤/恶性纤维组织细胞瘤；儿童胶质母细胞瘤；成人胶质母细胞瘤；儿童脑干胶质瘤；成人脑肿瘤；儿童脑肿瘤，脑干胶质瘤；儿童脑肿瘤，小脑星形细胞瘤；儿童脑肿瘤，大脑星形细胞瘤/恶性胶质瘤；儿童脑肿瘤，室管膜瘤；儿童脑肿瘤，髓母细胞瘤；儿童脑肿瘤，幕上原始神经外胚层肿瘤；儿童脑肿瘤，视觉通路和下丘脑胶质瘤；儿童脑肿瘤(其他)；乳腺癌；乳腺癌伴妊娠；儿童乳腺癌；男性乳腺癌；儿童支气管腺瘤/类癌：儿童类癌瘤；胃肠道类癌瘤；肾上腺皮质癌；胰岛细胞癌；原发灶不明癌；原发性中枢神经***淋巴瘤；儿童小脑星形细胞瘤；儿童大脑星形细胞瘤/恶性胶质瘤；***；儿童癌症；慢性淋巴细胞白血病；慢性粒细胞性白血病；慢性骨髓增生性疾病；腱鞘透明细胞肉瘤；结肠癌；儿童结直肠癌；皮肤T细胞淋巴瘤；子宫内膜癌；儿童室管膜瘤；卵巢上皮癌；食道癌；儿童食道癌；尤文氏家族肿瘤；儿童颅外生殖细胞肿瘤；性腺外生殖细胞肿瘤；肝外胆管癌；眼癌，眼内黑色素瘤；眼癌，视网膜母细胞瘤；胆囊癌；胃(胃部)癌；儿童胃(胃部)癌；胃肠道类癌瘤；儿童颅外生殖细胞肿瘤；性腺外生殖细胞肿瘤；卵巢生殖细胞肿瘤；妊娠滋养细胞肿瘤；儿童脑干胶质瘤；儿童视觉通路和下丘脑胶质瘤；毛细胞白血病；头颈癌；成人(原发性)肝细胞(肝)癌；儿童(原发性)肝细胞(肝)癌；成人霍奇金淋巴瘤；儿童霍奇金淋巴瘤；妊娠期间的霍奇金淋巴瘤；下咽癌；儿童下丘脑和视觉通路胶质瘤；眼内黑色素瘤；胰岛细胞癌(内分泌胰腺)；卡波西肉瘤；肾癌；喉癌；儿童喉癌；成人急性淋巴母细胞白血病；儿童急性淋巴母细胞白血病；成人急性髓系白血病；儿童急性髓系白血病；慢性淋巴细胞白血病；慢性髓细胞性白血病；毛细胞白血病；唇和口腔癌；成人(原发性)肝癌；儿童(原发性)肝癌；非小细胞肺癌；小细胞肺癌；成人急性淋巴母细胞白血病；儿童急性淋巴母细胞白血病；慢性淋巴细胞白血病；AIDS相关淋巴瘤；中枢神经***(原发性)淋巴瘤；皮肤T细胞淋巴瘤；成人霍奇金淋巴瘤；儿童霍奇金淋巴瘤；妊娠期间霍奇金淋巴瘤；成人非霍奇金淋巴瘤；儿童非霍奇金淋巴瘤；妊娠期间非霍奇金淋巴瘤；原发性中枢神经***淋巴瘤；瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症；男性乳腺癌；成人恶性间皮瘤；儿童恶性间皮瘤；恶性胸腺瘤；儿童髓母细胞瘤；黑色素瘤；眼内黑色素瘤；默克尔细胞癌；恶性间皮瘤；原发灶隐匿转移性颈部鳞状癌；儿童多发性内分泌腺瘤综合征；多发性骨髓瘤/浆细胞肿瘤；蕈样肉芽肿病；骨髓增生异常综合征；慢性髓细胞性白血病；儿童急性髓系白血病；多发性骨髓瘤；慢性骨髓增生性疾病；鼻腔和鼻旁窦癌；鼻咽癌；儿童鼻咽癌；成神经细胞瘤；神经纤维瘤；成人非霍奇金淋巴瘤；儿童非霍奇金淋巴瘤；妊娠期间非霍奇金淋巴瘤；非小细胞肺癌；儿童口腔癌；口腔和唇癌；口咽癌；骨肉瘤/骨恶性纤维组织细胞瘤；儿童卵巢癌；卵巢上皮癌；卵巢生殖细胞肿瘤；卵巢低度恶性潜能肿瘤；胰腺癌；儿童胰腺癌，胰岛细胞胰腺癌；鼻旁窦和鼻腔癌；甲状旁腺癌；***癌；嗜铬细胞瘤；儿童松果体和幕上原始神经外胚层肿瘤；垂体肿瘤；浆细胞肿瘤/多发性骨髓瘤；胸膜肺母细胞瘤；妊娠伴乳腺癌；妊娠伴霍奇金淋巴瘤；妊娠伴非霍奇金淋巴瘤；原发性中枢神经***淋巴瘤；成人原发性肝癌；儿童原发性肝癌；***癌；直肠癌；肾细胞(肾)癌；儿童肾细胞癌；肾盂和输尿管移行细胞癌；视网膜母细胞瘤；儿童横纹肌肉瘤；唾液腺癌；儿童唾液腺癌；尤因家族肿瘤肉瘤；卡波西肉瘤；骨的肉瘤(骨肉瘤)/恶性纤维组织细胞瘤；儿童横纹肌肉瘤肉瘤；成人软组织肉瘤；儿童软组织肉瘤；塞扎里综合征；皮肤癌；儿童皮肤癌；皮肤癌(黑色素瘤)；默克尔细胞皮肤癌；小细胞肺癌；小肠癌；成人软组织肉瘤；儿童软组织肉瘤；原发灶隐匿转移性颈部鳞状癌；胃(胃部)癌；儿童胃(胃部)癌；儿童幕上原始神经外胚层肿瘤；皮肤T细胞淋巴瘤；睾丸癌；儿童胸腺瘤；恶性胸腺瘤；甲状腺癌；儿童甲状腺癌；肾盂和输尿管移行细胞癌；妊娠滋养层肿瘤；儿童原发部位不明癌症；异常儿童癌症；输尿管和肾盂移行细胞癌；尿道癌；子宫肉瘤；***癌；儿童视觉通路和下丘脑胶质瘤；外阴癌；瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症；和肾母细胞瘤等。

肿瘤可分类为恶性或良性。在这两种情况下，存在细胞的异常聚集和增殖。在恶性肿瘤的情况下，这些细胞更具有侵袭性，获得侵袭性增加的特性。最终，肿瘤细胞甚至可以获得脱离它们所起源的微观环境、扩散到身体的另一区域(具有非常不同的环境，通常不利于它们的生长)、并在该新位置继续它们的快速生长和***的能力。这称为转移。一旦恶性细胞已经转移，实现治愈就更加困难。良性肿瘤具有较少的侵袭倾向并且不太可能转移。

优选地，可用本文所述的组合物和方法治疗的癌症包括但不限于：黑色素瘤(例如转移性恶性黑色素瘤)、肾癌(例如透明细胞癌)、***癌(例如激素难治性***腺癌)、胰腺癌(例如腺癌)、乳腺癌、结肠癌、肺癌(例如非小细胞肺癌)、食道癌、头颈部鳞状细胞癌、肝癌、卵巢癌、***、甲状腺癌、胶质母细胞瘤、神经胶质瘤、白血病、淋巴瘤和其他赘生性恶性肿瘤。

优选地，本发明的组合物和方法用于治疗实体瘤，包括但不限于淋巴瘤、黑色素瘤、肾细胞癌(RCC)、晚期实体瘤、先前已经用治疗性疗法治疗但先前疗法仍难治的肿瘤。因此，本发明包括减少癌症患者的肿瘤，包括向患者施用治疗有效量的本发明的肽模拟物。

优选地，本发明的组合物用于减少癌症患者的肿瘤。如本文所用，术语“减少肿瘤”是指减少肿瘤块的大小或体积、减少受试者中转移肿瘤的数量、减少癌细胞的增殖状态(癌细胞增殖的程度)等。

用于癌症治疗的组合疗法

虽然本发明的肽模拟物可以作为单一疗法用于癌症治疗，但在本发明的上下文中还考虑了肽模拟物与其他治疗性抗癌治疗的组合。因此，本发明的方法包括将本发明的至少一种肽模拟物与一种或多种抗癌剂及其相关的抗癌治疗性治疗方案组合施用。术语“药剂”、“抗癌治疗剂”、“抗癌剂”和“治疗剂”在本文中可互换使用，并且统统指代具有抗癌特性或以其他方式可在治疗癌症和癌症治疗方案中使用的化合物和分子。

其他治疗性抗癌剂和相关的治疗性抗癌治疗方案包括免疫疗法，如过继性细胞转移方案、抗原特异性疫苗接种、抑制DNA修复蛋白(例如，核酸酶聚(腺苷5′-二磷酸核糖)聚合酶“聚(ADP-核糖)聚合酶”的抑制剂(“PARP抑制剂”)和阻断免疫检查点抑制分子(例如细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4(CTLA-4)程序性死亡蛋白1(PD-1)抗体，如派姆单抗和纳武单抗)。

其他共治疗性抗癌治疗方案包括与化疗剂的组合，所述化疗剂包括但不限于烷化剂、抗肿瘤抗生素、抗代谢剂、其他抗肿瘤抗生素和植物衍生剂，有效治疗癌症的小分子是本领域熟知的并且包括参与肿瘤生长的因子(如EGFR、ErbB2(也称为Her2)ErbB3、ErbB4或TNF)的拮抗剂、用于治疗癌症的治疗性蛋白质(如通过自身或在其他化合物的存在下引起细胞死亡的***蛋白)、以及治疗性抗体(如曲妥珠单抗、贝伐单抗、利妥昔单抗)。

“免疫检查点蛋白”调节免疫***中的T细胞功能。T细胞在细胞介导的免疫中起重要作用。检查点蛋白与将信号发送入T细胞的特定配体相互作用，并基本上关闭或抑制T细胞功能。癌细胞通过驱动其表面上的检查点蛋白的高水平表达来利用该***，从而控制进入肿瘤微环境的T细胞表面上表达检查点蛋白的T细胞，从而抑制抗癌免疫应答。因此，本文称为“免疫检查点蛋白(ICP)抑制剂”的药剂对检查点蛋白的抑制将导致T细胞功能的恢复和对癌细胞的免疫应答。检查点蛋白的例子包括但不限于：CTLA-4、PDL1、PDL2、PD1、B7-H3、B7-H4、BTLA、HVEM、TIM3、GAL9、LAG3、VISTA、KIR、2B4、CD160、CGEN-15049、CHK 1、CHK2、A2aR、OX40、B-7家族配体或其组合。优选地，免疫检查点抑制剂与检查点蛋白的配体相互作用，所述检查点蛋白可以是CTLA-4、PDL1、PDL2、PD1、B7-H3、B7-H4、BTLA、HVEM、TIM3、GAL9、LAG3、VISTA、KIR、2B4、CD160、CGEN-15049、CHK 1、CHK2、OX40、A2aR、B-7家族配体或其组合。优选地，检查点抑制剂是生物治疗剂或小分子。优选地，检查点抑制剂是单克隆抗体、人源化抗体、完全人抗体、肽模拟物或其组合。优选地，PD1检查点抑制剂包含一种或多种抗PD-1抗体，包括纳武单抗和派姆单抗。

使用根据本发明的肽模拟物的治疗方案也可以与用于治疗癌症的其他治疗剂组合。优选地，治疗剂和/或抗癌剂是抗体。优选地，治疗剂是治疗性蛋白质。优选地，治疗剂是小分子。优选地，抗癌剂是抗原。优选地，治疗剂是细胞群体。优选地，治疗剂是治疗性抗体。优选地，治疗剂是另一种细胞毒性剂和/或化疗剂。如本文所用的术语“细胞毒性剂”是指抑制或阻止细胞功能和/或导致细胞死亡或破坏的物质。“化疗剂”包括可用于治疗癌症的化合物。

抗体

优选地，将本发明的肽模拟物与治疗性抗体组合。产生抗体及其抗原结合片段的方法是本领域熟知的，并且公开于例如美国专利号7,247,301、US2008/0138336和美国专利号7,923,221中，所有这些专利通过引用以其整体并入本文。可用于本发明的方法的治疗性抗体包括但不限于批准用于临床试验或开发用于临床用途的任何本领域认可的治疗性抗体。在一些实施方案中，多于一种治疗性抗体可以包括在本发明的组合疗法中。治疗性抗体的非限制性例子包括而不限于以下：

·曲妥珠单抗(HERCEPTIN^TM，Genentech，南旧金山(South San Francisco)，加利福尼亚州)，其用于治疗HER-2/neu阳性乳腺癌或转移性乳腺癌；

·贝伐单抗(AVASTIN^TM，Genentech)，其用于治疗结直肠癌、转移性结直肠癌、乳腺癌、转移性乳腺癌、非小细胞肺癌或肾细胞癌；

·利妥昔单抗(RITUXAN^TM，Genentech)，其用于治疗非霍奇金淋巴瘤或慢性淋巴细胞白血病；

·帕妥珠单抗(OMNITARG^TM，Genentech)，其用于治疗乳腺癌、***癌、非小细胞肺癌或卵巢癌；

·西妥昔单抗(ERBITUX^TM，ImClone Systems Incorporated，纽约，纽约州)，其可用于治疗结直肠癌、转移性结直肠癌、肺癌、头颈癌、结肠癌、乳腺癌、***癌、胃癌、卵巢癌、脑癌、胰腺癌、食道癌、肾细胞癌、***癌、***或膀胱癌；

·IMC-1C11(ImClone Systems Incorporated)，其用于治疗结直肠癌、头颈癌以及其他潜在的癌症靶标；

·托西莫单抗以及托西莫单抗和碘I¹³¹(BEXXAR^TM，Corixa Corporation，西雅图(Seattle)，华盛顿州)，其用于治疗非霍奇金淋巴瘤，所述非霍奇金淋巴瘤可以是CD20阳性滤泡性非霍奇金淋巴瘤，具有和不具有转化，其疾病是利妥昔单抗难治的并且在化疗后复发；

·In¹¹¹替伊莫单抗(ibirtumomab tiuxetan)；Y⁹⁰替伊莫单抗；I¹¹¹替伊莫单抗和Y⁹⁰替伊莫单抗(ZEVALIN^TM，Biogen Idec，坎布里奇(Cambridge)，马萨诸塞州)，其用于治疗淋巴瘤或非霍奇金淋巴瘤，其可包括复发性滤泡性淋巴瘤；复发性或难治性、低分级或滤泡性非霍奇金淋巴瘤；或转化的B细胞非霍奇金淋巴瘤；

·EMD 7200(EMD Pharmaceuticals，达勒姆(Durham)，北卡罗来纳州)，其用于治疗非小细胞肺癌或***；

·SGN-30(靶向CD30抗原的基因工程化单克隆抗体，Seattle Genetics，博瑟尔(Bothell)，华盛顿州)，其用于治疗霍奇金淋巴瘤或非霍奇金淋巴瘤；

·SGN-15(靶向Lewisγ相关抗原的与多柔比星缀合的基因工程化单克隆抗体，Seattle Genetics)，其用于治疗非小细胞肺癌；

·SGN-33(靶向CD33抗原的人源化抗体，Seattle Genetics)，其用于治疗急性髓系白血病(AML)和骨髓增生异常综合征(MDS)；

·SGN-40(靶向CD40抗原的人源化单克隆抗体，Seattle Genetics)，其用于治疗多发性骨髓瘤或非霍奇金淋巴瘤；

·SGN-35(靶向CD30抗原的与澳瑞他汀E缀合的基因工程化单克隆抗体，SeattleGenetics)，其用于治疗非霍奇金淋巴瘤；

·SGN-70(靶向CD70抗原的人源化抗体，Seattle Genetics)，其用于治疗肾癌和鼻咽癌；

·SGN-75(由SGN70抗体和澳瑞他汀衍生物构成的缀合物，Seattle Genetics)；以及

·SGN-17/19(含有肽模拟物的与美法仑前药缀合的抗体和酶，SeattleGenetics)，其用于治疗黑色素瘤或转移性黑色素瘤。

用于本发明方法的治疗性抗体不限于本文所述的那些。例如，以下批准的治疗性抗体也可用于本发明的方法中：用于间变性大细胞淋巴瘤和霍奇金淋巴瘤的维汀-本妥昔单抗(ADCETRIS^TM)，用于黑色素瘤的伊匹单抗(MDX-101；YERVOY^TM)，用于慢性淋巴细胞白血病的奥法木单抗(ARZERRA^TM)，用于结直肠癌的帕尼单抗(VECTIBIX^TM)，用于慢性淋巴细胞白血病的阿仑单抗(CAMPATH^TM)，用于慢性淋巴细胞白血病的奥法木单抗(ARZERRA^TM)，用于急性髓细胞性白血病的吉妥珠单抗奥佐米星(MYLOTARG^TM)。

根据本发明使用的抗体还可以靶向免疫细胞表达的分子，如但不限于曲美木单抗(CP-675,206)和伊匹单抗(MDX-010)，其靶向CTLA4并具有肿瘤排斥、防止再激发和增强的肿瘤特异性T细胞应答的作用；OX86，其靶向OX40并增加肿瘤位点处的抗原特异性CD8+T细胞并增强肿瘤排斥；CT-011，其靶向PD1并具有维持和扩增肿瘤特异性记忆T细胞的作用并激活NK细胞；BMS-663513，其靶向CD137并引起已建立的肿瘤消退，以及CD8+T细胞的扩增和维持；以及达克利珠单抗(ZENAPAX^TM)，其靶向CD25并引起CD4+CD25+FOXP3+Treg的瞬时耗尽，并增强肿瘤消退和增加效应T细胞的数量。这些抗体的更详细讨论可见于例如Weiner等人,Nature Rev.Immunol 2010；10:317-27。

治疗性抗体可以是抗体的片段；包含抗体的复合物；或包含抗体的缀合物。抗体可以任选地是嵌合的或人源化的或完全人的抗体。

肽和蛋白质

优选地，本发明的方法包括施用本发明的肽模拟物与治疗性蛋白质或肽的组合。有效治疗癌症的治疗性蛋白质是本领域熟知的。优选地，治疗性多肽或蛋白质是“***蛋白”，其通过本身或在其他化合物的存在下引起细胞死亡。

这种***蛋白的代表性例子是单纯疱疹病毒的胸苷激酶。另外的例子包括水痘带状疱疹病毒的胸苷激酶、细菌基因胞嘧啶脱氨酶(其将5-氟胞嘧啶转化为高毒性化合物5-氟尿嘧啶)、p450氧化还原酶、羧肽酶G2、β-葡糖醛酸糖苷酶、青霉素-V-酰胺酶、青霉素-G-酰胺酶、β-内酰胺酶、硝基还原酶、羧肽酶A、亚麻苦苷酶(也称为β-葡糖苷酶)、大肠杆菌gpt基因、和大肠杆菌Deo基因，但其他也是本领域已知的。在一些实施方案中，***蛋白将前药转化为毒性化合物。

如本文所用，“前药”意指可用于本发明方法的任何化合物，其可转化为毒性产物，即对肿瘤细胞有毒性。前药通过***蛋白转化为毒性产物。此类前药的代表性例子包括：用于胸苷激酶的更昔洛韦、阿昔洛韦和FIAU(1-(2-脱氧-2-氟-β-D-***呋喃糖基)-5-碘-尿嘧啶)；用于氧化还原酶的异环磷酰胺；用于VZV-TK的6-甲氧基嘌呤***糖苷；用于胞嘧啶脱氨酶的5-氟胞嘧啶；用于β-葡糖醛酸糖苷酶的多柔比星；用于硝基还原酶的CB 1954和呋喃西林；以及用于羧肽酶A的N-(氰基乙酰基)-L-苯丙氨酸或N-(3-氯丙酰基)-L-苯丙氨酸。前药可以由本领域普通技术人员容易地施用。普通技术人员能够容易地确定前药施用的最适当的剂量和途径。

优选地，治疗性蛋白质或多肽是抑癌剂，例如p53或Rb，或编码这种蛋白质或多肽的核酸。技术人员知晓多种这样的抑癌剂以及如何获得它们和/或编码它们的核酸。

抗癌/治疗性蛋白质或多肽的其他例子包括促凋亡治疗性蛋白质和多肽，例如p15、p16或p21^WAF-1。

细胞因子和编码它们的核酸也可用作治疗性蛋白质和多肽。例子包括：GM-CSF(粒细胞巨噬细胞集落刺激因子)；TNF-α(肿瘤坏死因子α)；干扰素，包括但不限于IFN-α和IFN-γ；以及白细胞介素，包括但不限于白细胞介素-1(IL-1)、白细胞介素-β(IL-β)、白细胞介素-2(IL-2)、白细胞介素-4(IL-4)、白细胞介素-5(IL-5)、白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-7(IL-7)、白细胞介素-8(IL-8)、白细胞介素-10(IL-10)、白细胞介素-12(IL-12)、白细胞介素-13(IL-13)、白细胞介素-14(IL-14)、白细胞介素-15(IL-15)、白细胞介素-16(IL-16)、白细胞介素-18(IL-18)、白细胞介素-23(IL-23)、白细胞介素-24(IL-24)，但其他实施方案也是本领域已知的。

杀细胞基因的其他例子包括但不限于突变的细胞周期蛋白G1基因。例如，杀细胞基因可以是细胞周期蛋白G1蛋白的显性负突变(例如WO/01/64870)。

疫苗

优选地，本发明的方法包括将本发明的肽模拟物与癌症疫苗组合施用，以刺激癌症特异性免疫应答，例如先天性和适应性免疫应答，从而产生针对癌症的宿主免疫。说明性疫苗包括但不限于例如抗原疫苗、全细胞疫苗、树突细胞疫苗和DNA疫苗。根据疫苗的具体类型，疫苗组合物可包括一种或多种已知增强受试者对疫苗的免疫应答的合适佐剂。

疫苗可以是例如基于细胞的，即是使用来自患者自身癌细胞的细胞产生的以鉴定和获得抗原。示例性疫苗包括基于肿瘤细胞的疫苗和基于树突细胞的疫苗，其中将来自受试者的激活免疫细胞与其他蛋白质一起递送回同一受试者，以进一步促进这些肿瘤抗原引发的免疫细胞的免疫激活。基于肿瘤细胞的疫苗包括完整的肿瘤细胞和基因修饰的肿瘤细胞。可以任选地加工完整肿瘤细胞疫苗以增强抗原呈递，例如通过照射肿瘤细胞或肿瘤裂解物。根据所用疫苗的类型，疫苗施用还可以伴随佐剂，如卡介苗(BCG)或钥孔血蓝蛋白(KLH)。也可以使用质粒DNA疫苗，并且可以通过直接注射或生物弹射施用。还考虑使用肽疫苗、病毒基因转移载体疫苗和抗原修饰的树突细胞(DC)。

优选地，疫苗是基于治疗性癌症肽的疫苗。肽疫苗可使用已知序列或从分离自受试者的一种或多种自身肿瘤的抗原(包括新抗原和修饰的抗原)产生。说明性的基于抗原的疫苗包括其中抗原是肿瘤特异性抗原的疫苗。例如，肿瘤特异性抗原可以选自癌-睾丸抗原、分化抗原和广泛存在的过表达的肿瘤相关抗原等。当用于本发明的方法时，可以将基于来自肿瘤相关抗原的肽的重组肽疫苗与佐剂或免疫调节剂一起施用或配制。用于基于肽的疫苗的说明性抗原包括但不限于以下，因为该列表仅是说明性的。例如，肽疫苗可包含癌-睾丸抗原如MAGE、BAGE、NY-ESO-1和SSX-2，它们由正常情况下在成人组织中沉默但在肿瘤细胞中以转录方式再激活的基因编码。替代性地，肽疫苗可包含组织分化相关抗原，即正常组织来源的并由正常组织和肿瘤组织共有的抗原。例如，疫苗可包含黑色素瘤相关抗原如gp100、黑色素-A/Mart-1、MAGE-3或酪氨酸酶；或者可以包含***癌抗原如PSA或PAP。疫苗可包含乳腺癌相关抗原如乳腺珠蛋白-A。可包含在用于本发明方法的疫苗中的其他肿瘤抗原包括例如CEA、MUC-1、HER1/Nue、hTERT、ras和B-raf。可用于疫苗的其他合适抗原包括与癌症干细胞或EMT过程相关的SOX-2和OCT-4。

抗原疫苗包括多抗原和单抗原疫苗。示例性癌抗原可包括具有约5至约30个氨基酸、或约6至25个氨基酸、或约8至20个氨基酸的肽。

如上所述，免疫刺激佐剂(不同于RSLAIL-2)可用于疫苗，特别是基于肿瘤相关抗原的疫苗，以帮助产生有效的免疫应答。例如，疫苗可掺入病原体相关分子模式(PAMP)以帮助提高免疫力。其他合适的佐剂包括单磷酰脂质A或其他脂多糖；toll样受体(TLR)激动剂，例如咪喹莫特、瑞喹莫德(R-848)、TLR3、IMO-8400和林托莫德(rintatolimod)。适用的其他佐剂包括热休克蛋白。

基因疫苗通常使用携带表达盒的病毒或质粒DNA载体。在施用后，它们转染体细胞或树突细胞作为炎症反应的一部分，从而导致交叉致敏(cross-priming)或直接抗原呈递。优选地，基因疫苗是在一次免疫中提供多种抗原递送的疫苗。基因疫苗包括DNA疫苗、RNA疫苗和基于病毒的疫苗。

用于本发明方法的DNA疫苗是构建用于递送和表达肿瘤抗原的细菌质粒。DNA疫苗可通过任何合适的施用方式施用，例如皮下或皮内注射，但也可直接注射到***中。其他递送方式包括例如基因枪、电穿孔、超声、激光、脂质体、微粒和纳米颗粒。

优选地，疫苗包含一种新抗原或多种新抗原。优选地，疫苗是基于新抗原的疫苗。优选地，基于新抗原的疫苗(NBV)组合物可以串联编码多种癌症新抗原，其中每种新抗原是衍生自癌细胞中突变的蛋白质的多肽片段。例如，新抗原疫苗可以包含第一载体，所述第一载体包含编码多种免疫原性多肽片段的核酸构建体，每种蛋白质在癌细胞中突变，其中每种免疫原性多肽片段包含一个或多个突变的氨基酸，其侧翼为来自原始蛋白质的可变数量的野生型氨基酸，并且每种多肽片段头尾相连以形成免疫原性多肽。形成免疫原性多肽的每个免疫原性多肽片段的长度可以变化。

也可以使用病毒基因转移载体疫苗；在此类疫苗中，使用重组工程化病毒、酵母、细菌等以将癌症特异性蛋白引入患者的免疫细胞中。在可以是肿瘤裂解性或非肿瘤裂解性的基于载体的方法中，载体可以由于例如其固有的免疫刺激特性而提高疫苗的效率。说明性的基于病毒的载体包括来自痘病毒科的载体，如牛痘、修饰的牛痘毒株Ankara和禽痘病毒。还适合使用的是癌症疫苗PROSTVAC，其含有复制型牛痘致敏载体和复制缺陷型禽盒加强载体。每个载体含有PSA和三种共刺激分子CD80、CD54和CD58(统称为TRICOM)的转基因。其他合适的基于载体的癌症疫苗包括Trovax和TG4010(编码MUC1抗原和IL-2)。使用的其他疫苗包括基于细菌和酵母的疫苗，如重组单核细胞增生李斯特菌和酿酒酵母。

前述疫苗可与佐剂和其他免疫增强剂一起组合和/或配制以增加功效。根据具体的疫苗，施用可以是肿瘤内或非肿瘤内(即全身性)。

小分子

优选地，本发明的方法包括共同施用本发明的肽模拟物与抗癌小分子的组合。有效治疗癌症的小分子是本领域熟知的，并且包括参与肿瘤生长的因子(如EGFR、ErbB2(也称为Her2)、ErbB3、ErbB4或TNF)的拮抗剂。非限制性例子包括靶向一种或多种酪氨酸激酶受体如VEGF受体、FGF受体、EGF受体和PDGF受体的小分子受体酪氨酸激酶抑制剂(RTKI)。

许多治疗性小分子RTKI是本领域已知的，包括但不限于瓦他拉尼(PTK787)、厄洛替尼(TARCEVA^TM)、OSI-7904、ZD6474(ZACTIMA^TM)、ZD6126(ANG453)、ZD1839、舒尼替尼(SUTENT^TM)、司马沙尼(SU5416)、AMG706、AG013736、伊马替尼(GLEEVEC^TM)、MLN-518、CEP-701、PKC-412、拉帕替尼(GSK572016)、VELCADE^TM、AZD2171、索拉非尼(NEXAVAR^TM)、XL880和CHIR-265。小分子蛋白酪氨酸磷酸酶抑制剂，例如Jiang等人,Cancer MetastasisRev.2008；27:263-72中披露的那些也可用于实践本发明的方法。此类抑制剂可以靶向例如HSP2、PRL、PTP1B或Cdc25磷酸酶。

靶向Bcl-2/Bcl-XL的小分子，如US2008/0058322中披露的那些，也可用于实践本发明的方法。用于本发明的其他示例性小分子披露于Zhang等人Nature Reviews:Cancer2009；9:28-39中。特别地，导致免疫原性细胞死亡的化疗剂如蒽环类药物(Kepp等人,Cancer and Metastasis Reviews 2011；30:61-9)将非常适于与延长PK IL-2发挥协同效应。

另外的癌抗原和疫苗

优选地，本发明的方法包括施用本发明的肽模拟物与癌抗原的组合，例如，用作癌症疫苗(参见，例如，Overwijk,等人Journal of Experimental Medicine 2008；198:569-80)。可用于疫苗接种的其他癌抗原包括但不限于(i)肿瘤特异性抗原，(ii)肿瘤相关抗原，(iii)表达肿瘤特异性抗原的细胞，(iv)表达肿瘤相关抗原的细胞，(v)肿瘤上的胚胎抗原，(vi)自体肿瘤细胞，(vii)肿瘤特异性膜抗原，(viii)肿瘤相关膜抗原，(ix)生长因子受体，(x)生长因子配体，和(xi)与癌症相关的任何其他类型的抗原或抗原呈递细胞或物质。

癌抗原可以是上皮癌抗原(例如，乳腺、胃肠道、肺)、***特异性癌抗原(PSA)或***特异性膜抗原(PSMA)、膀胱癌抗原、肺(例如，小细胞肺)癌抗原、结肠癌抗原、卵巢癌抗原、脑癌抗原、胃癌抗原、肾细胞癌抗原、胰腺癌抗原、肝癌抗原、食道癌抗原、头颈癌抗原或结直肠癌抗原。

在另一个实施方案中，癌抗原是淋巴瘤(例如，非霍奇金淋巴瘤或霍奇金淋巴瘤)抗原、B细胞淋巴瘤癌抗原、白血病抗原、骨髓瘤(即，多发性骨髓瘤或浆细胞骨髓瘤)抗原、急性淋巴母细胞白血病抗原、慢性髓系白血病抗原或急性髓细胞性白血病抗原。所描述的癌抗原仅是示例性的，并且在本发明中可以靶向任何癌抗原。

优选地，癌抗原是在所有如以下的人腺癌上发现的粘蛋白-1蛋白或肽(MUC-1)：胰腺癌、结肠癌、乳腺癌、卵巢癌、肺癌、***癌、头颈癌，包括多发性骨髓瘤和一些B细胞淋巴瘤。患有炎性肠病(克罗恩病或溃疡性结肠炎)的患者发生结直肠癌的风险增加。MUC-1是I型跨膜糖蛋白。MUC-1的主要细胞外部分具有大量由20个氨基酸组成的串联重复，这些氨基酸构成免疫原性表位。在一些癌症中，其以被免疫***识别的非糖基化形式暴露(Gendler等人,J Biol Chem 1990；265:15286-15293)。

在另一个实施方案中，癌抗原是与黑色素瘤和结肠癌相关的突变B-Raf抗原。这些突变中的绝大多数代表在核苷酸1796处T-A的单个核苷酸变化，导致在B-Raf的激活区段内残基599处的缬氨酸变为谷氨酸。Raf蛋白也作为激活的Ras蛋白的效应物而与癌症间接相关，其致癌形式存在于所有人癌症的大约三分之一中。正常的非突变B-Raf参与细胞信号传导，将信号从细胞膜传递到细胞核。蛋白质通常仅在需要传递信号时才有活性。相比之下，已经报道突变体B-Raf具有持续活性，破坏信号传递(Mercer和Pritchard,BiochimBiophys Acta(2003)1653(1):25-40；Sharkey等人,Cancer Res.(2004)64(5):1595-1599)。

优选地，癌抗原是人表皮生长因子受体-2(HER-2/neu)抗原。具有过表达HER-2/neu的细胞的癌症称为HER-2/neu⁺癌症。示例性HER-2/neu⁺癌症包括***癌、肺癌、乳腺癌、卵巢癌、胰腺癌、皮肤癌、肝癌(例如，肝细胞腺癌)、肠癌和膀胱癌。

HER-2/neu具有与表皮生长因子受体(EGFR)具有40％同源性的大约645aa的细胞外结合结构域(ECD)，高度疏水的跨膜锚定结构域(TMD)和与EGFR具有80％同源性的大约580aa的羧基末端细胞内结构域(ICD)。HER-2/neu的核苷酸序列可从GENBANK^TM获得。登录号AH002823(人HER-2基因，启动子区和外显子1)；M16792(人HER-2基因，外显子4)：M16791(人HER-2基因，外显子3)；M16790(人HER-2基因，外显子2)；和M16789(人HER-2基因，启动子区和外显子1)。HER-2/neu蛋白的氨基酸序列可从GENBANK^TM获得。登录号AAA58637。基于这些序列，本领域技术人员可以使用已知的测定开发HER-2/neu抗原以发现产生有效免疫应答的适当表位。

示例性HER-2/neu抗原包括p369-377(HER-2/neu衍生的HLA-A2肽)；dHER2(CorixaCorporation)；li-Key MHC II类表位杂合体(Generex Biotechnology Corporation)；肽P4(氨基酸378-398)；肽P7(氨基酸610-623)；肽P6(氨基酸544-560)和P7的混合物；肽P4、P6和P7的混合物；HER2[9₇₅₄]等。

优选地，癌抗原是表皮生长因子受体(EGFR)抗原。EGFR抗原可以是EGFR变体1抗原、EGFR变体2抗原、EGFR变体3抗原和/或EGFR变体4抗原。具有过表达EGFR的细胞的癌症称为EGFR癌症。示例性EGFR癌症包括肺癌、头颈癌、结肠癌、结直肠癌、乳腺癌、***癌、胃癌、卵巢癌、脑癌和膀胱癌。

优选地，癌抗原是血管内皮生长因子受体(VEGFR)抗原。VEGFR被认为是癌症诱导的血管生成的调节物。具有过表达VEGFR的细胞的癌症称为VEGFR⁺癌症。示例性VEGFR⁺癌症包括乳腺癌、肺癌、小细胞肺癌、结肠癌、结直肠癌、肾癌、白血病和淋巴细胞白血病。

优选地，癌抗原是***特异性抗原(PSA)和/或***特异性膜抗原(PSMA)，其在雄激素非依赖性***癌中普遍表达。

优选地，癌抗原是Gp-100。糖蛋白100(gp 100)是与黑色素瘤相关的肿瘤特异性抗原。

优选地，癌抗原是癌胚抗原(CEA)。具有过表达CEA的细胞的癌症称为CEA⁺癌症。示例性CEA⁺癌症包括结直肠癌、胃癌和胰腺癌。示例性CEA抗原包括CAP-1(即CEA aa571-579)、CAP1-6D、CAP-2(即CEA aa 555-579)、CAP-3(即CEA aa 87-89)、CAP-4(CEA aa 1-11)、CAP-5(即CEA aa 345-354)、CAP-6(即CEA aa 19-28)和CAP-7。

优选地，癌抗原是糖抗原10.9(CA 19.9)。CA 19.9是与Lewis A血型物质相关的寡糖并且与结直肠癌相关。

优选地，癌抗原是黑色素瘤癌抗原。黑色素瘤癌抗原可用于治疗黑色素瘤。示例性黑色素瘤癌抗原包括MART-1(例如，MART-1 26-35肽、MART-1 27-35肽)；MART-1/黑色素A；pMel17；pMel17/gp100；gp100(例如，gp 100肽280-288、gp 100肽154-162、gp100肽457-467)；TRP-1；TRP-2；NY-ESO-1；p16；β-连环蛋白；mum-1；等。

优选地，癌抗原是突变型或野生型ras肽。突变ras肽可以是突变K-ras肽、突变N-ras肽和/或突变H-ras肽。ras蛋白中的突变通常发生在位置12(例如，精氨酸或缬氨酸取代甘氨酸)、13(例如，天冬酰胺取代甘氨酸)、61(例如，谷氨酰胺取代亮氨酸)和/或59。突变ras肽可用作肺癌抗原、胃肠癌抗原、肝癌抗原、髓系癌抗原(例如，急性白血病、脊髓发育不良)、皮肤癌抗原(例如，黑色素瘤、基底细胞、鳞状细胞)、膀胱癌抗原、结肠癌抗原、结直肠癌抗原和肾细胞癌抗原。

在本发明的另一个实施方案中，癌抗原是突变型和/或野生型p53肽。p53肽可用作结肠癌抗原、肺癌抗原、乳腺癌抗原、肝细胞癌癌抗原、淋巴瘤癌抗原、***癌抗原、甲状腺癌抗原、膀胱癌抗原、胰腺癌抗原和卵巢癌抗原。

癌抗原可以是细胞、蛋白质、肽、融合蛋白、编码肽或蛋白质的DNA、编码肽或蛋白质的RNA、糖蛋白、脂蛋白、磷蛋白、碳水化合物、脂多糖、脂质、它们中两种或更多种的化学连接的组合、它们中两种或更多种的融合物、或它们中两种或更多种的混合物。在另一个实施方案中，癌抗原是包含约6至约24个氨基酸；约8至约20个氨基酸；约8至约12个氨基酸；约8至约10个氨基酸；或约12至约20个氨基酸的肽。在一个实施方案中，癌抗原是具有MHC I类结合基序或MHC II类结合基序的肽。在另一个实施方案中，癌抗原包含对应于一个或多个细胞毒性T淋巴细胞(CTL)表位的肽。

细胞疗法

优选地，本发明的方法包括施用本发明的肽模拟物与治疗性细胞疗法的组合。可用于治疗癌症的细胞疗法是熟知的，并且披露于例如美国专利号7,402,431中。在一个优选的实施方案中，细胞疗法是T细胞移植。在优选的方法中，T细胞在移植到受试者中之前用IL-2离体扩增。用于细胞疗法的方法披露于例如美国专利号7,402,431、US2006/0057121、美国专利号5,126,132、美国专利号6,255,073、美国专利号5,846,827、美国专利号6,251,385、美国专利号6,194,207、美国专利号5,443,983、美国专利号6,040,177、美国专利号5,766,920、和US2008/0279836中。

化疗

优选地，本发明的方法包括施用本发明的肽模拟物与化疗剂的组合，所述化疗剂包括但不限于烷化剂、抗肿瘤抗生素、抗代谢剂、其他抗肿瘤抗生素和植物来源的药剂。

烷化剂是通过与生物学上重要的分子中的氨基、羧基、巯基和磷酸基形成共价键而损害细胞功能的药物。最重要的烷基化位点是DNA、RNA和蛋白质。烷化剂的活性取决于细胞增殖，但不是细胞周期阶段特异性的。适用于本发明的烷化剂包括但不限于双氯乙胺(氮芥类，例如苯丁酸氮芥、环磷酰胺、异环磷酰胺、氮芥、美法仑、尿嘧啶氮芥)、氮丙啶类(例如，噻替派)、烷基酮磺酸盐(例如，白消安)、亚硝基脲(例如，BCNU、卡莫司汀、洛莫司汀、链脲霉素)、非经典烷化剂(例如，六甲蜜胺、达卡巴嗪和丙卡巴肼)和铂化合物(例如，卡铂、奥沙利铂和顺铂)。

抗肿瘤抗生素如阿霉素在鸟嘌呤-胞嘧啶和鸟嘌呤-胸腺嘧啶序列处***DNA，导致自发氧化和形成导致链断裂的游离氧自由基。适用于本发明的其他抗生素药剂包括但不限于蒽环类(例如，多柔比星、道诺霉素、表柔比星、伊达比星和蒽二酮)、丝裂霉素C、博来霉素、更生霉素和普卡霉素。

适用于本发明的抗代谢剂包括但不限于氟尿苷、氟尿嘧啶、甲氨蝶呤、亚叶酸、羟基脲、硫鸟嘌呤、巯嘌呤、阿糖胞苷、喷司他丁、磷酸氟达拉滨、克拉屈滨、天冬酰胺酶和吉西他滨。

植物来源的药剂包括紫杉烷，它们是从紫杉植物的针叶中提取的前体的半合成衍生物。这些药物具有新型14元环，即紫杉烷。与引起微管分解的长春花生物碱不同，紫杉烷(例如泰素(taxol))促进微管组装和稳定性，因此阻断有丝***中的细胞周期。其他植物来源的药剂包括但不限于长春新碱、长春碱、长春地辛、长春利定、长春瑞滨、依托泊苷、替尼泊苷和多西他赛。

用于组合疗法的组合物

优选地，将本发明的肽模拟物与一种或多种另外的治疗剂或其他治疗剂(如治疗性抗体)一起(同时或依序)施用。优选地，将肽模拟物在施用一种或多种抗癌治疗剂如治疗性抗体之前施用。优选地，将肽模拟物与一种或多种抗癌治疗剂如治疗性抗体的施用并行施用。优选地，将肽模拟物在施用一种或多种抗癌治疗剂如治疗性抗体之后施用。优选地，将肽模拟物和一种或多种治疗剂如治疗性抗体同时施用。在其他实施方案中，将肽模拟物和一种或多种治疗剂如治疗性抗体依序施用。优选地，将肽模拟物和一种或多种治疗剂如治疗性抗体彼此在1、2或3天内施用。

一种或多种治疗剂可以是用作癌症辅助疗法的那些，如细胞因子、化疗剂、小分子、抗原或治疗性抗体，并且是本领域熟知的和上文讨论的。其他药剂的其他非限制性例子包括GM-CSF(扩增单核细胞和中性粒细胞群体)、IL-7(对记忆T细胞的产生和存活重要)、干扰素α、肿瘤坏死因子α、IL-12和治疗性抗体(如抗PD-1、抗PD-L、抗CTLA4、抗CD40、抗OX40和抗CD137)、PARP抑制剂、抗体。在一些实施方案中，受试者在同一的预防期、障碍发生和/或治疗期期间接受肽模拟物和一种或多种治疗剂。

优选地，本发明提供单独的药物组合物，其包含肽模拟物与药学上可接受的稀释剂、载体、增溶剂、乳化剂、防腐剂和/或佐剂；以及另一种药物组合物，其包含一种或多种治疗剂(如治疗性抗体)与药学上可接受的稀释剂、载体、增溶剂、乳化剂、防腐剂和/或佐剂。

优选地，本发明提供在同一组合物中包含肽模拟物和一种或多种治疗剂或抗癌剂以及药学上可接受的稀释剂、载体、增溶剂、乳化剂、防腐剂和/或佐剂的药物组合物。

其他疾病的治疗

本发明的肽模拟物可用于治疗其中需要抑制β-连环蛋白核易位或抑制β-连环蛋白信号传导途径的其他β-连环蛋白相关障碍。此类疾病和障碍包括但不限于：代谢疾病、骨质疏松症、神经疾病、免疫疾病、内分泌疾病、心血管疾病、血液疾病和炎性疾病。

优选地，本发明提供了治疗患者心血管疾病的方法，其包括向患者施用治疗有效量的本发明的肽模拟物。“心血管疾病”在本文中定义为影响心脏或血管的疾病或障碍。心血管疾病或障碍的非限制性例子主要包括动脉硬化的急性和慢性表现，如急性冠状动脉综合征、中风、短暂性缺血发作、心律失常、心力衰竭和外周动脉疾病。本发明还考虑用于治疗心血管疾病的组合疗法，其包括本发明的肽模拟物和本领域已知的用于治疗心血管疾病的任何其他治疗。

优选地，本发明提供了治疗患者的炎性疾病的方法，其包括向患者施用治疗有效量的本发明的肽模拟物。可用本文公开的组合物和方法治疗的炎性疾病或病症包括以本领域已知的炎性或过敏过程为特征的任何疾病或病症，如炎症、急性炎症、慢性炎症、呼吸***疾病、动脉粥样硬化、银屑病、皮炎、再狭窄、哮喘、过敏性鼻炎、特应性皮炎、脓毒性休克、类风湿性关节炎、炎性肠病、***性疾病、疼痛、眼部炎性疾病、乳糜泻、利氏综合征(Leigh syndrome)、甘油激酶缺乏症、家族性嗜酸性粒细胞增多症、常染色体隐性痉挛性共济失调、喉炎性疾病；结核病、慢性胆囊炎、支气管扩张、硅肺病和其他尘肺病。

可根据本发明的方法治疗的其他疾病和病症包括：衰老、头痛、复杂性区域性疼痛综合征、心脏肥大、肌营养不良(2A型)、分解代谢障碍；1型糖尿病、2型糖尿病、胎儿生长迟缓、血胆固醇过多症、动脉粥样硬化、心脏病、慢性心力衰竭、缺血/再灌注、中风、心绞痛、肺病、囊性纤维化肺动脉高压、透明膜、肾病、肾小球疾病、酒精性肝病、钩端螺旋体病、肾脏疾病、肠道疾病、腹膜子宫内膜异位、皮肤病、鼻窦炎、无汗性外胚层发育不良-ID、白塞病、色素失调症、结核病、哮喘、关节炎、克罗恩病、结肠炎、眼部过敏、双侧性青光眼、阑尾炎、佩吉特病、胰腺炎、牙周炎、子宫内膜异位症、炎性肠病、炎性肺病、二氧化硅诱导的脓毒症、睡眠呼吸暂停、AIDS(HIV-1)、自身免疫、抗磷脂综合征、狼疮、狼疮性肾炎、慢性疾病综合征、家族性地中海热、遗传性周期性发热综合征、心理社会应激疾病、神经病理性疾病、家族性淀粉样多神经病变、炎性神经病、创伤性脑损伤、帕金森病、多发性硬化、风湿性疾病、阿尔茨海默病、肌萎缩侧索硬化(ALS)、亨廷顿病、视网膜疾病、白内障和听力损失。

药物组合物

本发明提供了包含一种或多种本发明的肽模拟物和一种或多种药学上可接受的赋形剂的药物组合物。药物组合物可以任选地包含一种或多种另外的活性物质，例如治疗性和/或预防性活性物质。在药剂的配制和/或制造中的一般考虑可以在例如Remington:The Science and Practice of Pharmacy第21版,Lippincott Williams&Wilkins,2005(通过引用并入本文)中找到。

优选地，将组合物施用于人、人患者或受试者。出于本公开文本的目的，短语“活性成分”通常是指如本文所述的待递送的本发明的肽模拟物或其变体。

可以使用一种或多种赋形剂配制本发明的药物组合物。可通过药理学领域中已知或此后开发的任何方法制备本文所述的药物组合物。通常，此类制备方法包括将活性成分与赋形剂和/或一种或多种辅助成分缔合的步骤。

药物配制品可另外包含药学上可接受的赋形剂，如本文所用，所述药学上可接受的赋形剂包括适合于所需特定剂型的任何和所有溶剂、分散介质、稀释剂或其他液体媒介物、分散或悬浮助剂、表面活性剂、等渗剂、增稠剂或乳化剂、防腐剂、固体粘合剂、润滑剂、类脂质、脂质体、脂质纳米颗粒、聚合物、脂质体复合物、核-壳纳米颗粒、肽、蛋白质及其组合。Remington's The Science and Practice of Pharmacy,第21版,A.R.Gennaro(Lippincott,Williams&Wilkins,Baltimore,MD,2006；通过引用并入本文)披露了用于配制药物组合物的各种赋形剂及其制备的已知技术。

可以根据已知技术使用合适的分散剂、润湿剂和/或助悬剂配制可注射制剂，例如，无菌可注射水性或油性混悬剂。无菌可注射制剂可以是在无毒的肠胃外可接受的稀释剂和/或溶剂中的无菌可注射溶液剂、混悬剂和/或乳剂。可以采用的可接受的媒介物和溶剂包括水、林格氏溶液、U.S.P.和等渗氯化钠溶液。常规采用无菌不挥发性油作为溶剂或悬浮介质。出于这个目的，可以采用任何温和的不挥发性油，包括合成甘油单酯或甘油二酯。诸如油酸等脂肪酸可以用于注射剂的制备中。

可注射配制品可以例如通过以下方式来灭菌：经细菌截留过滤器过滤，和/或将灭菌剂并入无菌固体组合物形式中，所述无菌固体组合物可以在使用前溶解或分散于无菌水或其他无菌可注射介质中。在药剂的配制和/或制造中的一般考虑可以在例如Remington'sThe Science and Practice of Pharmacy,第21版,A.R.Gennaro(Lippincott,Williams&Wilkins,Baltimore,Md.,2006；通过引用并入本文)中找到。

剂量和施用

本发明提供了包括将本发明的肽模拟物施用于有需要的受试者的方法。优选地，可以将本发明的肽模拟物和包含本发明的肽模拟物的药物组合物通过导致治疗有效结局的任何途径施用，这些途径包括但不限于肠内、胃肠、硬膜上、口服、透皮、硬膜上(硬膜外)、大脑内(至大脑中)、脑室内(至大脑室中)、表皮(施加至皮肤上)、真皮内(至皮肤自身中)、皮下(皮肤下方)、鼻部施用(经过鼻子)、静脉内(至静脉中)、动脉内(至动脉中)、肌内(至肌肉中)、心内(至心脏中)、骨内输注(至骨髓中)、鞘内(至椎管中)、腹膜内(输注或注射至腹膜中)、膀胱内输注、玻璃体内(经过眼)、海绵窦内注射(至***根部中)、***内施用、子宫内、羊膜外施用、透皮(经过完整皮肤扩散以供全身分布)、经粘膜(经过粘膜扩散)、吸入法(嗅吸法)、舌下、唇下、灌肠、滴眼剂(至结膜上)或在滴耳剂中。

所需要的准确剂量将随受试者而改变，取决于受试者的物种、年龄和一般状况、疾病的严重程度、特定组合物、其施用方式、其活性模式等。根据本发明的组合物典型地以剂量单位形式来配制，以便于施用和剂量的一致性。然而，应理解，本发明的组合物的总日用量可由主治医师在合理的医学判断范围内决定。用于任一特定患者的具体治疗或预防有效剂量水平将取决于多种因素，包括所治疗的障碍和所述障碍的严重程度；所采用的具体化合物的活性；所采用的具体组合物；患者的年龄、体重、总体健康、性别和饮食；所采用具体化合物的施用时间、施用途径和***速率；治疗的持续时间；与所采用的具体化合物组合或同时使用的药物；以及医学领域中熟知的类似因素。

优选地，可以将根据本发明的组合物以足以递送每天约0.001mg/kg至约200mg/kg、约0.001mg/kg至约0.01mg/kg、约0.003mg/kg至约0.03mg/kg、约0.005mg/kg至约0.05mg/kg、约0.015mg/kg至约0.15mg/kg、约0.02mg/kg至约0.2mg/kg、约0.03mg/kg至约0.3mg/kg、约0.05mg/kg至约0.5mg/kg、约0.1mg/kg至约1mg/kg、约0.15mg/kg至约1.5mg/kg、约0.2mg/kg至约2mg/kg、约0.3mg/kg至约3mg/kg、约5mg/kg至约50mg/kg、约10mg/kg至约60mg/kg、约15mg/kg至约65mg/kg、约20mg/kg至约70mg/kg、或约30mg/kg至约80mg/kg、约40mg/kg至约90mg/kg、约50mg/kg至约100mg/kg、约75mg/kg至约150mg/kg、约100mg/kg至约150mg/kg或至少200mg/kg受试者体重的剂量水平施用，每天一次或多次，以获得期望的治疗、诊断或预防效果。可以每天三次、每天两次、每天一次、每隔一天、每三天、每周、每两周、每三周或每四周递送所需的剂量。在某些实施方案中，可以使用多次施用(例如，两次、三次、四次、五次、六次、七次、八次、九次、十次、十一次、十二次、十三次、十四次或更多次施用)来递送所需的剂量。所需剂量可包括在2周时间段内5次施用。

优选地，使用分割剂量施用本发明的药物组合物。如本文所用，“分割剂量”是将单一单位剂量或总日剂量分为两个或更多个剂量，例如，单一单位剂量的两次或更多次施用。如本文所用，“单一单位剂量”是以一个剂量/以一次/单一途径/单一接触点(即，单一施用事件)施用的任何治疗药的剂量。如本文所用，“总日剂量”是在24小时时间段中给予或指定的量。其可以作为单一单位剂量施用。

可以将药物组合物每天施用一次，或者可以在一天中以适当的间隔作为两个、三个或更多个亚剂量施用，或者甚至使用连续输注或通过控释配制品递送来施用。优选地，每个亚剂量中包含的肽模拟物必须相应地更小，以达到总日剂量。给药也可以根据一剂、二剂、三剂、四剂、五剂或更多剂的多次给药方案。

给药可以在一天、多于一天、一周、2周、3周、1个月或更长时间内以适当的间隔作为两个、三个或更多个亚剂量施用。

剂量单位可以使用连续输注在适当的时间间隔内施用，或者可以通过控释配制品进行递送。例如，可以将肽模拟物使用连续输注经1分钟、5分钟、10分钟、15分钟、30分钟、45分钟、1小时、2小时、3小时、4小时、5小时或更长时间施用。也可将剂量单位复合用于在数天内递送，例如使用提供在数天时间段内持续释放的常规持续释放配制品。持续释放配制品是本领域熟知的，并且特别可用于在特定部位递送药剂，例如可与本发明的药剂一起使用。在该实施方案中，剂量单位含有相应的多个日剂量。

单一剂量对任何特定表型或症状的影响可以是持久的，使得以不超过3、4或5天的间隔或以不超过1、2、3或4周的间隔施用后续剂量。

熟练技术人员将理解，某些因素可影响有效治疗受试者所需的剂量和时间安排，这些因素包括但不限于，疾病或障碍的严重程度、先前的治疗、受试者的一般健康状况和/或年龄、以及存在的其他疾病。此外，用治疗有效量的组合物治疗受试者可以包括单次治疗或一系列治疗。本发明所涵盖的单独药物组合物的有效剂量和体内半衰期的估计可以使用常规方法或基于使用适当动物模型的体内测试来进行。

递送***

各种递送***是已知的并且可以用于施用根据本发明的肽模拟物和/或其药物组合物，例如包封在脂质体、微粒、微胶囊中、能够表达化合物的重组细胞、受体介导的胞吞作用、作为逆转录病毒载体或其他载体的一部分的核酸的构建等。肽模拟物或其组合物可以通过输注或弹丸式注射、通过上皮或粘膜皮肤内层(例如，口腔粘膜、直肠和肠粘膜等)吸收来施用，并且可以与其他生物活性剂一起施用。

施用可以是全身的或局部的。此外，可能需要通过任何合适的途径将本发明的药物组合物和肽模拟物引入中枢神经***，所述合适的途径包括脑室内和鞘内注射；脑室内注射可以通过脑室内导管来辅助，所述脑室内导管例如附接到诸如Ommaya储器等储器。也可以使用肺部施用，例如，通过使用吸入器或喷雾器，以及与雾化剂一起配制。

优选地，可以将本发明的药物组合物和肽模拟物局部施用于需要治疗的区域；这可通过例如但不限于以下的方式来实现：手术期间的局部输注、局部应用(例如与手术后的伤口敷料结合)、通过注射、通过导管、通过栓剂或通过植入物，所述植入物为多孔、无孔或凝胶状材料，包括膜(如sialastic膜)或纤维。优选地，当施用本发明的肽模拟物时，必须注意使用蛋白质不吸收的材料。在另一个实施方案中，可以将化合物或组合物在囊泡中，特别是在脂质体中递送。优选地，可以将组合物在控释***中递送。优选地，可以将组合物在持续释放***中递送。在一个实施方案中，可以使用泵。在另一个实施方案中，可以使用聚合物材料。优选地，可以将控释***置于治疗靶标附近，因此仅需要全身剂量的一部分。

其他用途

多种β-TrCP底物(包括根据本发明的DKK3b的肽模拟物)的活性也可用作Dkk3b治疗的生物标记物或伴随诊断物(例如，可在AC1治疗前后从患者收集血细胞)。TNF或佛波酯(PBA)或脂多糖(LPS)可用于刺激收集的血细胞中的NF-kB活性。NF-kB依赖性细胞活性的治疗前与治疗后比率将指示AC1活性。

肽模拟物的产生

可以重组产生或通过用于肽合成的化学方法产生肽模拟物。

本发明提供了用于重组生产的编码本发明肽模拟物的核酸序列。优选地，对核酸序列进行密码子优化以在选择用于表达的宿主细胞类型中表达。将编码本发明肽模拟物的核酸序列***适当的表达媒介物中，所述表达媒介物即为含有所***编码序列的转录和翻译必需元件的载体，或在RNA病毒载体的情况下为含有复制和翻译必需元件的载体。然后将表达媒介物转染到将表达肽模拟物的合适的宿主细胞中。

通常，用于任何宿主细胞的表达载体含有用于质粒或病毒维持和用于克隆和表达外源核苷酸序列的序列。此类序列(统称为“侧翼序列”)通常包括以下可操作地连接的核苷酸序列中的一个或多个：启动子、一个或多个增强子序列、复制起点、转录终止序列、含有供体和受体剪接位点的完整内含子序列、编码用于多肽分泌的前导序列的序列、核糖体结合位点、聚腺苷酸化序列、用于***编码待表达多肽的核酸的多接头区、和选择性标记元件。

任选地，载体可含有“标签”编码序列，即，位于编码序列的5'或3'末端的寡核苷酸分子：编码聚His(如六His)的寡核苷酸序列，或市售抗体存在的另一“标签”，如

HA(来自流感病毒的血凝素)或myc。标签通常在表达时与抗体蛋白融合，并可用作从宿主细胞中亲和纯化抗体的手段。亲和纯化可以例如通过使用针对标签的抗体作为亲和基质的柱色谱来完成。任选地，随后可以通过各种方法从纯化的抗体多肽中去除标签，如使用某些肽酶进行切割。

当在适当的条件下培养时，转化的宿主细胞合成肽模拟物，肽模拟物随后可从培养基中收集(如果宿主细胞将其分泌到培养基中)或直接从产生其的宿主细胞中收集(如果其不分泌)。适当宿主细胞的选择将取决于各种因素，如所需的表达水平、活性所需或必需的多肽修饰(如糖基化或磷酸化)和折叠成生物活性分子的容易性。

优选地，宿主细胞选自哺乳动物细胞、细菌细胞、植物、微生物、藻类和真菌细胞。在一些实施方案中，细胞是哺乳动物细胞，如但不限于人、小鼠、大鼠、山羊、马、兔、仓鼠或牛细胞。优选地，细胞可以来自建立的细胞系，包括但不限于HeLa、NS0、SP2/0、KEK 293T、Vero、Caco、Caco-2、MDCK、COS-1、COS-7、K562、Jurkat、CHO-K1、DG44、CHOK1SV、CHO-S、Huvec、CV-1、Huh-7、NIH3T3、HEK293、293、A549、HepG2、IMR-90、MCF-7、U-20S、Per.C6、SF9、SF21或中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。

优选地，编码肽模拟物的核酸还编码有效地将表达的肽模拟物递送至细胞分泌途径的外源信号序列，从而允许从细胞培养基中回收和纯化肽模拟物。如果肽模拟物在没有分泌信号肽的情况下表达，可能需要从宿主细胞裂解物中回收肽模拟物。

优选地，分泌识别肽(SRP)是任何熟知的序列基序，其将蛋白质靶向易位穿过内质网(ER)膜。SRP通常衍生自分泌的蛋白质，并可进一步修饰。优选的SP是来自天青杀素(Azurocidin)的SP、来自PTEN(10号染色体上的磷酸酶和张力蛋白同源物)的SP、来自肝素结合蛋白(HPB)的SP。

优选地，将肽模拟物进一步从培养基中纯化和/或在培养基中浓缩。在一些实施方案中，使用合适的方法纯化和/或浓缩肽模拟物。合适的方法包括反相色谱、高效液相色谱、离子交换色谱、尺寸排阻色谱、亲和色谱、凝胶电泳等。用于纯化特定肽模拟物的实际条件将部分取决于合成策略和诸如净电荷、疏水性、亲水性等因素，并且对于本领域普通技术人员而言是清楚的。

包括SRP和聚His纯化标签的本发明肽模拟物的例子具有以下氨基酸序列：

如本领域所理解的，在本发明的药物组合物和方法中使用肽模拟物之前切割SRP和纯化标签。

用于化学合成肽(在本文中称为“肽合成”)的示例性非限制性方法包括Stuart和Young于“Solid Phase Peptide Synthesis,”第二版,Pierce Chemical Company(1984),“Solid Phase Peptide Synthesis,”Methods Enzymol.289,Academic Press,Inc,NewYork(1997),Proteins；Structures and molecular properties,第二版(1993)W.H.Freeman and Company,Merrifield,B.“Solid phase synthesis”Science(1986)232,241-247；以及Sheppard,R.C.,“Modern Methods of solid phase peptide synthesis”Science Tools(1986)33,9-16中所述的那些，每个参考文献均通过引用以其整体并入本文。这些方法包括使用液相和固相化学肽合成。例如，本文所述的肽和肽模拟物可以使用固相策略在自动化多肽合成仪(Abimed AMS 422)上使用9-芴基甲氧基羰基(Fmoc)化学来合成。各种合成制剂的纯度可以通过例如高效液相色谱分析和质谱法来评估。化学合成方法可能优于细胞表达***(例如，酵母或细菌蛋白质表达***)，因为它们可以排除对大量重组蛋白纯化步骤(例如，临床使用所需)的需要。相比之下，经由化学合成方法产生较长的合成多肽可能更复杂和/或成本更高，并且使用细胞表达***可以更有利地产生此类多肽。在一些实施方案中，本说明书的肽是化学合成的(例如，固相或液相肽合成)。在一些实施方案中，肽，例如本说明书的肽模拟物和N末端肽可缺少N末端甲硫氨酸残基，如上文详细讨论的。

试剂盒

本发明提供了用于便利地和/或有效地实施本发明方法的各种试剂盒。通常，试剂盒将包含足够量和/或数量的组分(以允许使用者对一名或多名受试者进行多次治疗和/或进行多次实验)以及包装和说明书。

在一些实施方案中，试剂盒将提供试剂盒中的肽模拟物的分割剂量或用于施用所述分割剂量的说明书。

等效物和范围

本领域技术人员仅使用常规实验就将认识到或能够确定根据本文所述的本发明的具体实施方案的许多等效物。本发明的范围并不旨在受限于上述说明，而是如所附的权利要求中所述。

在权利要求中，除非上下文明确指示相反或其他含义，否则诸如“一个/种”(“a”、“an”)和“所述”等冠词可以意指一个/种或多于一个/种。除非上下文明确指示相反或其他含义，否则如果一个、多于一个或所有组成员存在于、用于或以其他方式相关于给定产物或工艺，则包括一组的一个或多个成员之间的“或”的权利要求或说明被视为满意的。本发明包括其中确切地一个组成员存在于、用于或以其他方式相关于给定产物或工艺的实施方案。本发明包括如下实施方案，在所述实施方案中多于一个或所有的组成员存在于、被用于或以其他方式关联于给定的产品或过程。

还应注意，术语“包含”旨在是开放式的并且允许但不需要包括其他元件或步骤。在本文中使用术语“包含”时，由此也涵盖并公开术语“由……组成”。

在给出范围时，包括端点。此外，应理解，除非根据上下文和本领域普通技术人员的理解另有指示或有其他明确含义，否则在本发明的不同实施方案中，表示为范围的值可以假定所述范围内的任何具体值或子范围，除非上下文明确另有指示，否则精确至所述范围的下限的单位的小数点后一位。

另外，应理解，落在现有技术内的本发明的任何特定实施方案可以明确地从任何一项或多项权利要求排除。由于认为此类实施方案是本领域普通技术人员已知的，即使本文中没有明确陈述排除，也可以将其排除。

本发明的组合物的任何特定实施方案；任何产生方法；任何使用方法等可以因任何原因从任何一项或多项权利要求排除，不论是否与现有技术的存在相关。

实施例

实施例1：肽模拟物AC1和cpDKK3b之间的β-连环蛋白沉默活性的比较。

使用双链cDNA g块合成肽模拟物AC1的氨基酸序列，所述双链cDNA g块由以下构成：(i)起始甲硫氨酸，随后为(ii)人天青杀素的分泌结构域，(iii)4个氨基酸的间隔区，(iv)6个组氨酸残基，(v)9个随机氨基酸的间隔区和(vi)SEQ ID NO:1：

其中(i)-(v)为斜体字。

将该cDNA克隆到pcDNA3.4表达载体中。使用ExpiCHO-S细胞表达分泌的AC1。使用Ni-NTA树脂通过IMAC色谱法纯化分泌的AC1。

在TOPFLASH测定中评价AC1(SEQ ID NO:1)和融合肽cpDKK3b(SEQ ID NO:2)的β-连环蛋白信号传导活性。

通过使用复制缺陷型慢病毒将Lef/Tcf-Luc2CP报告构建体***HEK293细胞的基因组中产生TOPLFASH报告细胞。通过添加30mM LiCl诱导β-连环蛋白信号传导，并向培养基中添加渐增浓度的AC1或cpDKK3b。在37℃下16小时后，使用商业萤光素酶测定测量萤光素酶活性。处理实验一式四份进行，每个实验重复至少三次。

结果示于图2中。在β-连环蛋白沉默活性方面，AC1的效力是pDKK3b的10,000倍。

不限于任何理论，认为包括AC1的本发明的肽模拟物的设计允许本文公开的肽模拟物折叠成与天然DKK3b蛋白(SEQ ID NO:47)的折叠紧密相关的构型。cpDKK3b是一种变性分子，其显著地增加治疗功效所需的蛋白负荷。

实施例2：AC1和cpDKK3b对癌细胞存活的影响的比较

用10,000个卵巢癌(OVCAR3)或结直肠癌(Colo205)细胞接种聚赖氨酸包被的96孔微量滴定盘的一式四份孔，并在37℃下生长24小时。向培养基中添加渐增浓度的AC1或cpDKK3b，并使细胞在37℃下再生长16小时。轻轻抽吸处理培养基，用冷磷酸盐缓冲盐水洗涤孔3次，并且用5μM DRAQ5标记细胞DNA。使用LiCOR Odyssey Clx扫描仪的700nm通道对单独孔中的DNA成像。使用Image Studio Ver 5.2软件(LiCOR)处理数据。数据报告为一式四份孔的平均值。结果在图3中示出。在抑制癌细胞生长方面，AC1的效力是pDKK3b的10,000倍。

实施例3：SEQ ID NO:1的肽模拟物的生物利用度

使用慢病毒感染将体内生物报告基因(一种短寿命的由β连环蛋白驱动的萤火虫萤光素酶cDNA)引入人卵巢癌(OVCAR3)细胞中。将表达生物报告物的嘌呤霉素抗性OVCAR3细胞(OVR3R细胞)用抗生素选择并扩增。将5x10⁶个OVR3R细胞悬浮于100μl 50％Matrigel中，并注射(皮下)于免疫受损裸鼠的侧腹。在研究前使肿瘤生长至100mm³(范围为85-105mm³)。

在注射AC1之前，使用IVIS Spectrum系列生物发光光学成像***和注射的VivoGlo萤光素对肿瘤定位的β-连环蛋白信号传导成像。在研究开始时，将AC1(0.5μg)在200μl PBS中IP注射，并在注射后1、6、24和48小时测量肿瘤生物发光(BIL)。随时间测量每个OVR3R肿瘤的BIL-总通量(光子/秒)，并将每个时间的BIL相对基础水平归一化。数据报告为平均值±se，n＝6。结果在图4中示出。

实施例4：肽模拟物AC2在体内提供β-连环蛋白信号传导的时间依赖性抑制。

将卵巢癌细胞(5x10⁶个表达β连环蛋白依赖性萤光素酶cDNA的OVCAR3细胞)植入5只裸鼠的侧腹皮肤下，并使肿瘤生长至体积>100mm³。通过IVIS Spectrum成像仪(PerkinElmer，型号：IVIS Spectrum Preclinical In Vivo Imaging System)使用体内成像测量肿瘤β连环蛋白信号传导。

在研究的第0天，每只小鼠接受单次100微升肽模拟物AC2(具有SEQ ID NO:75的氨基酸序列)的静脉注射，其在补充有100微克/毫升硫酸葡聚糖(5,000mw)的生理盐水中含有1微克药物。每天对小鼠成像。研究结果示于图5中，该图提供了来自五只小鼠的数据。如图5所示，注射的肽模拟物到达植入的肿瘤，并显示β连环蛋白信号传导的时间依赖性降低，这在4天后稳定，60％的β连环蛋白沉默。

本文提及的专利和科学文献确立了本领域技术人员可获得的知识。本文引用的所有美国专利和公开或未公开的美国专利申请均通过引用并入。本文引用的所有公开的外国专利和专利申请均通过引用特此并入。本文引用的所有其他公开的参考文献、文件、手稿和科学文献均通过引用特此并入。

虽然已参考本发明的优选实施方案特定地显示并描述了本发明，但本领域技术人员将理解，在不背离所附权利要求所涵盖的本发明的范围的情况下，可在本发明中作出各种形式和细节的变化。还应理解，本文所描述的实施方案不是相互排斥的，而是来自各个实施方案的特征可以根据本发明全部或部分组合。

Claims (51)

1.一种人DKK3b的肽模拟物，其包含：

i.N末端结构域，其具有包含无规卷曲、α螺旋或β折叠片层的氨基酸序列且在所述N末端结构域的前6个氨基酸内包含约2至约3个带负电荷的氨基酸；

ii.N-1结构域，其为人DKK1、DKK2、DKK3b或DKK4的N-1结构域的变体，其中所述变体与人DKK1、DKK2、DKK3b或DKK4的N-1结构域至少约75％相同，并且其中所述变体包含细胞穿透肽，或

N-1结构域，其包含与SEQ ID NO:7、8、45、46、或69至少约80％相同的氨基酸序列，并且其中所述N-1结构域包含细胞穿透肽；以及

iii.C末端结构域，其具有包含无规卷曲、α螺旋或β折叠片层的氨基酸序列，在所述C末端结构域的最后6个氨基酸内包含约2至约3个带负电荷的氨基酸；

并且其中所述肽模拟物是β-连环蛋白核易位或β-连环蛋白信号传导途径的抑制剂。

2.根据权利要求1所述的肽模拟物，其中所述细胞穿透结构域是长度为约4至约8个氨基酸的肽。

3.根据权利要求1所述的肽，其中所述细胞穿透结构域是长度为约4至约8个精氨酸残基的肽。

4.根据权利要求1所述的肽模拟物，其中所述肽模拟物包含如下N-1结构域，所述N-1结构域是分别具有SEQ ID NO:3、4、5和6的氨基酸序列的人DKK1、DKK2、DKK3b和DKK4中一个的N-1结构域的变体，其中人DKK1、DKK2，DKK3b或DKK4的N-1结构域的一个或多个半胱氨酸残基被保守氨基酸取代。

5.根据权利要求4所述的肽模拟物，其中所述N-1结构域包含与SEQ ID NO:7、8、45、46、或69至少约80％相同的氨基酸序列，并且其中所述N-1结构域包含细胞穿透肽。

6.根据权利要求5所述的肽模拟物，其中所述N-1结构域包含与SEQ ID NO:45至少约80％相同的氨基酸序列。

7.根据权利要求1所述的肽模拟物，其包含在所述N末端结构域与所述N-1结构域之间和/或在所述N-1结构域与所述C末端结构域之间的氨基酸接头。

8.根据权利要求7所述的肽模拟物，其中所述氨基酸接头的长度为约1至约150个氨基酸。

9.根据权利要求8所述的肽模拟物，其中所述氨基酸接头的长度为约1至约2个氨基酸。

10.根据权利要求1所述的肽模拟物，其中所述N末端结构域在氨基酸位置2、4和5处包含带负电荷的氨基酸。

11.根据权利要求1所述的肽模拟物，其中所述N末端结构域包含与SEQ ID NO:59至少约80％相同的氨基酸序列。

12.根据权利要求1所述的肽模拟物，其中所述N末端结构域包含SEQ ID NO:59的氨基酸序列。

13.根据权利要求1所述的肽模拟物，其中所述N末端结构域包含氨基酸序列Φ₁DAEDLLLKLNLAATVGTAPP(SEQ ID NO:62)，其中Φ₁是苏氨酸、丝氨酸或除脯氨酸和甲硫氨酸之外的非极性氨基酸。

14.根据权利要求13所述的肽，其中所述N末端结构域包含选自ADAEDLLLKLNLAATVGTAPP(SEQ ID NO:63)和IDAEDLLLKLNLAATVGTAPP(SEQ ID NO:64)的氨基酸序列。

15.根据权利要求1所述的肽模拟物，其中所述C末端结构域在所述C末端结构域的最后6个氨基酸内包含两个连续的带负电荷的氨基酸。

16.根据权利要求15所述的肽模拟物，其中所述带负电荷的氨基酸正好位于所述C末端结构域的最后一个氨基酸之前。

17.根据权利要求1所述的肽模拟物，其中所述C末端结构域包含与SEQ ID NO:49至少约80％相同的氨基酸序列。

18.根据权利要求1所述的肽模拟物，其中所述C末端结构域包含与SEQ ID NO:60至少约80％相同的氨基酸序列。

19.根据权利要求18所述的肽模拟物，其中所述C末端结构域包含SEQ ID NO:60的氨基酸序列。

20.根据权利要求1所述的肽模拟物，其包含与SEQ ID NO:1的氨基酸序列至少约80％相同的氨基酸序列。

21.根据权利要求20所述的肽模拟物，其包含SEQ ID NO:1的氨基酸。

22.根据权利要求1所述的肽模拟物，其包含与以下氨基酸序列至少约80％相同的氨基酸序列：

Φ₂DAEDLLLKLNLAATVGTAPPKGKNLGQAYPASSDKESEVGRYSHSPHQGSSACMVARRRRRRAHRDGMACPSTRSNNGIAIPVPTAALLIILGGDDI(SEQ ID NO:66)，或

Φ₂DAEDLLLKLNLAATVGTAPPKGKNLGQAYPASSDKESEVGRYSHSPHQGSSAωMVARRRRRRAHRDGMAωPSTRSNNGIAIPVPTAALLIILGGDDI(SEQ ID NO:70)；

其中Φ₂是苏氨酸、丝氨酸或除脯氨酸和甲硫氨酸之外的非极性氨基酸；并且其中每个ω独立地是丙氨酸或丝氨酸。

23.根据权利要求22所述的肽模拟物，其中所述肽模拟物包含选自以下的氨基酸序列：ADAEDLLLKLNLAATVGTAPPKGKNLGQAYPASSDKESEVGRYSHSPHQGSSACMVARRRRRRAHRDGMACPSTRSNNGIAIPVPTAALLIILGGDDI(SEQ ID NO:67)；IDAEDLLLKLNLAATVGTAPPKGKNLGQAYPASSDKESEVGRYSHSPHQGSSACMVARRRRRRAHRDGMACPSTRSNNGIAIPVPTAALLIILGGDDI(SEQ ID NO:68)；

IDAEDLLLKLNLAATVGTAPPKGKNLGQAYPASSDKESEVGRYSHSPHQGSSASMVARRRRRRAHRDGMAAPSTRSNNGIAIPVPTAALLIILGGDDI(SEQ ID NO:75)；

IDAEDLLLKLNLAATVGTAPPKGKNLGQAYPASSDKESEVGRYSHSPHQGSSAAMVARRRRRRAHRDGMASPSTRSNNGIAIPVPTAALLIILGGDDI(SEQ ID NO:76)；

ADAEDLLLKLNLAATVGTAPPKGKNLGQAYPASSDKESEVGRYSHSPHQGSSASMVARRRRRRAHRDGMAAPSTRSNNGIAIPVPTAALLIILGGDDI(SEQ ID NO:77)；以及

ADAEDLLLKLNLAATVGTAPPKGKNLGQAYPASSDKESEVGRYSHSPHQGSSAAMVARRRRRRAHRDGMASPSTRSNNGIAIPVPTAALLIILGGDDI(SEQ ID NO:78)。

24.一种DKK3b的肽模拟物，其从N末端到C末端包含：

i)NH₂-Φ-Y-X-Y-Y-X₁

式4

其中：

每个Y独立地为带负电荷的氨基酸；

X是任何非极性氨基酸或带负电荷的氨基酸；

X₁为约4至约70个氨基酸的肽，其形成无规卷曲、α螺旋或β折叠片层；以及

Φ是除脯氨酸之外的非极性氨基酸，或者是苏氨酸或丝氨酸；

ii)如下N-1结构域，其为具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的人DKK1的N-1结构域的变体，具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的人DKK2的N-1结构域的变体，具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的人DKK3b的N-1结构域的变体，或具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的DKK4的N-1结构域的变体；其中所述变体包含细胞穿透肽，并且其中所述变体与SEQ ID NO:3、4、5和6中的一个具有至少约75％序列同一性，或

如下N-1结构域，其与SEQ ID NO:7、8、45或46的氨基酸序列具有至少约80％序列同一性并且其中所述N-1结构域包含细胞穿透肽；以及

iii)包含式2的肽的C末端结构域

X₂-Gly-Gly-X₃-Ile-COOH

式2

其中：

X₂为约4至约40个氨基酸的肽，其形成无规卷曲、α螺旋或β折叠片层；

Gly是氨基酸甘氨酸；以及

X₃是长度为2个连续氨基酸的肽，其中所述2个连续氨基酸是2个带负电荷的氨基酸或一个带负电荷的氨基酸和一个带正电荷的氨基酸；

其中所述肽模拟物是β-连环蛋白核易位或β-连环蛋白信号传导途径的抑制剂。

25.根据权利要求24所述的肽模拟物，其中Y是谷氨酸(Glu)或天冬氨酸(Asp)。

26.根据权利要求24所述的肽模拟物，其中X₁的长度为约15-17个氨基酸。

27.根据权利要求24所述的肽模拟物，其中所述N末端结构域的长度为约19至约22个氨基酸。

28.根据权利要求24所述的肽模拟物，其中X是丙氨酸。

29.根据权利要求24所述的肽模拟物，其中所述N末端结构域包含式3b的肽

NH₂-Φ-Asp-X₄-Glu-Asp-X₁

式3b

其中X₄是任何疏水性氨基酸；并且

X₁为约4至约70个氨基酸的肽，其形成无规卷曲、α螺旋或β折叠片层。

30.根据权利要求29所述的肽模拟物，其中X₄是丙氨酸。

31.根据权利要求29所述的肽模拟物，其中X₁的长度为15-17个氨基酸。

32.根据权利要求29所述的肽模拟物，其中所述式3b的肽具有与SEQ ID NO:59至少约80％相同的氨基酸序列。

33.根据权利要求24所述的肽模拟物，其中所述N-1结构域是人DKK2的N-1结构域的变体。

34.根据权利要求24和33中任一项所述的肽模拟物，其中所述人DKK1、DKK2、DKK3b或DKK4的N-1结构域中存在的半胱氨酸残基中的至少一个被保守氨基酸取代。

35.根据权利要求34所述的肽模拟物，其中所述保守氨基酸取代选自丙氨酸(Ala)和丝氨酸(Ser)。

36.根据权利要求24所述的肽模拟物，其中所述细胞穿透结构域的长度为约4至约8个氨基酸。

37.根据权利要求36所述的肽模拟物，其中所述细胞穿透结构域的长度为约6个氨基酸。

38.根据权利要求37所述的肽模拟物，其中所述细胞穿透结构域包含6个连续的精氨酸残基。

39.根据权利要求24所述的肽模拟物，其中所述N-1结构域的氨基酸序列选自SEQ IDNO:7、8、45和46。

40.根据权利要求24所述的肽模拟物，其中所述N-1结构域包含与SEQ ID NO:45的氨基酸序列至少约80％相同的氨基酸序列并包含细胞穿透结构域。

41.根据权利要求40所述的肽模拟物，其中所述N-1结构域包含SEQ ID NO:45的氨基酸序列。

42.根据权利要求24所述的肽模拟物，其中X₂的长度为约8个氨基酸。

43.根据权利要求24所述的肽模拟物，其中所述C末端结构域包含约12至约14个氨基酸。

44.根据权利要求24所述的肽模拟物，其中X₃包含至少两个连续的带负电荷的氨基酸，其中每个带负电荷的氨基酸独立地选自Asp和Glu。

45.根据权利要求24所述的肽模拟物，其中所述式2的C末端结构域具有与SEQ ID NO:60具有至少约80％序列同一性的氨基酸序列。

46.一种药物组合物，其包含根据权利要求1至45中任一项所述的肽模拟物和药学上可接受的载体。

47.一种抑制患者中β-连环蛋白核易位的方法，所述方法包括向有需要的患者施用有效量的根据权利要求1至45中任一项所述的肽模拟物。

48.根据权利要求47所述的方法，其中所述方法用于治疗患者中由β-连环蛋白信号传导途径的失调引起的疾病。

49.根据权利要求48所述的方法，其中所述方法用于治疗选自由癌症/增殖性疾病、代谢疾病、骨质疏松症、神经疾病、免疫疾病、内分泌疾病、心血管疾病、血液疾病和炎性疾病组成的疾病和障碍群组的疾病。

50.根据权利要求47所述的方法，其中所述肽模拟物包含与SEQ ID NO:1、62、63或64的氨基酸序列具有至少约80％同一性的氨基酸序列。

51.根据权利要求50所述的方法，其中所述肽模拟物包含SEQ ID NO:1、62、63或64的氨基酸序列。

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