CN114921508B - (r)-6-羟基色满-3-羧酸的生物催化制备方法 - Google Patents

(r)-6-羟基色满-3-羧酸的生物催化制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种(R)‑6‑羟基色满‑3‑羧酸的生物催化制备方法，包括步骤：步骤(a)在液态反应体系中，以式I化合物为底物，在辅酶存在下，在烯还原酶催化下，进行不对称还原反应，形成式II化合物；步骤(b)从所述步骤(a)的反应后的反应体系中分离出式II化合物；其中，所述烯还原酶选自：烯还原酶ERED‑16323或ERED‑1663。本发明还提供一种反应体系。本发明的优点在于步骤短，条件温和，转化率高，产品光学纯度高。

Description

(R)-6-羟基色满-3-羧酸的生物催化制备方法
技术领域
本发明属于医药技术领域，特别是涉及一种(R)-6-羟基色满-3-羧酸的生物催化制备方法。
背景技术
美国专利US10183939B2公开了一类结构新颖的外消旋的RAF抑制剂，其证明了对B-RAF V600E和C-RAF的结合亲和力，这些泛RAF抑制剂被认为是克服与临床批准的B-RAF选择性药物相关的耐药机制的有希望的候选药物。其中，实施例记载了该外消旋的RAF抑制剂采用色谱柱拆分，能得到两种单一构型的对映异构体，且两种单一构型的对映异构体的生物活性数据表现出显著的差异（比如化合物3A和3B的IC50值相差约10倍）。因此，开发单一构型的对映异构体的制备方法具有现实意义。
化合物(R)-6-羟基色满-3-羧酸及其衍生物是制备前述单一构型RAF抑制剂的关键手性中间体，目前的合成方法是用贵金属催化剂加手性配体进行催化氢化还原6-羟基-2H-色烯-3-羧酸来得到。该方法存在产物立体选择性不佳、收率不佳、原子经济性较低、催化剂和手性配体的价格较贵、氢化条件苛刻以及使用安全风险高等问题。
因此，本领域需要开发一种新的(R)-6-羟基色满-3-羧酸及其衍生物的制备方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种(R)-6-羟基色满-3-羧酸的制备方法，其具有底物转化率高、产品光学纯度高、反应条件温和、操作简便以及易于工业化生产的优点。
本发明的第一方面，提供了一种(R)-6-羟基色满-3-羧酸的生物催化制备方法，包括如下步骤：
步骤(a)在液态反应体系中，以式I化合物为底物，在辅酶存在下，在烯还原酶催化下，进行不对称还原反应，形成式II化合物；
Figure 279212DEST_PATH_IMAGE001
步骤(b)从所述步骤(a)的反应后的反应体系中分离出式II化合物；
其中，所述烯还原酶选自：1）烯还原酶ERED-16323，其Genbank序号为WP_014096091；或2）烯还原酶ERED-1663，其Genbank序号为NC_015687。
在一些实施方式中，所述反应体系中，式I化合物浓度为0.1-500g/L。
较佳地，所述反应体系中，式I化合物浓度为1g/L以上、10g/L以上、25g/L以上、50g/L以上、75g/L以上、100g/L以上、125g/L以上、150g/L以上、175g/L以上、200g/L以上、220g/L以上、240g/L以上、260g/L以上、280g/L以上、300g/L以上、320g/L以上、350g/L以上、400g/L以上，或450g/L以上。
较佳地，所述反应体系中，式I化合物浓度为1-500g/L；更佳地，所述反应体系中，式I化合物浓度为10-400g/L；最佳地，所述反应体系中，式I化合物浓度为50-350g/L。
在一些实施方式中，所述反应体系中，所述烯还原酶与所述式I化合物的质量比(w/w)为（0.01~20）：1。较佳地，所述烯还原酶与所述式I化合物的质量比(w/w)为（0.01~10）：1。更佳地，所述烯还原酶与所述式I化合物的质量比(w/w)为（0.1~10）：1。
在一些实施方式中，所述辅酶选自下组：还原性辅酶、氧化性辅酶或其组合。
在一些实施方式中，所述还原性辅酶选自下组：NADH、NADPH或其组合。
在一些实施方式中，所述氧化性辅酶选自下组：NAD+、NADP+或其组合。较佳地，所述氧化性辅酶选自NADP+。较佳地，所述氧化性辅酶选自NAD+。
在一些实施方式中，所述辅酶与所述式I化合物的质量比(w/w)为（0.0001~1）：1。较佳地，所述辅酶与所述式I化合物的质量比(w/w)为（0.0001~0.3）：1。更佳地，所述辅酶与所述式I化合物的质量比(w/w)为（0.01~0.3）：1。
在一些实施方式中，所述反应体系中，还存在用于辅酶再生的酶。较佳地，所述用于辅酶再生的酶选自：葡萄糖脱氢酶、醇脱氢酶、甲酸脱氢酶或其组合。更佳地，所述用于辅酶再生的酶选自：葡萄糖脱氢酶。
在一些实施方式中，所述反应体系中，所述用于辅酶再生的酶与所述式I化合物的质量比(w/w)为（0.01~10）：1。较佳地，所述用于辅酶再生的酶与所述式I化合物的质量比(w/w)为（0.01~6）：1。更佳地，所述用于辅酶再生的酶与所述式I化合物的质量比(w/w)为（0.1~2）：1。
在一些实施方式中，所述反应体系中，还存在共底物。较佳地，所述共底物选自：异丙醇、葡萄糖、甲酸铵或其组合。更佳地，所述共底物选自：葡萄糖。
在一些实施方式中，所述反应体系中，所述共底物与所述式I化合物的质量比(w/w)为（0.1-20）：1。较佳地，所述共底物与所述式I化合物的质量比(w/w)为（1-10）：1。较佳地，所述共底物与所述式I化合物的质量比(w/w)为（1-5）：1。
在一些实施方式中，所述反应体系中，所述用于辅酶再生的酶与所述共底物的组合选自：(1)葡萄糖脱氢酶与葡萄糖；(2)醇脱氢酶与异丙醇；或(3)甲酸脱氢酶与甲酸铵。较佳地，所述用于辅酶再生的酶与所述共底物的组合选自：葡萄糖脱氢酶与葡萄糖。
在一些实施方式中，所述步骤(a)中，反应温度为5℃~50℃。较佳地，反应温度为15℃~45℃。更佳地，反应温度为20℃~40℃。最佳地，反应温度为25℃~35℃。
在一些实施方式中，所述步骤(a)中，反应时间为0.1~120小时。较佳地，反应时间为0.2~72小时。更佳地，反应时间为0.5~48小时。最佳地，反应时间为1~24小时。
在一些实施方式中，所述步骤(a)中，反应体系的pH为5.5~9.5。较佳地，pH为6.0~8.5。更佳地，pH为6.5~8.0。最佳地，pH为6.5~7.5。
在一些实施方式中，所述反应体系中，烯还原酶的存在形式为：游离形式的酶、固定化酶或菌体形式的酶。
在一些实施方式中，所述反应体系为水性体系。
在一些实施方式中，所述反应体系的缓冲液为磷酸盐缓冲液（PBS）、三羟甲基甲胺盐缓冲液（TRIS-HCl）、三羟甲基甲胺硫酸盐缓冲液（TRIS-H2SO4）或三乙醇胺盐缓冲液（TOEA）或其组合。较佳地，所述反应体系的缓冲液为磷酸盐缓冲液（PBS）。
在一些实施方式中，所述反应体系含有选自下组的溶剂：水、醇或其组合。
在一些实施方式中，所述反应体系还可以含有助溶剂。较佳地，所述助溶剂选自二甲基亚砜。
在一些实施方式中，所述助溶剂与所述式I化合物的体积质量比为0.1-20 mL/g。较佳地，所述助溶剂与所述式I化合物的体积质量比为1-10 mL/g。更佳地，所述助溶剂与所述式I化合物的体积质量比为2-5 mL/g。
在一些实施方式中，所述步骤(b)中，所述的分离包括：加热使蛋白失活，离心或过滤，用萃取溶剂萃取滤液，浓缩有机层。
在一些实施方式中，所述步骤(b)中，所述萃取溶剂为甲醇。
在一些实施方式中，所述步骤(b)中，所述反应后的反应体系中，式II化合物的e.e.值≥99％。
在一些实施方式中，所述步骤(b)中，所述反应后的反应体系中，≥30％的式I化合物被转化为式II化合物。较佳地，≥32％的式I化合物被转化为式II化合物。更佳地，≥34％的式I化合物被转化为式II化合物。
第二方面，本发明提供了一种反应体系，所述反应体系包括：
(1)水性溶剂；
(2)底物，所述底物为式I化合物；
Figure 210259DEST_PATH_IMAGE002
(3)辅酶；
(4)烯还原酶；所述烯还原酶选自：1）烯还原酶ERED-16323，其Genbank序号为WP_014096091；或2）ERED-1663，其Genbank序号为NC_015687；
(5)共底物。
在一些实施方式中，所述反应体系还包括：(6)用于辅酶再生的酶。
在一些实施方式中，所述反应体系中，式I化合物浓度为0.1-500g/L。
较佳地，所述反应体系中，式I化合物浓度为1g/L以上、10g/L以上、25g/L以上、50g/L以上、75g/L以上、100g/L以上、125g/L以上、150g/L以上、175g/L以上、200g/L以上、220g/L以上、240g/L以上、260g/L以上、280g/L以上、300g/L以上、320g/L以上、350g/L以上、400g/L以上，或450g/L以上。
较佳地，所述反应体系中，式I化合物浓度为1-500g/L；更佳地，所述反应体系中，式I化合物浓度为10-400g/L；最佳地，所述反应体系中，式I化合物浓度为50-350g/L。
在一些实施方式中，所述反应体系中，所述烯还原酶与所述式I化合物的质量比(w/w)为（0.01~20）：1。较佳地，所述烯还原酶与所述式I化合物的质量比(w/w)为（0.01~10）：1。更佳地，所述烯还原酶与所述式I化合物的质量比(w/w)为（0.1~10）：1。
在一些实施方式中，反应后的反应体系中，式II化合物的e.e.值≥99％。
在一些实施方式中，反应后的反应体系中，≥30％的式I化合物被转化为式II化合物。较佳地，≥32％的式I化合物被转化为式II化合物。更佳地，≥34％的式I化合物被转化为式II化合物。
本发明提供的上述反应体系，能够进行酶促反应，以高立体选择性地制备得到(R)-6-羟基色满-3-羧酸，光学纯度为e.e.值≥99％。
第三方面，本发明还提供了一种(R)-6-羟基色满-3-羧酸的生物催化制备方法，其包括：使用如本发明第二方面所述的反应体系，进行酶促反应，从而制得式II化合物：
Figure 151539DEST_PATH_IMAGE003
。
在一些实施方式中，所述反应体系中，式I化合物浓度为0.1-500g/L。
较佳地，所述反应体系中，式I化合物浓度为1g/L以上、10g/L以上、25g/L以上、50g/L以上、75g/L以上、100g/L以上、125g/L以上、150g/L以上、175g/L以上、200g/L以上、220g/L以上、240g/L以上、260g/L以上、280g/L以上、300g/L以上、320g/L以上、350g/L以上、400g/L以上，或450g/L以上。
较佳地，所述反应体系中，式I化合物浓度为1-500g/L；更佳地，所述反应体系中，式I化合物浓度为10-400g/L；最佳地，所述反应体系中，式I化合物浓度为50-350g/L。
在一些实施方式中，所述方法中，所述反应体系中烯还原酶与式I化合物的质量比(w/w)为（0.01~20）：1。较佳地，所述烯还原酶与所述式I化合物的质量比(w/w)为（0.01~10）：1。更佳地，所述烯还原酶与所述式I化合物的质量比(w/w)为（0.1~10）：1。
在一些实施方式中，所述方法中，反应后的反应体系中，式II化合物的e.e.值≥99％。
在一些实施方式中，所述方法中，反应后的反应体系中，≥30％的式I化合物被转化为式II化合物。较佳地，≥32％的式I化合物被转化为式II化合物。更佳地，≥34％的式I化合物被转化为式II化合物。
技术术语
烯还原酶
在本发明中，“烯还原酶”是能够立体选择性催化碳碳双键还原得到光学活性的饱和化合物的酶。一种典型的烯还原酶为烯还原酶ERED-16323，其Genbank序号为WP_014096091；或烯还原酶ERED-1663，其Genbank序号为NC_015687。
反应体系中可以用上述烯还原酶的湿菌体、粗酶液、粗酶粉或者纯酶等，市售可得。
辅酶
本发明中，“辅酶”是指能够实现氧化还原反应中电子传递的辅酶。
典型地，本发明的辅酶为还原性辅酶或氧化性辅酶，还原性辅酶为NADH或NADPH，氧化性辅酶为NAD+或NADP+。由于还原性辅酶的价格成本较为昂贵，优选选择氧化性辅酶NAD+或NADP+。
当选择氧化性辅酶时，需要选择实现辅酶再生的方法，主要包括三种：(1)葡萄糖脱氢酶与共底物葡萄糖，(2)醇脱氢酶与共底物异丙醇，(3)甲酸脱氢酶与共底物甲酸铵。
在一个优选实施方式中，辅酶为NADP+，辅酶再生体系为葡萄糖脱氢酶，本发明优选葡萄糖脱氢酶与共底物葡萄糖。NADP+的用量与所述的如式I所示的化合物用量比率为0.01％～30.0％(w/ w)。缓冲体系为磷酸盐缓冲液（PBS）、三羟甲基甲胺盐缓冲液（TRIS-HCl）、三羟甲基甲胺硫酸盐缓冲液（TRIS-H2SO4）或三乙醇胺盐缓冲液（TOEA）或其组合，浓度为0 .1mol/L。缓冲液的pH为5.5~9.5。
助溶剂
本发明中，可以在反应体系中添加或不添加助溶剂。
如本文所用，术语“助溶剂”是指难溶性物质与加入的第三种物质在溶剂中形成可溶性分子间的络合物、缔合物或复盐等，以增加难溶性物质在溶剂中的溶解度。这种第三种物质称为助溶剂。
本发明中，底物化合物的水溶性不佳，当底物浓度增大时，严重影响反应转化率。因此，可以通过加入助溶剂提高底物溶解性，以改善反应转化情况。可选的助溶剂为二甲基亚砜、甲醇、乙醇、异丙醇、乙腈、甲苯、丙酮或其组合，优选为二甲基亚砜。
立体异构体
本发明中，立体异构体是指由分子中原子在空间上排列方式不同所产生的异构体，它可分为顺反异构体和对映异构体两种，也可分为对映异构体和非对映异构体两大类。在化学反应或酶促反应中，一种立体异构体相对于另一立体异构体优先形成，称之为立体选择性。立体选择性可以是部分的，这时一种立体异构体的形成比另一种有利，或者立体选择性可以是完全的，这时只形成一种立体异构体。当立体异构体是对映体时，立体选择性是指对映体选择性，即一种对映体在两种对映体总和中的分数（通常报道为百分比）。其（通常为百分比）在本领域中通常可选地报道为根据如下公式由其计算的对映体过量(e.e.) ：[主要对映体-次要对映体]／[主要对映体＋次要对映体]。在立体异构体是非对映异构体时，立体选择性是指非对映体选择性，即一种非对映体在两种非对映体混合物中的分数（通常报道为百分比），通常可选地报道为非对映体过量（d.e.)。对映体过量和非对映体过量是立体异构体过量的类型。本发明中，基本上立体异构体纯，酶能够将底物转化为具有至少约95％、96％、97％、98％或99％立体异构体过量的相应产物；优选为，至少约98％立体异构体过量；更优选为，至少约99％立体异构体过量。
生物催化制备方法
本发明提供了一种来源于市售可得的烯还原酶（ERED-16323或ERED-1663）催化还原式I化合物制备式II化合物的方法。反应式如下所示：
Figure 91813DEST_PATH_IMAGE004
所述制备方法的一种具体实施过程如下：将底物充分溶解在助溶剂，如二甲基亚砜，然后加入到磷酸缓冲液中，搅拌均匀后，加入烯还原酶的湿菌体、粗酶液、粗酶粉或纯酶，加入辅酶NADP+、葡萄糖脱氢酶和共底物葡萄糖，维持在5℃~50℃，反应时间为0.1~120小时。反应终止后，向反应液中加入甲醇，离心和/或硅藻土过滤，取上清液，超流界色谱检测分离手性化合物，收集液浓缩后得到产物。
本申请的发明人经过广泛而深入的研究，通过大量筛选试验，首次意外地开发出一种(R)-6-羟基色满-3-羧酸的生物制备方法，该方法中的烯还原酶对产物具有高的立体选择性和对底物具有特异性。
本发明的主要优点包括：
1) 利用本申请所筛选的烯还原酶及制备方法来制备式II化合物，相比现有技术水平，收率高，成本降低。
2) 本申请所筛选的烯还原酶对产物式II化合物具有很高的立体选择性，产物光学纯度高，e.e.值达99%以上。
3) 本申请所筛选的烯还原酶对底物式I化合物具有特异性。
4) 利用本申请所筛选的烯还原酶可以通过一步反应由式I化合物制备得到式II化合物，反应步骤短，反应条件温和，后处理仅需离心过滤，操作简便，易于工业化生产。
附图说明
图1为式II化合物的消旋体手性图谱，图中S构型保留时间为5.826 min和R构型保留时间为6.486 min；图中横坐标为时间，纵坐标为吸光度。
图2为本申请的烯还原酶催化所得式II化合物的手性图谱，图中显示R构型e.e.值达99%以上；图中横坐标为时间，纵坐标为吸光度。
具体实施方式
下面将对本发明的技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor LaboratoryPress ,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。本发明中所涉及的实验材料如无特殊说明均为商品化试剂，可从市售渠道获得。
实施例1：烯还原酶的筛选
反应式：
Figure 818460DEST_PATH_IMAGE005
反应操作：向10 mL反应瓶中加入5 mL体积浓度为0.2 M，pH 7.0的磷酸盐缓冲液,1 mg的NADP+和50 mg烯还原酶（市售渠道获得），5 mg 的葡萄糖脱氢酶和20 mg的葡萄糖，调节温度至27℃。将溶于25 μL二甲基亚砜的5 mg化合物I加入反应瓶中，剧烈搅拌，反应18小时。反应结束后，取100 μL反应液，加900 μL甲醇，离心过滤后，SFC检测（超临界流体色谱）分离。在波长为210 nm时，检测到化合物II 有最大紫外吸收峰，最大吸收波长为293.7nm，出峰时间为6.501 min，参考图2。反应结果如表1所示。
表1
Figure 936720DEST_PATH_IMAGE006
由试验A1~A5的反应结果可知，不同的烯还原酶对底物式I化合物的反应效果有显著的差异。
实施例2：烯还原酶对底物的特异性
反应式：
Figure 381608DEST_PATH_IMAGE007
反应操作：使用不同的底物，使用烯还原酶ERED-16323或ERED-1663，按照与实施例1相同的反应操作进行。反应结果如表2所示。
表2
Figure 843682DEST_PATH_IMAGE008
由试验B1~B4与对比例A1~A2相比较可知，烯还原酶ERED-16323或ERED-1663对不同R4取代的底物的反应效果有显著差异。
实施例3：(R)-6-羟基色满-3-羧酸（式II化合物）的生物催化制备工艺的放大
向2 L反应瓶中加入1 L体积浓度为0.2 M，pH 7.0的磷酸盐缓冲液, 1 g的NADP+和10 g烯还原酶（ERED-16323，Genbank序号WP_014096091），1 g 的葡萄糖脱氢酶和4 g的葡萄糖，调节温度至27℃。将溶于5 mL二甲基亚砜的1 g化合物I加入反应瓶中，剧烈搅拌，反应18小时。反应结束后，经后处理，SFC检测，转化率35.5%，e. e. > 99%。
综上所述，上述各实施例仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限定本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，皆应包含在本发明的保护范围内。

Claims (10)

1.一种(R)-6-羟基色满-3-羧酸的生物催化制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤(a)在液态反应体系中，以式I化合物为底物，在辅酶存在下，在烯还原酶催化下，进行不对称还原反应，形成式II化合物；
Figure 108018DEST_PATH_IMAGE001
步骤(b)从所述步骤(a)的反应后的反应体系中分离出式II化合物；
其中，所述烯还原酶选自：1）烯还原酶ERED-16323，其Genbank序号为WP_014096091；或2）ERED-1663，其Genbank序号为NC_015687。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，式I化合物浓度为0.1-500g/L。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述烯还原酶与所述式I化合物的质量比为（0.01~20）：1。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述辅酶选自下组：还原性辅酶、氧化性辅酶或其组合；所述还原性辅酶选自下组：NADH、NADPH或其组合；所述氧化性辅酶选自下组：NAD+、NADP+或其组合。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述辅酶与所述式I化合物的质量比为（0.0001~1）：1。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述反应体系中，还存在用于辅酶再生的酶；所述用于辅酶再生的酶选自：葡萄糖脱氢酶、醇脱氢酶、甲酸脱氢酶或其组合。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述反应体系中，还存在共底物；所述共底物选自：异丙醇、葡萄糖、甲酸铵或其组合。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(a)中，反应温度为5℃~50℃，反应时间为0.1~120小时，反应体系的pH为5.5~9.5。
9.一种反应体系，其特征在于，所述反应体系包括：
(1)水性溶剂；
(2)底物，所述底物为式I化合物；
Figure 98977DEST_PATH_IMAGE002
(3)辅酶；
(4)烯还原酶；所述烯还原酶选自：1）烯还原酶ERED-16323，其Genbank序号为WP_014096091；或2）ERED-1663，其Genbank序号为NC_015687；
(5)共底物。
10.一种(R)-6-羟基色满-3-羧酸的生物催化制备方法，其特征在于，所述制备方法包括：使用如权利要求9所述的反应体系进行酶促反应，从而制得式II化合物：
Figure 93478DEST_PATH_IMAGE003
。
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