CN112708641A - 托莫西汀的化学-酶合成方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种托莫西汀的化学‑酶合成方法，该制备方法以3‑氯苯丙酮为原料，在羰基还原酶，辅酶的催化下，进行不对称还原反应制得(S)‑3‑氯苯丙醇，手性纯度ee值99.9％，随后经光延反应，甲胺化反应，再经盐酸成盐制得托莫西汀。该制备方法能够显著的降低生产成本，绿色环保，具有潜在的工业化应用价值。

Description

托莫西汀的化学-酶合成方法
技术领域
本发明属于医药技术领域，尤其涉及一种托莫西汀的化学-酶合成方法。
背景技术
盐酸托莫西汀的商品名为择思达(Strattera)，中文化学名为(R)-N-甲基 -3-(2-甲基苯氧基)***盐酸盐，英文名称为 (R)-N-Methyl-3-(2-methylphenoxy)benzenepropanamine hydrochloride，分子式为 C17H22ClNO，相对分子质量291.82，CAS登记号82248-59-7，剂型为胶囊剂 (10mg；18mg；25mg；40mg)，适应证为注意缺陷多动障碍。
Figure BDA0002246790490000011
盐酸托莫西汀由美国礼来制药公司(Eli Lily)研制，于2003年美国获批上市。托莫西汀是FDA批准的首个非中枢兴奋性ADHD治疗药物，是一种高度选择性去甲肾上腺素再摄取抑制剂(SNRI)。盐酸托莫西汀代表性的合成路线如下：
路线一
王玲等以3-氯苯丙酮为起始原料，经NaBH4还原、Mitsunobu反应、甲胺化，扁桃酸拆分，随后经盐酸成盐得盐酸托莫西汀。
Figure BDA0002246790490000012
路线二
Kumar等以3-苯基-3-酮-丙酸乙酯为起始原料，经Baker’s酵母手性还原羰基、与甲胺反应、LiAlH4还原、Boc保护、与邻甲苯酚经Mitsunobu反应、盐酸酸化后得托莫西汀盐酸盐产物。
但是该步生物催化立体选择性不高，最终产品ee值仅为70％，且在反应路线中有Boc保护和脱保护的过程，反应步骤较长。
Figure BDA0002246790490000021
路线三
Vogl等以3-氯苯丙酮为起始原料，经羰基还原酶Candida tenuis xylosereductase选择性还原羰基、Mitsunobu反应、甲胺化反应得托莫西汀。该条路线中使用了羰基还原酶CtXR催化还原制得(S)-3-氯苯丙醇，但其底物浓度仅2mM，手性纯度98％，产物时空产率低，不适合工业化生产。
Figure BDA0002246790490000022
现有制备托莫西汀的工业化制备方法是主要是采用传统拆分方法，该法受限于理论收率仅为50％，而现有的生物制备方法中报道的羰基还原酶催化活性低，底物浓度低，产物手性纯度仅98％，难以满足工业化生产的要求。
因此本领域迫切需要一种工业化高效制备托莫西汀的化学-酶的方法。
发明内容
针对现有制备方法存在的上述问题，本发明目的是提供了一种制备托莫西汀的化学-酶的方法，该法表现了显著的工业化应用前景。
本发明的第一方面，提供了一种(S)-3-氯苯丙醇的制备方法，包括步骤：
(a)在液态反应体系中，以3-氯苯丙酮(式2化合物)为底物，在辅酶存在下，在羰基还原酶催下，进行不对称还原反应，从而形成(S)-3-氯苯丙醇[式 (S)-3化合物]；
Figure BDA0002246790490000031
和
(b)任选地从所述上一步骤的反应后的反应体系中分离出(S)-3；
其中，所述羰基还原酶选自下组：
(i)其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；
(ii)对SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列在保持酶活性范围内，进行一个或多个氨基酸的替换、缺失、改变、***或增加，所得到的氨基酸序列。
在另一优选例中，所述反应体系中，所述式2化合物的浓度为50～1000g/L。
在另一优选例中，所述反应体系中，所述式2化合物的浓度为60～700g/L。
在另一优选例中，所述反应体系中，所述式2化合物的浓度为80～600g/L。
在另一优选例中，所述反应体系中，所述式2化合物的浓度为20～500g/L。
在另一优选例中，所述反应体系中，所述式2化合物的浓度为50～200g/L。
在另一优选例中，所述反应体系中，所述式2化合物的浓度为50～150g/L。
在另一优选例中，所述反应体系中，所述式2化合物的浓度为100～150g/L。
在另一优选例中，所述的辅酶选自下组：还原性辅酶、氧化性辅酶，或其组合。
在另一优选例中，所述还原性辅酶选自下组：NADH、NADPH、或其组合。
在另一优选例中，所述氧化性辅酶选自下组：NAD、NADP、或其组合。
在另一优选例中，所述NAD用量与底物用量比率为0.01％～1.0％(w/w)、较佳地为0.01％～0.5％(w/w)。
在另一优选例中，所述NADP的用量与底物用量比率为0.01％～1.0％(w/ w)、较佳地为0.01％～0.5％(w/w)。
在另一优选例中，所述的反应体系中，还存在用于辅酶再生的酶。
在另一优选例中，所述的用于辅酶再生的酶选自下组：醇脱氢酶(如异丙醇脱氢酶)，甲酸脱氢酶、葡萄糖脱氢酶或其组合。
在另一优选例中，所述的反应体系中，还存在用于辅酶再生的酶，所述用于辅酶再生的酶为异丙醇脱氢酶、甲酸脱氢酶、或葡萄糖脱氢酶。
在另一优选例中，步骤(a)中，温度为10℃-50℃，较佳地为20℃-40℃，更佳地为25℃-35℃。
在另一优选例中，步骤(a)中，时间为0.1-240小时，较佳地为0.5-120小时，更佳地为1-72小时，又更佳地为20-24小时、又更佳地为3-10小时。
在另一优选例中，步骤(a)中，pH为6-9，较佳地为6.5-8.5，更佳地为7.0-7.5。
在另一优选例中，所述的反应体系中，羰基还原酶为游离形式的酶、固定化酶、或菌体形式的酶。
在另一优选例中，所述的反应体系为磷酸缓冲盐体系。
在另一优选例中，所述的反应体系还含有助溶剂。
在另一优选例中，所述的助溶剂选自下组：二甲基亚砜，甲醇，乙醇，异丙醇，乙腈，甲苯、丙酮、或其组合。
在另一优选例中，所述助溶剂的浓度为5～30％。
在另一优选例中，在步骤(b)中，所述的分离包括：加入异丙醇，离心菌体，部分浓缩，甲叔醚萃取，浓缩有机层。
在另一优选例中，在步骤(b)中，所述的分离包括：加热至50-80℃，使蛋白失活，加入萃取溶剂，如甲叔醚，二氯甲烷，甲苯，乙酸乙酯等，然后离心取有机层，经干燥，过滤，浓缩有机层得产品。
在另一优选例中，在步骤(b)中，所述反应后的反应体系中，式(S)-3化合物的ee值≥90％，较佳地≥95％，更佳地≥99％。
在另一优选例中，在步骤(b)中，所述反应后的反应体系中，≥80％(较佳地≥85％，更佳地≥90％)式2化合物被转化为式(S)-3化合物。
在另一优选例中，在步骤(b)中，所述反应后的反应体系中，式(S)-3化合物的浓度50～1000g/L。
在另一优选例中，所述的羰基还原酶的编码基因序列选自下组：
(a)SEQ ID NO.1所示的序列(NCBI的登录号为CP000677.1)；
(b)与(a)限定的序列互补的多核苷酸；或
(c)与(a)限定的序列具有至少70％(优选至少75％、80％、85％、90％，更优选至少95％、96％、97％、98％、99％)以上的序列一致性的任一多核苷酸或互补序列。
在另一优选例中，所述羰基还原酶基因构建在表达载体上。
在另一优选例中，所述的反应体系中，还存在共底物。
在另一优选例中，所述的共底物选自下组：异丙醇、葡萄糖、甲酸铵、或其组合,优选为葡萄糖。
在另一优选例中，所述的反应体系中，还存在共底物，所述共底物为异丙醇、甲酸铵、或葡萄糖。
在另一优选例中，所述的反应体系中，共底物的浓度为5-30％。
在另一优选例中，所述的反应体系中，共底物的用量为的化合物2用量的2-5 当量。
本发明的第二方面，提供了一种托莫西汀的制备方法，通过本发明第一方面所述的方法所制得式(S)-3化合物进行如下的反应步骤制得：
Figure BDA0002246790490000051
在另一优选例中，所述方法包括如下步骤：
(1)使用通过本发明第一方面所述的方法所制得的(S)-3-氯苯丙醇，与邻甲基苯酚发生光延反应制得化合物4；
(2)步骤(1)中获得的化合物4经碘化钠活化，甲胺取代草酸成盐制得托莫西汀的草酸盐；
(3)步骤(2)中获得的草酸盐经饱和碳酸氢钠溶液游离后，与氯化氢成盐制得盐酸盐托莫西汀。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1显示了3-氯苯丙醇消旋体的手性图谱。
图2显示了(S)-3-氯苯丙醇的手性图谱。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入的研究，本发明将现有托莫西汀制备方法中的关键的羰基还原反应步骤改进为通过羰基还原酶催化还原3-氯苯丙酮(式2化合物)制得(S)-3-氯苯丙醇(式(S)-3化合物)，即在羰基还原酶和辅酶的存在下，将式2化合物立体选择性的还原为式(S)-3化合物(即使在高浓度的底物，如 50～1000g/L条件下，也能够高效地制备式(S)-3化合物。然后以式(S)-3化合物为底物，进一步进行后续反应，以用于托莫西汀等药品的制备。在此基础上完成了本发明。
术语
羰基还原酶
本发明中，“羰基还原酶”是能够立体选择性催化潜手性酮不对称还原得到手性醇的酶。
在本发明中，所述的羰基还原酶可以是野生型的或突变型的。此外，可以分离的，也可以是重组的。
一种典型的羰基还原酶的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示，其编码基因如 SEQ IDNo.1所示。
由于密码子的简并性，编码SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的碱基序列不仅仅局限于SEQ ID NO.1。本领域技术人员可以通过适当引入替换、缺失、改变、***或增加来获得该碱基序列的同系物，本发明涵盖这些同系物，只要其表达的重组酶保持对底物化合物2的催化还原活性即可。本发明中多聚核苷酸的同系物可以通过对碱基序列SEQ ID NO.1的一个或多个碱基在保持酶活性范围内进行替换、缺失或增加来制得。
本发明的羰基还原酶还包括对SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列在保持酶活性范围内，进行一个或多个氨基酸的替换、缺失、改变、***或增加，所得到的氨基酸序列。
根据本领域的一般常识，反应体系中可以使用上述羰基还原酶构建的重组酶静息细胞、湿菌体、粗酶液、纯酶或者粗酶粉等。为获得较高的转化效率，优选使用粗酶液。羰基还原酶用量与底物用量比率优选为1％～6％(w/w)，或者静息细胞质量与底物质量比率为10-100％。
辅酶
本发明中，“辅酶”是指能够实现氧化还原反应中电子传递的辅酶。
典型地，本发明的辅酶为还原性辅酶NADH、NADPH或氧化性辅酶 NAD+、NADP+。由于还原性辅酶的价格成本昂贵，优选选择氧化性辅酶 NAD+、NADP+。
当选择氧化性辅酶时，需要选择实现辅酶再生的方法，主要包括三种(1) 葡萄糖脱氢酶与共底物葡萄糖；(2)醇脱氢酶与共底物异丙醇；(3)甲酸脱氢酶与共底物甲酸铵。
在一个优选实施例中，辅酶为NADP+，辅酶再生体系为葡萄糖脱氢酶，本发明优选葡萄糖脱氢酶与共底物葡萄糖。
在本发明的另一个优选实施例中，氧化性辅酶NAD+的浓度为 0.05-0.1g/L，缓冲体系为0.1mol/L磷酸缓冲盐。
典型地，缓冲液的pH为7.0-7.3。
典型地，本发明的辅酶可以使用葡萄糖脱氢酶与葡萄糖实现辅酶再生。
在另一个优选实施例中，本发明羰基还原酶也可以通过添加异丙醇，通过自身催化异丙醇为丙酮，实现辅酶再生。
助溶剂
本发明中，可以在反应体系中添加或不添加助溶剂。
如本文所用，术语“助溶剂”是指难溶性物质与加入的第三种物质在溶剂中形成可溶性分子间的络合物、缔合物或复盐等，以增加难溶性物质在溶剂中的溶解度。这种第三种物质称为助溶剂。
本发明中，底物化合物2难溶于水，当底物浓度增大时，严重影响反应转化率。因此，需通过加入助溶剂提高底物溶解性，以改善反应转化情况。可选的助溶剂为二甲基亚砜，甲醇，乙醇，异丙醇，乙腈，甲苯、丙酮，浓度优选为5-30％(v/v)，优选为二甲基亚砜，甲醇，乙醇，异丙醇。
生物制备方法
本发明提供了一种化合物(S)-3的制备方法，包括步骤：
(a)在液态反应体系中，以式2化合物为底物，在辅酶存在下，在羰基酶催化下，进行不对称还原反应，从而形成式(S)-3-氯苯丙醇；
Figure BDA0002246790490000081
和
(b)任选地从所述上一步骤的反应后的反应体系中分离出(S)-3-氯苯丙醇。
在本发明中，上述的反应可以偶联或不偶联辅酶再生体系。
优选地，上述反应是在同一体系中增加(偶联)辅酶再生方法(体系)，从而进一步提高生产效率，降低生产成本并提高对底物的耐受性。
此外，在本发明第一方面中所述的各类优选特征或其组合，同样适用于本发明所述的反应体系。
反应体系的应用
本发明还提供了本发明第二方面所述反应体系的应用，即用于制备式(S)-3化合物，它包括步骤：使用所述的反应体系中，在适合酶催化的条件下，进行酶促反应，从而制得式(S)-3化合物：
Figure BDA0002246790490000082
本发明的主要优点在于：
(1)利用本发明羰基还原酶生物催化还原化合物2制备(S)-3，仅需萃取操作，操作简单，成本低廉，生产1公斤产物的所需酶的成本在30元。
(2)该制备方法绿色环保，更适合工业化生产具有高化学纯度和高光学纯度的托莫西汀关键中间体(S)-3。
(3)本发明底物浓度在50-150g/L，转化率>98％，ee值>99.5％，该法具有环保，经济，安全，绿色的特点，具备潜在的工业化应用前景。
(4)本发明羰基还原酶具有高立体选择性，ee值>99.5％，该酶对有机溶剂、底物具有良好耐受性，显著提高了底物浓度，当反应体系放大至百克级时，底物浓度最高可达100g/L是现有生物催化方法中底物浓度最高，通过与现有文献对比，是催化3-氯苯丙酮制备(S)-3效率最高的方法。
下面的具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如(Sambrook和Russell等人，分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning-A LaboratoryManual)(第三版)(2001CSHL出版社)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。以下实施例中所用的实验材料和试剂如无特别说明均可从市售渠道获得。
材料
化合物2消旋体外购自上海麦克林化学试剂有限公司，基因全合成由上海百利格有限公司完成。羰基还原酶1500与1306购自湖州颐辉生物有限工司，羰基还原酶K142、K157、K168、K195和K201购自上海富广生物有限公司。
羰基还原酶通过商业化的全基因合成得到编码基因，然后将编码基因构建入表达载体，导入宿主菌，诱导表达得到。
方法
手性HPLC条件：CHIRALPAK OD-3柱(4.6×250mm,5μm)；
流动相：正己烷/异丙醇＝98/2；
流速：1.0mL/min；
紫外检测波长：224nm；
柱温：30℃。
酶的制备方法
通过本领域常规技术，将上述羰基还原酶的基因构建在同一质粒pET28a (+)载体上，然后导入表达宿主大肠杆菌，通过发酵，诱导表达，获得含有目的酶的菌体。可直接使用离心获得菌体，也可将其破壁获得酶液，酶粉用于后续的生物转化反应。
实施例1.(S)-3-氯苯丙醇[(S)-3]的制备
Figure BDA0002246790490000101
将磷酸缓冲液(28mL，100mM/L，pH＝8.0)、二甲基亚砜(12mL)、葡萄糖(4.2g)、酮2(4.0g,0.012mol)、NAD+(0.02g)和本发明羰基还原酶湿菌体(8.0g)，葡萄糖脱氢酶(4.0g)依次加到250mL反应瓶中，于45℃油浴、200rpm 机械搅拌下反应24h。取样，HPLC监控反应进程，原料反应完全。反应液用二氯甲烷萃取三次(200mL×3)，合并有机层，经无水硫酸钠干燥后，过滤，滤液浓缩得淡黄色固体(S)-3，3.6g，粗品收率87.8％，HPLC纯度84.56％，ee值：>99.9％。
1HNMR(600MHz,CDCl3):δ＝7.37(d,J＝4.2Hz,4H),7.33-7.29(m,1H), 4.96-4.94(m,1H),3.77-3.73(m,1H),3.59-3.55(m,1H),2.27-2.22(m,1H), 2.12-2.07(m,1H),1.99(s,1H)；13CNMR(150MHz,CDCl3):δ＝143.69,128.67, 127.94,125.77,71.34,41.72,41.43。
图1显示了3-氯苯丙醇消旋体的手性图谱，图2显示(S)-3-氯苯丙醇的手性图谱。图1和图2比较可以看出本发明酶转化产物具有高手性纯度，ee值>99.9％。
表1酶的筛选结果
Figure BDA0002246790490000102
Figure BDA0002246790490000111
筛选条件：10mL反应体系：
(a)5g/L 2和2g/L GDH，20g/L菌体，0.5g/L NAD+，1倍当量的葡萄糖和磷酸缓冲液(100mM,pH 7.0)于 25℃、220rpm的摇床中反应2h；
(b)5g/L 2和2g/L GDH，20g/L菌体，0.5g/L NADP+，1倍当量的葡萄糖和磷酸缓冲液(100mM,pH 7.0)于 25℃、220rpm的摇床中反应2h；
(c)5g/L 2，20g/L菌体，0.5g/L NADP+，20％异丙醇和磷酸缓冲液(100mM,pH 7.0)于25℃、220rpm的摇床中反应2h；
由表1知，不同的酶对本发明中酶催化底物化合物2的还原情况存在显著差异。例如酶编号1500羰基还原酶催化还原化合物2制备(S)-3时，转化率虽然已经达到98％，但是立体选择性低，仅为ee值1.28％。相较于羰基还原酶1500、1306 K142、K157、K168、K195和K201，本发明的羰基还原酶能够同时获得显著更优异的转化率(98.91％)和立体选择性(ee值>99.9％)。
对比例1：
Figure BDA0002246790490000112
将磷酸缓冲液(10mL，100mM/L，pH＝8.0)、二甲基亚砜(2mL)、葡萄糖(0.2g)、酮2(0.5g,0.012mol)、NAD+(0.01g)和本发明羰基还原酶湿菌体(1g)，葡萄糖脱氢酶(0.5g)依次加到50mL反应瓶中，于45℃油浴、200rpm 机械搅拌下反应24h。取样，HPLC监控反应进程，原料反应完全。反应液用二氯甲烷萃取三次(200mL×3)，合并有机层，经无水硫酸钠干燥后，过滤，滤液浓缩得淡黄色固体(S)-5 0.3g，粗品收率60％，手性纯度，ee值：90.2％。
化合物4与化合物2结构上非常接近，区别仅在于化合物4的苯环上多了一个甲基取代基。但是化合物4反应后的产物ee值只有90.2％。说明本发明羰基还原酶可以高选择性的转化特定底物化合物2。
实施例2.(R)-1-氯-3-苯基-3-(2-甲基苯氧基)丙醇(4)的合成
Figure BDA0002246790490000121
在100mL三颈瓶中，将(S)-3(1.7g，0.010mol)溶于20mL无水四氢呋喃中，依次加入三苯基膦(3.4g，0.013mol)、邻甲酚(1.4g，0.013mol)，N2保护，在0℃下缓慢加入偶氮二甲酸二乙酯(DEAD)(2.3g，0.013mol)。滴毕，室温下搅拌24h。加入50mL石油醚搅拌1h，有大量白色固体产生，过滤，将过滤所得溶液用水洗涤(50mL×2)，经无水硫酸钠干燥后，过滤，滤液浓缩，经柱层析(石油醚)得无色油状液体4，7 2.4g，收率92.31％，HPLC纯度：88.63％。
1H NMR(600MHz,CDCl3):δ＝7.44-7.39(m,4H),7.33(t,J＝7.2Hz,1H),7.19(d, J＝7.8Hz,1H),7.04(t,J＝7.8Hz,1H),6.86(t,J＝7.5Hz,1H),6.71(d,J＝7.8Hz,1H),5.48-5.45(m,1H),3.89-3.85(m,1H),3.71-3.67(m,1H),2.59-2.53(m,1H),2.40(s,3H),2.34-2.28(m,1H)；13C NMR(150MHz,CDCl3):δ＝155.20,140.47,130.11,128.18, 127.24,126.39,126.07,125.23,119.94,112.27,75.84,40.96,40.79,15.96；HR-MS理论值(calcdfor)C16H17ClNaO[M+Na]+m/z 283.0860,实验值(found)m/z 283.0854。
实施例3.(R)-N-甲基-3-(2-甲基苯氧基)-3-苯基-1-丙胺(1·草酸盐)草酸盐的合成
Figure BDA0002246790490000122
在100mL三颈瓶中将4(1.0g，0.004mol)溶于10mL丙酮中，加入碘化钠(0.6g，0.004mol)，回流反应12h。冷却至室温，过滤，滤液减压浓缩，并将其溶于5mL四氢呋喃。
在100mL三颈瓶中加入10mL 30％甲胺水溶液，滴加上步所得产物的四氢呋喃溶液，滴毕，40℃反应8h。冷却至室温后，倒入30mL水中，用二氯甲烷萃取 (30mL×2)。二氯甲烷层用水洗涤(30mL×2)，经无水硫酸钠干燥后，过滤，滤液浓缩。
将上步浓缩产物溶于10mL丙酮中，在搅拌下加入草酸(0.6g，0.007mol)，不断析出白色固体。搅拌6h后过滤，滤饼用丙酮洗涤，干燥得白色固体1·草酸盐0.9g，收率：67.9％，HPLC纯度：98.86％，ee值：99.00％。
1HNMR(600MHz,DMSO-d6):δ＝8.85(s,2H),7.39-7.34(m,4H),7.29-7.26(m, 1H),7.12-7.11(m,1H),6.98-6.96(m,1H),6.77-6.74(m,1H),6.70(d,J＝7.8Hz,1H), 5.49-5.47(m,1H),3.09-2.99(m,2H),2.57(s,3H),2.29-2.22(m,4H),2.16-2.11(m, 1H)；13CNMR(150MHz,DMSO-d6):δ＝165.04,155.52,141.32,130.99,129.16, 128.30,127.06,126.76,126.30,120.83,113.38,76.18,45.78,34.76,33.01,16.70； HR-MS理论值(calcd for)C17H22NO[M+H]+m/z 256.1696,实验值(found) m/z 256.1700。
实施例4.(R)-N-甲基-3-(2-甲基苯氧基)-3-苯基-1-丙胺(6)盐酸盐的合成
将1·草酸盐(0.5g，0.0014mol)溶于5mL二氯甲烷和5mL饱和碳酸氢钠溶液的混合溶剂中，搅拌30min后，加入二氯甲烷(2×10mL)萃取、水洗(1×10mL)，二氯甲烷层经无水硫酸钠干燥后，过滤，滤液浓缩。
将上步所得油状物溶于5mL乙酸乙酯中，加入1mL 2mol/L氯化氢的乙酸乙酯溶液，室温下搅拌5h，过滤得白色固体，用乙酸乙酯洗涤后烘干，得1.HCl 0.4g，收率：94.7％，HPLC纯度：99.58％，ee值：>99.9％。
1HNMR(600MHz,DMSO-d6):δ＝9.15(s,2H),7.41-7.35(m,4H),7.29-7.26(m, 1H),7.12-7.10(m,1H),6.98-6.95(m,1H),6.76-6.72(m,2H),5.57-5.55(m,1H), 3.05-2.96(m,2H),2.53(s,3H),2.32-2.27(m,1H),2.26(s,3H),2.21-2.15(m,1H)；13CNMR(150MHz,DMSO-d6):δ＝155.53,141.35,130.98,129.14,128.29,127.06, 126.75,126.34,120.82,113.44,76.12,45.69,34.72,32.79,16.72；HR-MS理论值 (calcd for)C17H22NO[M+H]+m/z256.1696,实验值(found)m/z 256.1696。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
本发明涉及的序列信息：
DNA序列SEQ ID No.1
atgacgattgctctcaacaatgtggtcgccgtcgtcaccggcgcggcgggaggcatcggccgcgaactggtcaaggc gatgaaggccgccaacgccatcgtcatcgccaccgacatggccccctcggccgatgtcgaaggcgcggaccattatc tccagcacgacgtgacgagcgaggccggctggaaggccgtcgcggcgctggcccaggaaaagtacgggcgcgtc gatgcgctggtgcacaacgcgggcatctcgatcgtcacgaagttcgaagacactccgctgtccgatttccaccgcgtg aacacggtcaacgtcgattccatcatcatcggtacgcaggtcctgctgccgctgctcaaggaaggcggcaaggcgcg cgcagggggcgcctcggtggtcaacttctccagcgtcgcgggcctgcgcggcgcggcgttcaatgcggcctattgca ccagcaaggcggcggtgaagatgctctcgaagtgcctcggcgcggaattcgcggcgctcggctacaacatccgcgtc aactccgtgcatccgggcggcatcgataccccgatgctcggctcgctcatggacaagtacgtcgaactcggcgctgcc ccctcgcgcgaggtggcccaggccgcgatggaaatgcgccacccgatcggtcgcatgggtcgccctgccgaaatgg gcggcggcgtggtctatctctgctccgacgcagcaagcttcgtcacctgcacggaattcgtgatggacggcggcttca gccaggtc
氨基酸序列SEQ ID No.2
mtialnnvvavvtgaaggigrelvkamkaanaiviatdmapsadvegadhylqhdvtseagwkavaalaqeky grvdalvhnagisivtkfedtplsdfhrvntvnvdsiiigtqvllpllkeggkaraggasvvnfssvaglrgaafnaay ctskaavkmlskclgaefaalgynirvnsvhpggidtpmlgslmdkyvelgaapsrevaqaamemrhpigrmg rpaemgggvvylcsdaasfvtctefvmdggfsqv。
序列表
<110> 上海医药工业研究院
中国医药工业研究总院
<120> 托莫西汀的化学-酶合成方法
<130> P2019-1036
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 777
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 1
atgacgattg ctctcaacaa tgtggtcgcc gtcgtcaccg gcgcggcggg aggcatcggc 60
cgcgaactgg tcaaggcgat gaaggccgcc aacgccatcg tcatcgccac cgacatggcc 120
ccctcggccg atgtcgaagg cgcggaccat tatctccagc acgacgtgac gagcgaggcc 180
ggctggaagg ccgtcgcggc gctggcccag gaaaagtacg ggcgcgtcga tgcgctggtg 240
cacaacgcgg gcatctcgat cgtcacgaag ttcgaagaca ctccgctgtc cgatttccac 300
cgcgtgaaca cggtcaacgt cgattccatc atcatcggta cgcaggtcct gctgccgctg 360
ctcaaggaag gcggcaaggc gcgcgcaggg ggcgcctcgg tggtcaactt ctccagcgtc 420
gcgggcctgc gcggcgcggc gttcaatgcg gcctattgca ccagcaaggc ggcggtgaag 480
atgctctcga agtgcctcgg cgcggaattc gcggcgctcg gctacaacat ccgcgtcaac 540
tccgtgcatc cgggcggcat cgataccccg atgctcggct cgctcatgga caagtacgtc 600
gaactcggcg ctgccccctc gcgcgaggtg gcccaggccg cgatggaaat gcgccacccg 660
atcggtcgca tgggtcgccc tgccgaaatg ggcggcggcg tggtctatct ctgctccgac 720
gcagcaagct tcgtcacctg cacggaattc gtgatggacg gcggcttcag ccaggtc 777
<210> 2
<211> 259
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 2
Met Thr Ile Ala Leu Asn Asn Val Val Ala Val Val Thr Gly Ala Ala
1 5 10 15
Gly Gly Ile Gly Arg Glu Leu Val Lys Ala Met Lys Ala Ala Asn Ala
20 25 30
Ile Val Ile Ala Thr Asp Met Ala Pro Ser Ala Asp Val Glu Gly Ala
35 40 45
Asp His Tyr Leu Gln His Asp Val Thr Ser Glu Ala Gly Trp Lys Ala
50 55 60
Val Ala Ala Leu Ala Gln Glu Lys Tyr Gly Arg Val Asp Ala Leu Val
65 70 75 80
His Asn Ala Gly Ile Ser Ile Val Thr Lys Phe Glu Asp Thr Pro Leu
85 90 95
Ser Asp Phe His Arg Val Asn Thr Val Asn Val Asp Ser Ile Ile Ile
100 105 110
Gly Thr Gln Val Leu Leu Pro Leu Leu Lys Glu Gly Gly Lys Ala Arg
115 120 125
Ala Gly Gly Ala Ser Val Val Asn Phe Ser Ser Val Ala Gly Leu Arg
130 135 140
Gly Ala Ala Phe Asn Ala Ala Tyr Cys Thr Ser Lys Ala Ala Val Lys
145 150 155 160
Met Leu Ser Lys Cys Leu Gly Ala Glu Phe Ala Ala Leu Gly Tyr Asn
165 170 175
Ile Arg Val Asn Ser Val His Pro Gly Gly Ile Asp Thr Pro Met Leu
180 185 190
Gly Ser Leu Met Asp Lys Tyr Val Glu Leu Gly Ala Ala Pro Ser Arg
195 200 205
Glu Val Ala Gln Ala Ala Met Glu Met Arg His Pro Ile Gly Arg Met
210 215 220
Gly Arg Pro Ala Glu Met Gly Gly Gly Val Val Tyr Leu Cys Ser Asp
225 230 235 240
Ala Ala Ser Phe Val Thr Cys Thr Glu Phe Val Met Asp Gly Gly Phe
245 250 255
Ser Gln Val

Claims (10)

1.一种(S)-3-氯苯丙醇的制备方法，其特征在于，包括步骤：
(a)在液态反应体系中，以3-氯苯丙酮(式2化合物)为底物，在辅酶存在下，在羰基还原酶催下，进行不对称还原反应，从而形成(S)-3-氯苯丙醇[式(S)-3化合物]；
Figure FDA0002246790480000011
和
(b)任选地从所述上一步骤的反应后的反应体系中分离出(S)-3；
其中，所述羰基还原酶选自下组：
(i)其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；
(ii)对SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列在保持酶活性范围内，进行一个或多个氨基酸的替换、缺失、改变、***或增加，所得到的氨基酸序列。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的反应体系中，羰基还原酶为游离形式的酶、固定化酶、或菌体形式的酶。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的辅酶选自下组：还原性辅酶、氧化性辅酶，或其组合。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的反应体系中，还存在用于辅酶再生的酶，所述用于辅酶再生的酶为异丙醇脱氢酶、甲酸脱氢酶、或葡萄糖脱氢酶。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在步骤(b)中，所述反应后的反应体系中，式(S)-3化合物的ee值≥90％，较佳地≥95％，更佳地≥99％。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的羰基还原酶的编码基因序列选自下组：
(a)SEQ ID NO.1所示的序列(NCBI的登录号为CP000677.1)；
(b)与(a)限定的序列互补的多核苷酸；或
(c)与(a)限定的序列具有至少70％(优选至少75％、80％、85％、90％，更优选至少95％、96％、97％、98％、99％)以上的序列一致性的任一多核苷酸或互补序列。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的反应体系中，还存在共底物，所述共底物为异丙醇、甲酸铵、或葡萄糖。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述的反应体系中，共底物的浓度为5-30％。
9.一种托莫西汀的制备方法，其特征在于，通过权利要求1所述的方法所制得式(S)-3化合物进行如下的反应步骤制得：
Figure FDA0002246790480000021
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
(1)使用通过权利要求1所述的方法所制得的(S)-3-氯苯丙醇，与邻甲基苯酚发生光延反应制得化合物4；
(2)步骤(1)中获得的化合物4经碘化钠活化、甲胺取代、草酸成盐制得托莫西汀的草酸盐；
(3)步骤(2)中获得的草酸盐经饱和碳酸氢钠溶液游离后，与氯化氢成盐制得盐酸盐托莫西汀。
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