CN114916563B - 一株解淀粉芽孢杆菌及其增效剂的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一株解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens),保藏编号为CGMCC No.19213。该解淀粉芽孢杆菌及其发酵液可用于抑制植物病原菌和促进植物生长,同时使用茶树精油作为增效剂,对病害防治效果表现增效。该解淀粉芽孢杆菌具有生防促生效果,可有效降低番茄、草莓等作物土传病害的发生,并可有效防治核桃链格孢叶斑病和枣黑斑病的干果树木的病害,降低了化学药剂的使用量。由该解淀粉芽孢杆菌菌株其制备的制剂,及茶树精油制备的增效剂,贮藏性能稳定,防治效果好,对植株生长发育无任何不良影响,且加工方便,生产和运输成本均较低。
Description
技术领域
本发明属于生物农药技术领域,具体涉及一种解淀粉芽孢杆菌及其增效剂的应用。
背景技术
我国核桃种植面积、产量均占世界第一。核桃链格孢叶斑病的病原菌为半知菌亚门链格孢属极细链格孢菌(Alternaria tenuissima),可危害核桃树叶片、果实、芽和幼梢。该病造成核桃叶片出现黑褐色斑块,坏死焦枯,核桃灌浆不足,产量下降,对核桃产业发展具有潜在威胁。核桃链格孢叶斑病作为新发病害,在生产中缺少有效防控的绿色高效农药。
番茄和草莓土传病害日益严重,已成为制约生产的重要因素,其中在设施大棚上以番茄颈腐根腐病和草莓丝核菌根腐病为近年来的新发病害。番茄颈腐根腐病在冬暖式大棚发生严重,低温发病。番茄颈腐根腐病是由尖镰孢番茄颈腐根腐专化型(Fusarium oxysporum f. sp. radices-lycopersici,FORL)侵染引起的土传病害,虽然与番茄枯萎病都是有尖孢镰刀菌引起的,但是由于专化型的差异,两种病害在发病时期及发病症状有很大区别。草莓枯萎病和根腐病是草莓生产中的重要病害,主要由致病菌致病菌尖镰孢(Fusarium oxysporum)和立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)AG-4融合群侵染发病。由于土传病害侵染周期较长、防治困难且尚无登记药剂,已经给番茄、草莓生产造成重大的经济损失。
目前,我国对果蔬病害的防治仍以化学药剂为主,杀菌剂的频繁且不合理使用,不仅易造成病原菌抗药性的爆发,也对生态环境和人类健康产生了严重的威胁。开发利用有益微生物作为生物拮抗制剂为果蔬病害的生物防治提供了丰富的资源和方法。
解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)最早是由Priest发现并将其分类地位与枯草芽孢杆菌分开。解淀粉芽孢杆菌可以产生多种具抑菌效果物质,如抗菌蛋白、脂肽类、环二肽类等物质,在农业生产上有促进植物生长和抵御病原微生物作用,具有广谱抗菌活性,是开发生物药剂潜力较大的微生物。
茶树精油(Tea Tree Oil,TTO)是由桃金娘科(Myrtaceae)白千层属(Melaleuca)灌木树种互叶白千层(Meloleuca alternifolia)的新鲜枝叶经蒸馏得到的芳香精油。茶树精油色透明,黏度极低,挥发性强。茶树精油具有高效的抑制真菌菌丝生长和孢子萌发的效果,通过破坏微生物细胞壁或细胞膜结构、影响菌丝形态结构等达到抑菌作用。此外茶树精油还有诱导植物抗病性的作用。
发明内容
针对现有拮抗菌防控效率不佳、防治范围不广、在植株上定殖能力不足的问题,本发明提供一种可与茶树精油共同使用的解淀粉芽孢杆菌SDTB009,能够防治核桃、枣树、草莓和番茄等多种作物上的病害,提高防治效果。
为实现上述目的,本发明采用如下技术方案。
茶树精油作为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)SDTB009增效剂的应用。
所述茶树精油符合标准GB/T 26514-2011 互叶白千层(精)油,松油烯-4-醇型[茶树(精)油]的规定。
解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)SDTB009在防治极细链格孢(Alternaria tenuissima)、尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum f. sp. fragriae)、尖镰孢颈腐根腐专化型(Fusarium oxysporum f. sp. radices-lycopersici)及立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)AG-4融合群中的应用。
上述解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)SDTB009的保藏编号为CGMCC No.19213。
所述应用为解淀粉芽孢杆菌SDTB009单独或与茶树精油联合使用。
优选的,上述应用中,茶树精油的使用浓度为100-500mg/L。
所述应用的施用作物选自核桃、枣、番茄或草莓。
一种包含上述解淀粉芽孢杆菌SDTB009和茶树精油的组合物。
本发明具有以下优点:
本发明提供了一株可用于抑制植物病原菌和促进植物生长的解淀粉芽孢杆菌及其发酵液,同时使用茶树精油作为增效剂,对病害防治效果表现出明显的增效作用。该解淀粉芽孢杆菌具有生防促生效果,可有效降低番茄、草莓等作物土传病害的发生,并可有效防治核桃链格孢叶斑病和枣黑斑病的干果树木的病害,降低了化学药剂的使用量。由该解淀粉芽孢杆菌菌株其制备的制剂,及茶树精油制备的增效剂,贮藏性能稳定,防治效果好,对植株生长发育无任何不良影响,且加工方便,生产和运输成本均较低。
生物保藏信息
解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)SDTB009,于2019年12月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC),保藏地址为中国北京,北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所,保藏编号为CGMCC No. 19213。
附图说明
图1是解淀粉芽孢杆菌的平板划线培养图片(A)、培养物水解淀粉作用图(B)和菌体透射电镜图(C);
图2是加入终浓度0.5mg/L茶树精油对2株解淀粉芽孢杆菌在LB培养基上生长的影响,其中A为解淀粉芽孢杆菌SDTB009菌株,B解淀粉芽孢杆菌JM-3菌株;
图3是加入终浓度0.5mg/L茶树精油对2株解淀粉芽孢杆菌发酵的影响,其中处理1为阴性对照LB培养基,2为振荡培养的解淀粉芽孢杆菌SDTB009菌株,3为加入精油后振荡培养的解淀粉芽孢杆菌SDTB009菌株,4为振荡培养的解淀粉芽孢杆菌菌株JM-3,5为加入精油后振荡培养的解淀粉芽孢杆菌JM-3菌株;
图4是解淀粉芽孢杆菌对靶标病原菌的拮抗效果,其中A为与番茄颈腐根腐病菌平皿对峙及加入茶树精油后的抑菌效果,B为与草莓枯萎病菌平皿对峙及加入茶树精油后的抑菌效果,C为与核桃链格孢叶斑病菌平皿对峙及加入茶树精油后的抑菌效果,D为与枣黑斑病菌与及加入茶树精油后的抑菌效果,E为与立枯丝核菌AG-4融合群平皿对峙及加入茶树精油后的抑菌效果。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明做进一步说明,但本发明不受下述实施例的限制。
实施例1 SDTB009的分离、鉴定
2017年8月,于山东省泰安市岱岳区良庄镇采集解决连作障碍较好的设施大棚的土壤,从中分离细菌菌株,具体分离、纯化过程为:称取10g过筛土壤样品,放入装有90mL无菌水和少量玻璃珠的250mL灭菌三角瓶中,将三角瓶置于37℃、180rpm摇床上振荡30min,使之充分悬浮,随后80℃水浴处理10min,用无菌水将菌悬液稀释至10-4、10-5、10-6等梯度。分别吸取各梯度溶液100µL均匀涂布于NA培养基平板上,每个梯度重复3次,置于28℃恒温培养箱中培养1-2d后挑取不同的单菌落经平板划线纯化。将纯化后多株菌种以番茄颈腐根腐病菌(Fusarium oxysporum f. sp. radicis-lycopersici)为靶标菌进行筛选,获得抑菌圈最大的目标菌株,编号为SDTB009。对该菌进行形态鉴定和生理生化特征试验,并对该菌株进行16s rDNA测序并构建***发育树。
表1 菌株生理生化特征
培养形态及透射电镜照片如图1所示,目标菌株在NA固体培养基上,37℃下培养24h后,菌落呈乳白色,不透明,边缘不整齐,呈不规则圆形,革兰氏染色阳性。透射电镜下观察到杆状菌体细胞,具有较厚的荚膜,周生鞭毛,长度约1.2-2.5μm。结合目标菌株的形态学、生理生化性状以及16s rDNA序列同源性比对结果,鉴定该菌株为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens),于2019年12月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏编号为CGMCC No. 19213。
实施例2 茶树精油对解淀粉芽孢杆菌SDTB009的增效作用
1. 茶树精油对解淀粉芽孢杆菌SDTB009生长的影响
在超净工作台上将贴好滤纸的平皿中倒入15mL LB培养基制备平板。使用移菌环蘸取实施例1所述的解淀粉芽孢杆菌单菌落划线,以拮抗菌解淀粉芽孢杆菌JM-3(保藏编号:CGMCC No. 15444)菌株为对照。在滤纸片上滴加入终浓度0.5mg/L茶树精油,迅速迅速封口。30℃条件下黑暗培养24h后,观察划线效果。结果如图2所示,茶树精油对解淀粉芽孢杆菌SDTB009菌株生长无抑制,而对解淀粉芽孢杆菌JM-3菌株生长抑制显著。
在超净工作台上量取5mL LB液体培养基加入灭菌试管,使用灭菌牙签挑取实施例1所述的解淀粉芽孢杆菌单菌落加入试管,在试管塞内侧粘贴滤纸片并在滤纸片上滴加入终浓度0.5mg/L茶树精油,迅速迅速封口。30℃条件下180rpm黑暗振荡培养24h后,检测发酵液OD600值,以LB培养基为阴性对照,以不加精油处理的对解淀粉芽孢杆菌SDTB009菌株为阳性对照,并以解淀粉芽孢杆菌JM-3菌株为处理对照。结果如图3所示,茶树精油对解淀粉芽孢杆菌SDTB009菌株发酵无抑制,对解淀粉芽孢杆菌JM-3菌株发酵有显著抑制效果。0.5mg/L茶树精油对解淀粉芽孢杆菌SDTB009菌株无抑制效果,可与解淀粉芽孢杆菌SDTB009联用防治目标病原菌。
2. 茶树精油对解淀粉芽孢杆菌SDTB009的增效
将番茄颈腐根腐病菌(尖孢镰刀菌番茄颈腐根腐病专化型,Fusarium oxysporumf. sp. radicis-lycopersici)、草莓枯萎病菌(F. oxysporum f. sp. fragriae)、核桃链格孢叶斑病菌(极细链格孢菌,Alternaria tenuissima)、枣黑斑病菌(极细链格孢菌,A. tenuissima)、草莓丝核菌根腐病菌(立枯丝核菌AG-4融合群,Rhizoctonia solani)活化备用。选择直径9cm的培养皿,在皿盖中央贴1片直径5mm滤纸片,灭菌后待用。
在超净工作台上,在灭菌平皿中倒入15mL PDA培养基制备PDA固体培养基平板。将贴好滤纸的平皿中倒入15mL PDA培养基,制备PDA平板。在超净工作台上,在两种PDA培养基平板中央分别接种直径7mm的预先活化的生长旺盛的番茄颈腐根腐病菌、草莓枯萎病菌、核桃链格孢叶斑病菌、枣黑斑病菌、草莓丝核菌根腐病菌菌饼。同时,在滤纸片上滴加入终浓度0.5mg/L茶树精油,迅速迅速封口。25℃条件下黑暗培养24h后,以灭菌牙签挑取活化好的实施例1所述的解淀粉芽孢杆菌单菌落,在距离菌饼中央2cm处接菌,迅速以封口膜封口,20-28℃、黑暗培养3-7d,测定抑菌圈直径并计算增效率。
表2 解淀粉芽孢杆菌对靶标病原菌的抑菌圈及茶树精油的增效作用
解淀粉芽孢杆菌SDTB009与靶标病原菌的拮抗效果及茶树精油对解淀粉芽孢杆菌的增效作用如图4所示,其抑菌圈结果如表2所示。由图4和表2可知,解淀粉芽孢杆菌对各病原菌的抑制效果非常明显,抑菌圈清晰可见。加入茶树精油后,对解淀粉芽孢杆菌的增效效果显著。由此说明,该解淀粉芽孢杆菌对多种真菌病害均有效果,且茶树精油对该解淀粉芽孢杆菌的抑菌作用有意想不到的增效作用。
实施例3 对草莓丝核菌根腐病菌的盆栽防治效果
挑取活化好的实施例1所述的解淀粉芽孢杆菌SDTB009单菌落,接种于装有约300mL灭菌LB液体培养基的500mL三角瓶中,于37℃、150rpm摇床培养24h,调整菌体浓度为107 cfu/mL的解淀粉芽孢杆菌菌悬液。将茶树精油加入乳化剂和溶剂先配制成10%的母液然后稀释成1%的乳液。
从草莓丝核菌根腐病发生严重地块取土,装于直径15cm的塑料花盆中,并人工接种培养好的立枯丝核菌AG-4群。移栽草莓幼苗,1株/盆,生防菌处理组每盆草莓灌根处理30mL浓度为107cfu/mL的解淀粉芽孢杆菌SDTB009菌悬液,对照组以清水代替菌液。增效剂处理组除与上述步骤相同外,每盆草莓灌根处理10mL 1%茶树精油乳液。每个处理设4次重复,每个重复10盆。采用常规栽培管理,每隔15d调查1次各处理组的发病率,并计算相对防效(相对防效(%)=(对照组发病率-处理组发病率)/对照组发病率×100%),连续调查2次;30d时处理组和对照组各取10株植株测根长。
表3 解淀粉芽孢杆菌菌液对草莓丝核菌根腐病的盆栽试验结果
表中数据经新复极差法统计,数据后不同小写字母表示P<0.05水平差异显著。
结果如表3所示:移栽后15d和30d,对照组病株率为100%。解淀粉芽孢杆菌SDTB009对草莓丝核菌根腐病的防效分别为58.5%和55.6%,防治效果显著。加入茶树精油增效剂的处理组,对草莓丝核菌根腐病的防效分别为72.5%和74.9%,显著高于解淀粉芽孢杆菌单独使用的处理,增效作用显著(P<0.05)。处理后30天测量草莓株高,各处理组株高显著高于清水对照组,解淀粉芽孢杆菌SDTB009对草莓植株有明显促生效果(P<0.05)。
实施例4 解淀粉芽孢杆菌微生物菌剂和茶树精油增效剂的制备
(1)菌液的制备:挑取预先在LB培养基固体平板上活化好的实施例1纯化的解淀粉芽孢杆菌SDTB009的单菌落,接种于装有约300mL灭菌LB液体培养基的500mL三角瓶中,于37℃、150rpm摇床培养24h,制得菌株种子液。再将种子液转入装有50L灭菌LB液体培养基的100L发酵罐中,37℃、300rpm培养16h,制得菌体浓度为108-109cfu/mL的发酵液;
(2)将步骤(1)制得的发酵液在4000rpm条件下离心15min,弃上清液,留沉淀物。将1kg沉淀物、0.5kg黄腐酸钾、0.5kg硅藻土和1kg腐殖酸混合均匀,60℃烘干至水分含量<15%,粉碎,过筛,得到活菌含量为5亿cfu/克的粉末状微生物菌剂。
(3)茶树精油增效剂的制备:将茶树精油配制成10%茶树精油乳油:茶树精油10%,二甲苯84%,农乳2201乳化剂6%;将上述成分充分混匀,于4℃冰箱密封存放。
实施例5 解淀粉芽孢杆菌微生物菌剂对核桃链格孢叶斑病的田间防效
在连续多年发生核桃链格孢叶斑病的果园开展试验。在病害发生前或零星发病时施药,连续施药两次,间隔10天施药。微生物菌剂处理组使用实例4制备的解淀粉芽孢杆菌微生物菌剂500倍液喷雾。每个处理设4次重复,每个重复2株核桃树。增效剂处理组,在喷施微生物菌剂之前,将10%茶树精油乳油加水稀释成1%水乳剂,然后加入配好的药液中,至稀释倍数20倍和100倍,搅匀后喷雾。对照组未处理,随机区组排列,处理间设保护行。
采用常规栽培管理,第一次药后10天和第二次药后10天各调查一次发病率。调查方法为每处理按对角线五点取样法取样,各调查2株。每株树按东、南、西、北、中5个方位取样(取样时兼顾上、中、下3层叶片),调查100片叶(每方位调查20片),分别记录病叶数,计算发病率,并计算防效(防效(%)=(对照组发病率-处理组发病率)/对照组发病率×100%)。
表4 解淀粉芽孢杆菌制剂及增效剂对核桃链格孢叶斑病的田间防效
结果如表4所示:较对照组,两次结果调查中解淀粉芽孢杆菌微生物菌剂处理对核桃链格孢叶斑病的相对防效分别为73.77%和72.80%,微生物菌剂+茶树精油增效剂(100mg/L)处理对核桃链格孢叶斑病的相对防效分别为86.34%和90.80%,微生物菌剂+茶树精油增效剂(500 mg/L)处理对核桃链格孢叶斑病的相对防效分别为91.80%和93.87%,且加入茶树精油增效剂的2个处理防效均显著高于单独加入菌剂处理(P<0.05)。解淀粉芽孢杆菌SDTB009微生物菌剂处理及添加茶树精油增效剂处理均显著降低了核桃链格孢叶斑病的发病率,添加茶树精油增效剂处理对病害防控的持效性较好,增效效果显著。
Claims (6)
1.茶树精油作为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)SDTB009增效剂的应用,其特征在于,所述解淀粉芽孢杆菌SDTB009的保藏编号为CGMCC No. 19213;
所述解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)SDTB009的防治对象为极细链格孢(Alternaria tenuissima)、尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum f. sp. fragriae)、尖镰孢颈腐根腐专化型(Fusarium oxysporum f. sp. radices-lycopersici)及立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)AG-4融合群。
2.解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)SDTB009在防治极细链格孢(Alternaria tenuissima)、尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum f. sp. fragriae)、尖镰孢颈腐根腐专化型(Fusarium oxysporum f. sp. radices-lycopersici)及立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)AG-4融合群中的应用,其特征在于,所述解淀粉芽孢杆菌SDTB009的保藏编号为CGMCC No. 19213。
3.根据权利要求2所述的应用,其特征在于,为解淀粉芽孢杆菌SDTB009单独或与茶树精油联合使用。
4.根据权利要求1或3所述的应用,其特征在于,茶树精油的使用浓度为100-500mg/L。
5.根据权利要求2所述的应用,其特征在于,施用作物选自核桃、枣、番茄或草莓。
6.一种包含解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)SDTB009和茶树精油的组合物,其特征在于,所述解淀粉芽孢杆菌SDTB009的保藏编号为CGMCC No. 19213。
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