CN114901315A - 癌症和其他纤维化和炎性疾病的成纤维细胞活化蛋白(fap)靶向的成像和治疗 - Google Patents

癌症和其他纤维化和炎性疾病的成纤维细胞活化蛋白(fap)靶向的成像和治疗 Download PDF

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Abstract

成纤维细胞活化蛋白(FAP)靶向化合物(例如，缀合物)；用于对癌症或纤维化进行成像的方法；以及用于治疗炎性疾病/病症和癌症的方法。

Description

癌症和其他纤维化和炎性疾病的成纤维细胞活化蛋白(FAP) 靶向的成像和治疗
相关申请的交叉引用
本申请要求于2019年9月17日提交的美国临时专利申请No.62/901,792的权益，其在此通过引用整体并入。
技术领域
本公开内容涉及对某些化学化合物和基团，例如靶向成纤维细胞活化蛋白(fibroblast activation protein，FAP-α)的配体的开发。在一些情况下，基团与药物或成像剂连接。在某些情况下，这样的连接的化合物(本文中也称为“缀合物”)用于多种方法，例如对(例如，FAP阳性)癌症、纤维化疾病和/或炎性病症的治疗和/或成像。在一些情况下，特异性靶向的(例如，在治疗和/或成像方法中)是癌症相关成纤维细胞(cancer-associatedfibroblast，CAF)和/或活化的肌成纤维细胞(例如，在癌症和/或其他纤维化和炎性疾病中)。在一些情况下，本文中提供的化学化合物和/或配体在肿瘤和其他疾病部位具有良好的或改善的内化和停留时间。
背景技术
放射治疗和化学治疗被考虑用于多种癌症、纤维化病症和炎性疾病。通常，这样的治疗不被视为一线治疗，因为可产生不良(例如，全身)作用。
作为结果，需要使用适合于靶向病变细胞和组织的、具有最小或降低的脱靶或全身作用的放射治疗剂和/或化学治疗剂来治疗疾病(例如，癌症、纤维化疾病和/或炎性疾病)的靶向治疗。
在一些情况下，某些肿瘤的存活和增殖取决于肿瘤基质的百分比(percentage oftumor stroma，TSP)。高TSP与低TSP相比(分别为>50％vs.≤50％)，可与较差的长期患者存活相关。TSP也可以是肿瘤复发、生长和转移的重要预后因素。
在某些情况下，癌症相关成纤维细胞(CAF)在肿瘤基质中是丰富的并且进行数种重要功能以促进肿瘤发生。作为非限制性实例，这些功能包括细胞因子分泌和/或胞外基质(extracellular matrix，ECM)产生和重塑。在一些情况下，这样的作用导致血管生成以促进肿瘤生长，信号传导因子以提高化学抗性，较致密的ECM以产生免疫抑制环境，以及增强的细胞运动以直接转移。在一些情况下，这样的过程与纤维化疾病中致病性成纤维细胞的行为相似。
在一些情况下，CAF的普遍标志物是成纤维细胞活化蛋白α(FAPα)。此外，FAPα是(主要)存在于病变细胞和组织(例如在纤维化疾病、炎性疾病和/或癌症(例如，纤维化、类风湿关节炎、伤口愈合和癌症)中的病变细胞和组织)中的活化成纤维细胞的细胞表面的丝氨酸蛋白酶。超过90％的上皮癌在免疫组织化学(IHC)染色中显示出FAPα表达。在肿瘤相关巨噬细胞(tumor-associated macrophage，TAM)和原代胶质瘤细胞培养物的子集中发现了另外的FAPα表达。然而，大多数成体组织中FAPα的表达非常低或不存在。因此，由于表达局限于病变细胞(例如癌)的表面，因此FAPα被认定为是独特的通过配体靶向将药物治疗剂选择性地递送至肿瘤的受体。
发明概述
提供了式X化合物(例如，缀合物)：
Am-L-B (X)
其中：
A是成纤维细胞活化蛋白α(FAPα)配体(靶向部分)基团(例如，分子量低于10,000)；
L是将一个或更多个A基团与B连接的(例如双功能化)接头(例如，通过将L与A连接的第一共价键和将L与B连接的第二共价键)；
B是成像剂、光动力学治疗剂、放射成像剂、放射治疗剂、化学治疗剂、抗纤维化剂或者抗癌剂(例如，有效抗癌细胞或癌症相关成纤维细胞、肌成纤维细胞或其他肿瘤微环境因素的抗癌剂)(例如，其基团)；并且
m是1至6。
还提供了式I化合物(例如，缀合物)：
A-L-B (I)
其中：
A包含FAPα配体(例如靶向部分)(例如，其基团)；
L包含将一个或更多个A基团与B连接的(例如双功能化)接头；并且
B包含光学成像剂、光动力学治疗剂、放射成像剂、放射治疗剂、化学治疗剂、抗纤维化剂或抗癌剂(例如，有效抗癌细胞或癌症相关成纤维细胞、肌成纤维细胞或其他肿瘤微环境因素的抗癌剂)(例如，其基团)。
还提供了用于在患有癌症或纤维化的对象中对癌症或纤维化进行成像的方法，该方法包括向有此需要的对象施用有效量的化合物。
还提供了用于治疗炎性疾病或病症的方法，该方法包括向患有炎性疾病或病症的对象施用治疗有效量的化合物。
甚至还提供了用于治疗癌症的方法，该方法包括向患有癌症的对象施用治疗有效量的化合物。
附图简述
附图一般性地以实例的方式而非以限制性的方式示出了在本文件中讨论的多个实施方案。
图1示出了靶向成纤维细胞活化蛋白(FAP)的配体的逆合成(retrosynthesis)。
图2示出了具有靶向配体的靶向化合物的结构。
图3示出了递增浓度(例如，50nM(A)、25nM(B)、12.5nM(C)和6.25nM(D))的靶向配体对具有高浓度成纤维细胞活化蛋白(FAP)的成纤维细胞的结合提高。
图4示出了在孵育1小时(A)、8小时(B)、24小时(C)和48小时(D)之后，在单一浓度下靶向配体对具有高表面浓度FAP的成纤维细胞的结合。
图5示出了在至少100倍过量的竞争配体(例如，A：25nM靶向配体，2.5μM竞争物；B：25nM靶向配体，5μM竞争物)下，靶向配体对具有高表面浓度FAP的成纤维细胞的结合，持续1小时。
图6示出了靶向配体对无高表面浓度FAP的类似成纤维细胞的结合(例如，在100nM(A)和在200nM(B))。
图7示出了靶向配体对具有高表面浓度FAP的成纤维细胞(或FAP成纤维细胞)的结合曲线。
图8示出了靶向配体对FAP成纤维细胞(仅靶向配体(圆形)以及靶向配体和竞争物(正方形))以及FAP成纤维细胞(三角形)的结合曲线。
图9A示出了显示靶向配体在施用于患有有富含FAP环境的肿瘤的哺乳动物2小时至32小时之后的体内肿瘤特异性靶向的成像结果。
图9B示出了显示靶向配体在施用于患有有富含FAP环境的肿瘤的哺乳动物48小时至122小时之后的体内肿瘤特异性靶向的成像结果。
图9C示出了靶向配体在施用于患有有富含FAP环境的肿瘤的哺乳动物(MDA-MB-231异种移植小鼠)之后，在122小时之后在肿瘤、心脏、肝、肺、脾、肾、肠和胃中的生物分布。图像中的黑色或白色椭圆形或圆形突出显示了靶向配体的存在位置。椭圆形或圆形内较深的阴影表示与椭圆形或圆形内较浅的阴影相比靶向配体的浓度更高。
图10示出了在有(右)和无(左)未经标记的竞争物的两种情况下靶向配体在施用于患有有富含FAP环境的肿瘤的哺乳动物(MDA-MB-231异种移植小鼠)之后，在2小时和6小时之后的体内成像。图像中的黑色椭圆形或圆形突出显示了靶向配体的存在位置。椭圆形或圆形内较深的阴影表示与椭圆形或圆形内较浅的阴影相比靶向配体的浓度更高。
图11A示出了靶向配体在施用于患有有富含FAP环境的另一种肿瘤的哺乳动物(KB异种移植小鼠)2小时至32小时之后的体内成像。
图11B示出了靶向配体在施用于患有有富含FAP环境的另一种肿瘤的哺乳动物(KB异种移植小鼠)48小时至122小时之后的体内成像。
图11C示出了靶向配体在施用于患有有富含FAP环境的肿瘤的哺乳动物之后，在122小时时在肿瘤、心脏、肝、肺、脾、肾、肠和胃中的生物分布。图像中的黑色椭圆形或圆形突出显示了靶向配体的存在位置。椭圆形或圆形内较深的阴影表示与椭圆形或圆形内较浅的阴影相比靶向配体的浓度更高。
图12示出了在有(右)和无(左)未经标记的竞争物的两种情况下靶向配体在施用于患有有富含FAP环境的另一种肿瘤的哺乳动物(KB异种移植小鼠)之后，在2小时和6小时之后的体内成像。图像中的黑色椭圆形或圆形突出显示了靶向配体的存在位置。椭圆形或圆形内较深的阴影表示与椭圆形或圆形内较浅的阴影相比靶向配体的浓度更高。
图13示出了靶向配体在施用于患有有富含FAP环境的另一种肿瘤的哺乳动物(KB异种移植小鼠)之后在时间点2小时、4小时、6小时、6小时(肾覆盖(kidney covered，KC))、15小时、24小时和122小时在肿瘤、心脏、肝、肺、脾、肾、肠和胃中的生物分布。图像中的黑色或白色箭头、椭圆形或圆形突出显示了靶向配体的存在位置。与箭头相邻或在椭圆形或圆形内的较深的阴影表示与较浅的阴影相比靶向配体的浓度更高。
图14A示出了靶向配体在施用于患有有富含FAP环境的另一种肿瘤的哺乳动物(FADu异种移植小鼠M1、M2、M3)之后在注射之后6小时的体内成像。
图14B示出了FAP靶向化合物在6小时之后在肿瘤、心脏、肝、肺、脾、肾、肠、肌和胃中的生物分布。
图14C示出了在注射至患有有富含FAP环境的另一种肿瘤的哺乳动物(FADu异种移植小鼠M1、M2和M3)之后6小时，示例性FAP靶向化合物与未经标记的竞争物之间的竞争实验的体内成像。
图14D示出了FAP靶向化合物在6小时之后在肿瘤、心脏、肝、肺、脾、肾、肠、肌和胃中的生物分布。图像中的黑色或白色箭头、椭圆形或圆形突出显示了靶向配体的存在位置。与箭头相邻或在椭圆形或圆形内的较深的阴影表示与较浅的阴影相比靶向配体的浓度更高。
图15A示出了靶向配体在施用于患有有富含FAP环境的另一种肿瘤的哺乳动物(HT29异种移植小鼠，M1、M2和M3)之后的体内成像。
图15B示出了FAP靶向化合物在6小时之后在肿瘤、心脏、肝、肺、脾、肾、肠、肌和胃中的生物分布。图15C示出了在施用之后，靶向配体与未经标记的竞争物之间的竞争实验的体内成像。
图15C示出了FAP靶向化合物在6小时之后在肿瘤、心脏、肝、肺、脾、肾、肠、肌和胃中的生物分布。图像中的黑色或白色箭头、椭圆形或圆形突出显示了靶向配体的存在位置。与箭头相邻或在椭圆形或圆形内的较深的阴影表示与较浅的阴影相比靶向配体的浓度更高。
图15D示出了FAP靶向化合物在6小时之后在肿瘤、心脏、肝、肺、脾、肾、肠、肌和胃中的生物分布。图像中的黑色或白色箭头、椭圆形或圆形突出显示了靶向配体的存在位置。在HT29异种移植小鼠中，与箭头相邻或在椭圆形或圆形内的较深的阴影表示与较浅的阴影相比靶向配体的浓度更高。
图16A示出了靶向配体在施用于患有有富含FAP环境的肿瘤的哺乳动物(KB肿瘤异种移植小鼠(例如，M1、M2和M3))之后的体内成像。
图16B示出了在肿瘤、心脏、肝、肺、脾、肾、肠、肌和胃中的生物分布。
图16C示出了在施用于患有有富含FAP环境的肿瘤的哺乳动物(KB肿瘤异种移植小鼠(例如，M1、M2和M3))之后，靶向配体与未经标记的竞争物之间的竞争实验的体内成像。
图16D示出了对于竞争研究，在肿瘤、心脏、肝、肺、脾、肾、肠、肌和胃中的生物分布。图像中的黑色或白色箭头、椭圆形或圆形突出显示了靶向配体的存在位置。与箭头相邻或在椭圆形或圆形内的较深的阴影表示与较浅的阴影相比靶向配体的浓度更高。
图17A示出了靶向配体在施用于患有有富含FAP环境的肿瘤的哺乳动物(MDA-MB-231肿瘤异种移植小鼠(例如，M1、M2和M3))之后的体内成像。
图17B示出了FAP靶向化合物在肿瘤、心脏、肝、肺、脾、肾、肠、肌和胃中的生物分布。
图17C示出了靶向配体与未经标记的竞争物(500nmol)之间的竞争实验的体内成像。
图17D示出了竞争研究中FAP靶向化合物在肿瘤、心脏、肝、肺、脾、肾、肠、肌和胃中的生物分布。图像中的黑色或白色箭头、椭圆形或圆形突出显示了靶向配体的存在位置。与箭头相邻或在椭圆形或圆形内的较深的阴影表示与较浅的阴影相比靶向配体的浓度更高。
图18A示出了靶向配体在施用于患有有富含FAP环境的另一种肿瘤的哺乳动物(U87MG肿瘤异种移植小鼠(例如，M1、M2和M3))之后的体内成像。
图18B示出了FAP靶向化合物在肿瘤、心脏、肝、肺、脾、肾、肠、肌和胃中的生物分布。
图18C示出了靶向配体与未经标记的竞争物之间的竞争实验的体内成像。
图18D示出了竞争研究中在肿瘤、心脏、肝、肺、脾、肾、肠、肌和胃中的生物分布。图像中的黑色或白色箭头、椭圆形或圆形突出显示了靶向配体的存在位置。与箭头相邻或在椭圆形或圆形内的较深的阴影表示与较浅的阴影相比靶向配体的浓度更高。
图19A示出了靶向配体在施用于患有有富含FAP环境的另一种肿瘤的哺乳动物(PANC1肿瘤异种移植小鼠(例如，M1、M2和M3))之后的体内成像。
图19B示出了FAP靶向化合物在肿瘤、心脏、肝、肺、脾、肾、肠、肌和胃中的生物分布。
图19C示出了本文中提供的靶向配体与未经标记的竞争物之间的竞争实验的体内成像。
图19D示出了竞争研究中在肿瘤、心脏、肝、肺、脾、肾、肠、肌和胃中的生物分布。图像中的黑色或白色箭头、椭圆形或圆形突出显示了靶向配体的存在位置。与箭头相邻或在椭圆形或圆形内的较深的阴影表示与较浅的阴影相比靶向配体的浓度更高。
图20A示出了靶向配体在施用于患有有富含FAP环境的另一种肿瘤的哺乳动物(4T1肿瘤异种移植小鼠)之后在注射之后2小时的体内成像。
图20B示出了FAP靶向化合物在6小时之后在肿瘤、心脏、肝、肺、脾、肾、肠、肌和胃中的生物分布。图像中的黑色或白色箭头、椭圆形或圆形突出显示了靶向配体的存在位置。与箭头相邻或在椭圆形或圆形内的较深的阴影表示与较浅的阴影相比靶向配体的浓度更高。
图20C示出了FAP靶向化合物在6小时之后在肿瘤、心脏、肝、肺、脾、肾、肠、肌和胃中的生物分布。图像中的黑色或白色箭头、椭圆形或圆形突出显示了靶向配体的存在位置。在4T1异种移植小鼠中，与箭头相邻或在椭圆形或圆形内的较深的阴影表示与较浅的阴影相比靶向配体的浓度更高。
图21示出了HEK-FAP细胞中靶向配体的一个置换结合曲线。
图22示出了HEK-FAP细胞中靶向配体的置换结合曲线。
图23示出了在磷酸肌醇3-激酶抑制剂(PI3Ki)或本文中提供的靶向化合物(例如，以1nM、10nM或100nM的浓度)处理之后，经转化生长因子(transforming growth factor，TGF)-β-刺激的人肺成纤维细胞中Akt(蛋白激酶B)的磷酸化水平的Western印迹。
图24示出了在磷酸肌醇3-激酶抑制剂(PI3Ki)或本文中提供的靶向化合物(例如，以1nM、10nM或100nM的浓度)处理之后，经转化生长因子(TGF)-β-刺激的人肺成纤维细胞中胶原蛋白1A1 mRNA的表达的相对变化。
发明详述
定义
除非另外限定，否则本文中使用的所有技术和科学术语具有与化学和生物学领域的技术人员通常理解的相同的含义。另外，如在本说明书和所附权利要求书中使用的，除非内容明确另外指出，否则未用数量词修饰的名词包括一个/种和/或更多个/种。因此，例如，当化合物/组合物被未用数量词修饰的烷基或芳基取代时，化合物/组合物任选地被至少一种烷基和/或至少一种芳基取代。此外，除非另有明确说明，否则术语“约”是指对于百分比加或减10％的值和对于单位值加或减1.0单位的值的范围，例如约1.0是指0.9至1.1的值的范围。
就治疗用途而言，化合物的“治疗有效量”(或“有效量”)是指制剂中该化合物的量，其当作为期望剂量方案的一部分施用(施用于哺乳动物，例如人)时，根据待治疗障碍或病症或者美容目的的临床可接受标准，减轻症状、改善病症或减慢疾病病症的发作，例如以适用于任何医学治疗的合理的收益/风险比。
术语“预防性或治疗性”治疗是本领域公认的并且包括向患者施用一种或更多种本公开内容的化合物。如果其在不期望的病症(例如宿主动物的疾病或其他不期望的状态)的临床表现之前施用，则治疗是预防性的(即，其保护宿主免于发展不期望的病症)，而如果其在不期望的病症表现之后施用，则治疗是治疗性的(即，其旨在减少、减轻或稳定现有的不期望的病症或其副作用)。
术语“患者”、“个体”或“对象”是指需要特定治疗的哺乳动物。患者或对象可以是灵长类、犬类、猫科动物或马科动物。患者或对象可以是鸟类。鸟类可以是驯养的鸟类(domesticated bird)，例如鸡。鸟类可以是禽类。患者或对象可以是人。
“氧代”是指＝O基团。
“烷基”通常是指仅由碳和氢原子组成的直链或支链烃链基团，例如具有一至十五个碳原子(例如C1-C15烷基)。除非另有说明，否则“烷基”的本文中提供的公开内容旨在包括饱和“烷基”的独立记载。烷基可包含一至十三个碳原子(例如，C1-C13烷基)。烷基可包含一至八个碳原子(例如，C1-C8烷基)。烷基可包含一至五个碳原子(例如，C1-C5烷基)。烷基可包含一至四个碳原子(例如，C1-C4烷基)。烷基可包含一至三个碳原子(例如，C1-C3烷基)。烷基可包含一至两个碳原子(例如，C1-C2烷基)。烷基可包含一个碳原子(例如，C1烷基)。烷基可包含五至十五个碳原子(例如，C5-C15烷基)。烷基可包含五至八个碳原子(例如，C5-C8烷基)。烷基可包含二至五个碳原子(例如，C2-C5烷基)。烷基可包含三至五个碳原子(例如，C3-C5烷基)。在另一些实施方案中，烷基选自甲基、乙基、1-丙基(正丙基)、1-甲基乙基(异丙基)、1-丁基(正丁基)、1-甲基丙基(仲丁基)、2-甲基丙基(异丁基)、1,1-二甲基乙基(叔丁基)、1-戊基(正戊基)。烷基通过单键与分子的其余部分连接。
“烷氧基”是指通过式-O-烷基的氧原子键合的基团，其中烷基是如上定义的烷基链。
“亚烷基”或“亚烷基链”通常是指将分子的其余部分与基团连接的直链或支链二价烷基，例如具有一至十二个碳原子，例如亚甲基、亚乙基、亚丙基、异亚丙基、正亚丁基等。
“芳基”是指通过从环碳原子上除去氢原子而衍生自芳族单环或多环烃环体系的基团。芳族单环或多环烃环体系仅包含氢和五至十八个碳原子的碳，其中环体系中的环中的至少一个是完全不饱和的，即其根据Hückel理论包含环状的、离域的(4n+2)π-电子体系。衍生芳基的环体系包括但不限于基团例如苯、芴、茚满、茚、四氢化萘和萘。
“芳烷基”或“芳基-烷基”是指式-Rc芳基的基团，其中Rc是如上定义的亚烷基链，例如亚甲基、亚乙基等。芳烷基的亚烷基链部分如上所述任选地被亚烷基链取代。
“碳环基”或“环烷基”是指仅由碳和氢原子组成的稳定的非芳族单环或多环烃基，其包括稠环体系或桥环体系，具有三至十五个碳原子。碳环基可包含三至十个碳原子。碳环基可包含五至七个碳原子。碳环基通过单键与分子的其余部分连接。碳环基或环烷基是饱和的(即仅包含单个C-C键)或不饱和的(即包含一个或更多个双键或三键)。饱和环烷基的一些实例包括例如环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基和环辛基。不饱和碳环基也称为“环烯基”。单环环烯基的一些实例包括例如环戊烯基、环己烯基、环庚烯基和环辛烯基。多环碳环基包括例如金刚烷基、降冰片基(即，双环[2.2.1]庚基)、降冰片烯基、十氢萘基(decalinyl)、7,7-二甲基双环[2.2.1]庚基等。
“碳环基烷基”是指式-Rc-碳环基的基团，其中Rc是如上定义的亚烷基链。
“卤代”或“卤素”是指溴、氯、氟或碘取代基。
“卤代烷基”是指被一个或更多个如上定义的卤素基团取代的如上定义的烷基，例如三氟甲基、二氟甲基、氟甲基、2,2,2-三氟乙基、1-氟甲基-2-氟乙基等。
术语“杂烷基”是指这样的如上定义的烷基，其中烷基的一个或更多个骨架碳原子被杂原子取代(具有适当数目的取代基或化合价，例如-CH2-可被-NH-或-O-替代)。例如，每个经取代的碳原子独立地被杂原子取代，例如其中碳被氮、氧、硒或其他合适的杂原子取代。在一些情况下，每个经取代的碳原子独立地被氧、氮(例如-NH-、-N(烷基)-或-N(芳基)-或具有本文中考虑的另一个取代基)或硫(例如-S-、-S(＝O)-或-S(＝O)2-)取代。杂烷基在杂烷基的碳原子处与分子的其余部分连接。杂烷基在杂烷基的杂原子处与分子的其余部分连接。杂烷基是C1-C18杂烷基。杂烷基是C1-C12杂烷基。杂烷基是C1-C6杂烷基。杂烷基是C1-C4杂烷基。杂烷基可包括如本文中所定义的烷氧基、烷氧基烷基、烷基氨基、烷基氨基烷基、氨基烷基、杂环烷基、杂环烷基和杂环烷基烷基。
“亚杂烷基”是指二价的上述定义的杂烷基，其将分子的一部分与分子的另一部分连接。
“杂环基”是指稳定的3至18元非芳族环基团，其可包含二至十二个碳原子以及选自氮、氧和硫的一至六个杂原子。除非说明书中另有具体说明，否则杂环基是单环、双环、三环或四环环体系，其任选地包括芳环体系、稠环体系和/或桥环体系。杂环基中的杂原子任选地被氧化。杂环基部分或完全饱和。除非另有说明，否则“杂环基”的本文中提供的公开内容旨在包括包含芳族和非芳族环结构的杂环基的独立记载。杂环基通过环的任何原子与分子的其余部分连接。这样的杂环基的一些实例包括但不限于二氧杂环戊烯基、噻吩基[1,3]二噻烷基、十氢异喹啉基、咪唑啉基、1,3-苯并二氧杂环戊烯基、1,4-苯并二
Figure BDA0003645599830000111
烷基、四氢喹啉基、5,6,7,8-四氢喹唑啉基、5,6,7,8-四氢苯并[4,5]噻吩并[2,3-d]嘧啶基、6,7,8,9-四氢-5H-环庚基[4,5]噻吩并[2,3-d]嘧啶基、5,6,7,8-四氢吡啶并[4,5-c]哒嗪基、吲哚啉基、异吲哚啉基、咪唑烷基、异噻唑烷基、异
Figure BDA0003645599830000112
唑烷基、吗啉基、八氢吲哚基、八氢异吲哚基、2-氧代哌嗪基、2-氧代哌啶基、2-氧代吡咯烷基、
Figure BDA0003645599830000113
唑烷基、哌啶基、哌嗪基、4-哌啶酮基、吡咯烷基、吡唑烷基、奎宁环基、噻唑烷基、四氢呋喃基、三噻烷基、四氢吡喃基、硫代吗啉基、噻吗啉基(thiamorpholinyl)、1-氧代-硫代吗啉基和1,1-二氧代-硫代吗啉基。
“N-杂环基”或“N-连接的杂环基”是指如上定义的杂环基，其包含至少一个氮，并且其中杂环基与分子的其余部分的连接点是通过杂环基中的氮原子。这样的N-杂环基的一些实例包括但不限于1-吗啉基、1-哌啶基、1-哌嗪基、1-吡咯烷基、吡唑烷基、咪唑啉基和咪唑烷基。
“杂芳基”是指衍生自3至18元芳环基的基团，其可包含二至十七个碳原子以及选自氮、氧和硫的一至六个杂原子。本文中使用的杂芳基是单环、双环、三环或四环环体系，其中环体系中的环中的至少一个是完全不饱和的，即其根据Hückel理论包含环状的、离域的(4n+2)π-电子体系。杂芳基包括稠环体系或桥环体系。杂芳基中的杂原子任选地被氧化。一个或更多个氮原子(如果存在)任选地被季铵化。杂芳基通过环的任何原子与分子的其余部分连接。杂芳基的一些实例包括但不限于氮杂环庚烷基(azepinyl)、吖啶基、苯并咪唑基、苯并吲哚基、苯并呋喃基、苯并
Figure BDA0003645599830000114
唑基、苯并[d]噻唑基、苯并噻二唑基、苯并[b][1,4]二氧杂环庚三烯基(benzo[b][1,4]dioxepinyl)、苯并[b][1,4]
Figure BDA0003645599830000115
嗪基、苯并萘并呋喃基、苯并
Figure BDA0003645599830000116
唑基、苯并二氧杂环戊烯基(benzodioxolyl)、苯并二氧杂环己烯基(benzodioxinyl)、苯并吡喃基、苯并吡喃酮基、苯并呋喃基、苯并呋喃酮基、苯并噻吩基(苯并硫代苯基)、苯并噻吩[3,2-d]嘧啶基、苯并***基、苯并[4,6]咪唑并[1,2-a]吡啶基、咔唑基、噌啉基、环戊[d]嘧啶基、6,7-二氢-5H-环戊[4,5]噻吩并[2,3-d]嘧啶基、5,6-二氢苯并[h]喹唑啉基、5,6-二氢苯并[h]噌啉基、6,7-二氢-5H-苯并[6,7]环戊[1,2-c]哒嗪基、二苯并呋喃基、二苯并硫代苯基、呋喃基、呋喃酮基、呋喃并[3,2-c]吡啶基、5,6,7,8,9,10-六氢环八[d]嘧啶基、5,6,7,8,9,10-六氢环八[d]哒嗪基、5,6,7,8,9,10-六氢环八[d]吡啶基、异噻唑基、咪唑基、吲唑基、吲哚基、吲唑基、异吲哚基、异喹啉基、吲嗪基(indolizinyl)、异
Figure BDA0003645599830000117
唑基、5,8-甲醇-5,6,7,8-四氢喹唑啉基、萘啶基、1,6-萘啶酮基、
Figure BDA0003645599830000121
二唑基、2-氧代氮杂环庚烷基、
Figure BDA0003645599830000122
唑基、环氧乙烷基、5,6,6a,7,8,9,10,10a-八氢苯并[h]喹唑啉基、1-苯基-1H-吡咯基、吩嗪基、吩噻嗪基、吩
Figure BDA0003645599830000123
嗪基、酞嗪基、蝶啶基、嘌呤基、吡咯基、吡唑基、吡唑并[3,4-d]嘧啶基、吡啶基、吡啶并[3,2-d]嘧啶基、吡啶并[3,4-d]嘧啶基、吡嗪基、嘧啶基、哒嗪基、吡咯基、喹唑啉基、喹喔啉基、喹啉基、异喹啉基、噻唑基、噻二唑基、***基、四唑基、三嗪基、噻吩并[2,3-d]嘧啶基、噻吩并[3,2-d]嘧啶基、噻吩并[2,3-c]吡啶基和硫代苯基(即，噻吩基)。
本文中公开的化合物可包含一个或更多个不对称中心，并且因此产生对映体、非对映体和根据绝对立体化学定义为(R)-或(S)-的其他立体异构体形式。除非另有说明，否则其旨在本文中公开的化合物的所有立体异构体形式均被本公开内容考虑。当本文中所述的化合物包含烯烃双键时，并且除非另有说明，否则其旨在本公开内容包括E和Z几何异构体(例如顺式或反式)二者。同样，也旨在包括所有可能的异构体，以及其外消旋和光学纯形式，以及所有互变异构体形式。术语“几何异构体”是指烯烃双键的E或Z几何异构体(例如，顺式或反式)。术语“位置异构体”是指围绕中心环的结构异构体，例如围绕苯环的邻位、间位和对位异构体。
本文中使用的术语“接头”通常是指与A(例如，结合配体)和/或B(例如，治疗剂或成像剂)形成化学键的化合物的一部分。特别地，“接头”可连接分子的两个或更多个官能化部分以形成本文中提供的化合物。举例说明性地，接头可包含选自C、N、O、S、Si和P；C、N、O、S和P；或C、N、O和S的原子。接头可连接化合物(例如FAP配体和PI3K抑制剂)的不同功能能力。接头可包含数个接头基团，例如如在连续骨架中约2至约100个原子的范围内。接头可以是可释放接头。接头可以是不可释放接头。
化合物可以是单价缀合物(例如，包含一个结合配体(如本文中别处所述，例如，一个FAP结合配体)的化合物)。化合物可以是二价缀合物(例如，包含与治疗剂或成像剂(例如，通过接头)缀合的一个或更多个结合配体(如本文中别处所述，例如，一个或更多个FAP结合配体)的化合物)(如本文中别处所述))。化合物可以是多价缀合物(例如，包含与多点接头缀合的两个或更多个结合配体(如本文中别处所述，例如两个或更多个FAP结合配体)的化合物)。
结合配体(本文中也称为靶向配体或靶向部分)可以是与定位于特定细胞、组织、器官等的生物分子(例如多肽(例如酶))结合的化合物(或其基团)。结合配体可以是成纤维细胞活化蛋白(FAP)配体(或其基团)。结合配体可以是成纤维细胞活化蛋白α(FAPα)配体(或其基团)。
治疗剂(或其基团)可以是可产生期望的生理响应的任何实体。治疗剂(或其基团)可以是抗纤维化剂、抗癌剂、化学治疗剂、放射治疗剂等。治疗剂可以是有效对抗癌细胞或促纤维化细胞(例如，癌症相关成纤维细胞、肌成纤维细胞等(例如，其他肿瘤微环境因素))(例如，有效消除、破坏、降低(例如，降低癌细胞或促纤维化细胞的量)或者减轻癌细胞或促纤维化细胞的作用)的化合物(例如，或其基团)。治疗剂(或其基团)的一些实例包括但不限于光动力学治疗剂、放射治疗剂、化学治疗剂、抗纤维化剂和抗癌剂。本文中提供的治疗剂可以是磷酸肌醇-3-激酶(PI3K)抑制剂(或其基团)。治疗剂可以是抗癌剂(或其基团)。治疗剂可以是抗纤维化剂(或其基团)。治疗剂可以是选自以下的化合物(或其基团)：肿瘤生长因子(TGF)β/Smad抑制剂、Wnt/β-联蛋白抑制剂、激酶抑制剂(例如，血管内皮生长因子受体(Vascular Endothelial Growth Factor Receptor，VEGFR)的激酶抑制剂、成纤维细胞生长因子受体(Fibroblast Growth Factor Receptor，FGFR)的激酶抑制剂、血小板衍生生长因子受体(platelet-derived growth factor receptor，PDGFR)的激酶抑制剂、黏着斑激酶(focal adhesion kinase，FAK)的激酶抑制剂或Rho相关蛋白激酶(Rho-associatedprotein kinase，ROCK)的激酶抑制剂)、Toll样受体激动剂(TLR)、活化B细胞的核因子κ-轻链增强子(NF-κB)抑制剂、胶原合成抑制剂和磷酸肌醇-3-激酶(PI3K)抑制剂。治疗剂可以是磷酸肌醇-3-激酶(PI3K)抑制剂(或其基团)。
成像剂可以是发出可检测信号(例如，电磁信号(例如，无线信号、荧光信号、伽马射线)或质量)的化合物(或其基团)。成像剂的一些实例包括但不限于放射成像剂(例如，PET成像剂或SPECT成像剂)、荧光成像剂(例如，荧光染料)等。
化合物
提供了式X化合物(例如，缀合物)：
Am-L-B (X)
其中：
A是成纤维细胞活化蛋白α(FAPα)配体(靶向部分)的基团(例如，分子量低于10,000)；
L是将一个或更多个A基团与B连接的(例如双功能化)接头(例如，通过将L与A连接的第一共价键和将L与B连接的第二共价键)；
B是光学成像剂、光动力学治疗剂、放射成像剂、放射治疗剂、化学治疗剂、抗纤维化剂或抗癌剂(例如，有效抗癌细胞或癌症相关成纤维细胞、肌成纤维细胞或其他肿瘤微环境因素的抗癌剂)(例如，其基团)；并且
m是1至6。
A可以是分子量小于10,000、7,500小于5,000、小于2,500、小于1,000、小于760、小于500；约500至约10,000g/mol、约1,000至约7,500g/mol、约750g/mol至约1,500g/mol、约1000至约5,000g/mol或约500至约2,500g/mol的FAPα配体的基团。
m可以是1。m可以是2。m可以是3。m可以是4。m可以是5。m可以是6。m可以是1至3、2至4、1至5。
本公开内容还涉及式I化合物(例如，缀合物)：
A-L-B (I)
其中：
A包含FAPα配体(例如靶向部分)(例如，其基团)；
L包含将一个或更多个A基团与B连接的(例如双功能化)接头；并且
B包含光学成像剂、光动力学治疗剂、放射成像剂、放射治疗剂、化学治疗剂、抗纤维化剂或抗癌剂(例如，有效抗癌细胞或癌症相关成纤维细胞、肌成纤维细胞或其他肿瘤微环境因素的抗癌剂)(例如，其基团)。
靶向部分可与表达FAPα的活化的成纤维细胞结合，并且这样的活化的成纤维细胞涉及癌症或炎性疾病。靶向部分的分子量可低于10,000。L可包含双功能化接头。(例如，生物功能化)接头可与A和B形成化学键。L可以是将一个或更多个A基团与B连接的(例如，双功能化)接头(例如，通过将L与A连接的第一共价键和将L与B连接的第二共价键)。B可包含成像剂、放射成像剂、光动力学治疗剂、化学治疗剂、抗纤维化剂和/或放射治疗剂(例如，其基团)，其中B是有效抗癌细胞或癌症相关成纤维细胞、肌成纤维细胞或其他肿瘤微环境因素的抗癌剂。
A可具有由式I-A表示的结构：
Figure BDA0003645599830000151
其中：
Figure BDA0003645599830000152
是官能化的5至10元含N芳族或非芳族单环或双环杂环，所述杂环任选地还包含选自氧、氮和硫的1至3个杂原子；
Z是键、经取代或未经取代的亚烷基(例如-CH2-)、经取代或未经取代的氨基(例如-NH-)、-O-或-S-；
T是经取代或未经取代的亚甲基(-CH2-)、经取代或未经取代的氨基(-NH-)、-O-或-S-；
R1和R2各自独立地选自-H、-CN、-CHO、-B(OH)2、-C(O)烷基、-C(O)芳基-、-C＝C-C(O)芳基、-C＝C-S(O)2芳基、-CO2H、-SO3H、-SO2NH2、-PO3H2、-SO2F和5-四唑基；
R3和R4各自独立地选自-H、-OH、F、Cl、Br、I、-C1-6烷基、-O-C1-6烷基和-S-C1-6烷基；
R5、R6、R7和R8各自独立地选自H、烷基和卤素；并且
Figure BDA0003645599830000153
是FAPα结合配体的连接点(例如，通过接头L或成像剂/治疗剂部分B)，其中连接点可通过以下的任何碳原子：5至10元含N芳族或非芳族单环或双环杂环或者1°、2°胺或者具有官能化烷基或环烷基基序，以及其立体异构体及其可药用盐。
A可具有由式I-B表示的结构：
Figure BDA0003645599830000161
T是经取代或未经取代的亚甲基(-CH2-)、经取代或未经取代的氨基(-NH-)、-O-或-S-；
R1和R2各自独立地选自-H、-CN、-CHO、-B(OH)2、-C(O)烷基、-C(O)芳基-、-C＝C-C(O)芳基、-C＝C-S(O)2芳基、-CO2H、-SO3H、-SO2NH2、-PO3H2、-SO2F和5-四唑基；
R3和R4各自独立地选自-H、-OH、F、Cl、Br、I、-C1-6烷基、-O-C1-6烷基和-S-C1-6烷基；
R5、R6、R7和R8各自独立地选自H、烷基和卤素；并且
R9、R10和R11各自独立地选自H、-C1-6烷基、-O-C1-6烷基、-S-C1-6烷基、F、Cl、Br和I。
A可具有由式I-C表示的结构：
Figure BDA0003645599830000162
T是经取代或未经取代的亚甲基(-CH2-)、经取代或未经取代的氨基(-NH-)、-O-或-S-；
R1和R2各自独立地选自-H、-CN、-CHO、-B(OH)2、-C(O)烷基、-C(O)芳基-、-C＝C-C(O)芳基、-C＝C-S(O)2芳基、-CO2H、-SO3H、-SO2NH2、-PO3H2、-SO2F和5-四唑基；
R3和R4各自独立地选自-H、-OH、F、Cl、Br、I、-C1-6烷基、-O-C1-6烷基和-S-C1-6烷基；
R5、R6、R7和R8各自独立地选自H、烷基和卤素；并且
R9、R10和R11各自独立地选自H、-C1-6烷基、-O-C1-6烷基、-S-C1-6烷基、F、Cl、Br和I。
A可具有由下式表示的结构：
Figure BDA0003645599830000171
其中T是经取代或未经取代的亚甲基(-CH2-)、经取代或未经取代的氨基(-NH-)、-O-或-S-；
R1和R2各自独立地选自-H、-CN、-CHO、-B(OH)2、-C(O)烷基、-C(O)芳基-、-C＝C-C(O)芳基、-C＝C-S(O)2芳基、-CO2H、-SO3H、-SO2NH2、-PO3H2、-SO2F和5-四唑基；
R3和R4各自独立地选自-H、-OH、F、Cl、Br、I、-C1-6烷基、-O-C1-6烷基和-S-C1-6烷基；
R5、R6、R7和R8各自独立地选自H、烷基和卤素；并且
R9、R10和R11各自独立地选自H、-C1-6烷基、-O-C1-6烷基、-S-C1-6烷基、F、Cl、Br和I。
A可具有由式X-A表示的结构：
Figure BDA0003645599830000181
其中：
Q是芳基、杂芳基或杂环基(例如，包含芳基和非芳基环结构)(例如，5至10元含N芳族或非芳族单环或双环杂环，所述杂环任选地还包含选自O、N和S的1至3个杂原子)；
Z是键、经取代或未经取代的C1-C3亚烷基(例如-CH2-)、经取代或未经取代的杂烷基(例如，长度为1至3个原子)、氨基(例如，NH)、-O-或-S-；
T是经取代或未经取代的亚甲基(-CH2-)、经取代或未经取代的氨基(-NH-)、-O-或-S-(例如，其中T的取代是C1-C3烷基、卤代烷基或卤素)；
R1和R2各自独立地选自-H、-CN、-CHO、-B(OH)2、-C(O)烷基、-C(O)芳基-、-C＝C-C(O)芳基、-C＝C-S(O)2芳基、-CO2H、-SO3H、-SO2NH2、-PO3H2、-SO2F、-CONH2和5-四唑基；
R3和R4各自独立地选自-H、-OH、F、Cl、Br、I、-C1-6烷基、-O-C1-6烷基和-S-C1-6烷基；并且
R5、R6、R7和R8各自独立地选自H、烷基和卤素。
Q可与L(例如，L或L1)连接。Q可以是芳基、杂芳基或杂环基。杂环基可包含芳基和非芳基环结构。Q可在Q的杂烷基、烷基或芳基位置与L连接。Q可在Q的芳基位置与L连接。Q可通过(例如L的)氮原子与L连接。Q可通过(例如L的)***基或酰胺与L连接。杂芳基可包含芳基和非芳基环结构。杂芳基或杂环基可包含选自O、N和S的1至3个杂原子。杂环基可包含选自O、N和S的1至3个杂原子。Q可以是5至10元含N芳族或非芳族单环或双环杂环(例如，任选地包含芳基和非芳基环结构)。Q可以是N-连接的杂环基(例如，任选地包含芳基和非芳基环结构)。Q可以是C6-C9-N-连接的杂环基(例如，任选地包含芳基和非芳基环结构)。N-连接的杂环基通过N-杂环烷基与Z连接。Q可以是(例如，N-连接的)异吲哚啉基(例如，其中N与Z连接)。
Z可以是键、经取代或未经取代的C1-C3亚烷基、经取代或未经取代的杂亚烷基(例如，长度为1至3个原子)、氨基(例如，NH)、-O-或-S-。Z可以是键。Z可以是经取代的亚甲基。Z可以是-CH2-。Z可以是经取代的亚乙基。Z可以是被氧代取代的亚乙基。Z可以是-C(CO)CH2-。Z可以是-CH2CH2-。Z可以是C1-C3杂亚烷基。
A可具有由式X-B表示的结构：
Figure BDA0003645599830000191
其中：
Q是芳基、杂芳基或杂环基(例如，包含芳基和非芳基环结构)；(例如，5至10元含N芳族或非芳族单环或双环杂环，所述杂环任选地还包含选自O、N和S的1至3个杂原子)，
T是经取代或未经取代的亚甲基(-CH2-)、经取代或未经取代的氨基(-NH-)、-O-或-S-(例如，其中T的取代是C1-C3烷基、卤代烷基或卤素)；
J是C(RJ)2，其中每个RJ独立地是H或烷基，或两个RJ一起形成氧代；
R1和R2各自独立地选自-H、-CN、-CHO、-B(OH)2、-C(O)烷基、-C(O)芳基-、-C＝C-C(O)芳基、-C＝C-S(O)2芳基、-CO2H、-SO3H、-SO2NH2、-PO3H2、-SO2F、-CONH2和5-四唑基；
R3和R4各自独立地选自-H、-OH、F、Cl、Br、I、-C1-6烷基、-O-C1-6烷基和-S-C1-6烷基；
R5、R6、R7和R8各自独立地选自H、烷基和卤素；并且
R9、R10和R11各自独立地选自H、-C1-6烷基、-C1-6卤代烷基、-O-C1-6烷基、-S-C1-6烷基、F、Cl、Br和I。
J可与L(例如，L或L1)连接。J可通过氮原子与L连接。J可通过(例如L的)***基或酰胺与L连接。J可以是C(RJ)2，其中每个RJ独立地是H或烷基，或两个RJ一起形成氧代。J可以是C1-C3烷基。J可以是-CH2-。J可以是-CH2CH2-。J可以是C＝O。
T可以是经取代或未经取代的亚甲基(例如，-CH2-)、经取代或未经取代的氨基(例如，-NH-)、-O-或-S-。T的取代可以是C1-C3烷基、C1-C3卤代烷基或(针对亚甲基的)卤素。T可以是(-CH2-)。T的取代可以是C1-C3烷基、卤代烷基或卤素。T可以是未经取代的。
R1和R2各自独立地选自-H、-CN、-CHO、-B(OH)2、-C(O)烷基、-C(O)芳基-、-C＝C-C(O)芳基、-C＝C-S(O)2芳基、-CO2H、-SO3H、-SO2NH2、-PO3H2、-SO2F、-CONH2和5-四唑基。R1和R2可各自独立地选自H、-CN、-CHO和-B(OH)2。R1和R2可各自独立地选自H、-CN、-CHO和-CONH2。R1可以是H。R2可以是-CN、-CHO、-B(OH)2或-CONH2。R1可以是H并且R2可以是-CN、-CHO、-B(OH)2或-CONH2。R1可以是H并且R2可以是-CN。R1可以是H并且R2可以是-CHO。R1可以是H并且R2可以是-B(OH)2。R1可以是H并且R2可以是-CONH2。
R3和R4可各自独立地选自-H、-OH、F、Cl、Br、I、-C1-6烷基、-O-C1-6烷基和-S-C1-6烷基。R3和R4可各自独立地是-H或-F。R3可以是H并且R4可以是-F。R3可以是F并且R4可以是-F。
R1可以是H，R2可以是-CN，R3可以是H并且R4可以是-F。R1可以是H，R2可以是-CN，R3可以是F并且R4可以是-F。R1可以是H，R2可以是-CHO，R3可以是H并且R4可以是-F。R1可以是H，R2可以是-CHO，R3可以是F并且R4可以是-F。R1可以是H，R2可以是-B(OH)2，R3可以是H并且R4可以是-F。R1可以是H，R2可以是-B(OH)2，R3可以是F并且R4可以是-F。R1可以是H，R2可以是-CONH2，R3可以是H并且R4可以是-F。R1可以是H，R2可以是-CONH2，R3可以是F并且R4可以是-F。
R5、R6、R7和R8可各自独立地选自H、烷基和卤素。R5、R6、R7和R8各自均可以是H。
R9、R10和R11可各自独立地选自H、-C1-6烷基、-C1-6卤代烷基、-O-C1-6烷基、-S-C1-6烷基、F、Cl、Br和I。R9、R10和R11可各自独立地选自H、-C1-6卤代烷基、F和Cl。R9和R11可以是H并且R10可以是H、-C1-6卤代烷基、F或Cl。R9和R11可以是H并且R10可以是H、-CF3、F或Cl。R9和R11可以是H并且R10可以是-CF3。R9和R11可以是H并且R10可以是F。R9和R11可以是H并且R10可以是Cl。R9、R10和R11可以是H。
A可通过(例如L的)氮原子与L连接。A可通过(例如L的)***基或酰胺与L连接。
A可选自以下：
Figure BDA0003645599830000211
Figure BDA0003645599830000221
A可选自以下：
Figure BDA0003645599830000222
A(例如，FAPα结合配体)对FAP(例如，FAPα)的结合亲和力可以为约1nM至约25nM，例如1nM至约25nM或约1nM至25nM。
L可以是接头，例如任何合适的接头。L可以是不可释放接头。L可以是可释放接头。
L可包含一个或更多个接头基团，每个接头基团独立地选自(亚)烷基、(亚)杂烷基、(亚)杂环烷基、杂芳基、芳基、烷氧基、硫醚、二硫化物、羧酸、酸酐、碳酸酯、氨基甲酸酯、硫醚、糖和肽。L可包含一个或更多个接头基团，每个接头基团独立地选自聚乙二醇(PEG)、(亚)烷基、二硫化物、酰胺、羧酸、酸酐、碳酸酯、酯、氨基甲酸酯、硫醚、***、糖和肽。L可包含一个或更多个接头基团，每个接头基团独立地选自聚乙二醇(PEG)、(亚)烷基、二硫化物、酰胺、羧酸、碳酸酯、酯、苯基、***和氨基甲酸酯。L可包含一个或更多个接头基团，每个接头基团独立地选自聚乙二醇(PEG)、(亚)烷基、二硫化物、酰胺、羧酸、苯基、***、酯和碳酸酯。L可包含一个或更多个接头基团，每个接头基团独立地选自聚乙二醇(PEG)、(亚)烷基、二硫化物、酰胺、羧酸、酯和碳酸酯。L可包含一个或更多个接头基团，每个接头基团独立地选自聚乙二醇(PEG)、(亚)烷基、二硫化物和酰胺。L可包含一个或更多个接头基团，每个接头基团独立地选自(亚)烷基、二硫化物和酰胺。L可包含一个或更多个接头基团，每个接头基团独立地选自酰胺、(亚)烷基、PEG、苯基和***。L可包含一个或更多个接头基团，每个接头基团独立地选自PEG、(亚)烷基和酰胺。L可包含一个或更多个接头基团，每个接头基团独立地选自(亚)烷基和酰胺。L可包含一个或更多个接头基团，每个接头基团独立地选自PEG和酰胺。接头可包含一个或更多个***接头基团。接头可包含一个或更多个二硫化物接头基团。接头可包含一个或更多个酰胺接头基团。接头可包含一个或更多个PEG接头基团。
L可包含一个或更多个可释放基团。
L可通过酰胺接头基团与A(共价)连接。L可通过酰胺接头基团与B(共价)连接。L可通过酰胺接头基团独立地与A和B(共价)连接。
L可通过***接头基团与A(共价)连接。L可通过***接头基团与B(共价)连接。L可通过***接头基团独立地与A和B(共价)连接。
L可通过***接头基团与A(共价)连接。L可通过酰胺接头基团与B(共价)连接。L可通过***接头基团与A连接并且通过酰胺接头基团与B连接。
L可通过酰胺接头基团与A(共价)连接。L可通过氨基甲酸酯接头基团与B(共价)连接。L可通过酰胺接头基团与A连接并且通过氨基甲酸酯接头基团与B连接。
接头可以是二价接头(例如，将单个A与单个B连接)。接头可以是多价接头(例如，将两个或更多个A与单个B连接)。接头可以是可释放接头。接头可以是不可释放接头。
L可以是(L1)o-Y-(L2)p，其中：
每个L1是第一接头；
每个L2是第二接头；
Y是第三接头；
o是1至5的整数；并且
p是1至5的整数。
L1和L2可以相同。L1和L2可以不同。每个L1均可与A基团(和Y基团)连接。每个L2均可与B基团(和Y基团)连接。o和m可以相同，例如1至6、1至3或1。p可以是1。o可以是1。p和o各自均可以是1。
每个L1和L2独立地包含寡乙二醇(链)、聚乙二醇(链)、烷基(链)、寡肽(链)或多肽(链)。每个L1和L2独立地包含寡乙二醇(链)或聚乙二醇(链)。
每个L1和L2独立地包含***或酰胺。
每个L1和L2独立地包含寡肽(链)或多肽(链)。每个L1和L2独立地包含肽聚糖(链)。
每个L1和L2独立地包含寡脯氨酸或寡哌啶。
每个L1和L2的长度可独立地为15至200埃
Figure BDA0003645599830000241
o可以是1至5的整数。o可以是1至3的整数。o可以是1。
p可以是1至5的整数。p可以是1至3的整数。p可以是1。
还提供了具有式II的多价缀合物：
(A-S)mY-L-B
其中：
A是FAPα配体(靶向部分)的基团(例如，分子量低于10,000)；
S是间隔子(例如，具有多价靶向配体(例如药物)的臂到达靶细胞上的多个相邻FAP的长度)；
Y是接头；
L是将一个或更多个A基团与B连接的(例如双功能化)接头(例如，通过将L与A连接的第一共价键和将L与B连接的第二共价键)；并且
B是荧光染料、光动力学治疗剂、放射成像剂、放射治疗剂、化学治疗剂、抗纤维化剂或抗癌剂(例如，有效抗癌细胞或癌症相关成纤维细胞、肌成纤维细胞或其他肿瘤微环境因素的抗癌剂)的基团；并且
m是2至6。
间隔子可以是多价药物的臂到达靶(例如，癌或促纤维化)细胞上的多个相邻FAP的最佳长度。
S可包含寡乙烯、聚乙二醇、烷基链、寡肽或多肽。S可以是寡乙二醇或聚乙二醇。
S可以是寡肽或多肽。
S可以是肽聚糖。
间隔子可以是刚性接头。S可以是刚性接头，例如如寡脯氨酸或寡哌啶。
S的长度可以是至少15埃
Figure BDA0003645599830000251
S的长度可以是最多200埃
Figure BDA0003645599830000252
S的长度可以是15至200埃
Figure BDA0003645599830000253
Y可以是将化合物(例如缀合物)的多个臂连接的接头。Y可具有重复结构。Y可包含可释放键。L可包含二硫键。Y可包含至少一个柠檬酸基(或其基团)。Y可包含一个或更多个***。Y可包含一个或更多个胺。Y可包含一个或更多个酰胺。Y可具有芳族核(例如芳基核或杂芳基核)。Y可具有(亚)烷基核。Y可具有胺核。Y可以是N(L1)3(例如，其中L1可以是如本文中别处所述)。Y可以是被三个L1(例如，其中L1如本文中别处所述)取代的苯基。Y可以是C(L1)4(例如，其中L1可以是如本文中别处所述)。
Y可与单个L1连接。Y可与单个L2连接。Y可与单个L1和单个L2连接。Y可通过酰胺键独立地与每个L1和L2连接。Y可与L连接。
Y可以是将化合物(例如缀合物)的多个臂连接的接头(例如，多价接头)。Y可具有重复结构。Y可包含至少一个柠檬酸基(或其基团)。接头可具有以下结构：
Figure BDA0003645599830000261
Y可以是将化合物(例如缀合物)的多个臂连接的接头(例如，多价接头)并且可包含以下结构的接头(例如，重复单元)：
Figure BDA0003645599830000262
Y可以是将化合物(例如缀合物)的多个臂连接的接头，其可具有基于柠檬酸的接头。Y可以是将化合物(例如缀合物)的多个臂连接的接头(例如，多价模板)并且可具有以下结构的(例如，基于柠檬酸的)接头：
Figure BDA0003645599830000271
Y可以是将化合物(例如缀合物)的多个臂连接的接头(例如，多价接头)并且可具有以下结构的(例如，基于柠檬酸的)接头：
Figure BDA0003645599830000272
Y可以是将化合物(例如缀合物)的多个臂连接的接头(例如，多价接头)并且可具有以下结构的(例如，基于柠檬酸的)接头：
Figure BDA0003645599830000273
L可包含至少一个接头基团，每个接头基团选自聚乙二醇(PEG)、烷基、糖和肽。接头可以是基于聚乙二醇(PEG)(例如，聚乙二醇化的)、基于烷基、基于糖和基于肽的双重接头。
L可以是(例如，与B和A二价(例如，共价)连接的)不可释放接头。L可以是(例如，与B和A二价(例如，共价)连接的)可释放接头。
L、L1、L2或其任意组合可包含具有以下结构的一个或更多个接头基团：
Figure BDA0003645599830000281
其中n是0至10。
L可包含具有以下结构的一个或更多个接头基团：
Figure BDA0003645599830000282
其中n是0至10。
L可包含具有以下结构的一个或更多个接头基团：
Figure BDA0003645599830000283
其中n是0至10。
L可包含具有以下结构的一个或更多个接头基团：
Figure BDA0003645599830000291
其中n是1至32。
L可包含具有以下结构的一个或更多个接头基团：
Figure BDA0003645599830000292
其中n是1至32。
L可包含具有以下结构的一个或更多个接头基团：
Figure BDA0003645599830000293
其中：
R12和R13可各自独立地为H或C1-C6烷基；并且
z是1至8的整数。
L可包含具有以下结构的一个或更多个接头基团：
Figure BDA0003645599830000301
其中：
R12和R13可各自独立地为H或C1-C6烷基；并且
z是1至8的整数。
L、L1、L2或其任意组合可包含具有以下结构的一个或更多个接头基团：
Figure BDA0003645599830000302
L可包含具有以下结构的一个或更多个接头基团：
Figure BDA0003645599830000303
L可包含具有以下结构的一个或更多个接头基团：
Figure BDA0003645599830000304
其中：
R16是H或C1-C6烷基；并且
R14a、R14b和R15a、R15b可各自独立地为H或C1-C6烷基。
L可具有以下结构：
Figure BDA0003645599830000311
L可包含具有以下结构的一个或更多个接头基团：
Figure BDA0003645599830000312
其中n是0至15。
B可通过(例如，L的)碳原子或氮原子与L连接。B可通过***基与L连接。B可通过氧代(例如酯)与L连接。B可通过(例如，L的)酰胺与L连接。
B可以是光学染料(或其基团)。B可以是荧光染料(或其基团)(例如，可用于荧光引导手术(fluorescence guided surgery，FGS))。荧光染料可包含荧光染料基团，每个荧光染料基团选自碳菁、吲哚碳菁、氧杂碳菁、硫碳菁、部花青(merocyanine)、聚甲炔、香豆素、罗丹明、呫吨、荧光素等。荧光染料(或其基团)可以是硼二吡咯甲烷(BODIPY)、CyS、CyS.S、Cy7、VivoTag-680、VivoTag-S680、VivoTag-S7S0、AlexaFluor660、AlexaFluor680、AlexaFluor700、AlexaFluor7S0、10AlexaFluor790、Dy677、Dy676、Dy682、Dy7S2、Dy780、DyLightS47、Dylight647、HiLyte Fluor 647、HiLyte Fluor 680、HiLyte Fluor 7S0、IRDye 800CW、IRDye 800RS、IRDye 700DX、ADS780WS、ADS830WS、ADS832WS、S0456等。
有效载荷的激发可以是600纳米(nm)至1000nm。有效载荷的发射可以是700nm至1800nm。
B可以是具有以下结构的荧光染料基团(或其基团)：
Figure BDA0003645599830000321
Figure BDA0003645599830000331
化合物可以是与包含一个或更多个接头基团的接头连接的FAP靶向配体(或其基团)，每个接头基团选自烷基、聚乙二醇化和肽聚糖，其中接头还可与本文中所述的荧光染料连接。
A-L-B可具有以下结构：
Figure BDA0003645599830000341
其中：
n是1至5的整数；并且
B是：
Figure BDA0003645599830000351
A-L-B可具有以下结构：
Figure BDA0003645599830000361
Figure BDA0003645599830000371
其中：
n是1至5的整数；并且
B是：
Figure BDA0003645599830000372
化合物(例如缀合物)可具有以下结构：
表1：
Figure BDA0003645599830000381
Figure BDA0003645599830000391
Figure BDA0003645599830000401
Figure BDA0003645599830000411
以下是举例说明用于产生未经标记的(竞争)FAP配体的方法的方案，例如在本文中的实例和图中使用的：
Figure BDA0003645599830000421
某些治疗剂(例如，化学治疗剂或放射治疗剂)的缺点是这样的药剂不能在靶位置(例如，在癌症、肿瘤、或纤维化组织)达到和/或维持药剂的治疗有效浓度而仍不产生不期望的、毒性和/或致死性(例如，全身性)作用。这样的药剂(例如，可以是途径特异性的，但不是靶组织特异性的)的一般全身或甚至局部施用，在一些情况下导致治疗剂的脱靶倾向(liability)，从而增加副作用。在一些情况下，将有效载荷(例如，治疗剂)定位到靶位点(例如，肿瘤或纤维化组织)的化合物(例如如包含靶向配体的化合物)可改善有效载荷在靶位点的停留时间。在一些情况下，增加治疗性有效载荷在靶位置的停留时间有助于使治疗剂的浓度提高和/或有效，即使在低剂量或可耐受剂量下也是如此。在一些情况下，活性有效载荷的有效浓度在靶位置维持足以达到治疗浓度(例如，在可耐受剂量和/或在如果类似施用的游离有效载荷不足以达到治疗浓度的剂量)的时间和/或足以降低给药频率的(例如，相对于施用游离有效载荷所需的)时间。此外，在一些情况下，增加治疗性有效载荷在靶位置的停留时间意味着可降低脱靶效应(例如，因为活性剂维持在靶位置)。在一些情况下，化合物有助于活性剂或有效载荷的施用，并且例如(例如，相对于另外的类似游离活性剂或有效载荷的施用)降低给药频率、降低副作用或其组合。
本文中提供的靶向配体是根据图1中示出的逆合成方案来合成的。图1的逆合成方案用于合成图2中示出的化合物。然而，任何合适的合成方案或过程均可用于产生化合物。例如，实施例中示出了某些合成方案。对于任何过程、步骤或化合物(例如，方案的终产物、方案的中间体和/或方案的试剂)，所有这样的合成方案均并入本文中的具体实施方式中。
化合物靶向(例如，定位于)表达FAP(例如，FAP5)的细胞。化合物与由细胞(例如癌细胞或促纤维化细胞)表达(例如，并嵌入细胞的细胞膜内)的FAP(例如FAP5)结合。例如，如由图3、图4、图5和图6中的灰色阴影所示，化合物1(以不同浓度，例如，以50nM、25nM、12.5nM和6.5nM(图3))定位于表达FAP5的细胞(例如，HT1080-FAP细胞)。另外，化合物1使配体定位并内化至FAP5表达细胞的膜(例如，FAP5所在的位置)，保持定位并内化(例如，当以12.5nM的浓度施用时)至细胞至少1小时(例如，1小时、8小时、24小时或更长)(例如，图4)。
图3示出了靶向配体(例如，以50nM(A)、25nM(B)、12.5nM(C)和6.25nM(D))对(FAPHT1080)细胞的结合，持续1小时。递增浓度的靶向配体显示出更多的表面结合。图4示出了靶向配体(例如，以12.5nM)对FAP HT1080细胞的结合，持续1小时(A)、8小时(B)、24小时(C)和48小时(D)。在早期时间点，在细胞表面上观察到了化合物(靶向配体)，并且化合物随时间被内化到细胞中。图5示出了在至少100倍过量的竞争配体(例如，A：25nM靶向配体，2.5μM竞争物；B：25nM靶向配体，5μM竞争物)下，靶向配体对FAP HT1080细胞的结合，持续1小时。图6示出了靶向配体对非FAP HT1080细胞的结合(例如，以100nM(A)和200nM(B))。在相当的时间点，在1小时之后在这样的细胞的表面上观察到极少的化合物(靶向配体)(与图3至5相比，图3至5示出了在类似时间之后化合物在具有高FAP表面浓度的细胞上的良好的表面结合，即使在低得多的浓度下也是如此)。
化合物可对FAP(例如，FAP5)表达细胞具有强(例如，结合)亲和力。在一些情况下，这种强结合亲和力允许化合物定位于FAP(例如，FAP5)表达细胞延长的时间段(例如，足以测量来自定位于目的组织(例如，肿瘤或纤维化组织)的化合物的信号或者递送有效载荷(例如，治疗剂)的时间段)。化合物对FAP(例如，FAP5)表达细胞的结合亲和力可以为0.01nM至1μM。例如，化合物1在表达FAP5的细胞中的Kd为5nM至15nM(图7)。此外，如图8所示，化合物1未与不表达FAP5的HT1080细胞结合并且化合物1在存在未经标记的FAP5配体的情况下(例如，化合物8)未与表达FAP5的HT1080细胞结合。
图7示出了靶向配体对HT1080-FAP细胞的结合曲线。图8示出了靶向配体对HT1080-FAP细胞(仅靶向配体(圆形)以及靶向配体和竞争物(正方形))和HT1080细胞(三角形)的结合曲线。
化合物可靶向癌细胞(例如，或肿瘤)。本文中提供的化合物可以以最小的脱靶效应靶向肿瘤。化合物可迅速积累并且可长时间在肿瘤中维持其浓度。如所示，配体在靶位置(肿瘤)中表现出良好的积累，而在脱靶位置表现出有限的积累。如另外所示，在非肿瘤器官中化合物(FAP配体缀合物)几乎无积累或无积累。特别地，如所示，在一些情况下，高浓度的化合物可在靶位置(例如，肿瘤)长时间(例如，长至5天或更长时间)实现，而在任何时候在心脏、肝、肺、脾、胃或肠中几乎无积累或无积累。在肾中在短时间内有一些积累，但大部分在15小时期间清除(例如，与在靶位置持续数天的高浓度相比)。在某些情况下，这意味着在无靶向配体的情况下需要每天施用一次或两次以维持治疗浓度和/或提供治疗作用(如果这样的结果甚至可在无不可耐受的副作用和/或死亡的情况下获得)的某些治疗，可以以本文中提供的形式以低得多的频率(例如，每周一次或两次)施用。此外，如所注意的，本文中提供的化合物几乎无脱靶积累，这表明以有效量给药这样的化合物的耐受性。在一些情况下，化合物在对象的肾中积累。在一些情况下，化合物的积累(例如，在肾中)为最多6小时。在一些情况下，化合物在24小时期间(例如，在24小时期间、在15小时期间等)从器官(例如，肾)中显著清除。在一些情况下，化合物保持定位至肿瘤至少1天(例如，1天或更多、2天或更多、3天或更多、4天或更多、5天或更多等)。
例如，图9A至图20C示出了化合物(例如，化合物8)定位至肿瘤(例如，在MDA-MB-231异种移植小鼠(例如，图9A至10和图17A至17D)、KB异种移植小鼠(例如，图11A至13D和图16A至16D)、FADu异种移植小鼠(例如，图14A至14D)、HT29异种移植小鼠(例如，图15A至15D)、U87MG肿瘤异种移植小鼠(例如，图18A至18D)、PANC1异种移植小鼠(例如，图19A至19D)和4T1肿瘤异种移植小鼠(例如，图20A至20C)中表达FAP5的肿瘤)。该数据显示本文中提供的化合物(仅)定位于肿瘤(例如，在数种肿瘤类型中)至少1天、2天、3天、4天、5天或更长时间。此外，虽然化合物(例如，化合物8)在肾中显示出一些堆积(例如，通常在2小时开始)，但肾中的峰值堆积在6小时，此后迅速降低和清除。例如，肾暴露的显著降低仅在15小时之后实现，并且在24小时期间几乎完全清除。相比之下，化合物被迅速吸收(例如，在2小时期间)并在肿瘤中维持比其存在于肾中长得多的时间(例如，多于1天、2天、3天、4天、5天等)。总之，这些体内数据显示本文中提供的缀合物靶向肾，允许递送有效载荷(例如，成像剂或化学治疗剂)持续长时间(例如，数天)。
图9A和图9B示出了本文中提供的靶向配体(例如，以10nmol的剂量)在MDA-MB-231异种移植小鼠(肿瘤尺寸为400mm3)上持续2小时至122小时的体内成像。在122小时之后在肿瘤、心脏、肝、肺、脾、肾、肠和胃中的生物分布在图9C中示出。图像中的黑色或白色椭圆形或圆形突出显示了靶向配体的存在位置。椭圆形或圆形内较深的阴影表示与椭圆形或圆形内较浅的阴影相比靶向配体的浓度更高。更一般地，图9A和图9B示出了显示靶向配体在施用于患有有富含FAP环境的肿瘤的哺乳动物2小时至122小时之后的体内肿瘤特异性靶向的成像结果。图9C示出了靶向配体在施用于患有有富含FAP环境的肿瘤的哺乳动物之后，在122小时之后在肿瘤、心脏、肝、肺、脾、肾、肠和胃中的生物分布。如可看出的，当一般地观察哺乳动物或特别地观察哺乳动物的器官时，(i)数天并且(ii)在别处几乎未发现至未发现化合物的情况下，具有良好的肿瘤靶向性。
图10示出了在有和无未经标记的竞争物的两种情况下本文中提供的靶向配体在MDA-MB-231异种移植小鼠上持续2小时至6小时的体内成像。在无竞争物的研究中，将10nmol的经标记的配体施用于小鼠。在有竞争物的研究中，将10nmol的经标记的配体和1,000nmol的未经标记的配体施用于小鼠。对于每个时间点，最左侧的小鼠表示仅用靶向配体处理的小鼠，而最右侧的小鼠表示用靶向配体和未经标记的竞争物处理的小鼠。图像中的黑色椭圆形或圆形突出显示了靶向配体的存在位置。椭圆形或圆形内较深的阴影表示与椭圆形或圆形内较浅的阴影相比靶向配体的浓度更高。如可看出的，在无FAP竞争物的情况下，在2和6小时之后实现了对肿瘤位置的良好靶向。相比之下，FAP竞争物的存在限制了化合物的肿瘤靶向，这表明化合物靶向FAP的能力在一些情况下对于化合物能够靶向所期望位置是重要的。此外，在一些情况下，这样的信息表明非富含FAP的位置预计未实现靶向化合物的不成比例或不期望的积累。
图11A和图11B示出了本文中提供的靶向配体(例如，以5nmol的剂量)在KB异种移植小鼠(肿瘤尺寸为600mm3)上持续2小时至122小时的体内成像。在122小时时在肿瘤、心脏、肝、肺、脾、肾、肠和胃中的生物分布在图11C中示出。图像中的黑色椭圆形或圆形突出显示了靶向配体的存在位置。椭圆形或圆形内较深的阴影表示与椭圆形或圆形内较浅的阴影相比靶向配体的浓度更高。在肿瘤位置观察到活性剂的高浓度持续5天或更长时间。相比之下，其他器官明显不含FAP靶向化合物。此外，这些数据表明了在不同***，包括图9的MDA-MB-231异种移植小鼠和图11的KB异种移植小鼠中的类似作用。
图12示出了在有和无未经标记的竞争物的两种情况下本文中提供的靶向配体在KB异种移植小鼠上持续2小时至6小时的体内成像。在无竞争物的研究中，将10nmol的经标记的配体施用于小鼠。在有竞争物的研究中，将10nmol的经标记的配体和1,000nmol的未经标记的配体施用于小鼠。对于每个时间点，最左侧的小鼠表示仅用靶向配体处理的小鼠，而最右侧的小鼠表示用靶向配体和未经标记的竞争物处理的小鼠。图像中的黑色椭圆形或圆形突出显示了靶向配体的存在位置。椭圆形或圆形内较深的阴影表示与椭圆形或圆形内较浅的阴影相比靶向配体的浓度更高。如可看出的，在无FAP竞争物的情况下，在2和6小时之后实现了对肿瘤位置的良好靶向。相比之下，FAP竞争物的存在限制了化合物的肿瘤靶向，这表明化合物靶向FAP的能力在一些情况下对于本文中提供的化合物能够靶向所期望位置是重要的。此外，在一些情况下，这样的信息表明非富含FAP的位置预计未实现靶向化合物的不成比例或不期望的积累。此外，这些数据表明了在不同***，包括图10的MDA-MB-231异种移植小鼠和图12的KB异种移植小鼠中的类似作用。
图13示出了(以10nmol剂量在尾静脉中注射的)靶向配体在2小时、4小时、6小时、6小时(肾覆盖(KC))、15小时、24小时和122小时时在肿瘤、心脏、肝、肺、脾、肾、肠和胃中的生物分布(在荷KB瘤小鼠中)。图像中的黑色或白色箭头、椭圆形或圆形突出显示了靶向配体的存在位置。与箭头相邻或在椭圆形或圆形内的较深的阴影表示与较浅的阴影相比靶向配体的浓度更高。
图14A示出了靶向配体(例如，以5nmol的剂量)在FADu异种移植小鼠(例如，M1、M2和M3)上在注射之后6小时的体内成像(全身分布)。在6小时之后在肿瘤、心脏、肝、肺、脾、肾、肠、肌和胃中的生物分布在图14B中示出。图14C示出了在FADu异种移植小鼠(例如，M1、M2和M3)上在注射之后6小时，在靶向配体(例如，以5nmol的剂量)与未经标记的竞争物500nmol之间的竞争实验的体内成像(全身分布)。在6小时之后在肿瘤、心脏、肝、肺、脾、肾、肠、肌和胃中的生物分布在图14D中示出。图像中的黑色或白色箭头、椭圆形或圆形突出显示了靶向配体的存在位置。与箭头相邻或在椭圆形或圆形内的较深的阴影表示与较浅的阴影相比靶向配体的浓度更高。如图14A和图14B中可看出的，FAP靶向化合物以几乎无脱靶积累来靶向肿瘤。图14C和图14D表明在存在FAP靶向竞争物的情况下，FAP靶向化合物在肿瘤处的积累较少(例如，由于对FAP的竞争)，并且图14D表明当存在对FAP的竞争时，有更多的脱靶效应(例如，在胃和肾中)。
此外，如图13和图14B中可看出的，在肿瘤位置看到了高浓度的活性剂持续5天或更长时间。相比之下，其他器官明显不含FAP靶向化合物。肾中显示出一些活性剂的积累，但这样的积累显示在约6小时达到峰值，并且在15小时期间观察到肾中的浓度显著降低，并且在24小时期间几乎完全清除。在一些情况下，使用靶向配体来递送活性有效载荷有助于在良好(例如，几乎无或无)脱靶效应或副作用的情况下将有效载荷良好地递送至靶位置。此外，在一些情况下，用单次施用在靶位置维持递送数天的能力有助于降低治疗施用频率、提高患者依从性(例如，通过降低施用频率的要求)、减少副作用(例如，降低施用频率还降低了脱靶/副作用)和/或其他益处。
图15A示出了靶向配体(5nmol)在HT29异种移植小鼠(例如，M1、M2和M3)上在注射之后6小时的体内成像(全身分布)。在6小时之后在肿瘤、心脏、肝、肺、脾、肾、肠、肌和胃中的生物分布在图15B中示出。图15C示出了在HT29异种移植小鼠(例如，M1、M2和M3)上在注射之后6小时，在靶向配体(5nmol)与未经标记的竞争物(500nmol)之间的竞争实验的体内成像(全身分布)。在6小时之后在肿瘤、心脏、肝、肺、脾、肾、肠、肌和胃中的生物分布在图15D中示出。图像中的黑色或白色箭头、椭圆形或圆形突出显示了靶向配体的存在位置。与箭头相邻或在椭圆形或圆形内的较深的阴影表示与较浅的阴影相比靶向配体的浓度更高。图16A示出了靶向配体(5nmol)在KB肿瘤异种移植小鼠(例如，M1、M2和M3)上在注射之后6小时的体内成像(全身分布)。在6小时之后在肿瘤、心脏、肝、肺、脾、肾、肠、肌和胃中的生物分布在图16B中示出。图16C示出了在KB肿瘤异种移植小鼠(例如，M1、M2和M3)上在注射之后6小时，在靶向配体(5nmol)与未经标记的竞争物(500nmol)之间的竞争实验的体内成像(全身分布)。在6小时之后在肿瘤、心脏、肝、肺、脾、肾、肠、肌和胃中的生物分布在图16D中示出。图像中的黑色或白色箭头、椭圆形或圆形突出显示了靶向配体的存在位置。与箭头相邻或在椭圆形或圆形内的较深的阴影表示与较浅的阴影相比靶向配体的浓度更高。图17A示出了本文中提供的靶向配体(例如，以5nmol的浓度)在MDA-MB-231肿瘤异种移植小鼠(例如，M1、M2和M3)上在注射之后6小时的体内成像(全身分布)。在6小时之后在(例如，M1、M1肾覆盖(KC)、M2和M3的)肿瘤、心脏、肝、肺、脾、肾、肠、肌和胃中的生物分布在图17B中示出。图17C示出了在MDA-MB-231肿瘤小鼠(例如，M1、M2和M3)上在注射之后6小时，在靶向配体(例如，以5nmol的浓度)与未经标记的竞争物(500nmol)之间的竞争实验的体内成像(全身分布)。在6小时之后在肿瘤、心脏、肝、肺、脾、肾、肠、肌和胃中的生物分布在图17D中示出。图像中的黑色或白色箭头、椭圆形或圆形突出显示了靶向配体的存在位置。与箭头相邻或在椭圆形或圆形内的较深的阴影表示与较浅的阴影相比靶向配体的浓度更高。图18A示出了靶向配体(5nmol)在U87MG肿瘤异种移植小鼠(例如，M1、M2和M3)上在注射之后6小时的体内成像(全身分布)。在6小时之后在(例如，M1、M1肾覆盖(KC)、M2、M3 KC和M3的)肿瘤、心脏、肝、肺、脾、肾、肠、肌和胃中的生物分布在图18B中示出。图18C示出了在U87MG肿瘤小鼠(例如，M1、M2和M3)上在注射之后6小时，在靶向配体(5nmol)与未经标记的竞争物(500nmol)之间的竞争实验的体内成像(全身分布)。在6小时之后在肿瘤、心脏、肝、肺、脾、肾、肠、肌和胃中的生物分布在图18D中示出。图像中的黑色或白色箭头、椭圆形或圆形突出显示了靶向配体的存在位置。与箭头相邻或在椭圆形或圆形内的较深的阴影表示与较浅的阴影相比靶向配体的浓度更高。图19A示出了本文中提供的靶向配体(例如，以5nmol的剂量)在PANC1肿瘤异种移植小鼠(例如，M1、M2和M3)上在注射之后6小时的体内成像(全身分布)。在6小时之后在(例如，M1、M1肾覆盖(KC)、M2 KC、M2、M3 KC和M3的)肿瘤、心脏、肝、肺、脾、肾、肠、肌和胃中的生物分布在图18B中示出。图18C示出了在PANC1肿瘤小鼠(例如，M1、M2和M3)上在注射之后6小时，在靶向配体(例如，以5nmol的剂量)与未经标记的竞争物(500nmol)之间的竞争实验的体内成像(全身分布)。在6小时之后在肿瘤、心脏、肝、肺、脾、肾、肠、肌和胃中的生物分布在图18D中示出。图像中的黑色或白色箭头、椭圆形或圆形突出显示了靶向配体的存在位置。与箭头相邻或在椭圆形或圆形内的较深的阴影表示与较浅的阴影相比靶向配体的浓度更高。图20A示出了在4T1肿瘤异种移植小鼠上在注射之后2小时，在仅靶向配体(例如，以5nmol的剂量)相较于靶向配体和未经标记的竞争物的体内成像(全身分布)。图20B示出了在4T1肿瘤异种移植小鼠上在注射之后6小时，在仅靶向配体(例如，以5Nmol的剂量)相较于靶向配体和未经标记的竞争物的体内成像(全身分布)。在6小时之后在肿瘤、心脏、肝、肺、脾、肾、肠、肌和胃(例如，靶向的、靶向的肾覆盖(KC)和竞争)中的生物分布在图20C中示出。图像中的黑色或白色箭头、椭圆形或圆形突出显示了靶向配体的存在位置。与箭头相邻或在椭圆形或圆形内的较深的阴影表示与较浅的阴影相比靶向配体的浓度更高。这些结果与其他图中呈现的结果一致，进一步表明多种肿瘤类型和/或模型的结果的一致性。
另外，图21至22示出了(以非常高的亲和力(例如1nM至10nM))靶向表达FAP(例如FAP5)的细胞的数种化合物(例如，化合物21、化合物1、化合物5和化合物6)。
此外，结合图9A至22，示出了化合物定位于靶位点，图23和图24示出了化合物(例如，化合物11)对FAP(例如，FAP5)表达细胞具有效力(例如，降低纤维化响应)。例如，化合物(例如，化合物11)在降低病理生物学响应(例如，降低经TGF-β刺激的人肺成纤维细胞中Akt的磷酸化(图23)和降低经TGF-β-刺激的人肺成纤维细胞中胶原蛋白1A1mRNA的相对表达(图24))方面具有与单独的PI3Ki相当的效力。因此，虽然单独的有效载荷(例如PI3Ki)有效地降低了病原性生物学响应，但本文中提供的化合物有效地降低了病原性生物学响应并增加了在靶位点(例如，肿瘤或纤维化组织)的停留时间，最终提高了有效载荷在靶位点的有效浓度(例如，降低副作用、减少剂量等)。
B可以是成像剂。B可以是放射成像剂。B可以是光动力学治疗剂。B可以是化学治疗剂。B可以是抗纤维化剂。B可以是放射治疗剂。B可以是抗癌剂。B可以是有效抗癌细胞或癌症相关成纤维细胞、肌成纤维细胞或其他肿瘤微环境因素的抗癌剂。
B可包含放射成像核素。放射成像核素可以是任何合适的放射成像核素。放射成像核素可选自99mTc、111In、18F、68Ga、124I、125I和131I。
B可包含放射治疗核素。放射治疗核素可选自177Lu、90Y和211At。
B可以是螯合剂，并且在放射治疗核素的情况下，B可螯合核素。
B可包含放射性标记的辅基(或其基团)。放射性标记的辅基可包含选自18F、124I、125I、131I和211At的放射性同位素。
A-L-具有以下结构：
Figure BDA0003645599830000501
Figure BDA0003645599830000511
其中n是1至5的整数。
B(例如，放射性标记的辅基(或其基团))具有以下结构：
Figure BDA0003645599830000512
其中：
每个X独立地是选自18F、124I、125I、131I和211At的放射性同位素；
每个R或R1独立地为H、烷基、经取代的烷基、环烷基、经取代的环烷基、杂环烷基、芳基、经取代的芳基、杂芳基或经取代的杂芳基；并且
每个n独立地是选自0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19和20的整数。
代表性的放射性标记的辅基(例如，B)包括但不限于：
Figure BDA0003645599830000521
B可以是螯合基团(例如，螯合剂(或其基团))。代表性螯合基团包括但不限于以下(包括其游离碱，例如其中一种或更多种CO2H(COOH)的质子(H+)被除去以形成COO-)：
Figure BDA0003645599830000531
Figure BDA0003645599830000541
B可以是抗纤维化剂或其基团。
B可以是PI-3激酶抑制剂或其基团。
B可以是转化生长因子β(TGFβ)/Smad抑制剂或其基团。
B可以是Wingless相关整合位点(Wnt)/β-联蛋白抑制剂或其基团。B可以是血管内皮生长因子受体(VEGFR1、VEGFR2、VEGFR3)、成纤维细胞生长因子受体(FGFR1或FGFR2)或血小板来源生长因子受体(PDGFR)的激酶抑制剂，或其基团。
B可以是黏着斑激酶(FAK)或Rho相关蛋白激酶(ROCK)的激酶抑制剂，或其基团。
B可以是toll样受体(TLR)激动剂，或其基团。
B可以是NF-κB(活化B细胞的核因子κ-轻链增强子)的抑制剂，或其基团。
B可以是胶原蛋白合成的抑制剂，或其基团。
B通过羟基与L连接。
PI-3激酶抑制剂(或其基团)(例如，包含PI-3激酶抑制剂(或其基团)的化合物或缀合物)可具有式III的结构：
Figure BDA0003645599830000551
其中：
X选自：
Figure BDA0003645599830000552
X可以是B的基团(例如，其中基团在杂原子(例如，X的S、N或O))上。B可通过X(例如X的羟基)与L连接。
化合物(例如，缀合物)可具有以下结构：
表2
Figure BDA0003645599830000553
Figure BDA0003645599830000561
其中：
X选自：
Figure BDA0003645599830000562
PI-3激酶抑制剂(或其基团)(例如，包含PI-3激酶抑制剂(或其基团)的化合物或缀合物)可具有以下结构：
Figure BDA0003645599830000563
化合物(例如，缀合物)可具有以下结构：
表3
Figure BDA0003645599830000571
Figure BDA0003645599830000581
化合物(例如，缀合物)可具有以下结构：
表4
Figure BDA0003645599830000591
化合物(例如，缀合物)可具有以下结构：
Figure BDA0003645599830000592
化合物(例如，缀合物)可具有以下结构：
Figure BDA0003645599830000601
治疗方法
还提供了用于治疗炎性疾病或病症的方法。该方法用于通过调节活化的成纤维细胞的活性来治疗炎性疾病或病症。该方法可包括施用本文中提供的任何式(例如，式(I)、式(I-A)、式(I-B)、式(I-C)、式(II)、式(III)、式(X)、式(X-A)、式(X-B)、表2、表3或表4)的化合物(例如，缀合物)。
提供了用于治疗癌症的方法。治疗癌症的方法可以是通过调节活化的成纤维细胞的活性。该方法可包括本文中提供的任何式(例如，式(I)、式(I-A)、式(I-B)、式(I-C)、式(II)、式(III)、式(X)、式(X-A)、式(X-B)、表2、表3或表4)的化合物(例如，缀合物)。该方法可包括使癌症激活的成纤维细胞(CAF)(例如癌症患者的CAF)与本文中提供的任何式(例如，式(I)、式(I-A)、式(I-B)、式(I-C)、式(II)、式(III)、式(X)、式(X-A)、式(X-B)、表2、表3或表4)的化合物(例如，缀合物)接触。
还提供了用于治疗纤维化的方法。治疗纤维化的方法可以是通过调节活化的成纤维细胞的活性。该方法可包括施用本文中提供的任何式(例如，式(I)、式(I-A)、式(I-B)、式(I-C)、式(II)、式(III)、式(X)、式(X-A)、式(X-B)、表2、表3或表4)的化合物(例如，缀合物)。
该方法可以是化学治疗或放射治疗。
提供了用于在患有癌症或纤维化的对象中对癌症或纤维化进行成像的方法。
还提供了用于光学成像的组合物和方法。该组合物和方法可用于荧光引导手术。该组合物和方法可用于放射成像。
上述方法包括以下步骤：向有此需要的患者提供药学有效量的缀合物A-L-B，其中A包含分子量低于10,000的成纤维细胞活化蛋白α(FAPα)靶向部分；L包含可与A和B形成化学键的双功能化接头；并且B包含光学染料(例如，荧光染料)、光动力学治疗剂、放射成像剂、放射治疗剂、化学治疗剂、抗纤维化剂或者有效抗癌细胞或癌症相关成纤维细胞、肌成纤维细胞或其他肿瘤微环境因素的抗癌剂。
药物组合物、施用途径和给药
在某些实施方案中，本公开内容涉及药物组合物，其包含化合物和可药用载体。在某些实施方案中，药物组合物包含多种化合物和可药用载体。
在某些实施方案中，药物组合物还包含至少一种另外的药物活性剂。至少一种另外的药物活性剂可以是可用于治疗缺血-再灌注损伤的药剂。
药物组合物可通过将一种或更多种化合物与可药用载体和任选的一种或更多种另外的药物活性剂组合来制备。
如上所述，“有效量”是指足以实现期望的生物学效应的任何量。结合本文中提供的教导，通过在多种活性化合物中进行选择并权衡因素，例如效力、相对生物可利用度、患者体重、不良副作用的严重程度和施用方式，可计划有效的预防性或治疗性治疗方案，其不会引起明显的不期望的毒性，但对治疗特定对象是有效的。任何特定应用的有效量可根据这样的因素例如所治疗的疾病或病症、所施用的特定化合物、对象的大小或者疾病或病症的严重程度而变化。本领域普通技术人员可凭经验确定特定化合物和/或其他治疗剂的有效量，而无需过度实验。可使用最大剂量，即根据一些医学判断的最高安全剂量。可考虑每天多个剂量以达到化合物的适当的全身水平。适当的全身水平可例如通过测量患者的药物峰值或持续血浆水平来确定。“剂量(dose)”和“剂量(dosage)”在本文中可互换使用。
通常，对于人对象，化合物的每日经口剂量为约0.01毫克/kg/天至1,000毫克/kg/天。在每天一次或更多次施用中的0.5至50毫克/kg的经口剂量可产生治疗结果。根据施用方式，可适当调整剂量以达到局部或全身的期望的药物水平。例如，静脉内施用可从每天一个数量级到数个数量级的较低剂量变化。如果在这样的剂量下对象的响应不足，则可采用甚至更高的剂量(或通过不同的、更局部的递送途径实现的有效更高的剂量)直至患者耐受性允许的程度。考虑每天多个剂量以达到化合物的适当全身水平。
对于任何化合物，治疗有效量可最初从动物模型中确定。治疗有效剂量也可从已经在人中测试过的化合物和已知表现出类似药理学活性的化合物例如其他相关活性剂的人数据中确定。对于肠胃外施用可能需要更高的剂量。可基于所施用化合物的相对生物可利用度和效力来调整施加的剂量。基于上述方法和如本领域公知的其他方法调整剂量以达到最大效力是完全在普通技术人员的能力范围内的。
对于临床用途，任何化合物可以以等于或等同于0.2至2,000毫克(mg)化合物/千克(kg)对象体重/天的量施用。化合物可以以等于或等同于2至2,000mg化合物/kg对象体重/天的剂量施用。化合物可以以等于或等同于20至2,000mg化合物/kg对象体重/天的剂量施用。化合物可以以等于或等同于50至2,000mg化合物/kg对象体重/天的剂量施用。化合物可以以等于或等同于100至2,000mg化合物/kg对象体重/天的剂量施用。化合物可以以等于或等同于200至2,000mg化合物/kg对象体重/天的剂量施用。当待施用化合物的前体或前药时，其以等同于(即足以)递送上述量的化合物的量施用。
化合物的制剂可以以治疗有效量施用于人对象。典型的剂量范围为约0.01微克/kg体重/天至约2mg/kg体重/天。待施用的药物剂量可能取决于这样的变量，例如病症的类型和程度、特定对象的整体健康状况、施用的特定化合物、用于配制该化合物的赋形剂以及其施用途径。常规实验可用于优化任何特定化合物的剂量和给药频率。
化合物可以以约0.001微克/kg至大于约500mg/kg的浓度施用。例如，浓度可以是0.001微克/kg、0.01微克/kg、0.05微克/kg、0.1微克/kg、0.5微克/kg、1.0微克/kg、10.0微克/kg、50.0微克/kg、100.0微克/kg、500微克/kg、1.0mg/kg、5.0mg/kg、10.0mg/kg、15.0mg/kg、20.0mg/kg、25.0mg/kg、30.0mg/kg、35.0mg/kg、40.0mg/kg、45.0mg/kg、50.0mg/kg、60.0mg/kg、70.0mg/kg、80.0mg/kg、90.0mg/kg、100.0mg/kg、150.0mg/kg、200.0mg/kg、250.0mg/kg、300.0mg/kg、350.0mg/kg、400.0mg/kg、450.0mg/kg至大于约500.0mg/kg或其任何增量值。应理解，旨在涵盖这些值和范围之间的所有值和范围。
化合物可以以约0.2毫克/kg/天至大于约100mg/kg/天的剂量施用。例如，剂量可以是0.2mg/kg/天至100mg/kg/天、0.2mg/kg/天至50mg/kg/天、0.2mg/kg/天至25mg/kg/天、0.2mg/kg/天至10mg/kg/天、0.2mg/kg/天至7.5mg/kg/天、0.2mg/kg/天至5mg/kg/天、0.25mg/kg/天至100mg/kg/天、0.25mg/kg/天至50mg/kg/天、0.25mg/kg/天至25mg/kg/天、0.25mg/kg/天至10mg/kg/天、0.25mg/kg/天至7.5mg/kg/天、0.25mg/kg/天至5mg/kg/天、0.5mg/kg/天至50mg/kg/天、0.5mg/kg/天至25mg/kg/天、0.5mg/kg/天至20mg/kg/天、0.5mg/kg/天至15mg/kg/天、0.5mg/kg/天至10mg/kg/天、0.5mg/kg/天至7.5mg/kg/天、0.5mg/kg/天至5mg/kg/天、0.75mg/kg/天至50mg/kg/天、0.75mg/kg/天至25mg/kg/天、0.75mg/kg/天至20mg/kg/天、0.75mg/kg/天至15mg/kg/天、0.75mg/kg/天至10mg/kg/天、0.75mg/kg/天至7.5mg/kg/天、0.75mg/kg/天至5mg/kg/天、1.0mg/kg/天至50mg/kg/天、1.0mg/kg/天至25mg/kg/天、1.0mg/kg/天至20mg/kg/天、1.0mg/kg/天至15mg/kg/天、1.0mg/kg/天至10mg/kg/天、1.0mg/kg/天至7.5mg/kg/天、1.0mg/kg/天至5mg/kg/天、2mg/kg/天至50mg/kg/天、2mg/kg/天至25mg/kg/天、2mg/kg/天至20mg/kg/天、2mg/kg/天至15mg/kg/天、2mg/kg/天至10mg/kg/天、2mg/kg/天至7.5mg/kg/天或2mg/kg/天至5mg/kg/天。
化合物可以以约0.25毫克/kg/天至约25mg/kg/天的剂量施用。例如，剂量可以是0.25mg/kg/天、0.5mg/kg/天、0.75mg/kg/天、1.0mg/kg/天、1.25mg/kg/天、1.5mg/kg/天、1.75mg/kg/天、2.0mg/kg/天、2.25mg/kg/天、2.5mg/kg/天、2.75mg/kg/天、3.0mg/kg/天、3.25mg/kg/天、3.5mg/kg/天、3.75mg/kg/天、4.0mg/kg/天、4.25mg/kg/天、4.5mg/kg/天、4.75mg/kg/天、5mg/kg/天、5.5mg/kg/天、6.0mg/kg/天、6.5mg/kg/天、7.0mg/kg/天、7.5mg/kg/天、8.0mg/kg/天、8.5mg/kg/天、9.0mg/kg/天、9.5mg/kg/天、10mg/kg/天、11mg/kg/天、12mg/kg/天、13mg/kg/天、14mg/kg/天、15mg/kg/天、16mg/kg/天、17mg/kg/天、18mg/kg/天、19mg/kg/天、20mg/kg/天、21mg/kg/天、22mg/kg/天、23mg/kg/天、24mg/kg/天、25mg/kg/天、26mg/kg/天、27mg/kg/天、28mg/kg/天、29mg/kg/天、30mg/kg/天、31mg/kg/天、32mg/kg/天、33mg/kg/天、34mg/kg/天、35mg/kg/天、36mg/kg/天、37mg/kg/天、38mg/kg/天、39mg/kg/天、40mg/kg/天、41mg/kg/天、42mg/kg/天、43mg/kg/天、44mg/kg/天、45mg/kg/天、46mg/kg/天、47mg/kg/天、48mg/kg/天、49mg/kg/天或50mg/kg/天。
化合物或其前体可以以0.01微摩尔至大于或等于500微摩尔的浓度施用。例如，剂量可以是0.01微摩尔、0.02微摩尔、0.05微摩尔、0.1微摩尔、0.15微摩尔、0.2微摩尔、0.5微摩尔、0.7微摩尔、1.0微摩尔、3.0微摩尔、5.0微摩尔、7.0微摩尔、10.0微摩尔、15.0微摩尔、20.0微摩尔、25.0微摩尔、30.0微摩尔、35.0微摩尔、40.0微摩尔、45.0微摩尔、50.0微摩尔、60.0微摩尔、70.0微摩尔、80.0微摩尔、90.0微摩尔、100.0微摩尔、150.0微摩尔、200.0微摩尔、250.0微摩尔、300.0微摩尔、350.0微摩尔、400.0微摩尔、450.0微摩尔至大于约500.0微摩尔或其任何增量值。应理解，旨在涵盖这些值和范围之间的所有值和范围。
化合物或其前体可以以0.10微克/mL至500.0微克/mL的浓度施用。例如，浓度可以是0.10微克/mL、0.50微克/mL、1微克/mL、2.0微克/mL、5.0微克/mL、10.0微克/mL、20微克/mL、25微克/mL.、30微克/mL、35微克/mL、40微克/mL、45微克/mL、50微克/mL、60.0微克/mL、70.0微克/mL、80.0微克/mL、90.0微克/mL、100.0微克/mL、150.0微克/mL、200.0微克/mL、250.0g/mL、250.0微克/mL、300.0微克/mL、350.0微克/mL、400.0微克/mL、450.0微克/mL，至大于约500.0微克/mL或其任何增量值。应理解，旨在涵盖这些值和范围之间的所有值和范围。
制剂可在可药用溶液中施用，所述可药用溶液可常规地包含可药用浓度的盐、缓冲剂、防腐剂、相容的载体、辅料和任选的其他治疗成分。为了用于治疗，可通过将化合物递送至期望表面的任何方式将有效量的化合物施用于对象。施用药物组合物可通过本领域技术人员已知的任何方式完成。施用途径包括但不限于静脉内、肌内、腹膜内、膀胱内(膀胱)、经口、皮下、直接注射(例如，进入肿瘤或脓肿)、黏膜(例如，眼表面)、吸入和表面。
对于静脉内和其他肠胃外施用途径，可将化合物配制成冻干制剂、脂质体嵌入或包封的活性化合物的冻干制剂、水性悬浮液中的脂质复合物、或盐复合物。冻干制剂通常在施用之前不久在合适的水溶液中(例如，在无菌水或盐水中)重构。
对于经口施用，可通过将活性化合物与本领域公知的可药用载体组合来容易地配制化合物。这样的载体使得化合物能够被配制成片剂、丸剂、糖衣丸、胶囊剂、液体剂、凝胶剂、糖浆剂、浆液剂(slurry)、混悬剂等，用于被待治疗的对象经口摄取。用于经口使用的药物制剂可作为固体赋形剂获得，任选地研磨所得混合物，并且如果期望，在添加合适的助剂之后加工颗粒的混合物以获得片剂或糖衣丸芯。合适的赋形剂特别是填充剂，例如糖，包括乳糖、蔗糖、甘露糖醇或山梨糖醇；纤维素制剂，例如如玉米淀粉、小麦淀粉、稻米淀粉、马铃薯淀粉、明胶、西黄蓍胶、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素钠和/或聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。如果期望的话，可添加崩解剂，例如交联聚乙烯吡咯烷酮、琼脂、或者藻酸或其盐(例如藻酸钠)。任选地，经口制剂也可在盐水或缓冲液(例如，用于中和内部酸性条件的EDTA)中配制，或者可在没有任何载体的情况下施用。
还考虑了化合物的经口剂型。可对化合物进行化学修饰，使得衍生物的经口递送是有效的。通常来说，所考虑的化学修饰是至少一个部分与化合物本身的连接，其中所述部分允许(a)抑制酸水解；和(b)从胃或肠摄取到血流中。还期望提高化合物的整体稳定性并增加体内循环时间。这样的部分的一些实例包括：聚乙二醇、乙二醇和丙二醇的共聚物、羧甲基纤维素、右旋糖酐、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、以及聚脯氨酸。Abuchowski和Davis,“Soluble Polymer-Enzyme Adducts,”In:Enzymes as Drugs,Hocenberg和Roberts,编辑,Wiley-Interscience,New York,N.Y.,第367至383页(1981)；Newmark et al.,J ApplBiochem 4:185-189(1982)。可使用的另一些聚合物是聚-1,3-二氧杂环戊环和聚-1,3,6-三氧杂环辛烷。对于药物用途，如上表明，聚乙二醇部分是合适的。
化合物释放的位置可以是胃、小肠(十二指肠、空肠或回肠)或大肠。本领域的技术人员可获得不会在胃中溶解但会在十二指肠或肠中的其他地方释放物质的制剂。释放可通过保护化合物或通过在胃环境外(例如在肠中)释放化合物来避免胃环境的有害影响。
为了确保完全的胃抗性，在至少pH 5.0下不可渗透的包衣是必要的。用作肠溶包衣的较常见惰性成分的一些实例是乙酸纤维素偏苯三酸酯(cellulose acetatetrimellitate，CAT)、羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯(hydroxypropylmethylcellulosephthalate，HPMCP)、HPMCP 50、HPMCP55、聚乙酸乙烯酯邻苯二甲酸酯(polyvinyl acetatephthalate，PVAP)、Eudragit L30D、Aquateric、乙酸纤维素邻苯二甲酸酯(celluloseacetate phthalate，CAP)、Eudragit L、Eudragit S和虫胶(shellac)。这些包衣可用作混合膜。
也可在片剂上使用包衣或包衣混合物，其并非旨在针对胃提供保护。这可包括糖包衣或使片剂更容易吞咽的包衣。胶囊剂可由用于递送干的治疗剂(例如粉末)的硬壳(例如明胶)组成；对于液体形式，可使用软明胶壳。扁囊剂(cachet)的壳材料可以是厚的淀粉纸或其他可食用的纸。对于丸剂、锭剂、模制片剂或片剂研磨物(tablet triturate)，可使用湿法聚集(moist massing)技术。
治疗剂可作为细碎多颗粒以约1mm粒度的颗粒剂或丸粒剂(pellet)的形式包含在制剂中。用于胶囊剂施用的材料的制剂也可以是散剂、轻压塞(lightly compressed plug)或甚至是片剂。治疗剂可通过压缩来制备。
着色剂和矫味剂均可包含在内。例如，可配制化合物(例如通过脂质体或微球包封)，并随后进一步包含在可食用产品中，例如包含着色剂和矫味剂的冷藏饮料中。
可用惰性材料稀释治疗剂或提高治疗剂的体积。这些稀释剂可包括碳水化合物，尤其是甘露糖醇、a-乳糖、无水乳糖、纤维素、蔗糖、经修饰右旋糖酐和淀粉。某些无机盐也可用作填充剂，包括三磷酸钙、碳酸镁和氯化钠。一些市售稀释剂是Fast-Flo、Emdex、STA-Rx 1500、Emcompress和Avicell。
崩解剂可包含在将治疗剂配制成固体剂型的制剂中。用作崩解剂的材料包括但不限于淀粉，包括基于淀粉的商业崩解剂Explotab。羟基乙酸淀粉钠、安伯来特(Amberlite)、羧甲基纤维素钠、超支链淀粉(ultramylopectin)、藻酸钠、明胶、橘皮、酸性羧甲基纤维素、天然海绵和膨润土均可被使用。崩解剂的另一种形式是不溶性阳离子交换树脂。粉末胶(powdered gum)可用作崩解剂和黏合剂，并且这些可包括粉末胶，例如琼脂、刺梧桐胶(Karaya)或西黄蓍胶。藻酸及其钠盐也可用作崩解剂。
黏合剂可用于将治疗剂保持在一起以形成硬片剂，并且包括来自天然产物的材料，例如***胶、西黄蓍胶、淀粉和明胶。另一些包括甲基纤维素(methyl cellulose，MC)、乙基纤维素(ethyl cellulose，EC)和羧甲基纤维素(carboxymethyl cellulose，CMC)。聚乙烯吡咯烷酮(PVP)和羟丙基甲基纤维素(HPMC)二者均可在醇溶液中用于使治疗剂粒化。
抗摩擦剂(anti-frictional agent)可包含在治疗剂的制剂中，以阻止在配制过程中黏冲(sticking)。润滑剂可用作治疗剂与模壁之间的层，并且这些可包括但不限于：硬脂酸(包括其镁盐和钙盐)、聚四氟乙烯(PTFE)、液体石蜡、植物油和蜡。也可使用可溶性润滑剂，例如十二烷基硫酸钠、十二烷基硫酸镁、多种分子量的聚乙二醇、Carbowax 4000和6000。
可添加在配制期间可改善药物流动特性并在压缩期间帮助重排的助流剂。助流剂可包括淀粉、滑石、致热二氧化硅和水合硅铝酸盐。
为了帮助将治疗剂溶解到水性环境中，可添加表面活性剂作为润湿剂。表面活性剂可包括阴离子洗涤剂，例如十二烷基硫酸钠、二辛基钠磺基琥珀酸盐和二辛基钠磺酸盐。可使用的阳离子洗涤剂包括苯扎氯铵和苄索氯铵。可包含在制剂中作为表面活性剂的潜在非离子型洗涤剂包括聚桂醇400；聚氧乙烯40硬脂酸酯(polyoxyl 40stearate)；聚氧乙烯氢化蓖麻油(polyoxyethylene hydrogenated castor oil)10、50和60；单硬脂酸甘油酯；聚山梨酸酯40、60、65和80；蔗糖脂肪酸酯；甲基纤维素和羧甲基纤维素。这些表面活性剂可单独或作为混合物以不同比例存在于化合物或其衍生物的制剂中。
可经口使用的药物制剂包括由明胶制成的推入-配合胶囊剂(push-fitcapsule)，以及由明胶和增塑剂(例如甘油或山梨糖醇)制成的软密封胶囊剂。推入-配合胶囊剂可包含活性成分与填充剂(例如乳糖)、黏合剂(例如淀粉)和/或润滑剂(例如滑石或硬脂酸镁)以及任选地稳定剂的混合。在软胶囊剂中，可将活性化合物溶解或悬浮在合适的液体中，例如脂肪油、液体石蜡或液体聚乙二醇中。另外，可添加稳定剂。也可使用配制用于经口施用的微球。这样的微球在本领域中已被很好地定义。用于经口施用的所有制剂应是适合于这样的施用的剂量。
对于经颊施用，组合物可采用以常规方式配制的片剂或锭剂的形式。
对于表面施用，化合物可配制成如本领域公知的溶液剂、凝胶剂、软膏剂、乳膏剂、混悬剂等。全身性制剂包括被设计用于通过注射(例如皮下、静脉内、肌内、鞘内或腹膜内注射)施用的那些，以及被设计用于经皮、经黏膜、经口或经肺施用的那些。
对于通过吸入施用，化合物可伴有使用合适的抛射剂(例如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其他合适的气体)从加压包装或喷雾器以气雾剂喷射呈现的形式方便的递送。在加压气雾剂的情况下，剂量单位可通过提供阀门以递送计量的量来确定。用于吸入器或吹入器的胶囊和药筒(cartridge)(例如，明胶)可配制为包含化合物与合适的粉末基质(例如乳糖或淀粉)的粉末混合物。
还考虑了化合物(或其盐)的肺部递送。化合物在吸入时被递送至哺乳动物的肺，并穿过肺上皮内衬(epithelial lining)进入血流。吸入分子的其他报道包括Adjei etal.,Pharm Res 7:565-569(1990)；Adjei et al.,Int JPharmaceutics 63:135-144(1990)(乙酸亮丙瑞林)；Braquet et al.,JCardiovasc Pharmacol 13(增刊5):143-146(1989)(内皮素-1)；Hubbard et al.,Annal Int Med 3:206-212(1989)(a1-抗胰蛋白酶)；Smith et al.,1989,J Clin Invest 84:1145-1146(a-1-蛋白酶)；Oswein et al.,1990,"Aerosolization of Proteins,"Proceedings of Symposium on Respiratory DrugDelivery II,Keystone,Colorado,March,(重组人生长激素)；Debs et al.,1988,JImmunol 140:3482-3488(干扰素-γ和肿瘤坏死因子α)以及Platz et al.,U.S.Pat.No.5,284,656(粒细胞集落刺激因子；通过引用并入)。在1995年9月19日颁发给Wong et al.的美国专利No.5,451,569(特别地通过引用并入其关于其的公开内容)中描述了用于肺部递送药物以用于全身作用的方法和组合物。
考虑使用的是设计用于肺部递送治疗产品的多种机械装置，包括但不限于喷雾器、计量吸入器和粉末吸入器，所有这些对于本领域技术人员来说都是熟悉的。
还考虑了药物组合物的经鼻递送。经鼻递送允许药物组合物在将治疗产品施用给鼻之后直接进入血流，而不需要将该产品沉积在肺中。用于经鼻递送的制剂包括具有葡聚糖或环糊精的制剂。
当期望全身递送化合物时，所述化合物可配制成用于通过注射(例如通过推注或连续输注)进行肠胃外施用。用于注射的制剂可在添加防腐剂的情况下以单位剂型的形式(例如在安瓿中或在多剂量容器中)存在。组合物可采用例如在油性或水性载剂中的混悬剂、溶液剂或乳剂的形式，并且可包含配制剂，例如助悬剂、稳定剂和/或分散剂。
用于肠胃外施用的药物制剂包括水溶性形式的活性化合物的水溶液。另外，可将活性化合物的混悬剂制备为合适的油性注射混悬剂。合适的亲脂性溶剂或载剂包括脂肪油(例如芝麻油)、或合成脂肪酸酯(例如油酸乙酯或甘油三酯)、或脂质体。水性注射混悬剂可包含提高混悬剂黏度的物质，例如羧甲基纤维素钠、山梨糖醇或右旋糖酐。任选地，混悬剂还可包含合适的稳定剂或提高化合物的溶解度以允许制备高度浓缩溶液剂的试剂。
或者，活性化合物可以是粉末形式，以用于在使用之前与合适的载剂(例如无菌无热原水)构建。
化合物还可配制成直肠或***组合物，例如栓剂或保留灌肠剂(retentionenema)，例如包含常规栓剂基质，例如可可脂或其他甘油酯。
除上述制剂之外，还可将化合物配制成储存制剂(depot preparation)。这样的长效制剂可使用合适的聚合物或疏水性材料(例如作为可接受油中的乳剂)或离子交换树脂来配制，或配制为微溶性(sparingly soluble)衍生物(例如微溶性盐)。
药物组合物还可包含合适的固相或凝胶相载体或赋形剂。这样的载体或赋形剂的一些实例包括但不限于碳酸钙、磷酸钙、多种糖、淀粉、纤维素衍生物、明胶和聚合物，例如聚乙二醇。
合适的液体或固体药物制剂形式为，例如，用于吸入的水性或盐水溶液；微囊化的、包封的(encochleated)、包衣于微观金颗粒(microscopic gold particle)上的、包含在脂质体中的、雾化的(nebulized)气雾剂；用于植入到皮肤中的、或干燥至尖锐物体上以被划进皮肤中的丸粒剂。药物组合物还包括颗粒剂、散剂、片剂、包衣片剂、(微)胶囊剂、栓剂、糖浆剂、乳剂、混悬剂、乳膏剂、滴剂或具有活性化合物延长性释放的制剂，在其制剂中，习惯上使用上述赋形剂和添加剂和/或辅料，例如崩解剂、黏合剂、包衣剂、溶胀剂、润滑剂、矫味剂、甜味剂或增溶剂。药物组合物适用于多种药物递送***。对于药物递送方法的简要综述，参见Langer R,Science 249:1527-1533(1990)。
化合物和任选的一种或更多种其他治疗剂可以以本身(纯的)或以可药用盐的形式施用。当在药物中使用时，盐应是可药用的，但可方便地使用非可药用的盐以制备其可药用盐。这样的盐包括但不限于由以下酸制备的那些：盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸、马来酸、乙酸、水杨酸、对甲苯磺酸、酒石酸、柠檬酸、甲烷磺酸、甲酸、丙二酸、琥珀酸、萘-2-磺酸和苯磺酸。同样，这样的盐可制备为碱金属或碱土盐，例如羧酸基团的钠盐、钾盐或钙盐。
合适的缓冲剂包括：乙酸和盐(1％至2％w/v)；柠檬酸和盐(1％至3％w/v)；硼酸和盐(0.5％至2.5％w/v)；以及磷酸和盐(0.8％至2％w/v)。合适的防腐剂包括苯扎氯铵(0.003％至0.03％w/v)；氯丁醇(0.3％至0.9％w/v)；对羟基苯甲酸酯(0.01％至0.25％w/v)和硫柳汞(0.004％至0.02％w/v)。
药物组合物含有包含在可药用载体中的有效量的如本文中所述的化合物和任选的一种或更多种其他治疗剂。术语“可药用载体”意指适合施用于人或其他脊椎动物的一种或更多种相容性的固体或液体填充剂、稀释剂或包封物质。术语“载体”表示天然或合成的有机或无机成分，活性成分与其组合以促进应用。药物组合物的组分还可与化合物混合，以及与彼此混合，以使得不存在会显著损害期望的药物效力的相互作用的方式。
治疗剂(具体地包括但不限于化合物)可以以颗粒提供。本文中使用的“颗粒”意指可全部或部分由所述化合物或如本文中所述的其他治疗剂组成的纳米粒或微粒(或在一些情况下更大的颗粒)。颗粒可在被包衣(包括但不限于肠溶包衣)包围的核芯中包含治疗剂。治疗剂也可分散在整个颗粒中。治疗剂也可被吸附到颗粒中。颗粒可具有任何级别的释放动力学，包括零级释放、一级释放、二级释放、延迟释放、持续释放、立即释放及其任意组合等。除了治疗剂之外，颗粒还可包含药学和医学领域中常规使用的那些材料中的任一种，包括但不限于可侵蚀的、不可侵蚀的、生物可降解的或非生物可降解的材料或其组合。颗粒可以是包含为溶液或半固体状态的化合物的微胶囊。颗粒实际上可以是任何形状。
非生物可降解和生物可降解的聚合物材料二者均可用于制备用于递送治疗剂的颗粒。这样的聚合物可以是天然或合成聚合物。基于期望释放的时间段来选择聚合物。特别令人感兴趣的生物黏附聚合物包括在Sawhney et al.,Macromolecules 26:581-587(1993)中描述的可生物侵蚀的水凝胶，其教导特别地通过引用并入本文。这些包括聚透明质酸、酪蛋白、明胶、明胶蛋白、聚酐、聚丙烯酸、藻酸盐、壳聚糖、聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚(甲基丙烯酸乙酯)、聚(甲基丙烯酸丁酯)、聚(甲基丙烯酸异丁酯)、聚(甲基丙烯酸己酯)、聚(甲基丙烯酸异癸酯)、聚(甲基丙烯酸月桂酯)、聚(甲基丙烯酸苯酯)、聚(丙烯酸甲酯)、聚(丙烯酸异丙酯)、聚(丙烯酸异丁酯)和聚(丙烯酸十八酯)。
治疗剂可包含在控制释放***中。术语“控制释放”旨在指任何包含药物的制剂，其中药物从制剂中释放的方式和谱受到控制。这指的是立即释放制剂和非立即释放制剂，其中非立即释放制剂包括但不限于持续释放和延迟释放制剂。术语“持续释放”(也称为“延长释放”)以其常规意义使用，是指在延长的时间段内提供药物的逐渐释放并且可导致延长时间段内基本上恒定的药物血液水平的药物制剂。术语“延迟释放”以其常规意义使用，是指其中在制剂施用与药物从其中释放之间存在时间延迟的药物制剂。“延迟释放”可涉及或可不涉及药物在延长时间段内的逐渐释放，并因此可以是或可以不是“持续释放”。
长期持续释放植入物(implant)的使用可特别适合于治疗慢性病症。本文中使用的“长期”释放意指构建和布置植入物以递送治疗水平的活性成分持续至少7天，并且多至30至60天。长期持续释放植入物是本领域普通技术人员公知的并且包括一些上述释放***。
相关领域的普通技术人员将理解，鉴于普通技术人员已知的信息，对本文中所述的组合物和方法的其他合适的修改和改编从本文中所包含的描述中容易地显现，并且可在不脱离本公开内容或其任何实施方案的范围的情况下做出。现在已经详细描述了本公开内容，通过参考以下实施例将更清楚地理解本公开内容，所述实施例仅出于举例说明的目的而包括在本文中，并不旨在限制本公开内容。
实施例
化学实施例：
实施例1：
反式-2-((3S,5S)-5-((S)-2-氰基-4,4-二氟吡咯烷-1-羰基)-2-氧代吡咯烷-3-基)乙酸的合成：
根据方案1来合成反式-2-((3S,5S)-5-((S)-2-氰基-4,4-二氟吡咯烷-1-羰基)-2-氧代吡咯烷-3-基)乙酸。
方案1
Figure BDA0003645599830000711
步骤I：
将苄基(2S)-N-叔丁氧基羰基焦谷氨酸酯(化合物1，5克(g)，15.67毫摩尔(mmol))于氮气下搅拌的情况下溶解在四氢呋喃(THF，75毫升(mL))中并冷却至-78℃。在5分钟内逐滴添加双(三甲基甲硅烷基)氨基锂(LiHMDS)(在THF中1.0M，34.5mL，34.5mmol)并继续搅拌1小时。在5分钟内逐滴添加溴乙酸叔丁酯(4.36mL，31.34mmol)，并在-78℃下继续搅拌另外2小时。将反应混合物用饱和氯化铵水溶液(100mL)淬灭并萃取到乙酸乙酯(2×100mL)中。将有机层用水和饱和氯化钠水溶液洗涤，并随后用无水硫酸镁(MgSO4)干燥。在真空中除去溶剂以得到棕色油状物，将其通过硅胶色谱上的combi flash(用己烷/EtOAc洗脱)进行纯化，以得到化合物2a(反式-2-苄基1-(叔丁基)(2S,4S)-4-(2-(叔丁氧基)-2-氧代乙基)-5-氧代吡咯烷-1,2-二羧酸酯)和化合物2b(顺式-2-苄基1-(叔丁基)(2S,4S)-4-(2-(叔丁氧基)-2-氧代乙基)-5-氧代吡咯烷-1,2-二羧酸酯)的混合物(6.2gm，89％)，为胶状液体。
步骤II：
将化合物2a/2b(6g，13.85mmol)的混合物溶解在CH2Cl2(90mL)中并冷却至0℃。逐滴添加DBU(6.2mL，41.55mmol)并将混合物在0℃下搅拌30分钟，并随后在室温下搅拌24小时。将反应混合物用CH2Cl2(20mL)稀释并用水(100mL)洗涤。将有机层用MgSO4干燥、过滤并在真空中浓缩以得到粗产物，将其通过如步骤I中所述的柱色谱进行纯化，以得到反式-2-苄基1-(叔丁基)(2S,4S)-4-(2-(叔丁氧基)-2-氧代乙基)-5-氧代吡咯烷-1,2-二羧酸酯(化合物3，4.5g，75％)，为淡黄色液体。
步骤III：
在氮气氛下向化合物3(4g，9.23mmol)在MeOH(40mL)中的溶液添加5％Pd/C(400mg)。将混合物在室温下在氢气氛下剧烈搅拌12小时。将混合物通过硅藻土垫过滤并在真空中浓缩，以得到反式-(2S,4S)-4-(2-(叔丁氧基)-2-氧代乙基)-1-(叔丁氧羰基)-5-氧代吡咯烷-2-羧酸(化合物4，2.7g，87％)，为白色固体。
步骤IV：
向化合物4(2.5g，7.28mmol)在无水DMF(20mL)中的搅拌溶液添加HATU(3.3g，8.7mmol)、DIPEA(3.6mL，21.84mmol)并继续搅拌10min用于酸性官能团的活化。将(S)-4,4-二氟吡咯烷-2-甲酰胺盐酸盐(1.3g，8.736mmol)，随后DIPEA(1.46mL，8.73mmol)添加至上述反应混合物，并在室温下在氮气氛下继续搅拌5小时。将反应混合物用水(30mL)、盐水(30mL)稀释，并萃取到乙酸乙酯(2×50mL)中。将合并的有机萃取物用无水硫酸钠干燥，过滤并将滤液在减压下蒸发，并且将获得的粗剩余物通过combi flash使用DCM/MeOH作为流动相进行纯化，以提供反式叔丁基(3S,5S)-3-(2-(叔丁氧基)-2-氧代乙基)-5-((S)-2-氨基甲酰基-4,4-二氟吡咯烷-1-羰基)-2-氧代吡咯烷-1-羧酸酯(5，2.4g，88％)，为胶状固体。
步骤V：
在氮气下向冷却至-20℃的化合物5(2g，4.21mmol)和咪唑(333毫克(mg)，4.73mmol)在吡啶(13mL)中的混合物添加磷酰氯(POCl3)(1.02mL，10.94mmol)。在-20℃下搅拌30分钟至1小时之后，将混合物在真空中蒸发至干。将所得棕色固体溶解在CH2Cl2(40mL)中并用1.0N柠檬酸水溶液(40mL)洗涤。将有机相用硫酸镁干燥，过滤，并在减压下浓缩，以得到为黏性油状物的粗物质。将粗物质通过combi flash(用己烷/EtOAc洗脱)进行纯化，以得到反式-叔丁基(3S,5S)-3-(2-(叔丁氧基)-2-氧代乙基)-5-((S)-2-氰基-4,4-二氟吡咯烷-1-羰基)-2-氧代吡咯烷-1-羧酸酯(化合物6，1.3g，68％)，为白色固体。
步骤VI：
在0℃下在5分钟内向化合物6(1.0g，2.1mmol)在乙腈(CH3CN)(5mL)中的溶液逐滴添加TFA(5mL)。将反应混合物在室温下搅拌1小时。将反应混合物在真空下浓缩并从乙酸乙酯(ethyl acetate，EA)/***中结晶，以得到反式-2-((3S,5S)-5-((S)-2-氰基-4,4-二氟吡咯烷-1-羰基)-2-氧代吡咯烷-3-基)乙酸(化合物7，500mg，76％)，为白色粉末。
实施例2：
叔丁基4-(叠氮基甲基)异吲哚啉-2-羧酸酯和叔丁基4-(氨基甲基)异吲哚啉-2-羧酸酯的合成：
根据方案2来合成叔丁基4-(叠氮基甲基)异吲哚啉-2-羧酸酯和叔丁基4-(氨基甲基)异吲哚啉-2-羧酸酯。
方案2
Figure BDA0003645599830000731
步骤I
在室温下向异吲哚啉甲酯盐酸盐(化合物8，1.00g，5.64mmol)在DCM(20mL)中的搅拌溶液一次性添加Boc2O(4.9mL，22.59mmol)，随后逐滴添加三乙胺(2.9mL，22.59mmol)。继续搅拌12小时，并且将反应混合物用水(30mL)稀释并萃取到DCM(2×25mL)中。将有机层用无水MgSO4干燥并过滤，并且将滤液在减压下蒸发。将获得的粗剩余物通过combi flash使用己烷和乙酸乙酯作为流动相进行纯化，以提供2-(叔丁基)4-甲基异吲哚啉-2,4-二羧酸酯(化合物9，1.2g，92％)，为白色无色胶状液体。LC-MS(m/z)；[M+H]计算值C15H20NO4实测值：278.13g/mol。
步骤II：
在氮气氛中在室温下向2-(叔丁基)4-甲基异吲哚啉-2,4-二羧酸酯(化合物9，1.0g，3.61mmol)在THF(10.0mL)中的搅拌溶液添加硼氢化钠(1.37g，36.101mmol)。在5分钟内向搅拌的混合物逐滴添加甲醇(MeOH，10mL)。将反应物温热至55℃并搅拌5小时。将反应混合物冷却至0℃并用饱和氯化铵水溶液缓慢淬灭并萃取到EtOAc(60mL)中。收集有机相，用硫酸钠干燥并蒸馏溶剂以提供粗剩余物，将其通过combi flash进行纯化，以得到叔丁基4-(羟甲基)异吲哚啉-2-羧酸酯(化合物10，700mg，70％)，为白色胶状固体。LC-MS(m/z)：[M+H]：计算值：C14H20NO3实测值：250.14g/mol。
步骤III：
将叔丁基4-(羟甲基)异吲哚啉-2-羧酸酯(化合物10，500mg，2.00mmol)溶解在DMF(10mL)中，随后添加PPh3(790mg，3.01mmol)和新鲜重结晶的NBS(532mg，3.01mmol)。将反应混合物在室温下在氮气氛下搅拌4至5小时。将反应混合物用水(40mL)稀释并萃取到乙酸乙酯(2×25mL)中，并将有机层用水和盐水洗涤，用无水硫酸钠干燥，并过滤。将滤液在减压下蒸发并通过combi flask进行纯化，以提供叔丁基4-(溴甲基)异吲哚啉-2-羧酸酯(化合物11，450mg，72％)，为白色固体。LC-MS(m/z)：[M+H]计算值：C14H19BrNO2实测值：312.05g/mol。
步骤IV：
向叔丁基4-(溴甲基)异吲哚啉-2-羧酸酯(化合物11，400mg，1.286mmol)在DMF中的搅拌溶液添加NaN3(420mg，6.430mmol)，然后在65℃下继续搅拌6小时。将反应混合物用水稀释并萃取到乙酸乙酯中，将有机层用水和盐水洗涤，用无水硫酸钠干燥，并过滤。将滤液在减压下蒸发并通过combi flask进行纯化，以得到叔丁基4-(叠氮基甲基)异吲哚啉-2-羧酸酯(化合物12a，300mg，85％)，为无色胶状液体。LC-MS(m/z)：[M+H]计算值C14H19N4O2实测值：274.14g/mol。
步骤V：
向叔丁基4-(叠氮基甲基)异吲哚啉-2-羧酸酯(化合物12a，1.0当量)的搅拌溶液添加THF，随后添加PPh3(1.5当量)和水(3.0当量)并在室温下继续搅拌12小时。将反应混合物在减压下蒸发，并将获得的粗剩余物通过使用combi flask使用甲醇和二氯甲烷作为流动相进行纯化，以提供叔丁基4-(氨基甲基)异吲哚啉-2-羧酸酯(化合物12b，85％)，为白色固体。LC-MS(m/z)：[M+H]计算值C14H21N2O2实测值：249.15g/mol。
实施例3：
根据方案3来合成5-((2-(4-(((2-(2-((3S,5S)-5-((S)-2-氰基-4,4-二氟吡咯烷-1-羰基)-2-氧代吡咯烷-3-基)乙酰基)异吲哚啉-4-基)甲基)氨基)-4-氧代丁酰胺基)乙基)氨基甲酰基)-2-(6-(二甲基氨基)-3-(二甲基亚氨基)-9,9a-二氢-3H-呫吨-9-基)苯甲酸酯。
5-((2-(4-(((2-(2-((3S,5S)-5-((S)-2-氰基-4,4-二氟吡咯烷-1-羰基)-2-氧代吡咯烷-3-基)乙酰基)异吲哚啉-4-基)甲基)氨基)-4-氧代丁酰胺基)乙基)氨基甲酰基)-2-(6-(二甲基氨基)-3-(二甲基亚氨基)-9,9a-二氢-3H-呫吨-9-基)苯甲酸酯的合成：
方案3
Figure BDA0003645599830000761
步骤I
向叔丁基4-(叠氮基甲基)异吲哚啉-2-羧酸酯(化合物12a)在DCM中的搅拌溶液添加三氟乙酸(TFA)并继续搅拌1小时。在另一个烧瓶中将反式-2-((3S,5S)-5-((S)-2-氰基-4,4-二氟吡咯烷-1-羰基)-2-氧代吡咯烷-3-基)乙酸(化合物7)溶解在DMF中，随后添加HATU(1.3当量)和DIPEA(3.0当量)用于预活化酸性官能团。将所得胺添加至包含预活化的酸的混合物，并将混合物在室温下搅拌3小时。将反应混合物用水稀释，并萃取到乙酸乙酯中。将有机层蒸发并将获得的粗剩余物通过combiflash使用甲醇和DCM作为流动相进行纯化，以提供(S)-1-((2S,4S)-4-(2-(4-(叠氮基甲基)异吲哚啉-2-基)-2-氧代乙基)-5-氧代吡咯烷-2-羰基)-4,4-二氟吡咯烷-2-甲腈(化合物13)。LC-MS(m/z)：计算值C21H22F2N7O3实测值：458.17。
步骤II：
使用与实施例2步骤V中提供的相同的程序，将(S)-1-((2S,4S)-4-(2-(4-(叠氮基甲基)异吲哚啉-2-基)-2-氧代乙基)-5-氧代吡咯烷-2-羰基)-4,4-二氟吡咯烷-2-甲腈(化合物13)与三苯基膦(PPh3)、水和四氢呋喃反应以产生(S)-1-((2S,4S)-4-(2-(4-(氨基甲基)异吲哚啉-2-基)-2-氧代乙基)-5-氧代吡咯烷-2-羰基)-4,4-二氟吡咯烷-2-甲腈(化合物14)，其无需纯化即进行下一步。将(S)-1-((2S,4S)-4-(2-(4-(氨基甲基)异吲哚啉-2-基)-2-氧代乙基)-5-氧代吡咯烷-2-羰基)-4,4-二氟吡咯烷-2-甲腈(化合物14)与4-((2-((叔丁氧基羰基)氨基)乙基)氨基)-4-氧代丁酸、HATU(1.3当量)、DIPEA(3.0当量)和DCM反应，以提供叔丁基(2-(4-(((2-(2-((3S,5S)-5-((S)-2-氰基-4,4-二氟吡咯烷-1-羰基)-2-氧代吡咯烷-3-基)乙酰基)异吲哚啉-4-基)甲基)氨基)-4-氧代丁酰胺基)乙基)氨基甲酸酯(化合物15)。
步骤III
向叔丁基(2-(4-(((2-(2-((3S,5S)-5-((S)-2-氰基-4,4-二氟吡咯烷-1-羰基)-2-氧代吡咯烷-3-基)乙酰基)异吲哚啉-4-基)甲基)氨基)-4-氧代丁酰胺基)乙基)氨基甲酸酯(化合物15)在DCM中的搅拌溶液添加TFA，并继续搅拌10分钟。将反应混合物在减压下蒸发并且将获得的粗剩余物用在DMF中的NHS罗丹明(1.0当量)和DIPEA(2.0当量)处理1小时。将反应混合物用水稀释并通过UHPLC(A＝20mM乙酸铵缓冲液(pH＝7)，B＝乙腈，溶剂梯度在60分钟内为5％B至95％)进行纯化，以提供5-((2-(4-(((2-(2-((3S,5S)-5-((S)-2-氰基-4,4-二氟吡咯烷-1-羰基)-2-氧代吡咯烷-3-基)乙酰基)异吲哚啉-4-基)甲基)氨基)-4-氧代丁酰胺基)乙基)氨基甲酰基)-2-(6-(二甲基氨基)-3-(二甲基亚氨基)-9,9a-二氢-3H-呫吨-9-基)苯甲酸酯(化合物16)。LC-MS(m/z)：[M+H]计算值C52H56F2N9O9实测值：988.41g/mol。
实施例4：
根据方案4a和4b来合成N-(9-(2-羧基-4-((1-(4-(1-((2-(2-((3S,5S)-5-((S)-2-氰基-4,4-二氟吡咯烷-1-羰基)-2-氧代吡咯烷-3-基)乙酰基)异吲哚啉-4-基)甲基)-1H-1,2,3-***-4-基)苯基)-1,6-二氧代-9,12,15,18-四氧杂-2,5-二氮杂二十烷-20-基)氨基甲酰基)苯基)-6-(二甲基氨基)-9,9a-二氢-3H-呫吨-3-亚基)-N-甲基甲铵和5-((1-(4-(1-((2-(2-((3S,5S)-5-((S)-2-氰基-4,4-二氟吡咯烷-1-羰基)-2-氧代吡咯烷-3-基)乙酰基)异吲哚啉-4-基)甲基)-1H-1,2,3-***-4-基)苯基)-1,6-二氧代-9,12,15,18-四氧杂-2,5-二氮杂二十烷-20-基)氨基甲酰基)-2-(6-羟基-3-氧代-9,9a-二氢-3H-呫吨-9-基)苯甲酸。
N-(9-(2-羧基-4-((1-(4-(1-((2-(2-((3S,5S)-5-((S)-2-氰基-4,4-二氟吡咯烷-1-羰基)-2-氧代吡咯烷-3-基)乙酰基)异吲哚啉-4-基)甲基)-1H-1,2,3-***-4-基)苯基)-1,6-二氧代-9,12,15,18-四氧杂-2,5-二氮杂二十烷-20-基)氨基甲酰基)苯基)-6-(二甲基氨基)-9,9a-二氢-3H-呫吨-3-亚基)-N-甲基甲铵和5-((1-(4-(1-((2-(2-((3S,5S)-5-((S)-2-氰基-4,4-二氟吡咯烷-1-羰基)-2-氧代吡咯烷-3-基)乙酰基)异吲哚啉-4-基)甲基)-1H-1,2,3-***-4-基)苯基)-1,6-二氧代-9,12,15,18-四氧杂-2,5-二氮杂二十烷-20-基)氨基甲酰基)-2-(6-羟基-3-氧代-9,9a-二氢-3H-呫吨-9-基)苯甲酸的合成：
方案4a
Figure BDA0003645599830000781
步骤I
在室温下在氮气氛下，向4-乙炔基苯甲酸(化合物17，500mg，3.424mmol)在无水DCM(10mL)中的搅拌溶液添加HATU(1.4gm，3.76mmol)，随后添加DIPEA(1.7mL，10.27mmol)并继续搅拌10分钟用于活化酸。向反应混合物添加N-Fmoc-乙二胺(1.0g，3.76mmol)并继续搅拌另外3小时。将反应混合物用DCM(20mL)稀释并将获得的沉淀物通过布氏漏斗(Buchnerfunnel)过滤。将所得白色固体再次用DCM(2×20mL)洗涤并在真空下干燥1小时，以提供(9H-芴-9-基)甲基(2-(4-乙炔基苯甲酰氨基)乙基)氨基甲酸酯(化合物18，1.2g，85％)。LRMS-LC/MS(m/z)：[M+H]计算值C26H23N2O3实测值411.16。
步骤II：
向叔丁基4-(叠氮基甲基)异吲哚啉-2-羧酸酯(化合物12a，200mg，0.729mmol)和(9H-芴-9-基)甲基(2-(4-乙炔基苯甲酰氨基)乙基)氨基甲酸酯(化合物18，360mg，0.874mmol)在无水DMF(5.0mL)中的混合物添加碘化铜(CuI，70mg，0.364mmol)，随后添加DIPEA(0.3mL，1.458mmol)。将反应混合物在50℃下在氮气氛下搅拌5小时，并且将混合物冷却至室温，用水(20mL)稀释，并剧烈搅拌15分钟。将反应混合物中形成的固体剩余物过滤并用水2×20mL洗涤，并在真空下干燥1小时，以提供为棕色固体的叔丁基4-((4-(4-((2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)乙基)氨基甲酰基)苯基)-1H-1,2,3-***-1-基)甲基)异吲哚啉-2-羧酸酯(化合物19，480mg，96％)，其无需纯化即进行另外的步骤。LRMS-LC/MS(m/z)：[M+H]计算值C40H41N6O5实测值684.31。
步骤III：
向化合物叔丁基4-((4-(4-((2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)乙基)氨基甲酰基)苯基)-1H-1,2,3-***-1-基)甲基)异吲哚啉-2-羧酸酯(化合物19，400mg，0.584mmol)在DCM和MeOH(1:0.5mL)中的搅拌溶液添加(Et)2NH(1mL)并继续搅拌2小时。将反应混合物在减压下蒸发并将获得的粗剩余物用***(3×10mL)处理。刮划(scratching)剩余物用于产生固体。倾析出***，并将获得的固体在真空下干燥1小时，然后进入下一步。将胺化合物溶解在DCM(1mL，1mmol)中，随后溶解在Fmoc-NH(PEG)n NHS酯(1.2当量，n＝3、5和11)中，随后溶解在DIPEA(2.0当量)中，并将反应混合物在室温下在氮气氛下搅拌1小时。将反应混合物在减压下蒸发并且将获得的粗剩余物通过combi flash使用DCM和MeOH作为流动相进行纯化，以提供70％至80％产率的化合物20a至c。
i)20a的LCMS：LC/MS(m/z)：[M+H]计算值C51H62N7O10实测值：931.45。
ii)20b的LCMS：LC/MS(m/z)：[M+H]计算值C55H69N7O12实测值：1020.50。
iii)20c的LCMS：LC/MS(m/z)：[M+H]计算值C67H93N7O18实测值：1284.66。
步骤IV：
在室温下向化合物20a、20b或20c(1.0当量)在DCM(1.0mL)中的搅拌溶液添加TFA(10当量)并继续搅拌30分钟。将反应混合物蒸发并在真空下干燥。在单独的圆底烧瓶中，将反式-2-((3S,5S)-5-((S)-2-氰基-4,4-二氟吡咯烷-1-羰基)-2-氧代吡咯烷-3-基)乙酸(化合物7，1.2当量)溶解在DMF(0.5mL)中，随后溶解在HATU(1.3当量)和DIPEA(5.0当量)中，并将反应混合物在室温下在氮气氛下搅拌10分钟用于活化化合物7中的酸性官能团。将从化合物20a至c的Fmoc去保护而获得的胺溶解在DCM(1mL)中，添加至上述反应混合物并继续搅拌另外2小时。将反应混合物用水(15mL)稀释并萃取到乙酸乙酯(2×15mL)中。将有机萃取物用无水硫酸钠干燥并浓缩。将获得的粗剩余物通过combi flash使用DCM和MeOH作为流动相进行纯化，以得到40％至60％产率的所期望化合物(9H-芴-9-基)甲基(1-(4-(1-((2-(2-((3S,5S)-5-((S)-2-氰基-4,4-二氟吡咯烷-1-羰基)-2-氧代吡咯烷-3-基)乙酰基)异吲哚啉-4-基)甲基)-1H-1,2,3-***-4-基)苯基)-1,6-二氧代-9,12,15,18-四氧杂-2,5-二氮杂二十烷-20-基)氨基甲酸酯、(9H-芴-9-基)甲基(1-(4-(1-((2-(2-((3S,5S)-5-((S)-2-氰基-4,4-二氟吡咯烷-1-羰基)-2-氧代吡咯烷-3-基)乙酰基)异吲哚啉-4-基)甲基)-1H-1,2,3-***-4-基)苯基)-1,6-二氧代-9,12,15,18,21,24-六氧杂-2,5-二氮杂二十六烷-26-基)氨基甲酸酯和(9H-芴-9-基)甲基(1-(4-(1-((2-(2-((3S,5S)-5-((S)-2-氰基-4,4-二氟吡咯烷-1-羰基)-2-氧代吡咯烷-3-基)乙酰基)异吲哚啉-4-基)甲基)-1H-1,2,3-***-4-基)苯基)-1,6-二氧代-9,12,15,18,21,24,27,30,33,36,39,42-十二氧杂-2,5-二氮杂四十四烷-44-基)氨基甲酸酯。
i)化合物21a的LCMS：LC/MS(m/z)：[M+H]计算值：C58H65F2N10O11实测值：1115.47。
ii)化合物21b的LCMS：LC/MS(m/z)：[M+H]计算值：C62H72F2N10O13实测值：1203.52。
iii)化合物21c的LCMS：LC/MS(m/z)：[M+H]计算值：C74H97F2N10O19实测值：1467.68。
方案4b
Figure BDA0003645599830000811
步骤V：
化合物21a至c中Fmoc官能团的去保护按照与实施例4步骤III中提供的相同的程序进行。将从化合物21a获得的游离胺在存在DIPEA(1.1当量)的情况下用在DMF中的NHS罗丹明(1.1当量)或1.1当量的NHS FITC处理30分钟，随后用UHPLC(A＝20Mm乙酸铵缓冲液(pH＝7)，B＝乙腈，溶剂梯度在60分钟内为5％B至95％)进行纯化，以分别提供定量产率的靶向罗丹明化合物22或FITC(23)缀合物。化合物22的LCMS：LC/MS(m/z)：[M+H]计算值C68H78F2N12O13实测值：1308.57g/mol。化合物23的LCMS：LC/MS(m/z)：[M+H]计算值C64H67F2N10O15实测值：1253.47g/mol。
实施例5：
根据方案5来合成2-((E)-2-((E)-2-(4-(1-(4-(1-((2-(2-((3S,5S)-5-((S)-2-氰基-4,4-二氟吡咯烷-1-羰基)-2-氧代吡咯烷-3-基)乙酰基)异吲哚啉-4-基)甲基)-1H-1,2,3-***-4-基)苯基)-1,6,21-三氧代-9,12,14,17-四氧杂-2,5,20-三氮杂二十三烷-23-基)苯氧基)-3-(2-((E)-3,3-二甲基-5-磺酸根基-1-(4-磺酸根基丁基)吲哚啉-2-亚基)亚乙基)环己基-1-烯-1-基)乙烯基)-3,3-二甲基-1-(4-磺酸根基丁基)-3H-吲哚-1-
Figure BDA0003645599830000812
-5-磺酸钠。
2-((E)-2-((E)-2-(4-(1-(4-(1-((2-(2-((3S,5S)-5-((S)-2-氰基-4,4-二氟吡咯烷-1-羰基)-2-氧代吡咯烷-3-基)乙酰基)异吲哚啉-4-基)甲基)-1H-1,2,3-***-4-基)苯基)-1,6,21-三氧代-9,12,14,17-四氧杂-2,5,20-三氮杂二十三烷-23-基)苯氧基)-3-(2-((E)-3,3-二甲基-5-磺酸根基-1-(4-磺酸根基丁基)吲哚啉-2-亚基)亚乙基)环己基-1-烯-1-基)乙烯基)-3,3-二甲基-1-(4-磺酸根基丁基)-3H-吲哚-1-
Figure BDA0003645599830000813
-5-磺酸钠的合成：
方案5
Figure BDA0003645599830000821
步骤I：
将如实施例4步骤III中提供的从用二乙胺还原化合物21a获得的胺(1.0当量)溶解在DMF中。添加3-(4-羟基苯基)丙酸(1.2当量)、HATU(1.3当量)和DIPEA(3.0当量)，并将反应混合物在室温下搅拌2小时至3小时，随后在减压下蒸发。将获得的粗剩余物通过使用UHPLC(A＝20Mm乙酸铵缓冲液(pH＝7)，B＝乙腈，溶剂梯度在60分钟内为5％B至95％)进行纯化，以提供所期望的化合物24a。LRMS-LC/MS(m/z)：[M+H]计算值C50H59F2N10O10，实测值：997.43。
步骤II
在室温下在氩气氛下向化合物24a在无水DMSO中的搅拌溶液添加ClS0456染料(1.0当量)，随后添加Cs2CO3(5.0当量)，并继续搅拌另外3小时至4小时，并且该反应的进程通过LCMS监测。将反应混合物用水稀释并通过使用UHPLC(A＝20Mm乙酸铵缓冲液(pH＝7)，B＝0乙腈，溶剂梯度在60分钟内为5％B至35％)进行纯化，以提供2-((E)-2-((E)-2-(4-(1-(4-(1-((2-(2-((3S,5S)-5-((S)-2-氰基-4,4-二氟吡咯烷-1-羰基)-2-氧代吡咯烷-3-基)乙酰基)异吲哚啉-4-基)甲基)-1H-1,2,3-***-4-基)苯基)-1,6,21-三氧代-9,12,14,17-四氧杂-2,5,20-三氮杂二十三烷-23-基)苯氧基)-3-(2-((E)-3,3-二甲基-5-磺酸根基-1-(4-磺酸根基丁基)吲哚啉-2-亚基)亚乙基)环己基-1-烯-1-基)乙烯基)-3,3-二甲基-1-(4-磺酸根基丁基)-3H-吲哚-1-
Figure BDA0003645599830000831
-5-磺酸钠(化合物25a)。25a的LC-MS：LC/MS(m/z)：[M+H]计算值C90H105F2N12Na3O23S4：1957.60。
实施例6：
根据方案6来合成4-((2-(4-(1-((2-(2-((3S,5S)-5-((S)-2-氰基-4,4-二氟吡咯烷-1-羰基)-2-氧代吡咯烷-3-基)乙酰基)异吲哚啉-4-基)甲基)-1H-1,2,3-***-4-基)苯甲酰胺基)乙基)氨基)-4-氧代丁酸。
4-((2-(4-(1-((2-(2-((3S,5S)-5-((S)-2-氰基-4,4-二氟吡咯烷-1-羰基)-2-氧代吡咯烷-3-基)乙酰基)异吲哚啉-4-基)甲基)-1H-1,2,3-***-4-基)苯甲酰胺基)乙基)氨基)-4-氧代丁酸的合成：
方案6
Figure BDA0003645599830000832
步骤I
(9H-芴-9-基)甲基(2-(4-(1-((2-(2-((3S,5S)-5-((S)-2-氰基-4,4-二氟吡咯烷-1-羰基)-2-氧代吡咯烷-3-基)乙酰基)异吲哚啉-4-基)甲基)-1H-1,2,3-***-4-基)苯甲酰胺基)乙基)氨基甲酸酯(化合物26)的合成按照与实施例4步骤IV提供的类似的程序进行(LC/MS(m/z)：[M+H]计算值C47H44F2N9O6实测值：868.33)。将从使用实施例4步骤III中提供的类似程序还原化合物26获得的游离胺溶解在DCM中，随后添加琥珀酸酐(1.5当量)和DIPEA(2.0当量)。将溶液在室温下搅拌1小时。将反应混合物蒸发并将获得的粗剩余物通过UHPLC(A＝20Mm乙酸铵缓冲液(pH＝7)，B＝乙腈，溶剂梯度在60分钟内为5％B至95％)进行纯化，以提供4-((2-(4-(1-((2-(2-((3S,5S)-5-((S)-2-氰基-4,4-二氟吡咯烷-1-羰基)-2-氧代吡咯烷-3-基)乙酰基)异吲哚啉-4-基)甲基)-1H-1,2,3-***-4-基)苯甲酰胺基)乙基)氨基)-4-氧代丁酸(化合物27)。LC/MS(m/z)：[M+H]计算值C36H38F2N9O7实测值：746.28。
实施例7：
根据方案7来合成2-((E)-2-((E)-2-(4-(1-(2-(2-((3S,5S)-5-((S)-2-氰基-4,4-二氟吡咯烷-1-羰基)-2-氧代吡咯烷-3-基)乙酰基)异吲哚啉-4-基)-3,25-二氧代-6,9,12,15,18,21-六氧杂-2,24-二氮杂二十七烷-27-基)苯氧基)-3-(2-((E)-3,3-二甲基-5-磺酸根基-1-(4-磺酸根基丁基)吲哚啉-2-亚基)亚乙基)环己基-1-烯-1-基)乙烯基)-3,3-二甲基-1-(4-磺酸根基丁基)-3H-吲哚-1-
Figure BDA0003645599830000841
-5-磺酸钠。
2-((E)-2-((E)-2-(4-(1-(2-(2-((3S,5S)-5-((S)-2-氰基-4,4-二氟吡咯烷-1-羰基)-2-氧代吡咯烷-3-基)乙酰基)异吲哚啉-4-基)-3,25-二氧代-6,9,12,15,18,21-六氧杂-2,24-二氮杂二十七烷-27-基)苯氧基)-3-(2-((E)-3,3-二甲基-5-磺酸根基-1-(4-磺酸根基丁基)吲哚啉-2-亚基)亚乙基)环己基-1-烯-1-基)乙烯基)-3,3-二甲基-1-(4-磺酸根基丁基)-3H-吲哚-1-
Figure BDA0003645599830000842
-5-磺酸钠的合成：
方案7
Figure BDA0003645599830000843
步骤1：
向3-(4-(叔丁氧基)苯基)丙酸(化合物28)在无水DMF中的搅拌溶液添加HATU(1.3当量)和DIPEA(3.0当量)，随后添加氨基-PEG6-叔丁酯(1.2当量)。将反应混合物用水稀释，然后萃取到乙酸乙酯(2×20mL)中。将有机层用无水硫酸钠干燥，过滤，并将滤液在减压下蒸发。将粗剩余物通过使用combi flash使用甲醇和二氯甲烷作为流动相进行纯化，以提供叔丁基3-(2-(2-(3-(4-(叔丁氧基)苯基)丙酰胺基)乙氧基)乙氧基)丙酸酯(化合物29)，为胶状液体。LC/MS(m/z)：[M+H]：计算值C32H56NO10实测值：614.38。
步骤II：
将叔丁基3-(2-(2-(3-(4-(叔丁氧基)苯基)丙酰胺基)乙氧基)乙氧基)丙酸酯(化合物29)溶解在DCM中。添加三氟乙酸酐，并将反应混合物在室温下搅拌2小时。将反应混合物在减压下蒸发并将获得的粗剩余物溶解在DMF中。添加DIPEA(5.0当量)和HATU(1.3当量)，随后添加叔丁基4-(氨基甲基)异吲哚啉-2-羧酸酯(化合物12b，1.1当量)。将混合物搅拌1小时。将反应混合物用水稀释并萃取到乙酸乙酯(2×20mL)中，蒸发有机层，并将粗剩余物通过使用combi flash使用甲醇和二氯甲烷作为流动相进行纯化，以提供叔丁基4-(27-(4-羟基苯基)-3,25-二氧代-6,9,12,15,18,21-六氧杂-2,24-二氮杂二十七烷基)异吲哚啉-2-羧酸酯(化合物30)，为胶状液体。LC/MS(m/z)：[M+H]：计算值C38H58N3O11实测值：732.40。
步骤III和步骤IV：
N-((2-(2-((3S,5R)-5-((S)-2-氰基-4,4-二氟吡咯烷-1-羰基)-2-氧代吡咯烷-3-基)乙酰基)异吲哚啉-4-基)甲基)-1-(3-(4-羟基苯基)丙酰胺基)-3,6,9,12,15,18-六氧杂二十一烷-21-酰胺(化合物31)和2-((E)-2-((E)-2-(4-(1-(2-(2-((3S,5S)-5-((S)-2-氰基-4,4-二氟吡咯烷-1-羰基)-2-氧代吡咯烷-3-基)乙酰基)异吲哚啉-4-基)-3,25-二氧代-6,9,12,15,18,21-六氧杂-2,24-二氮杂二十七烷-27-基)苯氧基)-3-(2-((E)-3,3-二甲基-5-磺酸根基-1-(4-磺酸根基丁基)吲哚啉-2-亚基)亚乙基)环己基-1-烯-1-基)乙烯基)-3,3-二甲基-1-(4-磺酸根基丁基)-3H-吲哚-1-
Figure BDA0003645599830000851
-5-磺酸钠(化合物32)是使用与分别在实施例4步骤IV和实施例5步骤II中提供的类似的程序来合成。化合物31的LCMS：LC/MS(m/z)：[M+H]计算值C45H61F2N6O12实测值：915.42，化合物32的LCMS：LC/MS(m/z)：[M+H]计算值：C83H104F2N8Na3O24S4实测值：1831.56。
实施例8：
根据方案8来合成2-((E)-2-((E)-2-(4-(1-(1-((2-(2-((3S,5S)-5-((S)-2-氰基-4,4-二氟吡咯烷-1-羰基)-2-氧代吡咯烷-3-基)乙酰基)异吲哚啉-4-基)甲基)-1H-1,2,3-***-4-基)-3,19-二氧代-6,9,12,15-四氧杂-2,18-二氮杂二十一烷-21-基)苯氧基)-3-(2-((E)-3,3-二甲基-5-磺酸根基-1-(4-磺酸根基丁基)吲哚啉-2-亚基)亚乙基)环己基-1-烯-1-基)乙烯基)-3,3-二甲基-1-(4-磺酸根基丁基)-3H-吲哚-1-
Figure BDA0003645599830000861
-5-磺酸钠。
2-((E)-2-((E)-2-(4-(1-(1-((2-(2-((3S,5S)-5-((S)-2-氰基-4,4-二氟吡咯烷-1-羰基)-2-氧代吡咯烷-3-基)乙酰基)异吲哚啉-4-基)甲基)-1H-1,2,3-***-4-基)-3,19-二氧代-6,9,12,15-四氧杂-2,18-二氮杂二十一烷-21-基)苯氧基)-3-(2-((E)-3,3-二甲基-5-磺酸根基-1-(4-磺酸根基丁基)吲哚啉-2-亚基)亚乙基)环己基-1-烯-1-基)乙烯基)-3,3-二甲基-1-(4-磺酸根基丁基)-3H-吲哚-1-
Figure BDA0003645599830000862
-5-磺酸钠的合成：
方案8
Figure BDA0003645599830000871
步骤I
向叔丁基4-(叠氮基甲基)异吲哚啉-2-羧酸酯(化合物12a，1.0当量)和Fmoc炔丙基胺(1.2当量)在无水DMF(5.0mL)中的混合物添加CuI(0.5当量)，随后添加DIPEA(2.0当量)。将反应混合物在50℃下在氮气氛下搅拌5小时，然后将反应混合物冷却至室温，用水(20mL)稀释，并剧烈搅拌15分钟。将反应混合物中形成的固体剩余物进行过滤并用水2×20mL洗涤，并在真空下干燥1小时，以提供叔丁基4-((4-(((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)甲基)-1H-1,2,3-***-1-基)甲基)异吲哚啉-2-羧酸酯(化合物33，96％)，其为固体，并且其无需另外的纯化即进入另外的步骤。
向化合物33(1毫摩尔)在DCM(5mL)中的搅拌溶液添加(Et)2NH(2mL)并继续搅拌2小时，同时该反应的进程通过LCMS监测。将反应混合物在减压下蒸发，并将获得的粗剩余物用***处理。倾析出醚层，并将固体化合物在真空下干燥，随后溶解在DCM中。向该反应混合物添加Fmoc-NH(PEG4)NHS酯(1.2当量)和DIPEA(3.0当量)。将反应混合物在室温下搅拌1小时，在减压下蒸发，并将粗剩余物通过使用combi flash使用甲醇+DCM作为流动相进行纯化，以提供化合物34。
实施例9：
根据方案9来合成2-((3S,5S)-5-((2S,4S)-2-氰基-4-氟吡咯烷-1-羰基)-2-氧代吡咯烷-3-基)乙酸。
2-((3S,5S)-5-((2S,4S)-2-氰基-4-氟吡咯烷-1-羰基)-2-氧代吡咯烷-3-基)乙酸的合成：
方案9
Figure BDA0003645599830000881
步骤I：
向(2S,4S)-4-(2-(叔丁氧基)-2-氧代乙基)-1-(叔丁氧羰基)-5-氧代吡咯烷-2-羧酸(化合物4，1.0当量)在无水DMF中的搅拌溶液添加HATU(1.3)、DIPEA(3.0当量)并继续搅拌10分钟用于活化4中的酸性官能团。将4-顺式-氟代-L-脯氨酰胺盐酸盐(1.2)和DIPEA(2.0当量)添加至混合物并在室温下在氮气氛下继续搅拌5小时。将反应混合物用水和盐水稀释并萃取到乙酸乙酯中。将合并的有机萃取物用无水硫酸钠干燥并过滤。将滤液在减压下蒸发并将获得的粗剩余物通过combi flash使用DCM/MeOH作为流动相进行纯化，以提供叔丁基(3S,5S)-3-(2-(叔丁氧基)-2-氧代乙基)-5-((2S,4S)-2-氨基甲酰基-4-氟吡咯烷-1-羰基)-2-氧代吡咯烷-1-羧酸酯(化合物38)，其为胶状固体。
步骤II：
在氮气下向冷却至-20℃的叔丁基(3S,5S)-3-(2-(叔丁氧基)-2-氧代乙基)-5-((2S,4S)-2-氨基甲酰基-4-氟吡咯烷-1-羰基)-2-氧代吡咯烷-1-羧酸酯(化合物38，1.0当量)和咪唑(1.2当量)在吡啶中的混合物添加磷酰氯(POCl3)(1.0当量)。在-20℃下搅拌30分钟至1小时之后，将混合物在真空中蒸发至干。将所得棕色固体溶解在CH2Cl2(40mL)中并用1.0N柠檬酸水溶液(40mL)洗涤。将有机相用硫酸镁干燥，过滤，并在减压下浓缩，以得到为黏性油状物的粗物质。将粗物质通过combi flash(用己烷/EtOAc洗脱)进行纯化，以得到叔丁基(3S,5S)-3-(2-(叔丁氧基)-2-氧代乙基)-5-((2S,4S)-2-氰基-4-氟吡咯烷-1-羰基)-2-氧代吡咯烷-1-羧酸酯(化合物39)，为白色固体。
步骤III：
在0℃下在5分钟内向叔丁基(3S,5S)-3-(2-(叔丁氧基)-2-氧代乙基)-5-((2S,4S)-2-氰基-4-氟吡咯烷-1-羰基)-2-氧代吡咯烷-1-羧酸酯(化合物39，1mmol)在CH3CN(5mL)中的溶液逐滴添加TFA(5mL)。将反应混合物在室温下搅拌1小时。将反应混合物在真空下浓缩并用EA/***结晶，以得到2-((3S,5S)-5-((2S,4S)-2-氰基-4-氟吡咯烷-1-羰基)-2-氧代吡咯烷-3-基)乙酸(化合物40)，为白色粉末。LC/MS(m/z)：计算值C12H15FN3O4实测值284.10。
实施例10：
根据方案10来合成4-((2-(4-(1-((2-(2-((3S,5S)-5-((2S,4S)-2-氰基-4-氟吡咯烷-1-羰基)-2-氧代吡咯烷-3-基)乙酰基)异吲哚啉-4-基)甲基)-1H-1,2,3-***-4-基)苯甲酰胺基)乙基)氨基)-4-氧代丁酸。
4-((2-(4-(1-((2-(2-((3S,5S)-5-((2S,4S)-2-氰基-4-氟吡咯烷-1-羰基)-2-氧代吡咯烷-3-基)乙酰基)异吲哚啉-4-基)甲基)-1H-1,2,3-***-4-基)苯甲酰胺基)乙基)氨基)-4-氧代丁酸的合成：
方案10
Figure BDA0003645599830000891
在室温下将TFA(10当量)添加至化合物19(1.0当量)在DMF(1.0mL)中的搅拌溶液，并继续搅拌30分钟。将反应混合物蒸发并在真空下干燥。在单独的圆底烧瓶中，将化合物40(1.2当量)溶解在DMF(0.5mL)中，随后溶解在HATU(1.3当量)和DIPEA(5.0当量)，并将反应混合物在室温下在氮气氛下搅拌10分钟用于活化化合物40中的酸性官能团。将从化合物19获得的胺溶解在DMF(1mL)中并添加至上述反应混合物并继续搅拌另外2小时。将反应混合物用水(15mL)稀释并萃取到乙酸乙酯(2×15mL)中。将有机萃取物用无水硫酸钠干燥并浓缩，并将获得的粗剩余物通过combi flash使用DCM和MeOH作为流动相进行纯化，以得到期望的化合物41。化合物41的LCMS：LC/MS(m/z)：[M+H]计算值C47H45FN9O6实测值：850.34。化合物42的LCMS：LC/MS(m/z)：[M+H]计算值C36H40FN9O7实测值728.29g/mol。
实施例11：
根据方案11来合成5-((2-(2-(2-((3S,5S)-5-((S)-2-氰基-4,4-二氟吡咯烷-1-羰基)-2-氧代吡咯烷-3-基)乙酰基)异吲哚啉-4-羧酰氨基)乙基)氨基甲酰基)-2-(6-(二甲基氨基)-3-(二甲基亚氨基)-3H-呫吨-9-基)苯甲酸酯。
5-((2-(2-(2-((3S,5S)-5-((S)-2-氰基-4,4-二氟吡咯烷-1-羰基)-2-氧代吡咯烷-3-基)乙酰基)异吲哚啉-4-羧酰氨基)乙基)氨基甲酰基)-2-(6-(二甲基氨基)-3-(二甲基亚氨基)-3H-呫吨-9-基)苯甲酸酯的合成：
方案11
Figure BDA0003645599830000901
步骤I
将LiOH(172.8mg，7.2mmol，10当量)添加至2-(叔丁基)4-甲基异吲哚啉-2,4-二羧酸酯(化合物8，200mg，0.72mmol)在MeOH/THF/H2O(0.2mL/0.6mL/0.2mL)中的搅拌溶液。将混合物搅拌5小时。在减压下除去溶剂，并将混合物溶解在水(1mL)中，用柠檬酸(1M)调节pH至7。将产物用EA(3mL X 3)萃取。合并有机层，用硫酸钠干燥，并在减压下浓缩，以得到2-(叔丁氧基羰基)异吲哚啉-4-羧酸(化合物51)，其无需另外的纯化即用于下一步。
步骤II
将HATU(456mg，1.2mmol，1.2当量)和DIPEA(258mg，2mmol，2.0当量)添加至2-(叔丁氧基羰基)异吲哚啉-4-羧酸(化合物51，263mg，1.0mmol，1.0当量)在DMF(5mL)中的溶液。将混合物搅拌10分钟，并随后添加(9H-芴-9-基)甲基(2-氨基乙基)氨基甲酸酯盐酸盐(350.9mg，1.1mmol，1.1当量)。将混合物用乙酸乙酯(2mL)稀释并用H2O(2mLX3)洗涤。合并有机层，用硫酸钠干燥，并在减压下浓缩。将剩余的油状物用combi flash色谱使用己烷/乙酸乙酯作为洗脱液进行纯化，以提供叔丁基4-((2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)乙基)氨基甲酰基)异吲哚啉-2-羧酸酯(化合物52)，352.5mg产率，为白色固体。
步骤III
在室温下将TFA(10当量)添加至化合物52(1.0当量)在DMF(1.0mL)中的搅拌溶液，并继续搅拌30分钟。将反应混合物蒸发并在真空下干燥。在单独的圆底烧瓶中，将酸性化合物7(1.2当量)溶解在DMF(0.5mL)中，随后溶解在HATU(1.3当量)和DIPEA(5.0当量)，并将反应混合物在氮气氛下在室温下搅拌10分钟用于活化化合物7中的酸性官能团。将从化合物52获得的胺溶解在DMF(1mL)中，添加至上述反应混合物，并继续搅拌另外2小时。将反应混合物用水(15mL)稀释并萃取到乙酸乙酯(2×15mL)中。将有机萃取物用无水硫酸钠干燥。将萃取物浓缩并将获得的粗剩余物通过combiflash使用DCM和MeOH作为流动相进行纯化，以得到期望的化合物53。将(Et)2NH添加至化合物53DCM的溶液并在室温下搅拌1小时，在减压下蒸发，并将粗剩余物用***处理，干燥，并且无需纯化即进入下一步。
将N-(2-氨基乙基)-2-(2-((3S)-5-((S)-2-氰基-4,4-二氟吡咯烷-1-羰基)-2-氧代吡咯烷-3-基)乙酰基)异吲哚啉-4-甲酰胺(10.0mg，0.02mmol，1.0当量)溶解在DMF(1mL)中，然后添加罗丹明-NHS(12.9mg，0.024mmol，1.2当量)，随后添加DIPEA(3.87mg，0.03mmol，1.5当量)。将混合物在室温下搅拌2小时。将反应混合物用水稀释并通过使用UHPLC(A＝20Mm乙酸铵缓冲液(pH＝7)，B＝乙腈，溶剂梯度在60分钟内为5％B至95％)进行纯化，以提供5-((2-(2-(2-((3S,5S)-5-((S)-2-氰基-4,4-二氟吡咯烷-1-羰基)-2-氧代吡咯烷-3-基)乙酰基)异吲哚啉-4-羧酰氨基)乙基)氨基甲酰基)-2-(6-(二甲基氨基)-3-(二甲基亚氨基)-3H-呫吨-9-基)苯甲酸酯(化合物54)。LC/MS(m/z)：[M+H]计算值C48H46F2N8O8，实测值901.3g/mol。
实施例12：
根据方案12来合成5-((2-(3-(2-(2-((3S,5S)-5-((S)-2-氰基-4,4-二氟吡咯烷-1-羰基)-2-氧代吡咯烷-3-基)乙酰基)异吲哚啉-4-基)丙酰胺基)乙基)氨基甲酰基)-2-(6-(二甲基氨基)-3-(二甲基亚氨基)-3H-呫吨-9-基)苯甲酸酯。
5-((2-(3-(2-(2-((3S,5S)-5-((S)-2-氰基-4,4-二氟吡咯烷-1-羰基)-2-氧代吡咯烷-3-基)乙酰基)异吲哚啉-4-基)丙酰胺基)乙基)氨基甲酰基)-2-(6-(二甲基氨基)-3-(二甲基亚氨基)-3H-呫吨-9-基)苯甲酸酯的合成：
方案12
Figure BDA0003645599830000921
步骤I
在氩气氛下，向叔丁基4-溴异吲哚啉-2-羧酸酯(化合物55)(297mg，1mmol，1.0当量)在DMF(1mL)中的溶液添加丙烯酸苄酯(486mg，3mmol，3.0当量)、Pd(OAc)2(22.3mg，0.1mmol，0.1当量)、P(o-Tol)3(60.8mg，0.2mmol，0.2当量)和DIPEA(387mg，3.0mmol，3.0当量)。将所得混合物在100℃下加热8小时。在完成之后，将反应物用水(3mL)淬灭。水层用EA(10mLX3)萃取，并且合并有机相并用硫酸钠干燥。在减压下浓缩有机层，并将剩余物用combi flash色谱使用己烷/乙酸乙酯作为洗脱液进行纯化，以产生148mg的叔丁基(E)-4-(3-(苄氧基)-3-氧代丙基-1-烯-1-基)异吲哚啉-2-羧酸酯(化合物56)，为淡黄色油状物，无需另外的纯化。在氢气氛下使用MeOH中的Pd/C使化合物56氢化8小时，以提供3-(2-(叔丁氧基羰基)异吲哚啉-4-基)丙酸(化合物57)。57的LC/MS：LC/MS(m/z)[M+H]计算值C16H22NO4实测值292.15。
化合物58至61以与实施例11中提供的类似方式合成，以产生5-((2-(3-(2-(2-((3S,5S)-5-((S)-2-氰基-4,4-二氟吡咯烷-1-羰基)-2-氧代吡咯烷-3-基)乙酰基)异吲哚啉-4-基)丙酰胺基)乙基)氨基甲酰基)-2-(6-(二甲基氨基)-3-(二甲基亚氨基)-3H-呫吨-9-基)苯甲酸酯。化合物61的LC/MS(m/z)：[M+H]计算值C50H51F2N8O8，实测值929.3g/mol。
实施例13
根据方案13来合成N-(4-((2-(2-(2-((3S,5S)-5-((S)-2-氰基-4,4-二氟吡咯烷-1-羰基)-2-氧代吡咯烷-3-基)乙酰基)-2,3,7,7a-四氢-1H-异吲哚-4-甲酰胺基)乙基)氨基)-4-氧代丁酰基)-S-((2-((((5-(6-(5-((2,4-二氟苯基)磺酰氨基)-6-甲氧基吡啶-3-基)喹啉-4-基)吡啶-2-基)甲氧基)羰基)氧基)乙基)硫代)半胱氨酸。
N-(4-((2-(2-(2-((3S,5S)-5-((S)-2-氰基-4,4-二氟吡咯烷-1-羰基)-2-氧代吡咯烷-3-基)乙酰基)-2,3,7,7a-四氢-1H-异吲哚-4-甲酰胺基)乙基)氨基)-4-氧代丁酰基)-S-((2-((((5-(6-(5-((2,4-二氟苯基)磺酰氨基)-6-甲氧基吡啶-3-基)喹啉-4-基)吡啶-2-基)甲氧基)羰基)氧基)乙基)硫代)半胱氨酸的合成：
方案13
Figure BDA0003645599830000941
将N-(2-氨基乙基)-2-(2-((3S,5S)-5-((S)-2-氰基-4,4-二氟吡咯烷-1-羰基)-2-氧代吡咯烷-3-基)乙酰基)异吲哚啉-4-甲酰胺(化合物53，97.6mg，0.2mmol，1.0当量)溶解在DCM(2mL)中，然后添加琥珀酸酐(24mg，0.24mmol，1.2当量)，随后添加DIPEA(51.6mg，0.4mmol，2当量)。将所得混合物保持8小时。在减压下除去溶剂。将剩余物用制备型RP-HPLC[A＝2mM乙酸铵缓冲液(pH 7.0)，B＝乙腈，溶剂梯度为5％B至55％B持续60分钟]进行纯化，以产生4-((2-(2-(2-((3S,5S)-5-((S)-2-氰基-4,4-二氟吡咯烷-1-羰基)-2-氧代吡咯烷-3-基)乙酰基)异吲哚啉-4-羧酰氨基)乙基)氨基)-4-氧代丁酸(化合物71)。LC/MS(m/z)：[M+H]精确质量：588.21g/mol。使用H-Cys(Trt)-2-Cl-Trt(1.2当量)将4-((2-(2-(2-((3S,5S)-5-((S)-2-氰基-4,4-二氟吡咯烷-1-羰基)-2-氧代吡咯烷-3-基)乙酰基)异吲哚啉-4-羧酰氨基)乙基)氨基)-4-氧代丁酸(化合物71，117.6mg，0.2mmol，1.0当量)引入到具有HATU(91.2mg，0.24mmol，1.2当量)和DIPEA(51.6mg，0.4mmol，2.0当量)的固相肽偶联条件。使用TFA:水:TIPS:乙二硫醇(95％:2.5％:2.5％:2.5％)的混合溶液将终产物从树脂上裂解下来。将粗化合物在***中沉淀以得到(4-((2-(2-(2-((3S,5S)-5-((S)-2-氰基-4,4-二氟吡咯烷-1-羰基)-2-氧代吡咯烷-3-基)乙酰基)异吲哚啉-4-羧酰氨基)乙基)氨基)-4-氧代丁酰基)半胱氨酸(化合物72)。LC/MS(m/z)：[M+H]精确质量：691.22。将(5-(6-(5-((2,4-二氟苯基)磺酰胺基)-6-甲氧基吡啶-3-基)喹啉-4-基)吡啶-2-基)甲基(2-巯基乙基)碳酸酯(7.46mg，0.01mmol)和(4-((2-(2-(2-((3S,5S)-5-((S)-2-氰基-4,4-二氟吡咯烷-1-羰基)-2-氧代吡咯烷-3-基)乙酰基)异吲哚啉-4-羧酰氨基)乙基)氨基)-4-氧代丁酰基)半胱氨酸(化合物72，6.91mg，0.01mmol)溶解在DMF(1mL)中并搅拌。在反应完成之后，将粗产物通过制备型RP-HPLC[A＝2mM乙酸铵缓冲液(pH 7.0)，B＝乙腈，溶剂梯度为5％B至75％B持续60分钟]进行纯化，以得到N-(4-((2-(2-(2-((3S,5S)-5-((S)-2-氰基-4,4-二氟吡咯烷-1-羰基)-2-氧代吡咯烷-3-基)乙酰基)-2,3,7,7a-四氢-1H-异吲哚-4-甲酰胺基)乙基)氨基)-4-氧代丁酰基)-S-((2-((((5-(6-(5-((2,4-二氟苯基)磺酰氨基)-6-甲氧基吡啶-3-基)喹啉-4-基)吡啶-2-基)甲氧基)羰基)氧基)乙基)硫代)半胱氨酸(化合物73)。LRMS-LCMS(m/z)：C60H58F4N11O14S3的[M+H]+计算值为1328.3；实测值1328.2)。
细胞培养
在37℃下在5％CO2和95％湿润气氛中在由RPMI 1640、DMEM和EMEM、10％FBS、1％青霉素-链霉素、1％2mM谷氨酰胺组成的培养基中培养FaDu、HT29、MDA-MB231、KB、4T1PANC1、U87MG、LaNCap以及经人FAP转染的HEK-FAP和HT1080-FAP细胞。本研究中使用的细胞是通过解冻来自从ATCC购买的原始细胞系保存的母液(master stock)的冷冻小瓶开始的。所有实验均在细胞解冻之后的2至5代内进行。没有对任何细胞系进行支原体测试。
动物饲养
5至6周龄的雌性无胸腺nu/nu小鼠购自Harlan实验室，并允许随意取食正常啮齿动物食物和水。将动物维持在标准的12小时明暗循环中。所有动物程序均通过普渡动物护理和使用委员会(Purdue Animal Care and Use Committee)批准。
FAP靶向配体的共焦结合研究
方法1：将HT1080-FAP细胞(1000000个细胞/孔)接种在4孔共焦板中。允许细胞在37℃下在24小时内作为单层生长，并在37℃下在PBS中的1％FBS中与3.0nM(最低)至25nM(最高)的不同浓度的缀合物一起孵育1小时。将细胞用1％FBS(3×500μL)洗涤，并将细胞置于500μl的1％FBS中，并用共焦显微术获取图像。再次，用生长培养基替换细胞中的PBS，并将细胞在37℃下再孵育8至48小时。在37℃下在化合物的不同浓度下获得的图像在图3中示出，在不同时间点下的图像在图4中示出，以及具有100倍过量的竞争配体的图像在图5中示出。
方法2：将经人FAP转染的HT1080-FAP细胞(100,000)平板接种在4孔共焦板上并与不同浓度(50nM、25nM、12.5nM、6.25nM、3.125nM和1.65nM)的该化合物在37℃下孵育1小时。通过用培养基洗涤细胞3次来除去未结合的荧光，并使用Olympus共焦显微镜对结合细胞的荧光进行成像。实验以一式三份进行。
结合测定
方法1：将HT1080-FAP细胞(200000个细胞/孔)接种在24孔板中。允许细胞在24小时内作为单层生长，并在存在或不存在过量竞争配体(无染料的配体)的情况下与不同浓度的靶向FAP的罗丹明缀合物一起孵育。在4℃下孵育1小时之后，将细胞用PBS洗涤3次以除去未结合的荧光。然后将细胞溶解在1％SDS中，并使用Neo2读板器来测量结合细胞的荧光。结果在图6中示出。
方法2：将100,000个HT1080-hFAP和HT1080细胞接种在经胺包被的24孔板中以确保细胞黏附。在形成单层之后，在存在或不存在过量的未经标记配体的情况下，将细胞与不同浓度的化合物一起孵育。在孵育1小时之后，将细胞用培养基洗涤3次以除去未结合的荧光并溶解在1％SDS中。使用设置为
Figure BDA0003645599830000961
和
Figure BDA0003645599830000962
的荧光分光光度计(NeO2读板器)来测量结合细胞的荧光。将结合细胞的荧光针对不同浓度进行作图，并通过在GraphPad prism7中使用单点结合(双曲线)曲线拟合来确定表观Kd。实验以一式三份进行。
离体荧光成像和生物分布：
用5×106KB、MDA-MB231、HT29、U87MG、FaDu、PANC1(含20％基质胶)皮下注射雌性nu/nu无胸腺(5至6周龄)小鼠并且用0.1mL无菌PBS中的4T1细胞注射BalbC小鼠。允许肿瘤生长到约250至600mm3，然后开始成像研究。在存在或不存在10至500倍过量的未经标记的配体的情况下，对每只荷瘤小鼠(通过尾静脉)静脉内注射5nmol到10nmol的化合物。针对所有肿瘤在两个不同的时间点(在注射之后2小时和6小时)使用AMI仪器获取全身图像，随后使用CO2窒息进行安乐死。在进行全身成像之后，收获目的器官并成像以量化荧光积累。图像采集参数如下：i)灯位(lamp level)-高；ii)激发-745nm；iii)发射-810；iv)分档(binning)(M)4M；(v)光圈级数(f-stop)-4；(vi)FOV-12.5；(vii)采集时间，5秒；(viii)功率55。在2小时、6小时、8小时、24小时、32小时、48小时、72小时、96小时和/或122小时获取图像。
Western印迹分析：
在共孵育24小时之后，除去上清液，并用磷酸缓冲盐水(phosphate-bufferedsaline，PBS)洗涤细胞。收获细胞并将其裂解用于Western印迹分析。使用10％十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶，并通过凝胶电泳分析样品，随后封闭。然后将硝酸纤维素膜与抗体一起孵育以检测磷酸化的Akt^Ser473和α肌动蛋白，并通过Odyssey CLx成像***使信号显现(图23)。
定量PCR
使用Quick-RNA Microprep试剂盒基于制造商的说明(Zymo Research；目录号R1050)来提取RNA。将提取的RNA与试剂盒提供的DNA酶I在室温下孵育15分钟。通过高容量cDNA逆转录试剂盒根据制造商说明(Thermo Fisher；目录号4368814)对RNA进行逆转录。然后将cDNA与Cyber-green supermix以及人胶原蛋白1a1和人α平滑肌肌动蛋白的引物混合，以进行定量PCR以分析这两种促纤维化标志物的表达(图24)。

Claims (39)

1.化合物，其由式(X)结构表示：
Am-L-B (X)
其中：
A是成纤维细胞活化蛋白α(FAPα)配体的基团；
L是将一个或更多个A基团与B连接的接头；
B是以下的基团：光学染料、光动力学治疗剂、放射成像剂、放射治疗剂、化学治疗剂、抗纤维化剂或抗癌剂；并且
m是1至6。
2.权利要求1所述的化合物，其中A具有式(X-A)结构：
Figure FDA0003645599820000011
其中：
Q是芳基、杂芳基或杂环基；
Z是键、经取代或未经取代的C1-C3亚烷基、经取代或未经取代的亚杂烷基、氨基、-O-或-S-；
T是经取代或未经取代的亚甲基、经取代或未经取代的氨基、-O-或-S-；
R1和R2各自独立地选自-H、-CN、-CHO、-B(OH)2、-C(O)烷基、-C(O)芳基-、-C＝C-C(O)芳基、-C＝C-S(O)2芳基、-CO2H、-SO3H、-SO2NH2、-PO3H2、-SO2F、-CONH2和5-四唑基；
R3和R4各自独立地选自-H、-OH、F、Cl、Br、I、-C1-6烷基、-O-C1-6烷基和-S-C1-6烷基；并且
R5、R6、R7和R8各自独立地选自H、烷基和卤素。
3.权利要求1或权利要求2所述的化合物，其中A具有式(X-B)结构：
Figure FDA0003645599820000021
其中：
Q是芳基、杂芳基或杂环基；
T是经取代或未经取代的亚甲基、经取代或未经取代的氨基、-O-或-S-；
J是C(RJ)2，其中每个RJ独立地是H或烷基，或者两个RJ一起形成氧代；
R1和R2各自独立地选自-H、-CN、-CHO、-B(OH)2、-C(O)烷基、-C(O)芳基-、-C＝C-C(O)芳基、-C＝C-S(O)2芳基、-CO2H、-SO3H、-SO2NH2、-PO3H2、-SO2F、-CONH2和5-四唑基；
R3和R4各自独立地选自-H、-OH、F、Cl、Br、I、-C1-6烷基、-O-C1-6烷基和-S-C1-6烷基；
R5、R6、R7和R8各自独立地选自H、烷基和卤素；并且
R9、R10和R11各自独立地选自H、-C1-6烷基、-C1-6卤代烷基、-O-C1-6烷基、-S-C1-6烷基、F、Cl、Br和I。
4.权利要求1至3中任一项所述的化合物，其中A选自以下：
Figure FDA0003645599820000031
5.权利要求1至3中任一项所述的化合物，其中A选自以下：
Figure FDA0003645599820000041
6.权利要求1至5中任一项所述的化合物，其中A对FAPα的结合亲和力为约1nM至约25nM。
7.权利要求1至6中任一项所述的化合物，其中L包含一个或更多个接头基团，每个接头基团独立地选自(亚)烷基、(亚)杂烷基、(亚)杂环烷基、杂芳基、芳基、烷氧基、硫醚、二硫化物、羧酸、酸酐、碳酸酯、氨基甲酸酯、硫醚、糖和肽。
8.权利要求1至7中任一项所述的化合物，其中L包含一个或更多个接头基团，每个接头基团独立地选自聚乙二醇(PEG)、(亚)烷基、二硫化物、酰胺、羧酸、酸酐、碳酸酯、酯、氨基甲酸酯、硫醚、苯基和***。
9.权利要求1至8中任一项所述的化合物，其中L包含一个或更多个接头基团，每个接头基团独立地选自聚乙二醇(PEG)、(亚)烷基、二硫化物、酰胺、羧酸、碳酸酯和酯。
10.权利要求1至8中任一项所述的化合物，其中L是可释放接头。
11.权利要求1至8中任一项所述的化合物，其中L包含一个或更多个接头基团，每个接头基团独立地选自聚乙二醇(PEG)、(亚)烷基、酰胺、苯基和***。
12.权利要求1至8和11中任一项所述的化合物，其中L是不可释放接头。
13.权利要求1至12中任一项所述的化合物，其中：
L是(L1)o-Y-(L2)p，其中：
每个L1是第一接头；
每个L2是第二接头；
Y是第三接头；
o是1至5的整数；并且
p是1至5的整数。
14.权利要求13所述的化合物，其中每个L1和L2独立地包含一个或更多个接头基团，每个接头基团独立地选自(亚)烷基、(亚)杂烷基、(亚)杂环烷基、杂芳基、芳基、烷氧基、硫醚、二硫化物、羧酸、酸酐、碳酸酯、氨基甲酸酯、硫醚、糖和肽。
15.权利要求13所述的化合物，其中每个L1和L2独立地包含一个或更多个接头基团，每个接头基团独立地选自聚乙二醇(PEG)、(亚)烷基、二硫化物、酰胺、羧酸、酸酐、碳酸酯、酯、氨基甲酸酯、硫醚、苯基和***。
16.权利要求13所述的化合物，其中每个L1和L2独立地包含一个或更多个接头基团，每个接头基团独立地选自聚乙二醇(PEG)、(亚)烷基、二硫化物、酰胺、羧酸、碳酸酯和酯。
17.权利要求13至15中任一项所述的化合物，其中每个L1和L2独立地包含一个或更多个接头基团，每个接头基团独立地选自聚乙二醇(PEG)、(亚)烷基、酰胺、苯基和***。
18.权利要求13至17中任一项所述的化合物，其中Y具有胺核、芳族核。
19.权利要求13至17中任一项所述的化合物，其中Y具有胺核、芳族核亚烷基核。
20.权利要求1至19中任一项所述的化合物，其中L、L1、L2或其任意组合的长度独立地为15至200埃
Figure FDA0003645599820000051
21.权利要求1至20中任一项所述的化合物，其中L、L1、L2或其任意组合独立地包含具有以下结构的至少一个接头基团：
Figure FDA0003645599820000061
其中n是0至10。
22.权利要求1至21中任一项所述的化合物，其中L、L1、L2或其任意组合独立地包含具有以下结构的至少一个接头基团：
Figure FDA0003645599820000062
23.权利要求1至22中所述的化合物，其中L、L1、L2或其任意组合包含具有以下结构的至少一个接头基团：
Figure FDA0003645599820000063
其中n是1至32。
24.权利要求1至23中任一项所述的化合物，其中L具有以下结构：
Figure FDA0003645599820000064
25.权利要求1至24中任一项所述的化合物，其中B是(例如荧光)染料的基团。
26.权利要求1至25中任一项所述的化合物，其中所述化合物是成像剂并且B是荧光染料的基团。
27.权利要求1至24中任一项所述的化合物，其中B是抗癌剂或抗纤维化剂的基团。
28.权利要求1至24或27中任一项所述的化合物，其中所述化合物是化学治疗剂并且B是抗纤维化剂或抗癌剂的基团。
29.权利要求1至24、27或28中任一项所述的化合物，其中B是磷酸肌醇3-激酶(PI3K)抑制剂的基团。
30.权利要求1至24或27至29中任一项所述的化合物，其中B具有由下式表示的基团结构：
Figure FDA0003645599820000071
其中：
X选自以下：
Figure FDA0003645599820000072
31.权利要求1至24或27至30中任一项所述的化合物，其中B是具有以下结构的基团：
Figure FDA0003645599820000073
32.化合物，其具有以下结构：
Figure FDA0003645599820000081
33.化合物，其具有以下结构：
Figure FDA0003645599820000082
34.化合物，其具有以下结构：
Figure FDA0003645599820000091
35.化合物，其具有以下结构：
Figure FDA0003645599820000101
36.药物组合物，其包含权利要求1至35中任一项所述的化合物以及可药用载体。
37.用于在患有癌症或纤维化的对象中对所述癌症或所述纤维化进行成像的方法，所述方法包括向有此需要的对象施用有效量的权利要求1至26和35中任一项所述的化合物。
38.用于治疗炎性疾病或病症的方法，所述方法包括向有此需要的对象施用治疗有效量的权利要求1至35中任一项所述的化合物。
39.用于治疗癌症的方法，所述方法包括向有此需要的对象施用治疗有效量的权利要求1至35中任一项所述的化合物。
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