CN114891859A - 一种液相杂交捕获方法及其试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种液相杂交捕获方法,包括探针设计合成、文库构建和杂交捕获步骤,对杂交捕获进行了优化,能够用于多种不同来源的核酸样本捕获文库的构建,有效提高捕获效率,缩短实验时间,简化实验流程,用于靶标区域(Panel)捕获。
Description
技术领域
本发明涉及基因检测领域,具体涉及一种液相杂交捕获方法。
背景技术
核酸序列是生命信息的载体,而高通量测序技术已成为生物和医学领域的核心技术之一。高通量测序产生大量的数据,其中并非全部都是研究或者检测的目标序列。虽然测序成本已经大幅降低,但是由于全基因组测序数据量较高,成本仍然居高不下,解决这一问题的方案就是将全基因组测序变为靶向富集技术,靶标区域富集的NGS测序技术会忽略基因组中不感兴趣区域的信息,并将基因组中靶区域的信号放大,可以节约测序成本和测序时间。
靶向富集根据富集原理不同主要分为多重PCR扩增和靶向捕获。后者是基于探针的液相杂交捕获技术,是目前的主流,具有探针设计难度低、探针容错性高等优点。液相杂交捕获技术是在溶液中生物素标记的探针与靶区域特异性结合,通过链霉亲和素磁珠,对探针捕获到的目的片段进行富集。在这一过程中带有生物素标记的探针,以及杂交捕获的液相反应条件均对这一***捕获效率产生较大影响,对于大的靶标区域,杂交捕获效率较高,比如全外显子靶标区域(Panel,又称捕获区域),中靶率在80%以上;但是对于一些小的靶标区域(Panel),中靶率较低,比如10kb以下的小靶标区域,中靶在个位数以下。
探针序列长度的选择有多方面的考虑:首先,探针长度应保证其在特定的杂交体系中,不同的序列碱基组成下,杂交退火温度适宜,与靶序列的结合能力以及特异性最优;其次,应保证探针和靶序列的序列之间在存在一定程度错配的情况下,杂交退火温度下降不明显;最后,越长的探针合成难度越大,合成质量越难保证。目前,基于以上考虑,探针序列长度通常为40-120nt,主流的探针长度为120nt,且带有修饰(如生物素),其修饰基团则可与相应的亲和介质结合以完成对靶序列的“捕获”。探针的形式包括单链DNA、双链DNA、单链RNA、双链RNA等。
目前二代测序技术是应用最多的高通量测序技术,双向150bp是较为主流的测序读取模式。测序文库的平均***片段长度也多为100-400bp之间。过长的***片段其中间部分无法被读取,且过长的片段对测序流程中的多个PCR扩增步骤也提出了挑战。另外,对于FFPE、细胞外游离核酸等原始长度已经比较短的样本来说,也无法制备***片段更长的文库。那么,一个文库分子在进行杂交捕获的过程中,通常只能结合1-2个探针,这也意味着探针脱落的概率增加,靶序列的回收率降低。例如,一个长度为120bp靶序列,最多只能完整结合一条探针,即使可以结合两条探针,这两条探针也只能是部分结合。为了增加探针的结合能力和结合概率,可将探针缩短,或者采取叠瓦式的设计策略,即探针互相重叠设置,使得不同的靶序列片段均有更高的几率可以与探针有更为完整的结合。然而,即使是互相重叠的探针也不可能同时完整的结合在同一个靶片段之上。
对于经过了PCR扩增的测序文库来说,每个靶片段均存在多个拷贝,因此较低的回收率下也可以保证绝大部分原始的靶片段都有被捕获到的拷贝。并且杂交捕获技术通常靶向5kb以上的区域,而固有的非特异捕获可通过多种手段进行压缩,中靶率(靶序列在所有捕获到的序列中所占的比例)有一定保障。但是对于***片段长度较短,或是未经PCR扩增的测序文库,以及靶标区域占总和区域的比例过低的应用需求来说,目前主流的探针以及杂交捕获体系无法提供令人满意的回收效率及中靶率。
除此之外,液相杂交捕获流程非常耗时,从核酸样本到捕获文库的获取需要2-4天的时间;同时杂交捕获涉及的试剂种类较多、操作流程异常的繁琐,对于操作人员的技术要求较高,中途任何一个环节出现问题,均会影响捕获文库的表现。这些环节成为制约液相杂交捕获发展的关键技术瓶颈。
液相杂交捕获技术对于癌症肿瘤突变基因检测、拷贝数变异、甲基化状态分析的应用较为广泛,目前市面上有多款产品应用到基因检测和临床的应用研究,但是随着肿瘤早筛以及MRD热度的上升,对液相杂交捕获技术提出更高的要求。例如针对实体瘤MRD检测技术,首先针对原发肿瘤组织进行测序以鉴定患者特异性基因组变异图谱,然后设计靶标区域进行个性ctDNA检测分析。这就要求杂交捕获***对小靶标区域的兼容性、操作便捷性、实验流程简并性、自动化程度等方面提出更高要求。
因此,开发出一种回收效率及中靶率较高的探针,以及一套捕获效率高、均一、稳定且操作简便、涉及试剂种类少、耗时短的液相杂交捕获***,是解决当前市场痛点的出口。
发明内容
本发明目的在于针对现有技术中杂交富集溶液繁复、反应时间长等局限,提供一种液相杂交捕获方法。
为实现上述目的,本发明提供如下技术方案:
一种液相杂交捕获方法,其特征在于,包括如下步骤:
(1)探针设计:根据核酸目标区域设计探针池,该探针包括与另一探针互补配对的探针结合序列以及与核酸靶序列互补配对的靶特异性序列,按照该序列合成寡核苷酸并对其5’或3’末端进行生物标记物修饰;
(2)文库建构;
(3)杂交捕获
i.配置杂交体系:该杂交体系包含前述探针;
ii.杂交反应:将前述杂交体系置于57~63℃进行杂交1~2小时;
(4)产物捕获:杂交反应结束后,反应体系中加入链酶亲和素磁珠进行杂交捕获;
(5)产物洗脱:捕获结束后,使用洗脱缓冲液I、洗脱缓冲液II以及洗脱缓冲液III各洗涤1次;
(6)产物扩增纯化:洗涤结束后,加入PCR反应体系,进行PCR扩增程序,反应结束后,使用磁珠进行纯化。
优选地,上述探针结合序列包括第一探针结合序列和第二探针结合序列。
更优选地,上述探针的5’端具有与另一探针的3’端互补配对的第一探针结合序列,并且该探针的3’端具有与另一探针的5’端部互补配对的第二探针结合序列。所述探针结合序列长度为k,其退火温度小于探针与靶序列结合的退火温度,且选择总和序列长度为k的所有序列组合的出现次数的最小值。
优选地,上述探针结合序列的长度为8-30nt。
优选地,上述靶特异性序列的长度为20-80nt。
更优选地,上述探针5’端与另一探针互补配对的第一探针结合序列长度为20-80nt,探针3’端与另一探针互补配对的第二探针结合序列长度为8-30nt。
优选地,上述生物标记物可以是氨基酸、生物素(Biotin)、多肽标签、肝素、多糖或脂类。
优选地,上述杂交体系中包含2~10fmol的探针、1×Hyb Buffer、1×Enhance、1ugHuman Cot-1,以及100pmmol的Blocker。
更优选地,上述杂交体系中的探针浓度为6fmol。
优选地,上述杂交反应的条件为95℃变性2分钟、60℃杂交1小时。
优选地,上述产物捕获的条件为58℃捕获20分钟。
优选地,上述PCR反应体系包括2×HiFi PCR Master Mix、5μL Index Primer Mix以及20μL TE。
优选地,上述核酸来自新鲜组织、冰冻组织、石蜡包埋组织、胸腹水、血浆或肿瘤脱落细胞组织。
优选地,上述核酸为血浆游离DNA、基因组DNA或RNA。
优选地,上述文库构建按照核酸片段大小为200~250bp构建DNA文库。
优选地,上述文库建构包括对RNA样本进行反转录、一链以及二链合成。
优选地,上文库建构包括将核酸片段进行末端修复和接头连接。
优选地,上述洗脱缓冲液I的配方为5×SSPE、0.5%~5%SDS;洗脱缓冲液II的配方为2×SSPE、0.05%~0.5%SDS;洗脱缓冲液III的配方为0.1×SSPE、0.005%~0.05%SDS。
本发明还提供探针池的设计方法,包括以下步骤:
(1)输入捕获前文库信息和设计参数,生成序列信息,其中,序列信息包括总和序列信息和靶序列信息,设计参数包括探针与靶序列结合的退火温度范围、序列长度范围;
(2)统计总和序列正链及互补链中长度为k的所有序列组合的出现次数,其中k小于探针与靶序列结合区的序列长度范围的最小值;
(3)选择探针与探针间互补配对的探针结合序列,其中,前述探针结合序列长度为k,其退火温度小于探针与靶序列结合的退火温度,且其在总和序列中出现的次数较少,优选地,出现次数小于平均值5%;
(4)选择探针与核酸靶序列结合的靶特异性序列,其中,选择第i个靶序列,i的初始值等于1;接着从选择的靶序列,其第n个碱基开始选取探针与核酸靶序列结合的靶特异性序列,n的初始值等于1;
(5)在靶特异性序列的5’端加上探针结合序列,3’端加上探针结合序列的反向互补序列;
(6)输出所有的探针序列。
优选地,上述探针与核酸靶序列结合的靶特异性序列,其特异性的评估若评估为高特异性,则放入探针池,并在该碱基n加上一个数字m1进行间隔;若评估为低特异性,则不放入探针池,并在该碱基n加上一个数字m2进行间隔;
其中,数字m1值大于或等于探针与靶特异性序列的长度;数字m2值小于或等于探针与靶特异性序列长度范围的最小值。
优选地,选择探针与核酸靶序列结合的靶特异性序列,其步骤包括:当n小于第i个靶序列的长度时,选择下一个靶特异性序列;当n大于或等于第i个靶序列的长度时,选择第i个靶特异性序列。当第i个靶序列的靶特异性序列选择结束后,对第i+1个靶序列进行上述靶特异性序列选择,直到所有靶序列均完成靶特异性序列选择。
除此之外,本发明还提供一种液相杂交捕获试剂盒,其包括如下组分:探针、杂交反应液、洗脱缓冲液、核酸纯化磁珠;该探针包括与另一探针互补配对的探针结合序列以及与核酸靶序列互补配对的靶特异性序列。
优选地,上述试剂盒还包括末端修复酶混合物、末端修复反应缓冲液、含分子标签的接头、文库扩增引物、PCR预混液、接头封闭剂、DNA封闭剂、杂交增强剂、磁珠洗涤液、捕获文库PCR引物。
另一方面,本发明还提供了液相杂交捕获方法在基因组靶区域捕获中的应用。
优选地,该方法应用于检测核酸片段中的低频突变检测、染色体拷贝数变异分析、***/缺失、融合基因检测;或用于靶向mNGS测序,病原体开展流行病学检测。
与现有技术相比,本发明的方法有益效果在于:
(1)杂交捕获***各流程做了优化设计,兼顾自动化工作站的应用需求,步骤之间衔接性较高,一改传统杂交捕获流程繁琐的弊端,手动操作友好度较高,落地到自动化工作站的可实施性也较高。
(2)该杂交捕获***捕获效率较高,探针侧壁互补配对,可显著提高探针与靶标结合能力,提高靶标区域的杂交捕获效率、提高整体的覆盖均一性以及稳定性。
附图说明
构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解,本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明,并不构成本发明的不当限定。在附图中:
图1为本发明探针的结构示意图,探针主要由4个部分组成:与靶基因互补的P-Cap区、3’端的P-L区以及5’端的P-R区,其中探针的5’端有生物素(Biotin)标记,P-L和P-R有一段序列互补。
图2为常规杂交捕获***与本发明杂交捕获***流程的比较图。
图3为不同类型样本的实验方案。
图4为常规120nt探针、现有技术使用的短探针,以及本发明探针的结构示意图,其中T代表样本核酸的靶片段,P代表探针。
图5为常规120nt探针、现有技术使用的短探针、本发明探针杂交捕获文库NGS的实验结果。
图6为常规120nt探针与本发明探针用于PCR-free文库的捕获效果。
图7为本发明探针浓度测试结果。
图8为本发明探针杂交温度测试结果。
图9为本发明探针杂交时间测试结果。
具体实施方式
以下结合附图与具体实施例对本发明做进一步的描述,本发明的保护内容不局限于以下实施例。还应该理解,本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案,而不是为了限制本发明的保护范围,并不是唯一性限定。在不背离发明构思的精神和范围下,本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中,并且以所附的权利要求及其任何等同物为本发明的保护范围。
本文中使用的所有技术和科学术语具有被本发明所属领域技术人员普遍理解的相同含义。在其他情况下,本文使用的某些术语会在说明书中阐明其含义。下列实施例中未注明具体条件的实验方法,均为本领域技术人员的普遍知识和公知常识。实施例中使用的试剂,如果没有特别说明,在满足实验要求的情况下,均购自试剂公司。本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
通过以下详细说明结合附图可以进一步理解本发明的特点和优点。所提供的实施例仅是对本发明方法的说明,而不以任何方式限制本发明揭示的其余内容。
本发明提供了一套用于核酸捕获的探针,探针分别针对靶区域的正义链以及负义链设计,正义链探针以及负义链探针均采用无重叠的排列方式,探针3’端或5’端有生物素修饰,该生物素能够与链酶亲和素磁珠结合。
探针主要由三部分组成,中间区段为靶序列结合区段,5’和3’区段为稳定性增强区段,一条探针的5’端区段可与另一条探针的3’端区段互补配对,3’端区段可与另一条探针的5’端区段互补配对。其中,探针之间互补配对的片段分别是P-L片段以及P-R片段,L的3’端或R的5’端有生物素修饰,能够与磁珠上的链酶亲和素结合;探针与靶区域互补配对的片段为P-Cap片段,P-Cap长度在20-80nt之间(图1)。
探针设计方法如下:
根据待检基因的位置设计探针,若针对突变、***或缺失突变,选取覆盖相应片段的区域设计探针;若针对融合基因设计探针,选取融合基因断点两侧的基因设计探针;
若需要捕获正义链,探针会针对正义链设计捕获探针;
若需要捕获反义链,探针会针对反义链设计捕获探针;
通过软件分析,剔除危险探针,危险探针会导致整个杂交捕获***严重脱靶,导致中靶率降低,靶区域捕获效率偏低,覆盖均一性变差。
本发明还提供了一套从核酸样本到靶向文库构建的***(参见图2),具体流程如下:
前述核酸样本包括DNA样本或RNA样本,DNA样本包括血浆游离DNA(cfDNA)、基因组DNA(gDNA)、FFPE样本、病毒或细菌基因组样本等;RNA样本包括新鲜组织样本、FFPE样本、病毒或细菌基因组样本等。
针对cfDNA样本,无需打断,可以直接进行建库;
针对完整基因组样本需要进行物理打断,将基因组DNA打断至200-250bp左右;
针对RNA样本,需要进行反转录、一链以及二链合成;
片段化之后的样本进行末端修复、接头连接以及连接产物纯化,纯化后的产物直接进行杂交捕获,杂交捕获方案与使用的接头相关,使用全长UDI接头模块,可以进行多文库混合杂交,杂交产物使用Primer Mix对混和杂交捕获的文库进行PCR扩增;若使用截短型分子标签接头模块,只能进行单个样本的杂交,含分子标签接头模块可以对样本进行低频突变检测,通过一致性序列分析过滤掉杂交模糊以及PCR扩增引入的背景噪音。此处同时兼容Illumina以及MGI测序平台的接头模块,构建适用于不同测序平台的DNA文库。
接头连接产物无需真空浓缩,直接配置杂交捕获反应体系,也可以带着上一步的纯化磁珠直接进行杂交捕获;
杂交体系使用本项目设计的特异性探针,可以进行快速杂交,杂交时间为1-2小时,捕获时间20分钟,缩短了杂交捕获的时间,PCR扩增对杂交捕获文库进行富集,此步PCR扩增扩增方案与使用的接头模块相关,使用分子标签接头模块时,搭配含Barcode序列的引物进行PCR扩增,若使用全长接头模块,搭配Primer Mix对靶向富集的DNA文库进行扩增(参见图3)。
本***所选择的杂交捕获时间为1小时到16小时,最优的捕获时间为1小时。
本***所选择的杂交不捕获温度为59-61℃,最优捕获温度为60℃左右,温度选择与探针长度、靶区域GC含量以及杂交捕获时间相关。
本***杂交捕获文库构建,即从样本到捕获文库获取共需要6小时,相比传统的2天到4天,简化操作步骤的同时,大大缩短了全流程操作时间。
本发明还提供了杂交捕获试剂组分及其使用方法,具体内容如下:
接头连接产物使用2倍Beads纯化,且纯化产物使用试剂盒配置的磁珠洗涤液(Beads Wash Buffer),磁珠洗涤液为4mL乙腈加入1mL H2O。
杂交捕获反应体系使用的试剂详见表1。
表1
杂交***共涉及3种洗脱缓冲液,分别是洗脱缓冲液I、洗脱缓冲液II以及洗脱缓冲液III,三种洗脱缓冲液配方参见表2。
表2
本发明探针与常规120nt探针、短探针的结构示意图见图4。以下实施例1--3将针对本发明的探针与现有技术常用的探针进行效果比较,并将本发明的探针以NC探针代称。
本发明的试剂盒中各组分配置的量可以由本领域技术人员根据预定目的来确定,包括任意配置量的上述各组分的试剂盒均在本发明的保护范围内。
本发明的试剂盒还可包括使用说明书。“使用说明书”通常包括描述在使用试剂盒的组分来实现所需结果时采用的技术的明确表述。任选地,试剂盒还可含有其它适用组分,如稀释剂、缓冲剂、药学上可接受的载体或将易于由本领域技术人员认识到的其它适用附件。实施例1:常规120碱基探针与短探针的杂交捕获效果比较
本实施例中,捕获前文库为人血浆游离DNA文库,来源于人基因组DNA的断裂和向血液循环***的释放,即总和序列为全部的人基因组序列。设定的靶序列位于表3中所示的区间,包含与肿瘤相关的一系列高频体细胞突变位点。
表3.靶序列在hg19版本人基因组上所处的位置
该靶序列总长度仅为1.2kb,若以常规的120nt探针覆盖,需要44条探针,44条常规120nt探针如表4所示。本实验以Hybrid Capture Reagents进行杂交捕获,得到的捕获文库在Illumina Novaseq6000上测序。测序数据中,平均99.9%的序列可以比对到人参考基因组上,其中平均11.7%位于靶标区域,120nt探针的中靶率过低无法满足要求。
表4.表3中覆盖靶标区域的常规120nt探针
血浆游离DNA片段长度分布最集中的区间是在160bp左右,故而不一定有探针能完整地与之结合,探针与靶序列结合的整体不够稳固。再加上靶标区域占整个基因组的比例非常小,仅约1/2500000,故中靶率偏低的结果也是可以预期的。
为了提高每个片段与探针结合的概率,采用短探针来进行捕获。利用较短的探针长度,我们希望每个160bp待富集片段存在4条探针可以与之结合,即探针长度不超过40nt。探针的目标退火温度设为65度。探针长度较短则退火温度受序列碱基组成的影响较大,因此探针池的设计方法与常规的120nt探针不同,需要在一定范围内调整探针长度,使其退火温度接近目标值。按照本发明提供的探针池设计方法的部分步骤(a,d,g,优选部分m1=40,m2=5)进行探针池设计,总和序列为人参考基因组hg19,靶标序列为如表3所示的靶标区域序列,输入探针长度范围参数35-40nt,探针退火温度65度。得到的短探针如表5所示,长度约40bp,共97条。捕获文库NGS数据分析后,显示平均99.9%的序列可以比对到人参考基因组上,其中平均23.4%位于靶标区域。虽然中靶率有了较为明显的提升,但仍然低于常规的杂交捕获50%的中靶率要求。显见即使直接缩短探针并在重叠探针增加探针密度进行捕获,中靶率仍无法达到50%的基本要求。
表5.表3中覆盖靶标区域的短探针
实施例2:常规120bp探针与NC探针的杂交捕获效果比较
本实施例中,展示了NC探针与常规120bp探针捕获人血浆游离DNA文库与实施例1中相同靶标区域的捕获结果比较。
NC探针在表5所示短探针序列的基础上增加了探针相互结合的序列。根据本发明提供的探针池设计方法,总和序列为人参考基因组hg19,靶标序列为如表3所示的靶标区域序列,探针长度范围设定为35-40nt,探针退火温度设定为65度。探针相互结合区序列长度设为8,即k=8。8碱基所有可能的序列组合共有65536个,在人参考基因组hg19中均有出现,平均出现次数为88419次,从出现次数较低的序列中,选取的探针相互结合序列为CGTCGGTC,其互补序列为GACCGACG,出现次数为2078次。此序列作为探针互相结合序列加到表5中探针的两侧。
表6.表3中覆盖靶标区域的NC探针
结果如图5所示,NC探针捕获文库NGS数据显示,99.9%的序列可以比对到人参考基因组上,其中位于靶标区域的比例平均为56.0%,达到了常规的杂交捕获中靶率要求。
实施例3:NC探针用于PCR-free文库的靶向捕获
PCR-free文库是指连接了NGS接头,但是没有经过PCR扩增的文库,其保留了原始的序列信息,且尚未引入PCR偏好。直接以PCR-free文库进行杂交捕获面临着杂交投入量少,捕获得率无法保证的困难。经过了PCR扩增的文库,每个原始片段都有多个拷贝,因此有多个被探针结合并捕获到的机会。而PCR-free文库中的任何一个片段如果没有被探针捕获到,则无法进入后续步骤,造成信息损失。并且,PCR后的文库片段,每一条单链均生成了对应的互补链,因此探针只需要一个方向的设计,就可以捕获到来自原始片段两条链的信息。而PCR-free文库中,一个片段的正向负向两条链都是单一存在,如果只以其中一个方向的探针进行捕获,则互补链也会丢失。因此在本实施例中,增加了另一条链的探针。常规120bp的另一条链探针如表7所示,NC探针的另一条链探针如表8所示。
如图6所示,30ng血浆游离DNA PCR-free文库经表4和表7中的常规120bp探针捕获后,NGS结果显示,平均中靶率仅为5.6%,正链平均去重后覆盖深度为356.1x,负链平均去重后深度为329.9x。而经表6和表8中所示的NC探针捕获后,NGS结果显示,平均中靶率达到48.7%,正链去重后平均深度为980.2x,负链去重后平均深度为1020.5x。可见,对于PCR-free文库,NC探针的回收率及中靶率都有大幅提升。
表7.表3中覆盖靶标区域的常规120bp探针的互补链探针
表8.表3中覆盖靶标区域的NC探针的互补链探针
测试本发明NC探针的基础效果后,实施例4-8进一步测试基于本发明NC探针的杂交捕获***及相关参数。
实施例4:最佳NC探针浓度测试
不同浓度的NC探针对靶基因的捕获效率差异未知,通过设置不同浓度梯度探针的实验,寻找最佳探针浓度。具体实验方案参见下表9,按照本发明的探针设计思路,设计4.5kb的靶标区域,使用Promega标准品male(G1471 Promega-male),将样本打断至200-250bp左右。具体实验流程除各实验组探针浓度不同外,其他变量一致,结果数据参见图7。
表9
从Consensus depth结果分析来看,DS211或者SS信息与NC探针浓度呈正比,NC探针浓度较低时捕获到的有效文库信息较少,NC探针浓度越高,捕获到的有效文库信息越丰富,但是NC探针浓度太高会导致体系中含有过量的冗余NC探针,导致中靶率降低。本***采用的最优NC探针浓度在6-10fmol之间,更优的选择为6fmol的NC探针。
实施例5:最佳杂交捕获温度测试
本***使用的是NC探针,需要根据探针结构选择杂交捕获温度,为了确定最佳温度条件,进行了一系列测试,具体实验方案参见下表10,按照本发明的NC探针设计思路,设计4.5kb的靶标区域,使用Promega标准品male,将样本打断至200-250bp左右。具体实验流程除各实验组杂交捕获温度不同外,其他变量一致,结果数据参见图8。
表10
从建库效率以及Consensus depth结果分析来看,DS211或者SS含量受杂交捕获温度影响,60℃的杂交捕获温度表现优于其他两个温度条件,且60℃的捕获效率以及中靶率表现均高于其他杂交捕获温度。
为了确保60℃为最佳杂交条件,且该***不会对杂交温度过于敏感,接着测试了更为接近的杂交条件,比较59℃、60℃以及61℃的杂交条件下文库捕获效率差异(见表11),各实验组除杂交捕获温度不同外,其他变量一致,结果数据参见图8。
表11
实验分组 | 杂交捕获温度 |
Lib 1 | 59℃ |
Lib 2 | 60℃ |
Lib 3 | 61℃ |
从以上数据分析,杂交温度从59℃到61℃均表现出较优的捕获效率,本***采用60℃做为最终杂交捕获条件。
实施例6:缩短杂交捕获时间
传统杂交捕获***采用的杂交时间为16小时,本发明所采用的杂交时间可以由16小时缩短为1小时,并且缩短杂交时间并不会影响探针对DNA样本的捕获效率。
使用本***的杂交捕获条件进行实验,具体实验方案参见下表12,按照本发明的NC探针设计思路,先设计50kb的靶标区域,使用GW-OGTM800标准品,将样本打断至200-250bp左右。
实验流程如下:
gDNA打断至200bp左右(Covaris超声打断仪),进行末端修复、接头连接,接着利用等体积的Beads纯化核酸;该具体纯化流程如下:
3.将PCR管瞬时离心后放置于磁力架上5-10分钟至液体完全澄清,使用移液器吸取移弃上清;
4.加入200μL BW Buffer洗涤1次,静置2分钟,吸弃上清;
5.往反应体系中加入杂交反应液。
杂交体系中含有6fmol的探针、1×Hyb Buffer、1×Enhance、1ug Human Cot-1、100pmmol的Blocker,将配置的杂交反应***放置在温控仪反应,杂交反应条件如下:95℃变性2分钟、60℃杂交1小时或16小时。
杂交反应结束后,将上清转移到新的PCR管中,向PCR反应管中加入10μL M270Beads进行杂交捕获,60℃捕获20分钟。
捕获20分钟结束后,使用洗脱缓冲液I、洗脱缓冲液II以及洗脱缓冲液III各洗涤1次。
洗涤结束后,向M270Beads中加入PCR反应体系,PCR反应体系主要包括2×HiFiPCR Master Mix、5μL Index Primer Mix以及20μLTE;在PCR温控仪上启动PCR扩增程序,反应结束后,使用1倍体积磁珠进行纯化,纯化产物在平台测序。测试结果数据参见图9。
表12
实验分组 | 建库及杂交捕获试剂盒 | 杂交时间 |
Lib 1 | EASY Hybrid Capture System | 16小时 |
Lib 2 | EASY Hybrid Capture System | 16小时 |
Lib 3 | EASY Hybrid Capture System | 1小时 |
Lib 4 | EASY Hybrid Capture System | 1小时 |
从Consensus depth结果分析来看,DS211或者SS信息与杂交时间呈正比,杂交1小时已经捕获到90%以上的有效文库捕获,最终选择1小时杂交时间,控制整个实验流程在1天完成。
实施例7:小靶标区域NC探针PCR-free模式捕获与常规探针常规捕获流程的比较
为了比较对于小靶标区域,优化后的NC探针PCR-free模式与传统探针非PCR-free模式下的捕获表现,按照下表13的分组方式开展实验,其中组1采用传统方式构建靶向捕获文库,传统方式的杂交捕获***搭配120nt的探针;组2使用本发明NC探针的***构建PCR-free靶向捕获文库,针对同一区域设计捕获探针,探针覆盖基因组外显子区域,靶标区域大小为4kb左右。
表13
本实施例的数据表现参见表14,组1和组2覆盖平均率的接近100%,然而组2的中靶率为59%,比组1的11.73%还高,显见本发明NC探针的***可以有效提升中靶率。
表14.小靶标区域捕获效率高于传统杂交捕获
实施例8:对融合基因检测效率高于传统杂交捕获
融合基因是由于基因组重排造成两个基因的部分片段相接而产生的。可通过对重排断点两侧的区域进行捕获测序来检测和分析融合基因。由于跨断点的重排片段只有部分是原来的序列,对于常规探针来说,会出现只有部分区段可以结合的问题。而NC探针同样可以通过更多的探针结合可能性来提高融合基因的检测能力。
按照下面表15的分组方式开展实验,其中组1采用传统方式构建靶向捕获文库,传统方式的杂交捕获***搭配120nt的探针,设计覆盖ROS1内含子33的探针,检测CD74-ROS1融合;组2使用本发明构建靶向捕获文库,针对同一区域设计捕获探针,靶标区域为1kb左右。其中组1的具体实施流程参考简易杂交捕获试剂盒的商品说明书。
表15
样本为泛肿瘤800gDNA标准品(GW-OGTM800),该标准品包含多个经过数字PCR验证的突变位点,CD74-ROS1 Fusion就是其中之一,该位点理论突变频率为6%。
组2的具体实验流程参见实施例6,结果数据参见下表16。
表16.融合基因检测效果高于传统杂交捕获
融合位点常位于重复区域内,重复区域内的探针设计是捕获难题,而本***使用NC探针,对于融合基因的检测表现出一定的优势。本实验的GW-OGTM800标准品包含一组CD74-ROS1融合基因,数字PCR验证其突变频率为5%;组1、组2使用覆盖相同区域的探针进行杂交捕获,传统方法检测到融合基因频率在1.1%左右,而优化后的本发明***检测到融合基因频率在5.8%。
以上仅为本发明的优选实施例,并不用于限制本发明。本发明提及的所有文献都在本申请中全文引用作为参考。此外应理解,在阅读了本发明的上述讲授内容之后,凡在本发明的精神和原则之内,本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改,这些等价形式的修改同样落于本申请权利要求书所限定的范围。
序列表
<110> 纳昂达(南京)生物科技有限公司
<120> 一种液相杂交捕获方法及其试剂盒
<141> 2022-05-16
<160> 379
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 2
<211> 120
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 2
tgctgaaagc tgtaccatac ctgtctggtc ttggctgagg tttcaatgaa tggaatcccg 60
taactcttgg ccagttcgtg ggcttgtttt gtatcaactg tccttgttgg caaatcacac 120
<210> 2
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 2
tttcaatgaa tggaatcccg taactcttgg ccagttcgtg ggcttgtttt gtatcaactg 60
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<211> 120
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 3
gctattattg atggcaaata cacagaggaa gccttcgcct gtcctcatgt attggtctct 60
catggcactg tactcttctt gtccagctgt atccagtatg tccaacaaac aggtttcacc 120
<210> 4
<211> 120
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 4
attggtctct catggcactg tactcttctt gtccagctgt atccagtatg tccaacaaac 60
aggtttcacc atctataacc acttgttttc tgtaagaatc ctgggggtgt ggagggtaag 120
<210> 5
<211> 120
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 5
taccactggg cctcacctct atggtgggat catattcatc tacaaagtgg ttctggatta 60
gctggattgt cagtgcgctt ttcccaacac cacctgctcc aaccaccacc agtttgtact 120
<210> 6
<211> 120
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 6
ctcacctcta tggtgggatc atattcatct acaaagtggt tctggattag ctggattgtc 60
agtgcgcttt tcccaacacc acctgctcca accaccacca gtttgtactc agtcatttca 120
<210> 7
<211> 120
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 7
tttatttcag tgttacttac ctgtcttgtc tttgctgatg tttcaataaa aggaattcca 60
taacttcttg ctaagtcctg agcctgtttt gtgtctactg ttctagaagg caaatcacat 120
<210> 8
<211> 120
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 8
tttcaataaa aggaattcca taacttcttg ctaagtcctg agcctgtttt gtgtctactg 60
ttctagaagg caaatcacat ttatttccta ctaggaccat aggtacatct tcagagtcct 120
<210> 9
<211> 120
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 9
agcctgtttt gtgtctactg ttctagaagg caaatcacat ttatttccta ctaggaccat 60
aggtacatct tcagagtcct taactctttt aatttgttct ctgggaaaga aaaaaaagtt 120
<210> 10
<211> 120
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 10
agtattattt atggcaaata cacaaagaaa gccctcccca gtcctcatgt actggtccct 60
cattgcactg tactcctctt gacctgctgt gtcgagaata tccaagagac aggtttctcc 120
<210> 11
<211> 120
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 11
actggtccct cattgcactg tactcctctt gacctgctgt gtcgagaata tccaagagac 60
aggtttctcc atcaattact acttgcttcc tgtaggaatc ctgagaaggg agaaacacag 120
<210> 12
<211> 120
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 12
tttacctcta ttgttggatc atattcgtcc acaaaatgat tctgaattag ctgtatcgtc 60
aaggcactct tgcctacgcc accagctcca actaccacaa gtttatattc agtcattttc 120
<210> 13
<211> 120
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 13
gtccacaaaa tgattctgaa ttagctgtat cgtcaaggca ctcttgccta cgccaccagc 60
tccaactacc acaagtttat attcagtcat tttcagcagg ccttataata aaaataatga 120
<210> 14
<211> 120
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 14
tttccaatgg actattttag aagaaatgga gctgtcaccc acatcaagat tcagaacact 60
ggtgattact atgacctgta tggaggggag aaatttgcca ctttggctga gttggtccag 120
<210> 15
<211> 120
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 15
actggtgatt actatgacct gtatggaggg gagaaatttg ccactttggc tgagttggtc 60
cagtattaca tggaacatca cgggcaatta aaagagaaga atggagatgt cattgagctt 120
<210> 16
<211> 120
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 16
tcatgatgtt tccttcgtag gtgttgactg cgatattgac gttcccaaaa ccatccagat 60
ggtgcggtct cagaggtcag ggatggtcca gacagaagca cagtaccgat ttatctatat 120
<210> 17
<211> 120
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 17
gaggtcaggg atggtccaga cagaagcaca gtaccgattt atctatatgg cggtccagca 60
ttatattgaa acactacagc gcaggattga agaagagcag gtaccagcct gagggctggc 120
<210> 18
<211> 120
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 18
taggaaatag cagcctcaca ttgcccctga caacatagtt ggaatcactc atgatatctc 60
gagccaatcc aaagtcacat atcttcacca ctttcccgtg ggtgacaagc acgttcctgg 120
<210> 19
<211> 120
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 19
ttgcccctga caacatagtt ggaatcactc atgatatctc gagccaatcc aaagtcacat 60
atcttcacca ctttcccgtg ggtgacaagc acgttcctgg cggccaggtc tctgtgaaca 120
<210> 20
<211> 120
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 20
gttacctgac agtgtgcacg cccccagcag gttcacaata ttctcgtggc ttcccagctg 60
ggtcatcatc ttgagttctg acatgagtgc ctctctttca gagctgtctg ctttttctgt 120
<210> 21
<211> 120
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 21
cccccagcag gttcacaata ttctcgtggc ttcccagctg ggtcatcatc ttgagttctg 60
acatgagtgc ctctctttca gagctgtctg ctttttctgt caaagaaagg agcattaaaa 120
<210> 22
<211> 120
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 22
cattccattc ttaccaaact ctaaattttc tcttggaaac tcccatttga gatcatattc 60
atattctctg aaatcaacgt agaagtactc attatctgag gagccggtca cctgtaccat 120
<210> 23
<211> 120
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 23
ctaaattttc tcttggaaac tcccatttga gatcatattc atattctctg aaatcaacgt 60
agaagtactc attatctgag gagccggtca cctgtaccat ctgtagctgg ctttcatacc 120
<210> 24
<211> 120
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 24
tattacttgg gagacttgtc tgaacacttc ttccaggtcc aagatggtaa tgggtatcca 60
tccgagaaac aggacgcctg acttgccgat gcttctgcga gcacttgagg tttccctata 120
<210> 25
<211> 120
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 25
tgaacacttc ttccaggtcc aagatggtaa tgggtatcca tccgagaaac aggacgcctg 60
acttgccgat gcttctgcga gcacttgagg tttccctata gaaaagaacg tgtgaaataa 120
<210> 26
<211> 120
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 26
ccctctccac cctggcctac ctggtcgcca tgggcgtgcc tgccaatggt gatgggcttg 60
gtccagccag ggactaggcg tgggatgttt ttgcagatga tgggctcccg gaagacagtc 120
<210> 27
<211> 120
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 27
tgccaatggt gatgggcttg gtccagccag ggactaggcg tgggatgttt ttgcagatga 60
tgggctcccg gaagacagtc ccccccagga tgttccggat agttccattg ggacttttcc 120
<210> 28
<211> 120
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 28
cactcacctg gagtgagccc tgctcccccc tggctccttc ccagcctggg catccttgag 60
ttccaaggcc tcattcagct ctcggaacat ctcgaagcgc tcacgcccac ggatctgcag 120
<210> 29
<211> 120
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 29
tgctcccccc tggctccttc ccagcctggg catccttgag ttccaaggcc tcattcagct 60
ctcggaacat ctcgaagcgc tcacgcccac ggatctgcag caacagagga gggggagaag 120
<210> 30
<211> 120
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 30
gtgctccctg ggggcagctc gtggtgaggc tcccctttct tgcggagatt ctcttcctct 60
gtgcgccggt ctctcccagg acaggcacaa acacgcacct caaagctgtt ccgtcccagt 120
<210> 31
<211> 120
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 31
gtggtgaggc tcccctttct tgcggagatt ctcttcctct gtgcgccggt ctctcccagg 60
acaggcacaa acacgcacct caaagctgtt ccgtcccagt agattaccac tactcaggat 120
<210> 32
<211> 120
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 32
ctgacctgga gtcttccagt gtgatgatgg tgaggatggg cctccggttc atgccgccca 60
tgcaggaact gttacacatg tagttgtagt ggatggtggt acagtcagag ccaacctagg 120
<210> 33
<211> 120
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 33
gtgatgatgg tgaggatggg cctccggttc atgccgccca tgcaggaact gttacacatg 60
tagttgtagt ggatggtggt acagtcagag ccaacctagg agataacaca ggcccaagat 120
<210> 34
<211> 120
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 34
agacctcagg cggctcatag ggcaccacca cactatgtcg aaaagtgttt ctgtcatcca 60
aatactccac acgcaaattt ccttccactc ggataagatg ctgaggaggg gccagaccta 120
<210> 35
<211> 120
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 35
ggcaccacca cactatgtcg aaaagtgttt ctgtcatcca aatactccac acgcaaattt 60
ccttccactc ggataagatg ctgaggaggg gccagaccta agagcaatca gtgaggaatc 120
<210> 36
<211> 120
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 36
ctccagcccc agctgctcac catcgctatc tgagcagcgc tcatggtggg ggcagcgcct 60
cacaacctcc gtcatgtgct gtgactgctt gtagatggcc atggcgcgga cgcgggtgcc 120
<210> 37
<211> 120
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 37
gcctcacaac ctccgtcatg tgctgtgact gcttgtagat ggccatggcg cggacgcggg 60
tgccgggcgg gggtgtggaa tcaacccaca gctgcacagg gcaggtcttg gccagttggc 120
<210> 38
<211> 120
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 38
cgcggacgcg ggtgccgggc gggggtgtgg aatcaaccca cagctgcaca gggcaggtct 60
tggccagttg gcaaaacatc ttgttgaggg caggggagta ctgtaggaag aggaaggaga 120
<210> 39
<211> 120
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 39
aatgcaagaa gcccagacgg aaaccgtagc tgccctggta ggttttctgg gaagggacag 60
aagatgacag gggccaggag ggggctggtg caggggccgc cggtgtagga gctgctggtg 120
<210> 40
<211> 120
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 40
gaagggacag aagatgacag gggccaggag ggggctggtg caggggccgc cggtgtagga 60
gctgctggtg caggggccac ggggggagca gcctctggca ttctgggagc ttcatctgga 120
<210> 41
<211> 120
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 41
gcccttccaa tggatccact cacagtttcc ataggtctga aaatgtttcc tgactcagag 60
ggggctcgac gctaggatct gactgcggct cctccatggc agtgacccgg aaggcagtct 120
<210> 42
<211> 120
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 42
cacagtttcc ataggtctga aaatgtttcc tgactcagag ggggctcgac gctaggatct 60
gactgcggct cctccatggc agtgacccgg aaggcagtct ggctgctgca agaggaaaag 120
<210> 43
<211> 120
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 43
ttattgccaa catgacttac ttgatcccca taagcatgac gacctatgat gataggtttt 60
acccatccac tcacaagccg ggggatattt ttgcagataa tggcttctct gaagaccgtg 120
<210> 44
<211> 120
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 44
aggttttacc catccactca caagccgggg gatatttttg cagataatgg cttctctgaa 60
gaccgtgcca cccagaatat ttcgtatggt gccatttggt gatttccaca tttgtttcaa 120
<210> 45
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 45
caaatgctga aagctgtacc atacctgtct ggtct 35
<210> 46
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 46
gctgaggttt caatgaatgg aatcccgtaa ctctt 35
<210> 47
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 47
ccagttcgtg ggcttgtttt gtatcaactg tcctt 35
<210> 48
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 48
tggcaaatca cacttgtttc ccactagcac catag 35
<210> 49
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 49
acatcatccg agtcttttac tcgcttaatc tgctc 35
<210> 50
<211> 37
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 50
acttgctatt attgatggca aatacacaga ggaagcc 37
<210> 51
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 51
cgcctgtcct catgtattgg tctctcatgg cactg 35
<210> 52
<211> 0
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 52
<210> 53
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 53
caggtttcac catctataac cacttgtttt ctgtaagaat 40
<210> 54
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 54
cctgggggtg tggagggtaa gggggcaggg aggga 35
<210> 55
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 55
gggctaccac tgggcctcac ctctatggtg ggatc 35
<210> 56
<211> 38
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 56
attcatctac aaagtggttc tggattagct ggattgtc 38
<210> 57
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 57
tgcgcttttc ccaacaccac ctgctccaac cacca 35
<210> 58
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 58
agtttgtact cagtcatttc acaccagcaa gaacc 35
<210> 59
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 59
tatttatttc agtgttactt acctgtcttg tctttgctga 40
<210> 60
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 60
tgtttcaata aaaggaattc cataacttct tgctaagtcc 40
<210> 61
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 61
tgagcctgtt ttgtgtctac tgttctagaa ggcaa 35
<210> 62
<211> 39
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 62
cacatttatt tcctactagg accataggta catcttcag 39
<210> 63
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 63
gtccttaact cttttaattt gttctctggg aaagaaaaaa 40
<210> 64
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 64
aagttatagc acagtcatta gtaacacaaa tatctttcaa 40
<210> 65
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 65
tagtattatt tatggcaaat acacaaagaa agccctcccc 40
<210> 66
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 66
agtcctcatg tactggtccc tcattgcact gtact 35
<210> 67
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 67
tcttgacctg ctgtgtcgag aatatccaag agaca 35
<210> 68
<211> 38
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 68
tttctccatc aattactact tgcttcctgt aggaatcc 38
<210> 69
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 69
agaagggaga aacacagtct ggattattac agtgc 35
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<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 70
gatttacctc tattgttgga tcatattcgt ccacaaaatg 40
<210> 71
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 71
attctgaatt agctgtatcg tcaaggcact cttgc 35
<210> 72
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 72
acgccaccag ctccaactac cacaagttta tattc 35
<210> 73
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 73
tcattttcag caggccttat aataaaaata atgaaaatgt 40
<210> 74
<211> 39
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 74
ctttccaatg gactatttta gaagaaatgg agctgtcac 39
<210> 75
<211> 37
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 75
cacatcaaga ttcagaacac tggtgattac tatgacc 37
<210> 76
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 76
tatggagggg agaaatttgc cactttggct gagtt 35
<210> 77
<211> 38
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 77
tccagtatta catggaacat cacgggcaat taaaagag 38
<210> 78
<211> 39
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 78
gaatggagat gtcattgagc ttaaatatcc tctgaactg 39
<210> 79
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 79
cttcatgatg tttccttcgt aggtgttgac tgcga 35
<210> 80
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 80
ttgacgttcc caaaaccatc cagatggtgc ggtct 35
<210> 81
<211> 38
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 81
gtaccgattt atctatatgg cggtccagca ttatattg 38
<210> 82
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 82
acactacagc gcaggattga agaagagcag gtacc 35
<210> 83
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 83
cctgagggct ggcatgcgga ttctcattct cttgc 35
<210> 84
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 84
taagtaggaa atagcagcct cacattgccc ctgac 35
<210> 85
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 85
catagttgga atcactcatg atatctcgag ccaatc 36
<210> 86
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 86
aagtcacata tcttcaccac tttcccgtgg gtgac 35
<210> 87
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 87
gcacgttcct ggcggccagg tctctgtgaa cacac 35
<210> 88
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 88
gtgggttacc tgacagtgtg cacgccccca gcagg 35
<210> 89
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 89
cacaatattc tcgtggcttc ccagctgggt catca 35
<210> 90
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 90
ttgagttctg acatgagtgc ctctctttca gagct 35
<210> 91
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 91
ctgctttttc tgtcaaagaa aggagcatta aaaatgtaaa 40
<210> 92
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 92
ggcacattcc attcttacca aactctaaat tttctcttgg 40
<210> 93
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 93
aaactcccat ttgagatcat attcatattc tctgaaatca 40
<210> 94
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 94
acgtagaagt actcattatc tgaggagccg gtcac 35
<210> 95
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 95
gtaccatctg tagctggctt tcatacctaa attgc 35
<210> 96
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 96
tattacttgg gagacttgtc tgaacacttc ttccag 36
<210> 97
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 97
ccaagatggt aatgggtatc catccgagaa acagg 35
<210> 98
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 98
gcctgacttg ccgatgcttc tgcgagcact tgagg 35
<210> 99
<211> 37
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 99
tccctataga aaagaacgtg tgaaataagc tcactgg 37
<210> 100
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 100
atcccctctc caccctggcc tacctggtcg ccatg 35
<210> 101
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 101
cgtgcctgcc aatggtgatg ggcttggtcc agcca 35
<210> 102
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 102
gactaggcgt gggatgtttt tgcagatgat gggct 35
<210> 103
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 103
cggaagacag tcccccccag gatgttccgg atagt 35
<210> 104
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 104
cattgggact tttccacatc ttcttcagct tgaac 35
<210> 105
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 105
aggtcactca cctggagtga gccctgctcc cccct 35
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<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 106
ctccttccca gcctgggcat ccttgagttc caagg 35
<210> 107
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 107
tcattcagct ctcggaacat ctcgaagcgc tcacg 35
<210> 108
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 108
cacggatctg cagcaacaga ggagggggag aagta 35
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<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 109
agtgctccct gggggcagct cgtggtgagg ctccc 35
<210> 110
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 110
ttcttgcgga gattctcttc ctctgtgcgc cggtc 35
<210> 111
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 111
tcccaggaca ggcacaaaca cgcacctcaa agctg 35
<210> 112
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 112
ccgtcccagt agattaccac tactcaggat aggaa 35
<210> 113
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 113
ctcctgacct ggagtcttcc agtgtgatga tggtg 35
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<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 114
gatgggcctc cggttcatgc cgcccatgca ggaac 35
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<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 115
ttacacatgt agttgtagtg gatggtggta cagtc 35
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<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 116
agccaaccta ggagataaca caggcccaag atgag 35
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<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 117
ccagacctca ggcggctcat agggcaccac cacac 35
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<211> 37
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 118
tgtcgaaaag tgtttctgtc atccaaatac tccacac 37
<210> 119
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 119
aaatttcctt ccactcggat aagatgctga ggagg 35
<210> 120
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 120
ccagacctaa gagcaatcag tgaggaatca gaggc 35
<210> 121
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 121
ctccagcccc agctgctcac catcgctatc tgagc 35
<210> 122
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 122
cgctcatggt gggggcagcg cctcacaacc tccgt 35
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<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 123
tgtgctgtga ctgcttgtag atggccatgg cgcgg 35
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<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 124
gcgggtgccg ggcgggggtg tggaatcaac ccaca 35
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<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 125
tgcacagggc aggtcttggc cagttggcaa aacat 35
<210> 126
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 126
tgttgagggc aggggagtac tgtaggaaga ggaag 35
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<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 127
gacagagttg aaagtcaggg cacaagtgaa cagat 35
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<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 128
aatgcaagaa gcccagacgg aaaccgtagc tgccc 35
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<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 129
gtaggttttc tgggaaggga cagaagatga caggg 35
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 130
caggaggggg ctggtgcagg ggccgccggt gtagg 35
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<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 131
ctgctggtgc aggggccacg gggggagcag cctct 35
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<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 132
cattctggga gcttcatctg gacctgggtc ttcag 35
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 133
gcccttccaa tggatccact cacagtttcc atagg 35
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<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 134
tgaaaatgtt tcctgactca gagggggctc gacgc 35
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 135
ggatctgact gcggctcctc catggcagtg acccg 35
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<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 136
aggcagtctg gctgctgcaa gaggaaaagt gggga 35
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<211> 37
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 137
cattattgcc aacatgactt acttgatccc cataagc 37
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<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 138
gacgacctat gatgataggt tttacccatc cactc 35
<210> 139
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 139
aagccggggg atatttttgc agataatggc ttctc 35
<210> 140
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 140
aagaccgtgc cacccagaat atttcgtatg gtgcc 35
<210> 141
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 141
ttggtgattt ccacatttgt ttcaacttga actcctcaac 40
<210> 142
<211> 51
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 142
cgtcggtcca aatgctgaaa gctgtaccat acctgtctgg tctgaccgac g 51
<210> 143
<211> 51
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 143
cgtcggtcgc tgaggtttca atgaatggaa tcccgtaact cttgaccgac g 51
<210> 144
<211> 51
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 144
cgtcggtccc agttcgtggg cttgttttgt atcaactgtc cttgaccgac g 51
<210> 145
<211> 51
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 145
cgtcggtctg gcaaatcaca cttgtttccc actagcacca taggaccgac g 51
<210> 146
<211> 51
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 146
cgtcggtcac atcatccgag tcttttactc gcttaatctg ctcgaccgac g 51
<210> 147
<211> 53
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 147
cgtcggtcac ttgctattat tgatggcaaa tacacagagg aagccgaccg acg 53
<210> 148
<211> 51
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 148
cgtcggtccg cctgtcctca tgtattggtc tctcatggca ctggaccgac g 51
<210> 149
<211> 51
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 149
cgtcggtcct cttcttgtcc agctgtatcc agtatgtcca acagaccgac g 51
<210> 150
<211> 56
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 150
cgtcggtcca ggtttcacca tctataacca cttgttttct gtaagaatga ccgacg 56
<210> 151
<211> 51
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 151
cgtcggtccc tgggggtgtg gagggtaagg gggcagggag ggagaccgac g 51
<210> 152
<211> 51
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 152
cgtcggtcgg gctaccactg ggcctcacct ctatggtggg atcgaccgac g 51
<210> 153
<211> 54
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 153
cgtcggtcat tcatctacaa agtggttctg gattagctgg attgtcgacc gacg 54
<210> 154
<211> 51
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 154
cgtcggtctg cgcttttccc aacaccacct gctccaacca ccagaccgac g 51
<210> 155
<211> 51
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 155
cgtcggtcag tttgtactca gtcatttcac accagcaaga accgaccgac g 51
<210> 156
<211> 56
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 156
cgtcggtcta tttatttcag tgttacttac ctgtcttgtc tttgctgaga ccgacg 56
<210> 157
<211> 56
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 157
cgtcggtctg tttcaataaa aggaattcca taacttcttg ctaagtccga ccgacg 56
<210> 158
<211> 51
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 158
cgtcggtctg agcctgtttt gtgtctactg ttctagaagg caagaccgac g 51
<210> 159
<211> 55
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 159
cgtcggtcca catttatttc ctactaggac cataggtaca tcttcaggac cgacg 55
<210> 160
<211> 56
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 160
cgtcggtcgt ccttaactct tttaatttgt tctctgggaa agaaaaaaga ccgacg 56
<210> 161
<211> 56
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 161
cgtcggtcaa gttatagcac agtcattagt aacacaaata tctttcaaga ccgacg 56
<210> 162
<211> 56
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 162
cgtcggtcta gtattattta tggcaaatac acaaagaaag ccctccccga ccgacg 56
<210> 163
<211> 51
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 163
cgtcggtcag tcctcatgta ctggtccctc attgcactgt actgaccgac g 51
<210> 164
<211> 51
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 164
cgtcggtctc ttgacctgct gtgtcgagaa tatccaagag acagaccgac g 51
<210> 165
<211> 54
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 165
cgtcggtctt tctccatcaa ttactacttg cttcctgtag gaatccgacc gacg 54
<210> 166
<211> 51
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 166
cgtcggtcag aagggagaaa cacagtctgg attattacag tgcgaccgac g 51
<210> 167
<211> 56
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 167
cgtcggtcga tttacctcta ttgttggatc atattcgtcc acaaaatgga ccgacg 56
<210> 168
<211> 51
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 168
cgtcggtcat tctgaattag ctgtatcgtc aaggcactct tgcgaccgac g 51
<210> 169
<211> 51
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 169
cgtcggtcac gccaccagct ccaactacca caagtttata ttcgaccgac g 51
<210> 170
<211> 56
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 170
cgtcggtctc attttcagca ggccttataa taaaaataat gaaaatgtga ccgacg 56
<210> 171
<211> 55
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 171
cgtcggtcct ttccaatgga ctattttaga agaaatggag ctgtcacgac cgacg 55
<210> 172
<211> 53
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 172
cgtcggtcca catcaagatt cagaacactg gtgattacta tgaccgaccg acg 53
<210> 173
<211> 51
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 173
cgtcggtcta tggaggggag aaatttgcca ctttggctga gttgaccgac g 51
<210> 174
<211> 54
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 174
cgtcggtctc cagtattaca tggaacatca cgggcaatta aaagaggacc gacg 54
<210> 175
<211> 55
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 175
cgtcggtcga atggagatgt cattgagctt aaatatcctc tgaactggac cgacg 55
<210> 176
<211> 51
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 176
cgtcggtcct tcatgatgtt tccttcgtag gtgttgactg cgagaccgac g 51
<210> 177
<211> 51
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 177
cgtcggtctt gacgttccca aaaccatcca gatggtgcgg tctgaccgac g 51
<210> 178
<211> 54
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 178
cgtcggtcgt accgatttat ctatatggcg gtccagcatt atattggacc gacg 54
<210> 179
<211> 51
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 179
cgtcggtcac actacagcgc aggattgaag aagagcaggt accgaccgac g 51
<210> 180
<211> 51
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 180
cgtcggtccc tgagggctgg catgcggatt ctcattctct tgcgaccgac g 51
<210> 181
<211> 51
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 181
cgtcggtcta agtaggaaat agcagcctca cattgcccct gacgaccgac g 51
<210> 182
<211> 52
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 182
cgtcggtcca tagttggaat cactcatgat atctcgagcc aatcgaccga cg 52
<210> 183
<211> 51
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 183
cgtcggtcaa gtcacatatc ttcaccactt tcccgtgggt gacgaccgac g 51
<210> 184
<211> 51
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 184
cgtcggtcgc acgttcctgg cggccaggtc tctgtgaaca cacgaccgac g 51
<210> 185
<211> 51
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 185
cgtcggtcgt gggttacctg acagtgtgca cgcccccagc agggaccgac g 51
<210> 186
<211> 51
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 186
cgtcggtcca caatattctc gtggcttccc agctgggtca tcagaccgac g 51
<210> 187
<211> 51
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 187
cgtcggtctt gagttctgac atgagtgcct ctctttcaga gctgaccgac g 51
<210> 188
<211> 56
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 188
cgtcggtcct gctttttctg tcaaagaaag gagcattaaa aatgtaaaga ccgacg 56
<210> 189
<211> 56
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 189
cgtcggtcgg cacattccat tcttaccaaa ctctaaattt tctcttggga ccgacg 56
<210> 190
<211> 56
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 190
cgtcggtcaa actcccattt gagatcatat tcatattctc tgaaatcaga ccgacg 56
<210> 191
<211> 51
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 191
cgtcggtcac gtagaagtac tcattatctg aggagccggt cacgaccgac g 51
<210> 192
<211> 51
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 192
cgtcggtcgt accatctgta gctggctttc atacctaaat tgcgaccgac g 51
<210> 193
<211> 52
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 193
cgtcggtcta ttacttggga gacttgtctg aacacttctt ccaggaccga cg 52
<210> 194
<211> 51
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 194
cgtcggtccc aagatggtaa tgggtatcca tccgagaaac agggaccgac g 51
<210> 195
<211> 51
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 195
cgtcggtcgc ctgacttgcc gatgcttctg cgagcacttg agggaccgac g 51
<210> 196
<211> 53
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 196
cgtcggtctc cctatagaaa agaacgtgtg aaataagctc actgggaccg acg 53
<210> 197
<211> 51
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 197
cgtcggtcat cccctctcca ccctggccta cctggtcgcc atggaccgac g 51
<210> 198
<211> 51
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 198
cgtcggtccg tgcctgccaa tggtgatggg cttggtccag ccagaccgac g 51
<210> 199
<211> 51
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 199
cgtcggtcga ctaggcgtgg gatgtttttg cagatgatgg gctgaccgac g 51
<210> 200
<211> 51
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 200
cgtcggtccg gaagacagtc ccccccagga tgttccggat agtgaccgac g 51
<210> 201
<211> 51
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 201
cgtcggtcca ttgggacttt tccacatctt cttcagcttg aacgaccgac g 51
<210> 202
<211> 51
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 202
cgtcggtcag gtcactcacc tggagtgagc cctgctcccc cctgaccgac g 51
<210> 203
<211> 51
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 203
cgtcggtcct ccttcccagc ctgggcatcc ttgagttcca agggaccgac g 51
<210> 204
<211> 51
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 204
cgtcggtctc attcagctct cggaacatct cgaagcgctc acggaccgac g 51
<210> 205
<211> 51
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 205
cgtcggtcca cggatctgca gcaacagagg agggggagaa gtagaccgac g 51
<210> 206
<211> 51
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 206
cgtcggtcag tgctccctgg gggcagctcg tggtgaggct cccgaccgac g 51
<210> 207
<211> 51
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 207
cgtcggtctt cttgcggaga ttctcttcct ctgtgcgccg gtcgaccgac g 51
<210> 208
<211> 51
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 208
cgtcggtctc ccaggacagg cacaaacacg cacctcaaag ctggaccgac g 51
<210> 209
<211> 51
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 209
cgtcggtccc gtcccagtag attaccacta ctcaggatag gaagaccgac g 51
<210> 210
<211> 51
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 210
cgtcggtcct cctgacctgg agtcttccag tgtgatgatg gtggaccgac g 51
<210> 211
<211> 51
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 211
cgtcggtcga tgggcctccg gttcatgccg cccatgcagg aacgaccgac g 51
<210> 212
<211> 51
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 212
cgtcggtctt acacatgtag ttgtagtgga tggtggtaca gtcgaccgac g 51
<210> 213
<211> 51
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 213
cgtcggtcag ccaacctagg agataacaca ggcccaagat gaggaccgac g 51
<210> 214
<211> 51
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 214
cgtcggtccc agacctcagg cggctcatag ggcaccacca cacgaccgac g 51
<210> 215
<211> 53
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 215
cgtcggtctg tcgaaaagtg tttctgtcat ccaaatactc cacacgaccg acg 53
<210> 216
<211> 51
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 216
cgtcggtcaa atttccttcc actcggataa gatgctgagg agggaccgac g 51
<210> 217
<211> 51
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 217
cgtcggtccc agacctaaga gcaatcagtg aggaatcaga ggcgaccgac g 51
<210> 218
<211> 51
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 218
cgtcggtcct ccagccccag ctgctcacca tcgctatctg agcgaccgac g 51
<210> 219
<211> 51
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 219
cgtcggtccg ctcatggtgg gggcagcgcc tcacaacctc cgtgaccgac g 51
<210> 220
<211> 51
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 220
cgtcggtctg tgctgtgact gcttgtagat ggccatggcg cgggaccgac g 51
<210> 221
<211> 51
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 221
cgtcggtcgc gggtgccggg cgggggtgtg gaatcaaccc acagaccgac g 51
<210> 222
<211> 51
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 222
cgtcggtctg cacagggcag gtcttggcca gttggcaaaa catgaccgac g 51
<210> 223
<211> 51
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 223
cgtcggtctg ttgagggcag gggagtactg taggaagagg aaggaccgac g 51
<210> 224
<211> 51
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 224
cgtcggtcga cagagttgaa agtcagggca caagtgaaca gatgaccgac g 51
<210> 225
<211> 51
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 225
cgtcggtcaa tgcaagaagc ccagacggaa accgtagctg cccgaccgac g 51
<210> 226
<211> 51
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 226
cgtcggtcgt aggttttctg ggaagggaca gaagatgaca ggggaccgac g 51
<210> 227
<211> 51
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 227
cgtcggtcca ggagggggct ggtgcagggg ccgccggtgt agggaccgac g 51
<210> 228
<211> 51
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 228
cgtcggtcct gctggtgcag gggccacggg gggagcagcc tctgaccgac g 51
<210> 229
<211> 51
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 229
cgtcggtcca ttctgggagc ttcatctgga cctgggtctt caggaccgac g 51
<210> 230
<211> 51
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 230
cgtcggtcgc ccttccaatg gatccactca cagtttccat agggaccgac g 51
<210> 231
<211> 51
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 231
cgtcggtctg aaaatgtttc ctgactcaga gggggctcga cgcgaccgac g 51
<210> 232
<211> 51
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 232
cgtcggtcgg atctgactgc ggctcctcca tggcagtgac ccggaccgac g 51
<210> 233
<211> 51
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 233
cgtcggtcag gcagtctggc tgctgcaaga ggaaaagtgg ggagaccgac g 51
<210> 234
<211> 53
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 234
cgtcggtcca ttattgccaa catgacttac ttgatcccca taagcgaccg acg 53
<210> 235
<211> 51
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 235
cgtcggtcga cgacctatga tgataggttt tacccatcca ctcgaccgac g 51
<210> 236
<211> 51
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 236
cgtcggtcaa gccgggggat atttttgcag ataatggctt ctcgaccgac g 51
<210> 237
<211> 51
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 237
cgtcggtcaa gaccgtgcca cccagaatat ttcgtatggt gccgaccgac g 51
<210> 238
<211> 56
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 238
cgtcggtctt ggtgatttcc acatttgttt caacttgaac tcctcaacga ccgacg 56
<210> 239
<211> 120
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 239
gtgtgatttg ccaacaagga cagttgatac aaaacaagcc cacgaactgg ccaagagtta 60
cgggattcca ttcattgaaa cctcagccaa gaccagacag gtatggtaca gctttcagca 120
<210> 240
<211> 120
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 240
aagactcgga tgatgtacct atggtgctag tgggaaacaa gtgtgatttg ccaacaagga 60
cagttgatac aaaacaagcc cacgaactgg ccaagagtta cgggattcca ttcattgaaa 120
<210> 241
<211> 120
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 241
ggtgaaacct gtttgttgga catactggat acagctggac aagaagagta cagtgccatg 60
agagaccaat acatgaggac aggcgaaggc ttcctctgtg tatttgccat caataatagc 120
<210> 242
<211> 120
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 242
cttaccctcc acacccccag gattcttaca gaaaacaagt ggttatagat ggtgaaacct 60
gtttgttgga catactggat acagctggac aagaagagta cagtgccatg agagaccaat 120
<210> 243
<211> 120
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 243
agtacaaact ggtggtggtt ggagcaggtg gtgttgggaa aagcgcactg acaatccagc 60
taatccagaa ccactttgta gatgaatatg atcccaccat agaggtgagg cccagtggta 120
<210> 244
<211> 120
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 244
tgaaatgact gagtacaaac tggtggtggt tggagcaggt ggtgttggga aaagcgcact 60
gacaatccag ctaatccaga accactttgt agatgaatat gatcccacca tagaggtgag 120
<210> 245
<211> 120
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 245
atgtgatttg ccttctagaa cagtagacac aaaacaggct caggacttag caagaagtta 60
tggaattcct tttattgaaa catcagcaaa gacaagacag gtaagtaaca ctgaaataaa 120
<210> 246
<211> 120
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 246
aggactctga agatgtacct atggtcctag taggaaataa atgtgatttg ccttctagaa 60
cagtagacac aaaacaggct caggacttag caagaagtta tggaattcct tttattgaaa 120
<210> 247
<211> 120
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 247
aacttttttt tctttcccag agaacaaatt aaaagagtta aggactctga agatgtacct 60
atggtcctag taggaaataa atgtgatttg ccttctagaa cagtagacac aaaacaggct 120
<210> 248
<211> 120
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 248
ggagaaacct gtctcttgga tattctcgac acagcaggtc aagaggagta cagtgcaatg 60
agggaccagt acatgaggac tggggagggc tttctttgtg tatttgccat aaataatact 120
<210> 249
<211> 120
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 249
ctgtgtttct cccttctcag gattcctaca ggaagcaagt agtaattgat ggagaaacct 60
gtctcttgga tattctcgac acagcaggtc aagaggagta cagtgcaatg agggaccagt 120
<210> 250
<211> 120
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 250
gaaaatgact gaatataaac ttgtggtagt tggagctggt ggcgtaggca agagtgcctt 60
gacgatacag ctaattcaga atcattttgt ggacgaatat gatccaacaa tagaggtaaa 120
<210> 251
<211> 120
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 251
tcattatttt tattataagg cctgctgaaa atgactgaat ataaacttgt ggtagttgga 60
gctggtggcg taggcaagag tgccttgacg atacagctaa ttcagaatca ttttgtggac 120
<210> 252
<211> 120
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 252
ctggaccaac tcagccaaag tggcaaattt ctcccctcca tacaggtcat agtaatcacc 60
agtgttctga atcttgatgt gggtgacagc tccatttctt ctaaaatagt ccattggaaa 120
<210> 253
<211> 120
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 253
aagctcaatg acatctccat tcttctcttt taattgcccg tgatgttcca tgtaatactg 60
gaccaactca gccaaagtgg caaatttctc ccctccatac aggtcatagt aatcaccagt 120
<210> 254
<211> 120
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 254
atatagataa atcggtactg tgcttctgtc tggaccatcc ctgacctctg agaccgcacc 60
atctggatgg ttttgggaac gtcaatatcg cagtcaacac ctacgaagga aacatcatga 120
<210> 255
<211> 120
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 255
gccagccctc aggctggtac ctgctcttct tcaatcctgc gctgtagtgt ttcaatataa 60
tgctggaccg ccatatagat aaatcggtac tgtgcttctg tctggaccat ccctgacctc 120
<210> 256
<211> 120
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 256
ccaggaacgt gcttgtcacc cacgggaaag tggtgaagat atgtgacttt ggattggctc 60
gagatatcat gagtgattcc aactatgttg tcaggggcaa tgtgaggctg ctatttccta 120
<210> 257
<211> 120
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 257
tgttcacaga gacctggccg ccaggaacgt gcttgtcacc cacgggaaag tggtgaagat 60
atgtgacttt ggattggctc gagatatcat gagtgattcc aactatgttg tcaggggcaa 120
<210> 258
<211> 120
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 258
acagaaaaag cagacagctc tgaaagagag gcactcatgt cagaactcaa gatgatgacc 60
cagctgggaa gccacgagaa tattgtgaac ctgctggggg cgtgcacact gtcaggtaac 120
<210> 259
<211> 120
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 259
ttttaatgct cctttctttg acagaaaaag cagacagctc tgaaagagag gcactcatgt 60
cagaactcaa gatgatgacc cagctgggaa gccacgagaa tattgtgaac ctgctggggg 120
<210> 260
<211> 120
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 260
atggtacagg tgaccggctc ctcagataat gagtacttct acgttgattt cagagaatat 60
gaatatgatc tcaaatggga gtttccaaga gaaaatttag agtttggtaa gaatggaatg 120
<210> 261
<211> 120
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 261
ggtatgaaag ccagctacag atggtacagg tgaccggctc ctcagataat gagtacttct 60
acgttgattt cagagaatat gaatatgatc tcaaatggga gtttccaaga gaaaatttag 120
<210> 262
<211> 120
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 262
tatagggaaa cctcaagtgc tcgcagaagc atcggcaagt caggcgtcct gtttctcgga 60
tggataccca ttaccatctt ggacctggaa gaagtgttca gacaagtctc ccaagtaata 120
<210> 263
<211> 120
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 263
ttatttcaca cgttcttttc tatagggaaa cctcaagtgc tcgcagaagc atcggcaagt 60
caggcgtcct gtttctcgga tggataccca ttaccatctt ggacctggaa gaagtgttca 120
<210> 264
<211> 120
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 264
gactgtcttc cgggagccca tcatctgcaa aaacatccca cgcctagtcc ctggctggac 60
caagcccatc accattggca ggcacgccca tggcgaccag gtaggccagg gtggagaggg 120
<210> 265
<211> 120
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 265
ggaaaagtcc caatggaact atccggaaca tcctgggggg gactgtcttc cgggagccca 60
tcatctgcaa aaacatccca cgcctagtcc ctggctggac caagcccatc accattggca 120
<210> 266
<211> 120
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 266
ctgcagatcc gtgggcgtga gcgcttcgag atgttccgag agctgaatga ggccttggaa 60
ctcaaggatg cccaggctgg gaaggagcca ggggggagca gggctcactc caggtgagtg 120
<210> 267
<211> 120
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 267
cttctccccc tcctctgttg ctgcagatcc gtgggcgtga gcgcttcgag atgttccgag 60
agctgaatga ggccttggaa ctcaaggatg cccaggctgg gaaggagcca ggggggagca 120
<210> 268
<211> 120
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 268
actgggacgg aacagctttg aggtgcgtgt ttgtgcctgt cctgggagag accggcgcac 60
agaggaagag aatctccgca agaaagggga gcctcaccac gagctgcccc cagggagcac 120
<210> 269
<211> 120
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 269
atcctgagta gtggtaatct actgggacgg aacagctttg aggtgcgtgt ttgtgcctgt 60
cctgggagag accggcgcac agaggaagag aatctccgca agaaagggga gcctcaccac 120
<210> 270
<211> 120
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 270
cctaggttgg ctctgactgt accaccatcc actacaacta catgtgtaac agttcctgca 60
tgggcggcat gaaccggagg cccatcctca ccatcatcac actggaagac tccaggtcag 120
<210> 271
<211> 120
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 271
atcttgggcc tgtgttatct cctaggttgg ctctgactgt accaccatcc actacaacta 60
catgtgtaac agttcctgca tgggcggcat gaaccggagg cccatcctca ccatcatcac 120
<210> 272
<211> 120
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 272
taggtctggc ccctcctcag catcttatcc gagtggaagg aaatttgcgt gtggagtatt 60
tggatgacag aaacactttt cgacatagtg tggtggtgcc ctatgagccg cctgaggtct 120
<210> 273
<211> 120
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 273
gattcctcac tgattgctct taggtctggc ccctcctcag catcttatcc gagtggaagg 60
aaatttgcgt gtggagtatt tggatgacag aaacactttt cgacatagtg tggtggtgcc 120
<210> 274
<211> 120
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 274
ggcacccgcg tccgcgccat ggccatctac aagcagtcac agcacatgac ggaggttgtg 60
aggcgctgcc cccaccatga gcgctgctca gatagcgatg gtgagcagct ggggctggag 120
<210> 275
<211> 120
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 275
gccaactggc caagacctgc cctgtgcagc tgtgggttga ttccacaccc ccgcccggca 60
cccgcgtccg cgccatggcc atctacaagc agtcacagca catgacggag gttgtgaggc 120
<210> 276
<211> 120
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 276
tctccttcct cttcctacag tactcccctg ccctcaacaa gatgttttgc caactggcca 60
agacctgccc tgtgcagctg tgggttgatt ccacaccccc gcccggcacc cgcgtccgcg 120
<210> 277
<211> 120
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 277
caccagcagc tcctacaccg gcggcccctg caccagcccc ctcctggccc ctgtcatctt 60
ctgtcccttc ccagaaaacc taccagggca gctacggttt ccgtctgggc ttcttgcatt 120
<210> 278
<211> 120
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 278
tccagatgaa gctcccagaa tgccagaggc tgctcccccc gtggcccctg caccagcagc 60
tcctacaccg gcggcccctg caccagcccc ctcctggccc ctgtcatctt ctgtcccttc 120
<210> 279
<211> 120
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 279
agactgcctt ccgggtcact gccatggagg agccgcagtc agatcctagc gtcgagcccc 60
ctctgagtca ggaaacattt tcagacctat ggaaactgtg agtggatcca ttggaagggc 120
<210> 280
<211> 120
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 280
cttttcctct tgcagcagcc agactgcctt ccgggtcact gccatggagg agccgcagtc 60
agatcctagc gtcgagcccc ctctgagtca ggaaacattt tcagacctat ggaaactgtg 120
<210> 281
<211> 120
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 281
cacggtcttc agagaagcca ttatctgcaa aaatatcccc cggcttgtga gtggatgggt 60
aaaacctatc atcataggtc gtcatgctta tggggatcaa gtaagtcatg ttggcaataa 120
<210> 282
<211> 120
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 282
ttgaaacaaa tgtggaaatc accaaatggc accatacgaa atattctggg tggcacggtc 60
ttcagagaag ccattatctg caaaaatatc ccccggcttg tgagtggatg ggtaaaacct 120
<210> 283
<211> 51
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 283
cgtcggtcag accagacagg tatggtacag ctttcagcat ttggaccgac g 51
<210> 284
<211> 51
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 284
cgtcggtcaa gagttacggg attccattca ttgaaacctc agcgaccgac g 51
<210> 285
<211> 51
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 285
cgtcggtcaa ggacagttga tacaaaacaa gcccacgaac tgggaccgac g 51
<210> 286
<211> 51
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 286
cgtcggtcct atggtgctag tgggaaacaa gtgtgatttg ccagaccgac g 51
<210> 287
<211> 51
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 287
cgtcggtcga gcagattaag cgagtaaaag actcggatga tgtgaccgac g 51
<210> 288
<211> 53
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 288
cgtcggtcgg cttcctctgt gtatttgcca tcaataatag caagtgaccg acg 53
<210> 289
<211> 51
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 289
cgtcggtcca gtgccatgag agaccaatac atgaggacag gcggaccgac g 51
<210> 290
<211> 51
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 290
cgtcggtctg ttggacatac tggatacagc tggacaagaa gaggaccgac g 51
<210> 291
<211> 56
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 291
cgtcggtcat tcttacagaa aacaagtggt tatagatggt gaaacctgga ccgacg 56
<210> 292
<211> 51
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 292
cgtcggtctc cctccctgcc cccttaccct ccacaccccc agggaccgac g 51
<210> 293
<211> 51
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 293
cgtcggtcga tcccaccata gaggtgaggc ccagtggtag cccgaccgac g 51
<210> 294
<211> 54
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 294
cgtcggtcga caatccagct aatccagaac cactttgtag atgaatgacc gacg 54
<210> 295
<211> 51
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 295
cgtcggtctg gtggttggag caggtggtgt tgggaaaagc gcagaccgac g 51
<210> 296
<211> 51
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 296
cgtcggtcgg ttcttgctgg tgtgaaatga ctgagtacaa actgaccgac g 51
<210> 297
<211> 56
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 297
cgtcggtctc agcaaagaca agacaggtaa gtaacactga aataaataga ccgacg 56
<210> 298
<211> 56
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 298
cgtcggtcgg acttagcaag aagttatgga attcctttta ttgaaacaga ccgacg 56
<210> 299
<211> 51
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 299
cgtcggtctt gccttctaga acagtagaca caaaacaggc tcagaccgac g 51
<210> 300
<211> 55
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 300
cgtcggtcct gaagatgtac ctatggtcct agtaggaaat aaatgtggac cgacg 55
<210> 301
<211> 56
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 301
cgtcggtctt ttttctttcc cagagaacaa attaaaagag ttaaggacga ccgacg 56
<210> 302
<211> 56
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 302
cgtcggtctt gaaagatatt tgtgttacta atgactgtgc tataacttga ccgacg 56
<210> 303
<211> 56
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 303
cgtcggtcgg ggagggcttt ctttgtgtat ttgccataaa taatactaga ccgacg 56
<210> 304
<211> 51
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 304
cgtcggtcag tacagtgcaa tgagggacca gtacatgagg actgaccgac g 51
<210> 305
<211> 51
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 305
cgtcggtctg tctcttggat attctcgaca cagcaggtca agagaccgac g 51
<210> 306
<211> 54
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 306
cgtcggtcgg attcctacag gaagcaagta gtaattgatg gagaaagacc gacg 54
<210> 307
<211> 51
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 307
cgtcggtcgc actgtaataa tccagactgt gtttctccct tctgaccgac g 51
<210> 308
<211> 56
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 308
cgtcggtcca ttttgtggac gaatatgatc caacaataga ggtaaatcga ccgacg 56
<210> 309
<211> 51
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 309
cgtcggtcgc aagagtgcct tgacgataca gctaattcag aatgaccgac g 51
<210> 310
<211> 51
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 310
cgtcggtcga atataaactt gtggtagttg gagctggtgg cgtgaccgac g 51
<210> 311
<211> 56
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 311
cgtcggtcac attttcatta tttttattat aaggcctgct gaaaatgaga ccgacg 56
<210> 312
<211> 55
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 312
cgtcggtcgt gacagctcca tttcttctaa aatagtccat tggaaaggac cgacg 55
<210> 313
<211> 53
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 313
cgtcggtcgg tcatagtaat caccagtgtt ctgaatcttg atgtggaccg acg 53
<210> 314
<211> 51
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 314
cgtcggtcaa ctcagccaaa gtggcaaatt tctcccctcc atagaccgac g 51
<210> 315
<211> 54
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 315
cgtcggtcct cttttaattg cccgtgatgt tccatgtaat actggagacc gacg 54
<210> 316
<211> 55
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 316
cgtcggtcca gttcagagga tatttaagct caatgacatc tccattcgac cgacg 55
<210> 345
<211> 51
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 345
cgtcggtctc gcagtcaaca cctacgaagg aaacatcatg aaggaccgac g 51
<210> 318
<211> 51
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 318
cgtcggtcag accgcaccat ctggatggtt ttgggaacgt caagaccgac g 51
<210> 319
<211> 54
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 319
cgtcggtcca atataatgct ggaccgccat atagataaat cggtacgacc gacg 54
<210> 320
<211> 51
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 320
cgtcggtcgg tacctgctct tcttcaatcc tgcgctgtag tgtgaccgac g 51
<210> 321
<211> 51
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 321
cgtcggtcgc aagagaatga gaatccgcat gccagccctc agggaccgac g 51
<210> 322
<211> 51
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 322
cgtcggtcgt caggggcaat gtgaggctgc tatttcctac ttagaccgac g 51
<210> 323
<211> 52
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 323
cgtcggtcga ttggctcgag atatcatgag tgattccaac tatggaccga cg 52
<210> 324
<211> 51
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 324
cgtcggtcgt cacccacggg aaagtggtga agatatgtga cttgaccgac g 51
<210> 325
<211> 51
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 325
cgtcggtcgt gtgttcacag agacctggcc gccaggaacg tgcgaccgac g 51
<210> 326
<211> 51
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 326
cgtcggtccc tgctgggggc gtgcacactg tcaggtaacc cacgaccgac g 51
<210> 327
<211> 51
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 327
cgtcggtctg atgacccagc tgggaagcca cgagaatatt gtggaccgac g 51
<210> 328
<211> 51
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 328
cgtcggtcag ctctgaaaga gaggcactca tgtcagaact caagaccgac g 51
<210> 329
<211> 56
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 329
cgtcggtctt tacattttta atgctccttt ctttgacaga aaaagcagga ccgacg 56
<210> 330
<211> 56
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 330
cgtcggtccc aagagaaaat ttagagtttg gtaagaatgg aatgtgccga ccgacg 56
<210> 331
<211> 56
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 331
cgtcggtctg atttcagaga atatgaatat gatctcaaat gggagtttga ccgacg 56
<210> 332
<211> 51
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 332
cgtcggtcgt gaccggctcc tcagataatg agtacttcta cgtgaccgac g 51
<210> 333
<211> 51
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 333
cgtcggtcgc aatttaggta tgaaagccag ctacagatgg tacgaccgac g 51
<210> 334
<211> 52
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 334
cgtcggtcct ggaagaagtg ttcagacaag tctcccaagt aatagaccga cg 52
<210> 335
<211> 51
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 335
cgtcggtccc tgtttctcgg atggataccc attaccatct tgggaccgac g 51
<210> 336
<211> 51
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 336
cgtcggtccc tcaagtgctc gcagaagcat cggcaagtca ggcgaccgac g 51
<210> 337
<211> 53
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 337
cgtcggtccc agtgagctta tttcacacgt tcttttctat agggagaccg acg 53
<210> 338
<211> 51
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 338
cgtcggtcca tggcgaccag gtaggccagg gtggagaggg gatgaccgac g 51
<210> 345
<211> 51
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 345
cgtcggtctg gctggaccaa gcccatcacc attggcaggc acggaccgac g 51
<210> 340
<211> 51
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 340
cgtcggtcag cccatcatct gcaaaaacat cccacgccta gtcgaccgac g 51
<210> 341
<211> 51
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 341
cgtcggtcac tatccggaac atcctggggg ggactgtctt ccggaccgac g 51
<210> 342
<211> 51
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 342
cgtcggtcgt tcaagctgaa gaagatgtgg aaaagtccca atggaccgac g 51
<210> 343
<211> 51
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 343
cgtcggtcag gggggagcag ggctcactcc aggtgagtga cctgaccgac g 51
<210> 344
<211> 51
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 344
cgtcggtccc ttggaactca aggatgccca ggctgggaag gaggaccgac g 51
<210> 345
<211> 51
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 345
cgtcggtccg tgagcgcttc gagatgttcc gagagctgaa tgagaccgac g 51
<210> 346
<211> 51
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 346
cgtcggtcta cttctccccc tcctctgttg ctgcagatcc gtggaccgac g 51
<210> 347
<211> 51
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 347
cgtcggtcgg gagcctcacc acgagctgcc cccagggagc actgaccgac g 51
<210> 348
<211> 51
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 348
cgtcggtcga ccggcgcaca gaggaagaga atctccgcaa gaagaccgac g 51
<210> 349
<211> 51
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 349
cgtcggtcca gctttgaggt gcgtgtttgt gcctgtcctg ggagaccgac g 51
<210> 350
<211> 51
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 350
cgtcggtctt cctatcctga gtagtggtaa tctactggga cgggaccgac g 51
<210> 351
<211> 51
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 351
cgtcggtcca ccatcatcac actggaagac tccaggtcag gaggaccgac g 51
<210> 352
<211> 51
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 352
cgtcggtcgt tcctgcatgg gcggcatgaa ccggaggccc atcgaccgac g 51
<210> 353
<211> 51
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 353
cgtcggtcga ctgtaccacc atccactaca actacatgtg taagaccgac g 51
<210> 354
<211> 51
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 354
cgtcggtcct catcttgggc ctgtgttatc tcctaggttg gctgaccgac g 51
<210> 355
<211> 51
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 355
cgtcggtcgt gtggtggtgc cctatgagcc gcctgaggtc tgggaccgac g 51
<210> 356
<211> 53
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 356
cgtcggtcgt gtggagtatt tggatgacag aaacactttt cgacagaccg acg 53
<210> 357
<211> 51
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 357
cgtcggtccc tcctcagcat cttatccgag tggaaggaaa tttgaccgac g 51
<210> 358
<211> 51
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 358
cgtcggtcgc ctctgattcc tcactgattg ctcttaggtc tgggaccgac g 51
<210> 359
<211> 51
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 359
cgtcggtcgc tcagatagcg atggtgagca gctggggctg gaggaccgac g 51
<210> 360
<211> 51
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 360
cgtcggtcac ggaggttgtg aggcgctgcc cccaccatga gcggaccgac g 51
<210> 361
<211> 51
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 361
cgtcggtccc gcgccatggc catctacaag cagtcacagc acagaccgac g 51
<210> 362
<211> 51
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 362
cgtcggtctg tgggttgatt ccacaccccc gcccggcacc cgcgaccgac g 51
<210> 363
<211> 51
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 363
cgtcggtcat gttttgccaa ctggccaaga cctgccctgt gcagaccgac g 51
<210> 364
<211> 51
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 364
cgtcggtcct tcctcttcct acagtactcc cctgccctca acagaccgac g 51
<210> 365
<211> 51
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 365
cgtcggtcat ctgttcactt gtgccctgac tttcaactct gtcgaccgac g 51
<210> 366
<211> 51
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 366
cgtcggtcgg gcagctacgg tttccgtctg ggcttcttgc attgaccgac g 51
<210> 367
<211> 51
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 367
cgtcggtccc ctgtcatctt ctgtcccttc ccagaaaacc tacgaccgac g 51
<210> 368
<211> 51
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 368
cgtcggtccc tacaccggcg gcccctgcac cagccccctc ctggaccgac g 51
<210> 369
<211> 51
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 369
cgtcggtcag aggctgctcc ccccgtggcc cctgcaccag caggaccgac g 51
<210> 370
<211> 51
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 370
cgtcggtcct gaagacccag gtccagatga agctcccaga atggaccgac g 51
<210> 371
<211> 51
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 371
cgtcggtccc tatggaaact gtgagtggat ccattggaag ggcgaccgac g 51
<210> 372
<211> 51
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 372
cgtcggtcgc gtcgagcccc ctctgagtca ggaaacattt tcagaccgac g 51
<210> 373
<211> 51
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 373
cgtcggtccg ggtcactgcc atggaggagc cgcagtcaga tccgaccgac g 51
<210> 374
<211> 51
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 374
cgtcggtctc cccacttttc ctcttgcagc agccagactg cctgaccgac g 51
<210> 375
<211> 53
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 375
cgtcggtcgc ttatggggat caagtaagtc atgttggcaa taatggaccg acg 53
<210> 376
<211> 51
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 376
cgtcggtcga gtggatgggt aaaacctatc atcataggtc gtcgaccgac g 51
<210> 377
<211> 51
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 377
cgtcggtcga gaagccatta tctgcaaaaa tatcccccgg cttgaccgac g 51
<210> 378
<211> 51
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 378
cgtcggtcgg caccatacga aatattctgg gtggcacggt cttgaccgac g 51
<210> 379
<211> 56
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 379
cgtcggtcgt tgaggagttc aagttgaaac aaatgtggaa atcaccaaga ccgacg 56
Claims (17)
1.一种液相杂交捕获方法,其特征在于,包括如下步骤:
(1)探针设计:根据核酸目标区域设计探针池,所述探针包括与另一探针互补配对的探针结合序列以及与核酸靶序列互补配对的靶特异性序列,按照该序列合成寡核苷酸并对5’或3’末端进行生物标记物修饰;
(2)文库构建;
(3)杂交捕获
i.配置杂交体系:所述杂交体系包含所述探针;
ii.杂交反应:将所述杂交体系置于57~63℃进行杂交1~2小时;
(4)产物捕获:杂交反应结束后,反应体系中加入链霉亲和素磁珠进行杂交捕获;
(5)产物洗脱:捕获结束后,使用洗脱缓冲液I、洗脱缓冲液II以及洗脱缓冲液III各洗涤1次;
(6)产物扩增纯化:洗涤结束后,加入PCR反应体系,进行PCR扩增程序,反应结束后,使用磁珠进行纯化。
2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述探针结合序列包括第一探针结合序列和第二探针结合序列。
3.根据权利要求2所述的方法,所述探针的5’端具有与另一探针的3’端互补配对的第一探针结合序列,并且所述探针的3’端具有与另一探针的5’端部互补配对的第二探针结合序列。
4.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述核酸来自新鲜组织、冰冻组织、石蜡包埋组织、胸腹水、血浆或肿瘤脱落细胞组织。
5.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述核酸为血浆游离DNA、基因组DNA或RNA。
6.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述文库构建按照核酸片段大小为200~250bp构建DNA文库。
7.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述杂交体系中包含2~10fmol的探针、1×Hyb Buffer、1×Enhance、1ug Human Cot-1,以及100pmmol的Blocker。
8.根据权利要求7所述的方法,其特征在于,所述杂交体系中包含6fmol的探针。
9.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述杂交反应的条件为95℃变性2分钟、60℃杂交1小时。
10.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述产物捕获的条件为60℃捕获20分钟。
11.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述PCR反应体系包括2×HiFi PCRMaster Mix、5μL Index Primer Mix以及20μL TE。
12.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述文库建构包括将核酸片段进行末端修复和接头连接。
13.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述洗脱缓冲液I的配方为5×SSPE、0.5%~5%SDS;所述洗脱缓冲液II的配方为2×SSPE、0.05%~0.5%SDS;所述洗脱缓冲液III的配方为0.1×SSPE、0.005%~0.05%SDS。
14.一种液相杂交捕获试剂盒,其特征在于,包括如下组分:探针、杂交反应液、洗脱缓冲液、核酸纯化磁珠;所述探针包括与另一探针互补配对的探针结合序列以及与核酸靶序列互补配对的靶特异性序列。
15.根据权利要求14所述的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒还包括末端修复酶混合物、末端修复反应缓冲液、含分子标签的接头、文库扩增引物、PCR预混液、接头封闭剂、DNA封闭剂、杂交增强剂、磁珠洗涤液、捕获文库PCR引物。
16.权利要求1-13中任一项所述的方法在基因组靶区域捕获中的应用。
17.根据权利要求16所述的应用,其特征在于,所述靶区域捕获用于检测核酸片段中的低频突变检测、染色体拷贝数变异分析、***/缺失、微卫星不稳定性或融合基因检测;或用于靶向mNGS测序、病原体开展流行病学检测。
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