CN114891792B - 一种能够响应植物干旱诱导的启动子及其应用 - Google Patents

一种能够响应植物干旱诱导的启动子及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种能够响应植物干旱诱导的启动子及其应用，涉及基因工程技术领域，所述启动子为如SEQ ID NO.1所示核苷酸序列或其截短序列。通过荧光素酶LUC瞬时转化活性分析，表明该启动子能够响应干旱胁迫调控下游基因表达，且在‑650 bp区段表达的荧光素酶活性最强，而到‑200 bp区段时荧光素酶活性明显的减弱，说明该启动子核心调控区域位于‑650 bp到‑200 bp区域内。根据生物信息学分析，该启动子包含2个MYB和2个MBS等元件。

Description

一种能够响应植物干旱诱导的启动子及其应用
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种能够响应植物干旱诱导的启动子及其应用。
背景技术
玉米是一种重要的谷类作物，作为食品、饲料和燃料的主要来源，具有巨大的产量潜力和营养价值。尽管现代玉米产量显著增加，但其在植物生长各个阶段的生产，易受干旱胁迫、热胁迫和盐害等不利因素的影响，导致产量和品质的下降。干旱胁迫会导致植物体内一系列生理生化反应的改变，如限制光合作用，加强气孔关闭，改变细胞成分，刺激渗透因子的产生，活性氧的积累。
植物从激素、渗透调节物质、活性氧清除***和蛋白质几个方面来应对非生物胁迫。其中转录因子(transcription factor，TF)在非生物胁迫中发挥很重要的作用，当植物遭受外界非生物胁迫时，体内会发生一系列信号传导过程，最终能够诱导植物相关抗性基因的表达，转录因子在这个过程中发挥着分子开关的作用。近年来的研究表明，参与植物胁迫反应的转录因子主要为以下几个类型：NAC类型、AP2/EREBP类型、bZip/HD-Zip类型、MYB/MYC类型以及WRKY等类型。
研究表明，通过调控非生物胁迫响应转录因子的表达能够显著改变植物对非生物逆境的抗性。例如，WRKY作为最大的转录因子家族之一，在植物响应非生物胁迫中的作用已在多种植物中得到广泛研究，拟南芥AtWRKY57转基因水稻通过调节失水率、丙二醛含量等正向调控抗旱性并且转基因植株中一些胁迫响应基因表达上调；玉米ZmbZIP4基因可以被高盐、干旱、高温和脱落酸处理等诱导表达，ZmbZIP4通过调控ZmLEA2、ZmRD20、NCED以及ABA1等基因的表达调控植物对非生物胁迫的耐受性。基因的表达转录调控是植物应对非生物胁迫应答反应的主要机制之一，这同时也与多种转录因子及其与顺式调控序列的相互作用密切相关，而胁迫条件下激活/抑制启动子对决定转录速率、调控基因表达等方面具有重要作用。
基于上述内容，提出一种能够响应植物干旱诱导的启动子及其应用。
发明内容
本发明的目的在于提供一种能够响应植物干旱诱导的启动子。
本发明通过以下技术方案来实现上述目的：
本发明提供了一种能够响应植物干旱诱导的启动子，所述启动子为如SEQ IDNO.1所示核苷酸序列或其截短序列。
进一步改进在于，所述启动子为如SEQ ID NO.1所示核苷酸序列在-650bp或其上游处截短获得的下游序列。
进一步改进在于，所述启动子的核苷酸序列如SEQ ID 2-5任一所示。
进一步改进在于，所述启动子核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，序列全长650bp。
本发明还提供了一种上述启动子在响应植物干旱诱导调控下游基因表达中的应用。
进一步改进在于，所述植物为烟草或玉米。
本发明还提供了一种上述启动子的获得方法，以玉米B73基因组为模板，利用特异性扩增引物进行PCR扩增，获得能够响应植物干旱诱导的启动子，所述特异性扩增引物包括上游引物和下游引物；
所述上游引物选自如下序列的任一种：
P2000-F：GACTCTTGGTTGGGATGTAAAAT，扩增SEQ ID NO.1所示的启动子序列；
P1800-F：TAGGTGGACGATGAGCTGGAC，扩增SEQ ID NO.2所示的启动子序列；
P1500-F：CAAGAAGAAACATGGATTCATGTT，扩增SEQ ID NO.3所示的启动子序列；
P1200-F：AAACACACATGTGGTGTAGTGGTA，扩增SEQ ID NO.4所示的启动子序列；
P650-F：TTGCTTTGGTTAGAGGAA，扩增SEQ ID NO.5所示的启动子序列；
P200-F：AAAGTGACAAATACTCTGGCTCC，扩增SEQ ID NO.6所示的启动子序列；
所述下游引物为：
P2000-R：GGTGGCTGCAGGCTTTCC。
本发明具有如下有益效果：
本发明一种能够响应植物干旱诱导的启动子，通过荧光素酶LUC瞬时转化活性分析，表明该启动子能够响应干旱胁迫调控下游基因表达。发现-650bp区段表达的荧光素酶活性最强，其而到-200bp区段时荧光素酶活性明显的减弱，鉴定了启动子核心调控区域位于-650bp到-200bp区域内，其中包含2个MYB和2个MBS元件。
附图说明
图1为本发明中启动子扩增电泳图(M：DL 5000Marker；1：启动子)；
图2为本发明中启动子的生物信息学分析；
图3为本发明中启动子干旱诱导活性分析(A：pGreenII 0800-2000pro-LUC干旱处理前后发光图像；B：pGreenII 0800-CaMV35S-LUC干旱处理前后的发光图像；C：pGreenII0800-2000pro-LUC与pGreenII 0800-CaMV35S-LUC处理前后LUC/REN比值)；
图4为本发明中启动子5′缺失载体构建示意图；
图5为本发明中启动子5′缺失载体的酶切验证(M：DL 5000Marker；1-6：pGreenII0800-200-LUC、pGreenII 0800-650-LUC、pGreenII 0800-1200-LUC、pGreenII 0800-1500-LUC、pGreenII 0800-1800-LUC、pGreenII 0800-2000-LUC)；
图6为本发明中启动子不同缺失片段双荧光素酶活性分析(A：左上为pGreenII0800-LUC发光图像；左下为pGreenII 0800-CaMV35S-LUC发光图像；右为实验组发光图像；B：荧光素酶活性分析)。
具体实施方式
下面结合附图对本申请作进一步详细描述，有必要在此指出的是，以下具体实施方式只用于对本申请进行进一步的说明，不能理解为对本申请保护范围的限制，该领域的技术人员可以根据上述申请内容对本申请作出一些非本质的改进和调整。
1、材料
本实验所用所有试剂如无特殊说明均为常规试剂，均使用去离子水配制，所使用到的仪器均为实验室常规仪器。
2、方法
2.1启动子干旱诱导活性分析
2.1.1启动子的克隆及序列分析
以玉米B73基因组为模板，使用Primer Premier5.0软件设计特异性引物扩增启动子片段。特异性引物如下表：
表1引物序列(1)
Figure BDA0003676361290000041
使用高保真酶对启动子进行扩增，体系如下：
表2 PCR反应体系
Figure BDA0003676361290000042
PCR反应结束后，将产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，发现有2000bp左右的目的条带，如图1所示，将胶块切出，将目的条带胶回收(胶回收步骤参照AxyPrep公司胶回收说明书)，将纯化的胶回收产物连接到Blunt simple载体上，体系如下：
表3连接体系(1)
Figure BDA0003676361290000043
4℃过夜连接。将连接产物转化到Trans1-T1感受态细胞，等培养基长出菌斑后，挑斑摇菌，将单个克隆挑入含有50μg/mL Kan的液体LB培养基中，37℃，220r/min大摇。菌液培养10-12h以后，在超净工作台里一部分保菌，一部分送公司测序，剩下的提质粒保存(提质粒步骤参考AxyPrep公司说明书)。
根据启动子的测序结果，与从MaizeGDB网站(https://www.maizegdb.org/)获得的启动子序列(SEQ ID NO.1)进行比对(转录起始位点前2000bp序列)，然后将启动子的全长序列使用PlantCARE(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/ html/)工具对该启动子所包含的顺式作用元件及其分布进行分析。结果显示，启动子序列中包含了一些与非生物胁迫有关的顺式作用元件，如图2所示，包括3个与脱落酸响应有关的ABRE元件、2个与干旱响应有关的DRE core元件、1个与干旱响应有关DER1元件、1个与低温响应有关的LTR元件以及参与干旱响应的4个MYB和2个MBS结合位点，如表4所示。
表4启动子中包含的顺式作用元件
Figure BDA0003676361290000051
2.1.2启动子瞬时表达载体构建
为了鉴定启动子调控下游基因能力，构建全长启动子瞬时表达载体。以pGreenII0800-LUC载体作为实验所需载体，以成功克隆连接到Blunt simple载体上的质粒作为模板，根据瞬时表达载体pGreenII 0800-LUC序列重新设计引物，根据启动子序列选择BamHI(GGATCC)作为酶切位点，同时构建阳性对照表达载体pGreenII 0800-CaMV35S-LUC，设计引物如下：
表5引物序列(2)
Figure BDA0003676361290000052
采用单酶切的方式将载体pGreenII 0800-LUC线性化，酶切体系如下：
表5酶切体系(1)
Figure BDA0003676361290000061
加样后置于37℃金属浴3h，以空载做对照，电泳查看酶切结果并将目的条带回收，纯化保存备用。将PCR的胶回收产物和pGreenII 0800-LUC质粒酶切的胶回收产物按照同源重组方式连接，体系如下：
表7连接体系(2)
Figure BDA0003676361290000062
加样混匀，25℃连接15min。反应结束后，置于冰上冷却数秒，之后重组产物用于转化，将重组产物转化到Trans1-T1感受态细胞中，转化、涂板、挑斑摇菌，提质粒，对质粒进行单酶切检验是否成功构建载体。通过测序并使用MEGA6进行序列比对。测序结果表明测序序列与数据库序列完全一致，测序结果与酶切结果均证明启动子载体pGreenII 0800-2000pro-LUC构建成功。以同样的方法构建pGreenII 0800-CaMV35S-LUC载体。
2.1.3启动子干旱诱导活性分析
(一)重组质粒转化农杆菌
选择带有pSoup和p19的GV3101农杆菌感受态，转化步骤如下：
(1)将农杆菌感受态从-80℃冰箱拿出来，放手心融化，等到半融化状态时***冰里；
(2)等到感受态全部融化以后，向感受态加入pGreenII 0800-2000pro-LUC载体、pGreenII 0800-CaMV35S-LUC载体，轻轻弹弹离心管，使其混匀，***冰里冰浴5min；
(3)5min后迅速放进液氮中速冻5min；
(4)速冻结束，放入42℃水浴锅热击5min；
(5)热击后放入冰里冷却；
(6)在超净工作台里，往装有感受态混合物的离心管加500μL的新鲜的液体YEP；
(7)将离心管放在28℃摇床小摇2-3h；
(8)小摇结束，吸取80μL的菌液均匀的涂在双抗(50μg/mL Kana和50μg/mL Rif)YEP固体培养基上，28℃培养箱倒置培养36-48h；
(9)挑斑，摇菌，将菌斑挑到含有卡那霉素和利福平的液体培养基中大摇；
(10)菌液摇混以后保菌，菌液PCR验证，能扩增出目的条带的菌液保存备用。
(二)侵染烟草
将验证好的农杆菌28℃过夜培养，培养至菌液OD600值到1.5时，6000r/min离心5min收菌，收菌结束弃上清，使用烟草侵染液(0.5mol/L的MES，1mol/L的MgCl2，0.1mol/L的乙酰丁香酮(AS))，将每种菌液的OD600值调到1.0。黑暗放置2h。选择6周大的烟草叶片用于注射，每个菌液对应3颗烟草用于3个生物重复。用2mL的注射器吸取侵染液后，拔掉针头，从烟草背面轻轻的将侵染液注射到叶片中，每个叶片对称注射两个位置，侵染范围不要太大，将注射好的烟草黑暗放置36-48h用于后续的活性分析。为了探究启动子是否响应干旱胁迫调控下游基因的表达，注射前一天对6周大的烟草浇灌20％的PEG溶液作为干旱处理。
(三)荧光素酶活性分析
(1)定性分析
将黑暗处理的烟草叶片取出，在叶片背部注射的位置喷上荧光素酶的底物，黑暗放置十分钟后，放置在植物活体成像仪中检测发光情况，发光的强弱代表启动子的启动能力。每个实验组取3个不同的叶片，作为3个生物重复，操作重复3次。
(2)定量分析
定量分析根据Dual-Luciferase repoter assay system试剂盒操作说明进行操作，每个实验组取三棵烟草同一位置大小的烟草，用液氮磨成粉末，装在1.5mL离心管中。加入100μL的1×PLB缓冲液，震荡混匀，室温放置反应25min。离心取上清50μL于96孔板中，首先在向各个样品中加入50μL的LARⅡ试剂(Luciferase Assay Buffer Ⅱ溶解冻干粉Luciferase Assay Substrate)，将96孔板放在LB 942多模微孔板阅读器检测荧光素酶含量，随后将96孔板拿出，向各个加过试剂的孔中加入50μL的Stop&Glo Reagent试剂(1倍体积的Stop&
Figure BDA0003676361290000081
Substrate(50X)与50倍体积的Stop&
Figure BDA0003676361290000082
Buffer混合)检测海肾荧光素酶含量，最后以荧光素酶与海肾荧光素酶含量的比值来判断启动子活性强弱。
定性结果表明，干旱处理前，启动子能够启动下游荧光素酶的活性，且干旱诱导处理后明显的激活下游LUC基因的表达。CaMV35S启动子作为阳性对照，干旱诱导前后，都能明显的启动下游荧光素酶的表达，但在诱导前后活性变化并不大。定量分析结果与定性结果一致，如图3所示，表明启动子能够响应干旱诱导调控下游基因表达。
2.2启动子核心区域的鉴定
2.2.1启动子5′缺失片段瞬时表达载体的构建
为了鉴定启动子对下游基因调控的核心区域，需要构建不同缺失长度的瞬时表达载体。
根据PlantCARE在线网站对全长启动子的顺式作用元件的分布情况分析，对全长启动子进行不同的5′片段缺失，共获得了5个截短片段，如图4所示。序列长度分别为1800bp(序列如SEQ ID NO.2所示)、1500bp(序列如SEQ ID NO.3所示)、1200bp(序列如SEQ IDNO.4所示)、650bp(序列如SEQ ID NO.5所示)和200bp(序列如SEQ ID NO.6所示)，根据pGreenII 0800-LUC载体图谱分别设计上游引物，选择BamHI为酶切位点，所用引物如下：
表6引物序列(3)
Figure BDA0003676361290000083
以携带全长启动子的质粒为模板，分别进行PCR扩增，电泳检测得到目的条带，PCR胶回收产物通过同源重组方式连入线性化的pGreenII 0800-LUC载体的多克隆位点BamHI处，连接产物分别转化挑斑摇菌后，得到的质粒分别命名为pGreenII 0800-1800-LUC、pGreenII 0800-1500-LUC、pGreenII 0800-1200-LUC、pGreenII 0800-650-LUC和pGreenII0800-200-LUC。将得到的质粒进行酶切验证，电泳检测条带符合预期结果，如图5所示。同时，重组质粒的菌液进行测序验证，验证成功后，菌液保存用于后续实验。
2.2.2启动子核心调控区域的鉴定
为了鉴定启动子的核心调控区域，采用瞬时转化烟草的方式根据荧光素酶的活性强弱来判断启动子活性强弱。将构建好的5个截短序列以及全长启动子的瞬时转化载体，阳性对照pGreenII 0800-CaMV35S-LUC和pGreenII 0800-LUC空载阴性对照分别转化农杆菌感受态菌株GV3101(pSoup-p19)中，涂于含有50μg/mL Kana和50μg/mL Rif的YEP固体培养基上，28℃倒置培养36-48h，挑斑摇菌，保菌备用。将农杆菌菌液作为模板，通过菌落PCR的方式检测是否成功转入农杆菌中。验证成功的农杆菌28℃过夜培养，培养至OD600值到1.5，离心收菌，侵染烟草方法同上，侵染结束将烟草放于黑暗环境生长36-48h用于后续荧光素酶活性分析。
通过定性和定量两种方式观察瞬时转化报告基因LUC的表达，通过植物活体成像***采集烟草叶片的发光图像，发现-650bp区段表达的荧光素酶活性最强，到-200bp区段时荧光素酶活性明显的减弱，其他区段均有不同程度的活性减弱，定量结果与定性结果一致，如图6所示。由结果可得启动子核心调控片段为位于基因ATG上游-650bp到-200bp区域内的450bp序列。序列结构分析发现其中含有与干旱相关的2个MBS以及2个MYB顺式作用元件。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。
序列表
<110> 安徽农业大学
<120> 一种能够响应植物干旱诱导的启动子及其应用
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 2000
<212> DNA
<213> 玉米(Zea mays L)
<400> 1
gactcttggt tgggatgtaa aataaagtgc acctcgggct catcagcaag gtagtacccc 60
tagccgttgc accaccggat gcgctactcc tctacataca tcgtgttcga ggacactcat 120
acaacgtcag gaacggccat cgtctcagcg cacaagaatt tatggccagt cagtagcgac 180
ttacgtggca ggttgggctt taggtggacg atgagctgga cgacgtgtcg tcgtcgtcga 240
atgcggtgcc cagaacaacc cgagagtcgc cgacattggc gacgaccatg cggtccccct 300
gcttgacgat ggacagcgcg gagcggccgc tctgcaccgc gtaagcggcg gctgcgccgg 360
agcttgtcgt acatagcggc acatgcggcc acgtaggact gtttctagag gtcgaactgg 420
cagtcgctaa gtttcttctt atcgtcgatg agcgacccca acgcgagtgc ctcctgctaa 480
tggtatttgt tcggggtttt caagaagaaa catggattca tgtttggcgt tggtttatac 540
aaatgactca caagtcagat ccatggaaaa aatattatga agaataaatg tcacgcatgc 600
aaaaaagaaa tttaatttga aaacattatt caaacaaaag aaattgcatg caaggctctt 660
ctttaaatac tactccctcc atcaaaaata taattcaaga atctcggtga tacttatcta 720
ctactacgca ttgtacaagg gtagcaggtg ggcttgggga gagatatagt agatgtgttt 780
tctgttatag atatagaaat aaacacacat gtggtgtagt ggtagctact gctagcattt 840
gcttaagagg ttgtgggttt gaattccctt ggtgccatgt gaattttttt aattttagct 900
aggcgtcggc tgtacggggg gggggggaat atgaatggga atgggttttg cggggaggga 960
aaatgataat gatagataga atgatgacag aacatgtgaa tggactgtgc gcgaggagac 1020
tactattgca gccttaataa gtagtagaga tatcttggac taatttattt ggataagttt 1080
taaactcgat ttgaatcctc ttgaagcttc ttcacatatt ttgagtgatt atcttgttga 1140
tgttggattt attatttgtg catcccatca acacaattca aacacatggg tccgcgttct 1200
cgtgaattaa gccatatgag accactagaa gtaataaaac atataagcaa tatgaattca 1260
aactttttag ttttcaatga atgtcctaat tcatgtctat atgcactagc catatctggt 1320
aaggtatgaa aggcacaacc tattttacct ttgctttggt tagaggaaac actagtcata 1380
attgatgttt tttaactcgc gttcgaatca taaaaaatat ttacttcatt tcttagcatg 1440
taaaatattt ctttatctag tggcttggta aatatattga ccagttgatc ttggtcatct 1500
agactcgcaa cttcaatttt tggcacttga aaaataaaca attcaactgt atgtaaatga 1560
cctagggaaa agagatatgt ttttcgatac aaaagtataa gagataaaac agtactgtat 1620
aaaaatggtt gtaaaaatac tttagaattc ttgatacaaa attgtttatg tgcgatatat 1680
tgaaaataaa aacaaacaaa caaataggcc ttctactctt tttttcaact tgaaaatttt 1740
attaactagt tttgttttca gcgactattg tagatgctca tgctctacca gaaaccaaac 1800
aaagtgacaa atactctggc tccaaccacc gtcaggtttg cggtgcagga gaaataacac 1860
ctccctaaat agaaaacaac acaagtcacc atcgaataga aacgaaatat ttttaatccg 1920
cttttcggtt ggtggtgcct ggcatctacc gtgcggaggg ggaagaggga gaggccagga 1980
gaggaaagcc tgcagccacc 2066
<210> 2
<211> 1800
<212> DNA
<213> 玉米(Zea mays L)
<400> 2
taggtggacg atgagctgga cgacgtgtcg tcgtcgtcga atgcggtgcc cagaacaacc 60
cgagagtcgc cgacattggc gacgaccatg cggtccccct gcttgacgat ggacagcgcg 120
gagcggccgc tctgcaccgc gtaagcggcg gctgcgccgg agcttgtcgt acatagcggc 180
acatgcggcc acgtaggact gtttctagag gtcgaactgg cagtcgctaa gtttcttctt 240
atcgtcgatg agcgacccca acgcgagtgc ctcctgctaa tggtatttgt tcggggtttt 300
caagaagaaa catggattca tgtttggcgt tggtttatac aaatgactca caagtcagat 360
ccatggaaaa aatattatga agaataaatg tcacgcatgc aaaaaagaaa tttaatttga 420
aaacattatt caaacaaaag aaattgcatg caaggctctt ctttaaatac tactccctcc 480
atcaaaaata taattcaaga atctcggtga tacttatcta ctactacgca ttgtacaagg 540
gtagcaggtg ggcttgggga gagatatagt agatgtgttt tctgttatag atatagaaat 600
aaacacacat gtggtgtagt ggtagctact gctagcattt gcttaagagg ttgtgggttt 660
gaattccctt ggtgccatgt gaattttttt aattttagct aggcgtcggc tgtacggggg 720
gggggggaat atgaatggga atgggttttg cggggaggga aaatgataat gatagataga 780
atgatgacag aacatgtgaa tggactgtgc gcgaggagac tactattgca gccttaataa 840
gtagtagaga tatcttggac taatttattt ggataagttt taaactcgat ttgaatcctc 900
ttgaagcttc ttcacatatt ttgagtgatt atcttgttga tgttggattt attatttgtg 960
catcccatca acacaattca aacacatggg tccgcgttct cgtgaattaa gccatatgag 1020
accactagaa gtaataaaac atataagcaa tatgaattca aactttttag ttttcaatga 1080
atgtcctaat tcatgtctat atgcactagc catatctggt aaggtatgaa aggcacaacc 1140
tattttacct ttgctttggt tagaggaaac actagtcata attgatgttt tttaactcgc 1200
gttcgaatca taaaaaatat ttacttcatt tcttagcatg taaaatattt ctttatctag 1260
tggcttggta aatatattga ccagttgatc ttggtcatct agactcgcaa cttcaatttt 1320
tggcacttga aaaataaaca attcaactgt atgtaaatga cctagggaaa agagatatgt 1380
ttttcgatac aaaagtataa gagataaaac agtactgtat aaaaatggtt gtaaaaatac 1440
tttagaattc ttgatacaaa attgtttatg tgcgatatat tgaaaataaa aacaaacaaa 1500
caaataggcc ttctactctt tttttcaact tgaaaatttt attaactagt tttgttttca 1560
gcgactattg tagatgctca tgctctacca gaaaccaaac aaagtgacaa atactctggc 1620
tccaaccacc gtcaggtttg cggtgcagga gaaataacac ctccctaaat agaaaacaac 1680
acaagtcacc atcgaataga aacgaaatat ttttaatccg cttttcggtt ggtggtgcct 1740
ggcatctacc gtgcggaggg ggaagaggga gaggccagga gaggaaagcc tgcagccacc 1858
<210> 3
<211> 1500
<212> DNA
<213> 玉米(Zea mays L)
<400> 3
caagaagaaa catggattca tgtttggcgt tggtttatac aaatgactca caagtcagat 60
ccatggaaaa aatattatga agaataaatg tcacgcatgc aaaaaagaaa tttaatttga 120
aaacattatt caaacaaaag aaattgcatg caaggctctt ctttaaatac tactccctcc 180
atcaaaaata taattcaaga atctcggtga tacttatcta ctactacgca ttgtacaagg 240
gtagcaggtg ggcttgggga gagatatagt agatgtgttt tctgttatag atatagaaat 300
aaacacacat gtggtgtagt ggtagctact gctagcattt gcttaagagg ttgtgggttt 360
gaattccctt ggtgccatgt gaattttttt aattttagct aggcgtcggc tgtacggggg 420
gggggggaat atgaatggga atgggttttg cggggaggga aaatgataat gatagataga 480
atgatgacag aacatgtgaa tggactgtgc gcgaggagac tactattgca gccttaataa 540
gtagtagaga tatcttggac taatttattt ggataagttt taaactcgat ttgaatcctc 600
ttgaagcttc ttcacatatt ttgagtgatt atcttgttga tgttggattt attatttgtg 660
catcccatca acacaattca aacacatggg tccgcgttct cgtgaattaa gccatatgag 720
accactagaa gtaataaaac atataagcaa tatgaattca aactttttag ttttcaatga 780
atgtcctaat tcatgtctat atgcactagc catatctggt aaggtatgaa aggcacaacc 840
tattttacct ttgctttggt tagaggaaac actagtcata attgatgttt tttaactcgc 900
gttcgaatca taaaaaatat ttacttcatt tcttagcatg taaaatattt ctttatctag 960
tggcttggta aatatattga ccagttgatc ttggtcatct agactcgcaa cttcaatttt 1020
tggcacttga aaaataaaca attcaactgt atgtaaatga cctagggaaa agagatatgt 1080
ttttcgatac aaaagtataa gagataaaac agtactgtat aaaaatggtt gtaaaaatac 1140
tttagaattc ttgatacaaa attgtttatg tgcgatatat tgaaaataaa aacaaacaaa 1200
caaataggcc ttctactctt tttttcaact tgaaaatttt attaactagt tttgttttca 1260
gcgactattg tagatgctca tgctctacca gaaaccaaac aaagtgacaa atactctggc 1320
tccaaccacc gtcaggtttg cggtgcagga gaaataacac ctccctaaat agaaaacaac 1380
acaagtcacc atcgaataga aacgaaatat ttttaatccg cttttcggtt ggtggtgcct 1440
ggcatctacc gtgcggaggg ggaagaggga gaggccagga gaggaaagcc tgcagccacc 1548
<210> 4
<211> 1200
<212> DNA
<213> 玉米(Zea mays L)
<400> 4
aaacacacat gtggtgtagt ggtagctact gctagcattt gcttaagagg ttgtgggttt 60
gaattccctt ggtgccatgt gaattttttt aattttagct aggcgtcggc tgtacggggg 120
gggggggaat atgaatggga atgggttttg cggggaggga aaatgataat gatagataga 180
atgatgacag aacatgtgaa tggactgtgc gcgaggagac tactattgca gccttaataa 240
gtagtagaga tatcttggac taatttattt ggataagttt taaactcgat ttgaatcctc 300
ttgaagcttc ttcacatatt ttgagtgatt atcttgttga tgttggattt attatttgtg 360
catcccatca acacaattca aacacatggg tccgcgttct cgtgaattaa gccatatgag 420
accactagaa gtaataaaac atataagcaa tatgaattca aactttttag ttttcaatga 480
atgtcctaat tcatgtctat atgcactagc catatctggt aaggtatgaa aggcacaacc 540
tattttacct ttgctttggt tagaggaaac actagtcata attgatgttt tttaactcgc 600
gttcgaatca taaaaaatat ttacttcatt tcttagcatg taaaatattt ctttatctag 660
tggcttggta aatatattga ccagttgatc ttggtcatct agactcgcaa cttcaatttt 720
tggcacttga aaaataaaca attcaactgt atgtaaatga cctagggaaa agagatatgt 780
ttttcgatac aaaagtataa gagataaaac agtactgtat aaaaatggtt gtaaaaatac 840
tttagaattc ttgatacaaa attgtttatg tgcgatatat tgaaaataaa aacaaacaaa 900
caaataggcc ttctactctt tttttcaact tgaaaatttt attaactagt tttgttttca 960
gcgactattg tagatgctca tgctctacca gaaaccaaac aaagtgacaa atactctggc 1020
tccaaccacc gtcaggtttg cggtgcagga gaaataacac ctccctaaat agaaaacaac 1080
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ggcatctacc gtgcggaggg ggaagaggga gaggccagga gaggaaagcc tgcagccacc 1238
<210> 5
<211> 650
<212> DNA
<213> 玉米(Zea mays L)
<400> 5
ttgctttggt tagaggaaac actagtcata attgatgttt tttaactcgc gttcgaatca 60
taaaaaatat ttacttcatt tcttagcatg taaaatattt ctttatctag tggcttggta 120
aatatattga ccagttgatc ttggtcatct agactcgcaa cttcaatttt tggcacttga 180
aaaataaaca attcaactgt atgtaaatga cctagggaaa agagatatgt ttttcgatac 240
aaaagtataa gagataaaac agtactgtat aaaaatggtt gtaaaaatac tttagaattc 300
ttgatacaaa attgtttatg tgcgatatat tgaaaataaa aacaaacaaa caaataggcc 360
ttctactctt tttttcaact tgaaaatttt attaactagt tttgttttca gcgactattg 420
tagatgctca tgctctacca gaaaccaaac aaagtgacaa atactctggc tccaaccacc 480
gtcaggtttg cggtgcagga gaaataacac ctccctaaat agaaaacaac acaagtcacc 540
atcgaataga aacgaaatat ttttaatccg cttttcggtt ggtggtgcct ggcatctacc 600
gtgcggaggg ggaagaggga gaggccagga gaggaaagcc tgcagccacc 650
<210> 6
<211> 200
<212> DNA
<213> 玉米(Zea mays L)
<400> 6
aaagtgacaa atactctggc tccaaccacc gtcaggtttg cggtgcagga gaaataacac 60
ctccctaaat agaaaacaac acaagtcacc atcgaataga aacgaaatat ttttaatccg 120
cttttcggtt ggtggtgcct ggcatctacc gtgcggaggg ggaagaggga gaggccagga 180
gaggaaagcc tgcagccacc 200

Claims (5)

1.一种能够响应植物干旱诱导的启动子，其特征在于，所述启动子为如SEQ ID NO.1-5任一所示的核苷酸序列。
2.根据权利要求1所述的一种能够响应植物干旱诱导的启动子，其特征在于，所述启动子核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，序列全长650 bp。
3.一种如权利要求1-2任一所述的启动子在响应植物干旱诱导调控下游基因表达中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述植物为烟草或玉米。
5.一种如权利要求1所述的启动子的获得方法，其特征在于，以玉米B73基因组为模板，利用特异性扩增引物进行PCR扩增，获得能够响应植物干旱诱导的启动子，所述特异性扩增引物包括上游引物和下游引物；
所述上游引物选自如下序列的任一种：
P2000-F：GACTCTTGGTTGGGATGTAAAAT，扩增SEQ ID NO.1所示的启动子序列；
P1800-F：TAGGTGGACGATGAGCTGGAC，扩增SEQ ID NO.2所示的启动子序列；
P1500-F：CAAGAAGAAACATGGATTCATGTT，扩增SEQ ID NO.3所示的启动子序列；
P1200-F：AAACACACATGTGGTGTAGTGGTA，扩增SEQ ID NO.4所示的启动子序列；
P650-F：TTGCTTTGGTTAGAGGAA，扩增SEQ ID NO.5所示的启动子序列；
所述下游引物为：
P2000-R：GGTGGCTGCAGGCTTTCC。
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