CN104946665B

CN104946665B - GmMYB62在培育抗逆性提高的转基因植物中的应用

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Publication number: CN104946665B
Application number: CN201510364802.5A
Authority: CN
Inventors: 许玲; 张大勇; 邵宏波; 张玲; 徐照龙; 何晓兰; 黄益洪; 卫陪陪; 郭士伟
Original assignee: Jilin Academy of Agricultural Sciences; Jiangsu Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Jilin Academy of Agricultural Sciences; Jiangsu Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2015-06-26
Filing date: 2015-06-26
Publication date: 2021-06-25
Anticipated expiration: 2035-06-26
Also published as: CN104946665A

Abstract

本发明涉及植物的一个GmMYB62基因或其编码蛋白在培育抗逆性提高的转基因植物中的应用，所述的GmMYB62的编码基因来自野生大豆，多重序列比对发现和其他植物的MYB类基因具有较高的保守性。在转基因组合植株中，实时荧光定量PCR检测结果表明过表达GmMYB62基因能够调节抗旱相关基因的表达，同时调节异黄酮合成相关基因的表达；在干旱胁迫处理下，与对照相比较，转GmMYB62基因的过表达组合植株抗旱性明显提高，表明该基因GmMYB62可作为目的基因导入植物（包括单子叶和双子叶植物），提高植物抗逆性，具有较高的实际应用价值。

Description

GmMYB62在培育抗逆性提高的转基因植物中的应用

技术领域

本发明涉及植物GmMYB62基因及其所编码的蛋白质的应用，特别是涉及一个来源于大豆GmMYB62基因及其所编码的蛋白质在培育抗逆性提高的转基因植物中的应用，属于分子生物学和生物技术领域。

背景技术

干旱、低温和高盐等逆境胁迫是限制植物生长发育的重要因子，也是影响作物产量的主要非生物胁迫因素。植物中的转录因子有一部分是与抗逆性相关的，当植物受到外界的胁迫时，胁迫信号激发转录因子的表达，然后转录因子与相应的顺式作用元件结合，启动特定基因的转录表达，引起植物生理生化的变化，从而提高植物的抗逆性。近年来，相继从高等植物中分离出调控干旱、高盐、低温、激素、病原反应以及生长发育等相关基因表达的转录因子已达数百种。

Myb(v-myb avian myeloblastosis viral oncogene homolog)转录因子是最大的植物转录因子家族成员之一，参与了细胞分化、细胞周期的调节，激素和环境因子应答，并对植物次生代谢以及叶片等器官形态建成具有重要的调节作用。MYB类转录因子家族是指含有基因的N端含有特异MYB结构域的一类转录因子。MYB结构域是一段约51-52个氨基酸的肽段，包含一系列高度保守的氨基酸残基和间隔序列。每个MYB 结构域折叠成螺旋-转角-螺旋空间结构，其中含有3 个色氨酸残基，这3 个残基被18～19 个氨基酸残基隔开，起着疏水核心的作用。MYB类转录因子由3个保守的功能域组成：一个DNA结合结构域(DNAbinding domain，DBD)、一个转录激活结构域(transactivation domain，TAD)以及一个不完全界定的负调节区(negative regulatory domain， NRD)(Frampton，2004；Thompsonand Ramsay，1995)。DNA结合结构域最为保守，一般包含1～3个不完全重复序列(R)。根据重复片段(R)的个数，通常可以把MYB 转录因子分为单一MYB 结构域蛋白(R1/R2)，2R 蛋白(R2R3)和3R 蛋白(R1R2R3)。

研究发现有许多MYB 转录因子参与了植物在干旱逆境下的应答过程。厚叶旋蒴苣苔中的BcMYB1 受干旱强烈诱导，同时能对PEG、高盐、低温等胁迫产生一定程度的应答。拟南芥的AtMYB60 也被证实参与植物的耐旱胁迫过程。同时，MYB 转录因子还与其他应答因子共同合作应答干旱逆境。如乙烯基应答因子TSRF1 可以通过与目的基因启动子GCC 盒的结合增强MYB 的表达，通过表达TSRF1 植株的qPCR 分析发现OsMYB59 的表达与CK 相比较有明显的增长，从而加强了水稻的耐干旱能力。

2008年，Yong Liao 等对前期获得的 156 个大豆 MYBs 基因进行比对后发现，其中的 48 个基因具有全长开放阅读框。在这156 个 GmMYBs 中，有 43 个成员至少对盐、低温、干旱和 ABA 四种处理中的一种具有应答响应，GmMYB76，GmMYB92 和 GmMYB177 三个基因在 ABA，高盐，干旱和/或低温诱导时均表现为上调，拟南芥转基因植株表现出抗逆性的增强（Soybean GmMYB76,GmMYB92 and GmMYB177 genes confer stress tolerance intransgenic Arabiopsis plants. Cell Res, 2008, 18: 1047−1060）。杨文杰等分离并鉴定了四个 MYB 转录因子，分别命名为GmMYBZ1、GmMYBZ2、GmMYBJ6 和 GmMYBJ7，利用 UV-B射线、干旱和高盐处理中豆 27 号，诱导 GmMYBJ6 基因的表达水平增加，暗示 GmMYBJ6 基因表达与非生物胁迫密切相关（Expression and functional analysis of GmMYBJ6 fromsoybean. Heredites, 2009, 31(6): 645−653）。2012年，Xuyan Li等研究表明GmMYB62作为一个新的R1型MYB蛋白，可以与GmMYB176蛋白互作，推测其可能参与大豆异黄酮的合成，但没有明确GmMYB62基因的功能（14-3-3 proteins act as scaffolds for GmMYB62 andGmMYB176 and regulate their intracellular localization in soybean，PlantSignaling & Behavior 2012, 7(8): 965-968）。这些研究表明，研究大豆 GmMYB 基因功能对于大豆抗逆分子育种十分重要。

发明内容

本发明的目的在于提供一个来源于大豆的MYB类基因及其所编码的蛋白质GmMYB62（Glycine max v-myb avian myeloblastosis viral oncogene homolog 62)在培育抗逆性提高的转基因植物中的应用。其特征在于：

所述基因GmMYB62具有SEQ ID NO：1的DNA序列；

所述GmMYB62的编码蛋白具有SEQ ID NO：2的氨基酸残基序列，或者具有将SEQ IDNO：2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加成为具有转录激活功能的提高植物抗逆性的氨基酸残基序列。

具体地，上述基因GmMYB62可为如下a)或b)或c)的DNA分子：

a) 序列表中序列1所示的DNA分子，由1080个核苷酸组成；

b) 在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID NO：1限定的DNA序列杂交的核苷酸序列;

c) 编码与序列表中SEQ ID NO：2相同氨基酸残基序列的多核苷酸序列。

所述高严谨条件为在0.1×SSPE（或0.1×SSC），0.1％SDS的溶液中，在65℃条件下杂交并洗膜。

列表中的SEQ ID NO：1由1080个脱氧核苷酸组成，其编码序列为自5’端第1位至1080位脱氧核苷酸，编码具有序列表中SEQ ID NO：2的氨基酸残基序列的蛋白质。

其中，序列表中的SEQ ID NO：2由359个氨基酸残基组成，通过http:// www.ncbi.nlm.nih.gov/BLASTp结果表明该蛋白自氨基端（N端）第 111 位左右至第 155位左右的氨基酸残基为保守的 MYB家族蛋白特异保守的SANT结构域。

所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加是指不多于十个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。

含有本发明基因的表达载体、细胞系及宿主菌均属于本发明的保护范围。扩增任GmMYB62一片段的引物对也在本发明的保护范围之内。

本发明所提供的调控植物抗逆性的应用，是将所述大豆GmMYB62类基因导入植物组织或细胞，调节异黄酮的合成，植物抗逆性得到提高。

所述的GmMYB62基因可通过含有GmMYB62的植物表达载体导入外植体；用于构建所述植物表达载体的出发载体可为任意一种双元农杆菌载体或可用于植物微弹轰击的载体等，如pBI121、pCXSN或其他衍生植物表达载体；使用本发明的GmMYB62构建植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种组成型、组织特异型、诱导型或增强型启动子；为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所使用的载体进行加工，如加入具有抗性的抗生素标记（卡那霉素、潮霉素等）或抗化学试剂标记基因（如抗除草剂bar基因等）及可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或蛋白等（GUS基因、GFP基因等）。

携带有GmMYB62的植物表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物细胞或组织培育成植株。上述通过转基因调控植物抗逆性的方法对所有植物均适用，既可适用于单子叶植物（小麦、水稻、玉米等），也可以适用双子叶植物（大豆、烟草、棉花等）。

本发明提供的GmMYB62基因来自野生大豆，多重序列比对发现和其他植物的MYB类基因具有较高的保守性；实时荧光定量 PCR检测结果表明GmMYB62在大豆的各个生理发育时期均有表达，并且在根、茎、叶、花中表达较高，豆荚中没有检测到表达；在转基因组合植株中，实时荧光定量 PCR检测结果表明过表达GmMYB62基因能够调节抗旱相关基因的表达，同时调节异黄酮合成相关基因的表达；在干旱胁迫处理下，与对照相比较，转GmMYB62基因的过表达组合植株抗旱性明显提高，表明该基因GmMYB62可作为目的基因导入植物（包括单子叶和双子叶植物），提高植物抗逆性，具有较高的实际应用价值。

附图说明

图1为GmMYB62蛋白的保守结构域；

图2为GmMYB62蛋白与其他植物的MYB蛋白氨基酸的多重序列比对；

图3为MYB蛋白mRNA在不同组织器官中表达丰度的实时荧光定量PCR检测结果；

图4为PCXSN植物过表达载体物理图谱；

图5为过表达GmMYB62基因调节抗旱相关基因的表达情况；

图6为过表达GmMYB62基因调节异黄酮合成相关基因的表达情况；

图7为PCXSN:: GmMYB62转基因组合植株抗旱性鉴定和PCR验证照片。

具体发明实施方式

1．材料与方法

1.1 材料、菌株、试剂

实验使用的大豆材料为G.max，大肠杆菌菌株DH5α为本实验室保存。pGEM-T EasyVector T克隆试剂盒、Trizol reagent、T4 DNA连接酶来自Fermentas公司；引物由上海英潍生物技术有限责任公司提供，RNA提取试剂盒购于Promega公司，凝胶回收试剂盒、DNA纯化回收试剂盒购于上海捷瑞生物工程公司，DNA marker、Taq DNA聚合酶、反转录试剂等其他生物学试剂购自上海皓嘉科技发展有限公司。

1.2总RNA提取和c DNA合成

幼苗期的根、茎、叶，开花期的根、茎、叶、花和结荚期的根、茎、叶、荚等样品在液氮中研磨后用Promega RNA提取试剂盒进行总RNA的提取，经DNaseⅠ消化去除DNA，并经质量体积分数1.2%的琼脂糖凝胶电泳检测总RNA的浓度和完整性。cDNA合成采用上海皓嘉科技发展有限公司反转录试剂盒操作流程进行。

1.3基因克隆

利用RT-PCR方法从大豆幼苗根部组织mRNA中扩增全长ORF，所用正向引物序列为Primer F：5' ATGACTCGGCGTTGCTCCCACTGC 3'和反向引物序列为Primer R：5'CAAGCTCAGACAGCTTGAATT 3'，以cDNA为模板扩增基因全长DNA序列，扩增体系为：cDNA或DNA稀释样，适量；5×PS Buffer 5 µL， 2.5 mmol L^–1dNTPs 2 µL， 10 mmol L^–1上下游引物各0.5 µL， 5 U mL^–1PimerSTAR DNA聚合酶0.25 µL， ddH₂O补足至25 µL。反应程序为：98℃预变性3 min；98℃变性5 s，55℃复性10 s，72℃延伸5 min，35个循环；暂停PCR程序，加入1µL Taq DNA聚合酶，72℃延伸10 min。PCR产物连入pGEM-T Easy Vector T克隆试剂盒载体中，送交南京金斯瑞生物科技有限公司测序，获得目的序列。

1.4序列分析

采用BLAST X 和 BLAST P 搜索 NCBI 的核苷酸和蛋白质数据库，进行序列相似性分析及氨基酸保守性预测；用Clustal X进行氨基酸序列比对及功能结构域查找与相似序列分析；结果表明，该蛋白氨基酸序列与水稻(Oryza sativa)、拟南芥（Arabidopsis thaliana)、玉米(Zea mays)、苜蓿(Medicago truncatula)、梅花（Prunus mume)、番茄（Solanum lycopersicum）等的MYB家族基因均有较高的相似性，都在氨基酸111-155之间具有一个保守的SANT结构域，如图1，2所示。

1.5基因表达分析

采用半定量RT-PCR分析法，根据cDNA序列设计引物，以大豆持家基因（Glycinemax actin-1-like）(GmActin登录号：XM_003552652)为内参，正向引物序列为5'-CGGTGGTTCTATCTTGGCATC-3'，反向引物序列为5'-GTCTTTCGCTTCAATAACCCTA-3'，目的基因正向引物：5’- AAGGAGACTGGCGTGGGATA -3’；反向引物5’- TGATTTGAGGGAGAGATTTA -3’（对大豆基因组进行BLAST结果发现没有其他同源基因，表明基因的特异性）；利用提取的幼苗根、茎、叶组织和花以及豆荚的cDNA为模板来进行基因的组织表达分析，如图3所示。

1.6载体构建

利用Xcm1酶单切载体PCXSN形成T/A克隆位点，然后利用PCR扩增基因全长ORF，所用正向引物序列为Primer F：5' ATGACTCGGCGTTGCTCCCACTGC 3'和反向引物序列为PrimerR：5' CAAGCTCAGACAGCTTGAATT 3'，然后T4连接酶把扩增产物连入酶切后的空载体内，然后用35F正向引物5'-ACTCGCCGTAAAGACTGG -3'和基因反向引物扩增获得方向正确的阳性克隆通过冻融法转入发根农杆菌K599和根癌农杆菌EHA105中，以备后续转化所用，如图4所示。

运用Hairy Root 实验体系，包括离体和在体两类，一类是豆瓣体外菌液注射发根验证；另一类是在体注射菌液发根然后再生苗，获得转基因组合植株后，对它们进行抗或耐旱鉴定；植物过表达载体通过冻融法转入发根农杆菌K599，通过注射的方法获得转基因组合植株（根为转基因，其它为非转基因），结果发现：过表达GmMYB62基因可调节抗旱相关基因RD20A、RD22和ERD1的表达，其中RD20A基因的表达水平略有下降，而RD22和ERD1基因均表现为上调表达；同时过表达GmMYB62基因可调节异黄酮合成途径中重要调节基因4CL、PAL、CHI、CHS、CHR、C4H和IFS的表达，并且除CHR基因表达略有上调外，其他各基因均表现为明显上调；在干旱胁迫下，与空对照植株相比，过表达该基因的转基因植株对PEG(20% m/v)溶液的胁迫具有较强的耐受性，表明该基因在调控异黄酮合成及植物的抗旱耐盐胁迫过程中起着重要作用，如图5、6、7所示。

2. 功能初步鉴定：

2.1植物材料

植物材料为大豆幼苗，将大豆种子点播于蛭石：沙子（3:1）的基质中，浇水并在光照培养箱（宁波海曙赛福实验仪器厂）中培养，培养条件为25-28℃，每日光照12小时，光照强度为2000lux，待苗长至4-5厘米时以备后续注射所用。

2.2菌液培养与注射

从平板上挑取单菌落K599（含GsSIP基因表达载体）置于加有1ml液体LB（附加Kan50mg/L）的15ml管中，28℃摇床上200rpm摇1-2d，然后吸取2ml离心，沉淀用10m M硫酸镁溶液重旋，再离心一次，然后用硫酸镁稀释至OD600约0.8-1.0；用0.025ml量程微型注射器吸取菌液，在大豆子叶节部位注射，注射大约3-4个孔，然后放置在加有水的小烧杯内，用塑料膜封口，在光照培养箱中（12h光照/12h黑暗）28℃培养。

2.3组合苗生长管理

大致培养5-7天时，注射的孔部长出根之后，随后揭掉塑料膜，剪掉原有的根系，在Hoagland营养液中培养至根部足够健壮时为后续研究所用。

2.4组合苗阳性植株鉴定

DNA采用CTAB法提取，0.8%琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量。PCR反应总体积为20µL，模板DNA(20ng/µL) 1µl，正反向引物(10µM)各0.4µl，10xPCR Buffer 2µl，MgCl₂(25mM)1.6µl， dNTP(10mM) 1.6µl， rTaq(5U/µL) 0.2µl，ddH2O 12.8µl。反应程序94℃预变性4min，35个循环：94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸50s，72终延伸10min。所用引物为35S正向引物 5'-ACTCGCCGTAAAGACTGG-3'；基因反向引物5' CAAGCTCAGACAGCTTGAATT 3'组合扩增来进行验证。结果表明上述植株与对应转基因载体互相对应，即转基因植株可以成功扩增出目的条带且目的基因过量表达，而阴性对照则没有，如图7所示。

对该基因通过农杆菌介导的方法转入栽培大豆，然后对异黄酮的合成及耐旱关键标志基因的表达进行测定，同时研究其耐旱的分子机理，创造新的抗或耐旱种质资源，为育种提供桥梁亲本。

综上所述，本发明人提供的GmMYB62基因是首次大豆中分离的新基因，其功能参与了大豆的异黄酮合成及抗、耐旱逆境胁迫的应答。本发明的GmMYB62基因来自栽培大豆，具有适合于双子叶植物表达的优化密码子，其基因工程受体植物除了单子叶植物水稻、玉米、小麦外，更加适合于双子叶植物，如大豆、棉花、烟草等。

序列表

<110>江苏省农业科学院吉林省农业科学院

<120>植物的一个MYB家族基因及其编码的蛋白与应用

<160>2

<210>1

<211>1080

<212>DNA

<213>栽培大豆 Glycine max v-myb avian myeloblastosis viral oncogene homolog(简称GmMYB62)，

<400>1

atgactcggc gttgctccca ctgcagcaac aacggccaca attcccggac atgcccttcg 60

cgtgggggcg gaggtgtgaa gctcttcggg gtcaggctga cggatggatc aatcattatt 120

atatacgcca gcatgggcaa cctaaacctc tcctccgccg ccgcacatca ccaattccat 180

tcatctcctt cttcttccaa cctcgccgcc gccccctcat cccccaatcc aagctcccca 240

tgctccgacc ctccccaagg ttacttgtcc gatgaccccg cccatgtctc caccttcgct 300

aaccgccgcg gtgatagaaa aaaaggtgtt ccatggactg aagaagaaca tcggctgttc 360

ttaattggtc tccagaagct aggcaaagga gactggcgtg ggatagcacg caattttgtt 420

gtatcaagga cccctactca agtagcaagt catgcccaga agtattttat ccggcagagt 480

catgctacca ggagaaagag acgttccagt ctttttgaca tggttccaga tatgtcttca 540

gatcaacctt ctgtgccaga agaacaagtg ttgcttccac cttcccagaa ctcacaacct 600

tgcaatggaa aatcacagcc ttcattaaat ctctccctca aatcagaatt tgaacccatg 660

gagactactt ctcaagaaaa tgcgcaacag accaatgaaa ctatgatggg atcaatcgga 720

ctgacaccaa tggctcctca tggattcttt cctgcatatt tacctgttcc atttcccatg 780

tggccatcaa ctgtggctcc cccgtttgaa gaagttaagg gaggagagac atcccaccat 840

cagatccaca agccaatccc agtcattccc aaggaacctg ttaatgttga cgaacttgtg 900

ggaatgtctc atctaagcat tggggaagca aaggtacgtg atagagagcc ttcccctctt 960

tccttaaagt tgttaggaga gccctcaagg cagtcagcat tccatgcaaa tgctccagtt 1020

ggtacctcgg attttaaaca atggcaagga caacgcaatt caagctgtct gagcttgtaa 1080

<210>2

<211>359

<212>PRT

<213>栽培大豆 Glycine max

<400>2

Met Thr Arg Arg Cys Ser His Cys Ser Asn Asn Gly His Asn Ser Arg

1 5 10 15

Thr Cys Pro Ser Arg Gly Gly Gly Gly Val Lys Leu Phe Gly Val Arg

20 25 30

Leu Thr Asp Gly Ser Ile Ile Ile Ile Tyr Ala Ser Met Gly Asn Leu

35 40 45

Asn Leu Ser Ser Ala Ala Ala His His Gln Phe His Ser Ser Pro Ser

50 55 60

Ser Ser Asn Leu Ala Ala Ala Pro Ser Ser Pro Asn Pro Ser Ser Pro

65 70 75 80

Cys Ser Asp Pro Pro Gln Gly Tyr Leu Ser Asp Asp Pro Ala His Val

85 90 95

Ser Thr Phe Ala Asn Arg Arg Gly Asp Arg Lys Lys Gly Val Pro Trp

100 105 110

Thr Glu Glu Glu His Arg Leu Phe Leu Ile Gly Leu Gln Lys Leu Gly

115 120 125

Lys Gly Asp Trp Arg Gly Ile Ala Arg Asn Phe Val Val Ser Arg Thr

130 135 140

Pro Thr Gln Val Ala Ser His Ala Gln Lys Tyr Phe Ile Arg Gln Ser

145 150 155 160

His Ala Thr Arg Arg Lys Arg Arg Ser Ser Leu Phe Asp Met Val Pro

165 170 175

Asp Met Ser Ser Asp Gln Pro Ser Val Pro Glu Glu Gln Val Leu Leu

180 185 190

Pro Pro Ser Gln Asn Ser Gln Pro Cys Asn Gly Lys Ser Gln Pro Ser

195 200 205

Leu Asn Leu Ser Leu Lys Ser Glu Phe Glu Pro Met Glu Thr Thr Ser

210 215 220

Gln Glu Asn Ala Gln Gln Thr Asn Glu Thr Met Met Gly Ser Ile Gly

225 230 235 240

Leu Thr Pro Met Ala Pro His Gly Phe Phe Pro Ala Tyr Leu Pro Val

245 250 255

Pro Phe Pro Met Trp Pro Ser Thr Val Ala Pro Pro Phe Glu Glu Val

260 265 270

Lys Gly Gly Glu Thr Ser His His Gln Ile His Lys Pro Ile Pro Val

275 280 285

Ile Pro Lys Glu Pro Val Asn Val Asp Glu Leu Val Gly Met Ser His

290 295 300

Leu Ser Ile Gly Glu Ala Lys Val Arg Asp Arg Glu Pro Ser Pro Leu

305 310 315 320

Ser Leu Lys Leu Leu Gly Glu Pro Ser Arg Gln Ser Ala Phe His Ala

325 330 335

Asn Ala Pro Val Gly Thr Ser Asp Phe Lys Gln Trp Gln Gly Gln Arg

340 345 350

Asn Ser Ser Cys Leu Ser Leu

355

Claims

1.基因GmMYB62或其编码蛋白在培育抗逆性提高的转基因大豆中的应用，其特征在于，

所述基因GmMYB62为SEQ ID NO：1所示的DNA序列；

所述GmMYB62的编码蛋白为SEQ ID NO：2所示的氨基酸残基序列；

所述的抗逆性为耐干旱性；

将所述基因GmMYB62导入植物组织或细胞，调节异黄酮的合成；

所述的GmMYB62基因通过含有GmMYB62的植物表达载体导入外植体；

所述的调节异黄酮的合成为调节异黄酮合成途径中相关基因的表达。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述应用为含有基因GmMYB62的表达载体在培育抗逆性提高的转基因大豆中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，用于构建所述植物表达载体的出发载体为任意一种双元农杆菌载体或用于植物微弹轰击的载体。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述应用为含有基因GmMYB62的宿主菌在培育抗逆性提高的转基因大豆中的应用。