CN114875086A - 一种高品质l-茶氨酸发酵、提取及饲料制作的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于L‑茶氨酸生产技术领域，公开了一种高品质L‑茶氨酸发酵提取及饲料制作的方法，包括：L‑茶氨酸发酵、微膜过滤、连续离交柱离交、超滤脱色、色谱分离、反渗透、四效蒸发、结晶、干燥、包装等工艺得到精品L‑茶氨酸产品。本发明方法易操作且可连续***化生产，工艺废料经过综合处理可以生产蛋白饲料，全发酵液有效利用，有效的回收了资源，减轻了环保压力。
Description
技术领域
本发明属于L-茶氨酸生产技术领域，具体涉及到一种新的L-茶氨酸的发酵提取工艺及废弃料液制作饲料的方法。
背景技术
L-茶氨酸(L-Theanine)，又名谷氨酸γ-乙基酰胺，是茶叶中特有的游离氨基酸，占茶叶总游离氨基酸50 %以上。作为茶叶甘甜味道的主要组成部分，茶氨酸在一定程度上决定着茶叶的质量。茶氨酸具有对人体健康的许多有益作用，包括促进大脑的学习和记忆功能，预防心血管疾病，抑制脂肪积累，安神镇静药物，在食品工业中可以作为茶饮料的品质改良剂、改善食品风味的添加剂和功能食品的添加剂，抑制食品中的苦味和辣味，减轻涩味，因此已被广泛应用于制药和食品行业，成为了茶叶保健成分研究中备受瞩目注目的化合物。
目前，茶氨酸主要是从茶叶或茶叶废渣中提取，普遍存在提取步骤繁琐、有机溶剂使用较多、提取收率和产品纯度低等问题，不能满足大规模生产需求。微生物发酵法以廉价的碳源和氮源为底物，通过微生物菌体代谢，借助自身产茶氨酸的能力，通过葡萄糖发酵直接合成茶氨酸。发酵法原料来源成本相对较低，发酵反应条件较温和，生产工艺相对稳定，可控程度高，容易大规模放大生产，因而成为目前生产茶氨酸的主要方法。
但是，我国目前发酵法生产茶氨酸技术条件不成熟，L-茶氨酸工业生产也常常会受到生产成本的制约，而在生产成本的构成中，分离提取等下游工程的成本占有相当的比例。因此，迫切需要新的技术突破和生产工艺，在提高茶氨酸的转化率的同时降低生产成本。
发明内容
为解决上述问题，克服现有技术的不足之处，本发明提供了一种新的L-茶氨酸的发酵提取工艺，该工艺发酵效率高、易操作，能够实现废物利用，并且合理配置菌株，大大提高了发酵效率。
本发明的目的是通过下述技术方案实现的：
一种高品质L-茶氨酸发酵、提取及饲料制作的方法，其包括如下步骤：L-茶氨酸发酵、微膜过滤、连续离交柱离交和超滤脱色、色谱分离、反渗透、四效蒸发、结晶和烘干、制备饲料。
具体地，所述方法包括如下步骤：
步骤1) L-茶氨酸发酵：将大肠埃希氏菌CGMCC No.23583种子液接入到含有发酵培养基的发酵罐中进行发酵，得到L-茶氨酸发酵液；
步骤2) 微膜过滤：将步骤1)所得L-茶氨酸发酵液加热至70℃打入提取罐，用盐酸调节调pH值为4~5，经微滤膜过滤得到截留物和滤过后的滤液；
步骤3) 连续离交柱离交和超滤脱色：将步骤2)所得滤液经过连续串联离子交换柱，得到L-茶氨酸浓液；然后用盐酸调节L-茶氨酸浓液的pH值为3~4，最后进行超滤膜过滤得到L-茶氨酸超滤液和含有色素及蛋白的浓缩液；
步骤4) 色谱分离：将步骤3)所得L-茶氨酸超滤液泵入色谱***，进行L-茶氨酸和其他杂质的分离，得到纯度更高的L-茶氨酸提取液；
步骤5)反渗透：将步骤4)所得L-茶氨酸提取液进行反渗透膜脱水浓缩，得到纯水和L-茶氨酸料液；
步骤6) 四效蒸发：将步骤5)所得L-茶氨酸料液泵入四效蒸发器进行真空浓缩得到L-茶氨酸浓缩液；
步骤7)结晶和烘干：将步骤6)所得L-茶氨酸浓缩液进行冷却结晶，离心、烘干得到L-茶氨酸产品；
步骤8)制备饲料：将步骤2)所得截留物、步骤3)所得含有色素及蛋白的浓缩液以及步骤5)所得纯水合并得到废弃料液，然后往废弃料液中添加豆粕、酒糟、水稻秸秆粉以及麦麸，1500rpm搅拌20min，通入蒸汽升温至95℃，蒸馏40分钟；最后将蒸馏物烘干，粉碎机粉碎制得饲料。
优选地，所述发酵培养基的组分为：葡萄糖30g/L，甘油30g/L，玉米浆20g/L，七水硫酸镁1g/L，磷酸二氢钾2g/L，磷酸氢二钾2g/L，七水硫酸亚铁50mg/L，一水硫酸镁40mg/L，硫酸锌10mg/L，六水硝酸钴5mg/L。
优选地，所述微滤膜截留分子量为5000Da，微滤温度为40℃，工作压力：进压为2.0bar，出压为1bar。
优选地，所述超滤膜的截留分子量为600-1000Da，操作温度45℃，压力为0.15Mpa。
本发明的技术方案具有以下突出优点及独特性 ：
1、本发明菌株发酵效率高，发酵成本低廉，采用连续离交提取L-茶氨酸，其生产工艺简洁，便于操作和维护，占地面积小，可连续性工业生产。
2、本发明采用四效蒸发，蒸发过程在真空作用下，既保证了物料的卫生要求，同时保证了环保要求，同时大大降低了蒸发温度，节约了生蒸汽。
3、本发明设备可配置自动化***，实现进料量自动控制，加热温度自动控制，出料浓度自动控制，清洗自动控制，还可配备突发停电、故障时对敏感性物料的保护措施。其它安全、报警等自动化操作、控制。
4、本发明采用超滤脱色技术，脱色过程相对，脱色效果更好。与传统活性炭脱色所产生大量工业废水和活性炭废料相比，减轻水的使用量，节省了成本。
5、本发明在提取L-茶氨酸过程中，对菌体蛋白等进行回收利用，大大减少了废水外排，避免废液对环境造成的污染，绿色环保；而且从中获取营养丰富的菌体蛋白饲料，有效的回收资源，实现废弃物的资源化利用。
具体实施方式
为了使本技术领域的人员更好地理解本申请中的技术方案，下面将结合本申请具体实施例，对本技术方案进行完整地描述。
实施例1
大肠埃希氏菌(Escherichia coli)CTh2020-05，其于2021年10月12日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏号为CGMCC No.23583。
样品采集于生产车间L-茶氨酸发酵废渣，48℃热水处理3min，升温至50℃继续处理3min，然后涂布LB固体培养基，38℃培养24h收集菌斑，挑选L-茶氨酸表达量最高的菌株XFM-7；采用微生物菌种鉴定Biology仪鉴定，鉴定结果为大肠埃希氏菌。采用常压室温等离子体技术进行诱变，筛选L-茶氨酸表达量最高的菌株，即为大肠埃希氏菌(Escherichiacoli)CTh2020-05。
实施例2
一种发酵生产L-茶氨酸的方法，具体操作步骤如下：
1）将大肠埃希氏菌(Escherichia coli)CTh2020-05菌种接入葡萄糖30g/L，七水硫酸镁0.5g/L，酵母粉6g/L，磷酸二氢钾2g/L，柠檬酸2g/L，蛋白胨2g/L，七水硫酸亚铁10mg/L，一水硫酸镁10mg/L，硫酸锌6.5mg/L，六水硝酸钴5mg/L的种子培养基中，用氨水调节pH至4.5，温度121-123℃，时间25min，进行实消灭菌。灭菌后用冷凝水降温至38℃，控制pH 6.8~7.2、压力0.05MPa、溶氧控制为30%-50%，培养8h，得到种子液。
2）将步骤1）得到的种子液稀释50倍测得OD=0.4时开始移种，接种量为12.5%，接入到含有发酵培养基（发酵培养基：葡萄糖60g/L，玉米浆20g/L，七水硫酸镁1g/L，磷酸二氢钾2g/L，磷酸氢二钾2g/L，七水硫酸亚铁50mg/L，一水硫酸镁40mg/L，硫酸锌10mg/L，六水硝酸钴5mg/L）的发酵罐中进行发酵，测得OD=0.3时开始补加乙胺，初期流加速率为1mL/h.L，4h后增加到2mL/h.L。通过流加质量浓度为70%的葡萄糖溶液控制含糖量不低于1%（质量百分比）。控制发酵过程中搅拌转速: 550rpm，pH=7.0，压力0.05MPa，温度36-40℃，溶氧控制为20%，发酵24h，收集发酵液。
实施例3
不同发酵温度对发酵产L-茶氨酸的影响。
发酵工艺参照实施例2，发酵液中L-茶氨酸产量见表1：
表1
| 菌株 | 36℃ | 37℃ | 38℃ | 39℃ | 40℃ |
| XFM-7 | 31.3 | 35.4 | 35.8 | 33.1 | 27.6 |
| CTh2020-05 | 46.8 | 48.9 | 53.2 | 54.0 | 47.9 |
如上表1所示，与出发菌株XFM-7相比较，CTh2020-05发酵产茶氨酸效率提高了约50%，性能优异；并且较常规发酵菌株的最适发酵温度有所提高，有利于减少杂菌污染的可能性。
实施例4
发酵培养基碳源对L-茶氨酸的影响。
基础发酵培养基：碳源60g/L，玉米浆20g/L，七水硫酸镁1g/L，磷酸二氢钾2g/L，磷酸氢二钾2g/L，七水硫酸亚铁50mg/L，一水硫酸镁40mg/L，硫酸锌10mg/L，六水硝酸钴5mg/L。
不同碳源类型对L-茶氨酸的影响。
组1：葡萄糖；组2：葡萄糖：蔗糖=1:1质量比；组3：葡萄糖：甘油=1:1质量比；组4：葡萄糖：乳糖=1:1质量比；组5：蔗糖；组6：甘油。
发酵工艺参照实施例2，发酵温度为39℃，发酵液中L-茶氨酸产量见表2：
表2
| 菌株 | 组1 | 组2 | 组3 | 组4 | 组5 | 组6 |
| XFM-7 | 33.1 | 31.4 | 27.9 | 29.8 | 27.6 | 32.0 |
| CTh2020-05 | 54.0 | 52.5 | 57.8 | 53.6 | 45.3 | 51.2 |
如上表2所示，葡萄糖+甘油作为复合碳源的组3，CTh2020-05发酵产茶氨酸的效率最高，较葡萄糖作为碳源的组1提高了约7%，而这种趋势并没有在XFM-7和现有的L-茶氨酸生产用大肠杆菌中体现，葡萄糖是XFM-7菌株等大肠杆菌的最佳发酵碳源。考虑到生物能源领域中甘油大量过剩，成本相对低廉，CTh2020-05菌株利用部分甘油作为碳源，不仅能够提高发酵效率，而且解决了甘油过剩的问题，工业应用价值较高。
实施例5
一种高品质L-茶氨酸提取及饲料制作的方法，其包括如下步骤：
步骤1)：发酵工艺参照实施例2；发酵培养基替换为：葡萄糖30g/L，甘油30g/L，玉米浆20g/L，七水硫酸镁1g/L，磷酸二氢钾2g/L，磷酸氢二钾2g/L，七水硫酸亚铁50mg/L，一水硫酸镁40mg/L，硫酸锌10mg/L，六水硝酸钴5mg/L。
步骤2)：将步骤1)所得L-茶氨酸发酵液加热至70℃打入提取罐，用盐酸调节调pH值为4.5，经微滤膜过滤得到截留物和滤过后的滤液。所述微滤膜截留分子量为5000Da，微滤温度为40℃，工作压力：进压为2.0bar，出压为1bar。
步骤3)：将步骤2)所得滤液经过连续串联离子交换柱，得到L-茶氨酸浓液；然后用盐酸调节L-茶氨酸浓液的pH值为3.5左右，最后进行超滤膜过滤得到L-茶氨酸超滤液和含有色素及蛋白的浓缩液。所述超滤膜的截留分子量为600Da，操作温度45℃，压力为0.15Mpa。
步骤4)：将步骤3)所得L-茶氨酸超滤液泵入色谱***，进行L-茶氨酸和其他杂质的分离；柱温：40℃，将L-茶氨酸进行解脱，得到纯度更高的L-茶氨酸提取液。
步骤5)：将步骤4)所得L-茶氨酸提取液进行反渗透膜脱水浓缩，得到纯水和L-茶氨酸料液。
步骤6)：将步骤5)所得L-茶氨酸料液泵入四效蒸发器进行真空浓缩得到L-茶氨酸浓缩液。
步骤7)：将步骤6)所得L-茶氨酸浓缩液进行冷却结晶，离心、烘干得到L-茶氨酸产品；经检测，纯度可达到99.6%。
步骤8)：将步骤2)所得截留物、步骤3)所得含有色素及蛋白的浓缩液以及步骤5)所得纯水合并得到废弃料液，然后往废弃料液中添加占废弃料液10%（w/v）豆粕、8%（w/v）酒糟、12%（w/v）水稻秸秆粉以及15%（w/v）麦麸，1500rpm搅拌20min，通入蒸汽升温至95℃，蒸馏40分钟；然后将蒸馏物烘干，粉碎机粉碎制得饲料。
本发明采用连续离交柱离交、超滤脱色、色谱分离、反渗透、四效浓缩等技术，大大提高了L-茶氨酸的成品收率和纯度，有利于工业化，废弃料液制作饲料，实现了清洁生产和资源重复利用。
上述虽然结合实施例对本发明的具体实施方式进行了介绍，但并非对本发明保护范围的限制，所属领域技术人员应该明白，这对本领域技术人员而言应该很明确，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明保护的范围。
Claims (5)
1.一种高品质L-茶氨酸发酵、提取及饲料制作的方法，其包括如下步骤：L-茶氨酸发酵、微膜过滤、连续离交柱离交和超滤脱色、色谱分离、反渗透、四效蒸发、结晶和烘干、制备饲料。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
步骤1) L-茶氨酸发酵：将大肠埃希氏菌CGMCC No.23583种子液接入到含有发酵培养基的发酵罐中进行发酵，得到L-茶氨酸发酵液；
步骤2) 微膜过滤：将步骤1)所得L-茶氨酸发酵液加热至70℃打入提取罐，用盐酸调节调pH值为4~5，经微滤膜过滤得到截留物和滤过后的滤液；
步骤3) 连续离交柱离交和超滤脱色：将步骤2)所得滤液经过连续串联离子交换柱，得到L-茶氨酸浓液；然后用盐酸调节L-茶氨酸浓液的pH值为3~4，最后进行超滤膜过滤得到L-茶氨酸超滤液和含有色素及蛋白的浓缩液；
步骤4) 色谱分离：将步骤3)所得L-茶氨酸超滤液泵入色谱***，进行L-茶氨酸和其他杂质的分离，得到纯度更高的L-茶氨酸提取液；
步骤5)反渗透：将步骤4)所得L-茶氨酸提取液进行反渗透膜脱水浓缩，得到纯水和L-茶氨酸料液；
步骤6) 四效蒸发：将步骤5)所得L-茶氨酸料液泵入四效蒸发器进行真空浓缩得到L-茶氨酸浓缩液；
步骤7)结晶和烘干：将步骤6)所得L-茶氨酸浓缩液进行冷却结晶，离心、烘干得到L-茶氨酸产品；
步骤8)制备饲料：将步骤2)所得截留物、步骤3)所得含有色素及蛋白的浓缩液以及步骤5)所得纯水合并得到废弃料液，然后往废弃料液中添加豆粕、酒糟、水稻秸秆粉以及麦麸，1500rpm搅拌20min，通入蒸汽升温至95℃，蒸馏40分钟；最后将蒸馏物烘干，粉碎机粉碎制得饲料。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述发酵培养基的组分为：葡萄糖30g/L，甘油30g/L，玉米浆20g/L，七水硫酸镁1g/L，磷酸二氢钾2g/L，磷酸氢二钾2g/L，七水硫酸亚铁50mg/L，一水硫酸镁40mg/L，硫酸锌10mg/L，六水硝酸钴5mg/L。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述微滤膜截留分子量为5000Da，微滤温度为40℃，工作压力：进压为2.0bar，出压为1bar。
5.根据要求2所述的工艺，其特征在于，所述超滤膜的截留分子量为600-1000Da，操作温度45℃，压力为0.15Mpa。
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