CN114875037B

CN114875037B - 鸡gbp4l基因、表达载体及应用

Info

Publication number: CN114875037B
Application number: CN202210612622.4A
Authority: CN
Inventors: 康相涛; 郭玉洁; 田亚东; 闫峰宾; 李国喜; 蒋瑞瑞; 韩瑞丽; 孙桂荣; 李文婷; 李东华; 张彦华; 李转见; 李红; 刘小军
Original assignee: Henan Agricultural University
Current assignee: Henan Agricultural University
Priority date: 2022-05-31
Filing date: 2022-05-31
Publication date: 2023-06-06
Anticipated expiration: 2042-05-31
Also published as: CN114875037A

Abstract

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种鸡GBP4L基因、表达载体及应用。鸡GBP4L基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。本发明首次证明GBP4L基因与鸡热应激相关，通过调控GBP4L基因体内高表达能够有效缓解鸡热应激所导致的炎性因子增加、免疫器官损伤等表型。本发明的研究成果在缓解鸡热应激、耐热应激鸡品种选育方面具有良好的应用前景。

Description

鸡GBP4L基因、表达载体及应用

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种鸡GBP4L基因、表达载体及应用。

背景技术

热应激严重影响畜牧业发展，给全球养殖业每年造成重大损失，当前主流的畜禽品种由于其皮肤表面缺乏汗腺而不能有效散热，对环境温度的变化较敏感，温度过高引发的热应激给畜禽生产带来不利影响。热应激状态下，机体电解质平衡、糖脂代谢、抗氧化***和肠道健康均受到负面影响，进而导致畜禽情绪低落、食欲不振，机体免疫力也随之降低。

如何缓解肉鸡热应激一直是困扰养殖行业的一个难题，传统缓解热应激的途径如提高日粮能量浓度，或应用电解质、矿物质、维生素及中草药制剂等添加剂，在应用及功能等方面存在一些限制性因素。研究鸡热应激相关基因，有望从根本上解决鸡热应激反应，提高家禽养殖的经济收益。

申请公布号为CN101948832A的中国发明专利申请公开了一种热应激蛋白70基因上的耐热性相关分子标记，其与鸡的耐热性状显著相关，目的是通过遗传育种的方法培育出耐热品系的鸡。利用辅助分子标记进行遗传育种是解决鸡热应激反应的途径之一，发掘与鸡热应激相关基因，能够进一步从根本上研究鸡热应激反应的作用机理，从而提高缓解鸡热应激的有效性和针对性。

发明内容

本发明的目的是提供一种鸡GBP4L基因，首次证明GBP4L基因与鸡热应激相关。

本发明的第二个目的是提供含有上述鸡GBP4L基因的表达载体。

本发明的第三个目的是提供由上述表达载体生产得到的腺相关重组病毒。

本发明的第四个目的是提供上述鸡GBP4L基因、表达载体、腺相关重组病毒的应用。

为了实现以上目的，本发明所采用的技术方案是：

一种鸡GBP4L基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

本发明首次证明GBP4L基因与鸡热应激相关，通过调控GBP4L基因体内高表达能够有效缓解鸡热应激所导致的炎性因子增加、免疫器官损伤等表型。本发明的研究成果在缓解鸡热应激、耐热应激鸡品种选育方面具有良好的应用前景。

含有上述鸡GBP4L基因的表达载体。

利用上述表达载体可构建相应转化体，从而有效缓解鸡热应激。

优选地，所述表达载体的出发载体为腺相关病毒载体。

使用上述表达载体生产的腺相关重组病毒。

使用腺相关重组病毒技术，安全性好，技术成熟，可有效缓解鸡热应激。

上述鸡GBP4L基因、表达载体、腺相关重组病毒在缓解鸡热应激方面的应用。

优选地，高表达GBP4L基因，缓解鸡热应激。

优选地，所述鸡为固始鸡。

上述鸡GBP4L基因在耐受热应激鸡品种选育方面的应用。

优选地，所述鸡为固始鸡。

附图说明

图1为鸡GBP4L基因核苷酸序列及对应氨基酸序列；

图2为现有技术的工具载体图谱；

图3为本发明中的终载体图谱；

图4为本发明中的阳性克隆序列；

图5为本发明中的AAV病毒包装结果；其中，(A)AAV病毒包装过程(200×)；(B)Real-time PCR检测结果，293T-PMT602为对照质粒PMT602转染293T细胞样本，293T-PSE5343为目的质粒PSE5343转染293T细胞样本；

图6为本发明中重组GBP4L腺相关病毒体内表达结果；

图7为本发明中GBP4L对热应激鸡免疫相关因子的影响；

图8为本发明中GBP4L对热应激鸡脾脏组织结构的影响。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明的实施过程进行详细说明。以下实施例涉及的实验材料说明如下：

试验动物：所用固始鸡来自于河南农业大学原阳种质资源场。

试验试剂如下表1所示：

表1试验主要试剂

/>

主要仪器如下表2所示：

表2试验主要仪器

实施例1鸡GBP4L基因

本实施例的鸡GBP4L基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，鸡GBP4L基因核苷酸序列及对应氨基酸序列如图1所示。

实施例2含有鸡GBP4L基因的表达载体

本实施例的含有鸡GBP4L基因的表达载体，将鸡GBP4L基因连接腺相关病毒载体(AAV)获得。本实施例所用工具载体及终载体的载体图谱分别如图2、图3所示。

GBP4L序列由上海生工合成，并构建到目的载体上。筛选阳性克隆并测序验证，阳性克隆测序结果如图4所示(SEQ ID NO：2)，表明pAAV-GBP4L-3FLAG腺相关病毒重组质粒构建成功。

1、重组AAV病毒出毒与包装

使用HEK293细胞系来生产腺相关重组病毒，HEK293细胞是用剪切过的5型腺病毒DNA转化人胚肾细胞得到的细胞系，这样当细胞用AAV Helper-Free System三质粒(包含目的质粒，pAAV-RC和pHelper)共转时能生产出具有感染能力的病毒颗粒。

AAV病毒出毒、包装步骤：

(1)转染前24h，在15cm培养皿里铺2×10⁷个HEK293细胞于含10％FBS DMEM培养基，37℃，5％CO₂培养箱里培养24h；

(2)转染当天细胞密度达到70-80％，将pHelper质粒、pCap/rap质粒和目的质粒以6:5:3的比例加到一个5ml EP管混匀，加入500uL不含血清的DMEM，标记为A；

(3)将110ul 1×PEI转染试剂加入另一个1.5ml EP管，并用不含血清的DMEM培养基将总体积补到500uL，标记为B(注意：能看到培养基颜色变成橘黄色)；

(4)将B管中的转染试剂缓慢加入A管中，室温孵育5min；

(5)孵育过程中将用于包装AAV的HEK293细胞进行换液，每皿换成无血清DMEM培养基；

(6)孵育结束后，将A管中的混合物均匀的加入到细胞中，轻微摇晃培养皿后将细胞放入37℃，5％CO₂培养箱里培养4～8h；

(7)将培养基换为完全培养基，继续培养72h后准备收毒。

2、重组pAAV-GBP4L-3FLAG病毒纯化

重组pAAV-GBP4L-3FLAG病毒纯化步骤如下：

(1)收集细胞培养皿中上清液于50mL离心管中，4000rpm离心10min；

(2)弃掉上清，每管加入3mL 1×PBS将沉淀重悬；

(3)用5～10ml PBS吹下培养皿中细胞，装入另一只50mL离心管中，4000rpm离心5-10min；

(4)弃掉PBS，每管加入5mL 1×PBS将沉淀重悬；

(5)将以上所有装有重悬细胞的50mL离心管放入液氮罐，冷冻10-15min分钟，再取出放入37℃水浴锅解冻，反复冻融4次；

(6)将裂解的细胞在4000rpm离心5min收集上清于新的离心管并加入将核酸酶处理，注：经过物理方法裂解后，离心下来的细胞不易贴壁，而整个细胞粘在一块呈果冻状态，操作此步需要谨慎，否侧难以去除裂解后的细胞；

(7)将约7-8mL的上清液装入新的15mL离心管中；

(8)配置discontinuous iodixanol gradie，在离心管中依次加入17％layer，25％layer、40％layer、60％layer的iodixanol，在每管discontinuous iodixanolgradient最上层加入AAV上清溶液；

(9)离心管配平，在40,000rpm下离心2.5h；

(10)小心取出离心管，收集目的条带。

病毒浓缩步骤如下：

(1)准备超滤管，先加入5mL 1×PBS以浸润滤膜，在4000rpm下离心5min；

(2)将收集到的病毒用1×PBS稀释十倍，用0.22um过滤头过滤到超滤管中；

(3)将超滤管在4000rpm下离心10-20min；

(4)重复步骤2和3，最终使病毒液浓缩到0.8mL；

(5)将浓缩好的AAV病毒，吸到1.5mL EP管中，加入甘油，甘油终浓度10％；

(6)将病毒分装，并取出10uL用于滴度检测。

3、重组pAAV-GBP4L-3FLAG病毒滴度测定

目前测定AAV的滴度是通过定量PCR检测AAV载体的基因组拷贝数来测定AAV的病毒颗粒数。重组pAAV-GBP4L-3FLAG病毒滴度测定步骤如下：标准品pAAV-标准质粒作10³，10⁴，10⁵，10⁶，10⁷稀释，检测样品作1000，10000倍稀释，反应体系如表3所示，反应条件为：95℃变性10min，40个循环：95℃10s，60℃35s。

表3Real-time PCR反应体系

表3中，WPREs-F：TTACGCTATGTGGATACG；

WPREs-R：GCAAGAACTAACCAGGAT。

如图5A所示，目的质粒PSE5343转染293T细胞样本，转染后荧光倒置显微镜下观察可见绿色荧光蛋白(EGFP)明显表达，Real-time PCR检测结果显示(图5B)，GBP4L基因显著过表达，说明GBP4L基因过表达质粒构建成功。

腺相关病毒滴度测定结果如表4所示。

表4腺相关病毒滴度结果

经滴度检测，pAAV-GBP4L-3FLAG滴度测定结果为5.43^*10¹¹vg/mL。

实施例3缓解鸡热应激及鸡品种选育方面的应用

3.1、动物试验设计及样品制备

选择48只28d体重相近、健康固始公鸡为研究对象，置于隔离洁净鸡舍中，采用笼养方式饲养，饲养过程严格控制光照、温度及湿度。随机分为A、B、C、D四组，每组12只鸡。其中A组为对照组，B组为热应激组，C组为热应激+对照AAV组(无***GBP4L重组片段AAV，pAAV-3FLAG)，D组为热应激+过表达GBP4L重组AAV组(***GBP4L重组片段AAV，pAAV-GBP4L-3FLAG)。C组给予颈部皮下注射纯化后的pAAV-3FLAG病毒，病毒量为2.43^*10¹⁰vg；D组给予颈部皮下注射纯化后的pAAV-GBP4L-3FLAG病毒，病毒量为2.43^*10¹⁰vg。对照组A组采用常温饲养，温度控制在21±1℃，热应激组B、C、D组采用32±1℃，持续处理4周，即28d。

于试验第29d进行屠宰实验。屠宰前12h采取禁食措施，正常饮水。空腹活体称重，***麻醉后颈部放血处死，收集血液置于促凝管中，室温静置30min后，3500r/min离心15min，分离血清，-20℃冷冻保存。解剖并分离出脾脏和法氏囊组织，用滤纸将器官表面水分吸干，称重并记录数据。免疫器官于液氮速冻后转移至-80℃保存。

3.2、脾脏组织GBP4L基因表达量测定

随机选取A、B、C、D四组5个生物学重复，使用RNAiso Plus试剂盒，分别提取鸡脾脏组织总RNA。采用qRT-PCR方法检测脾脏组织中GBP4L基因表达水平。GBP4L基因引物序列如下：

F:5’-ACGCCTGGATCTTCACACTG-3’；

R:5’-CAGTCCTCGGCCTCATCTTC-3’。

qRT-PCR方法如下：以反转录所得cDNA，使用

96荧光定量PCR仪和

PremixEx TaqTM试剂盒进行qRT-PCR反应。反应体系见表5。

表5 qRT-PCR反应体系

qRT-PCR扩增程序如下：95℃3min，95℃30s，60℃30s，72℃30s，72℃延伸10分钟，共35个循环。以鸡GAPDH基因为内参，采用2^-ΔΔCt法计算基因的相对表达量。每个反应设置三个生物学和三个技术重复。

3.3、免疫相关指标检测

采用酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒检测血清中IgG、IgM、CD3⁺、CD4⁺、皮质酮以及TNF-α、IL-1β、IL-6、TGF-β、NF-kB细胞因子浓度。具体操作严格按照ELISA试剂盒使用说明书进行。具体操作如下：

(1)标准品加样：设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的50μL标准品；

(2)加样：分别设空白孔(空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同)、待测样品孔。在酶标包被板上待测样品孔中先加40μL样品稀释液，然后再加10μL待测样品。将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀；

(3)加酶：每孔加入100μL酶标试剂，空白孔除外；

(4)温育：用封板膜封板后置于37℃温育60min；

(5)配液：将20倍浓缩洗涤液用蒸馏水20倍稀释后备用；

(6)洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30s后弃去，如此重复操作5次，拍干；

(7)显色：每孔先加入50μL显色剂A，再加入50μL显色剂B，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15min；

(8)终止：每孔加50μL终止液，终止反应(此时蓝色立转黄色)；

(9)测定：以空白孔调零，450nm波长下依序测量各孔吸光度(OD值)。测定应在加终止液后15min以内进行。

3.4、血液生化指标检测

采用全自动生化分析仪，检测血液中葡萄糖(GLU)、甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)、谷丙转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)、碱性磷酸酶(ALP)、胆碱酯酶(CHE)、总蛋白(TP)、球蛋白(GLB)、白蛋白(ALB)、白球比、乳酸脱氢酶(LDH)水平。

3.5、免疫器官指数测定

测定每组12只鸡脾脏和法氏囊免疫器官指数，免疫器官指数计算公式：

免疫器官指数(％)＝免疫器官重(g)/鸡只活体重(g)×100％。

3.6、制备石蜡组织切片

随机采集A、B、C、D三组，各5只鸡脾脏组织，经4％甲醛溶液固定24h以上，之后进行洗涤和脱水12h，石蜡包埋和切片、展片、贴片后进行脱蜡和进行苏木精-伊红染色后再水洗和分化以及漂洗和脱水后再复染，之后再进行脱水和透明处理，最后封藏后成片。用***生物显微镜对切片进行组织学观察。

3.7、统计学分析

利用SPASS 20.0软件进行统计学分析，实验数据采用平均值±标准偏差表示，采用单因素方差分析和独立样本t检验用于统计分析，P<0.05被认为具有统计学意义，差异显著，P<0.01被认为差异极显著，使用Graphpad Prism 5进行图形绘制。

3.8、结果与分析

3.8.1、重组GBP4L腺相关病毒体内表达结果

如图6所示，病毒量为2.43^*10¹⁰vg重组GBP4L腺相关病毒注射热应激模型鸡，采用qRT-PCR方法检测鸡脾脏组织中GBP4L基因表达量，结果显示，热应激组GBP4L基因表达量显著高于对照组(P＜0.05)，注射pAAV-GBP4L-3FLAG载体热应激组GBP4L基因显著高于对照(P＜0.05)，GBP4L基因上调7倍，说明重组GBP4L腺相关病毒体内注射成功，脾脏组织可以明显高表达GBP4L基因。

3.8.2、GBP4L对热应激鸡免疫相关因子的影响

如图7所示，采用ELISA试剂盒检测血清中CD3⁺、CD4⁺、IgG、IgM、皮质酮以及TNF-α、IL-1β、IL-6、TGF-β、NF-kB细胞因子浓度，结果显示，热应激组血清CD3⁺、CD4⁺、IgG、IgM水平显著低于对照组(P＜0.05)，皮质酮以及TNF-α、IL-1β、IL-6、TGF-β、NF-kB细胞因子浓度显著高于对照组(P＜0.05)。CD3⁺和CD4⁺是指T细胞，反应细胞免疫水平，IgG、IgM反应体液免疫水平，血液皮质酮水平可作为家禽处于应激状态的可靠指标，由此可见，热应激模型构建成功。

热应激+对照AAV组血清CD3⁺、CD4⁺、IgG、IgM、皮质酮以及TNF-α、IL-1β、IL-6、TGF-β、NF-kB细胞因子浓度与热应激组无显著性差异(P＞0.05)。热应激+过表达GBP4L重组AAV组血清CD3⁺、IgG水平显著高于热应激组(P＜0.05)，CD4⁺、IgM水平高于热应激组(P＞0.05)，且与对照组无显著差异(P＞0.05)；热应激+过表达GBP4L重组AAV组血清皮质酮以及TNF-α、IL-1β、IL-6、TGF-β、NF-kB细胞因子浓度显著低于热应激组(P＜0.05)，且皮质酮以及TNF-α、IL-6、TGF-β、NF-kB细胞因子浓度与对照组无显著差异(P＞0.05)。

由上述结果可见，注射重组腺相关病毒GBP4L基因可有效缓解热应激所致鸡血清CD3⁺、CD4⁺、IgG、IgM水平降低，皮质酮以及TNF-α、IL-1β、IL-6、TGF-β、NF-kB细胞因子浓度升高，缓解热应激所致炎症反应，改善机体免疫状态。

3.8.3、GBP4L对热应激鸡血液生化指标的影响

采用全自动生化分析仪，检测血液中葡萄糖(GLU)、甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)、谷丙转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)、碱性磷酸酶(ALP)、胆碱酯酶(CHE)、总蛋白(TP)、球蛋白(GLB)、白蛋白(ALB)、白球比、乳酸脱氢酶(LDH)水平，结果如表6所示。

表6 GBP4L对热应激鸡血液生化指标的影响

注：不同字母代表P＜0.05，相同字母代表P＞0.05。

表6结果显示，对照组A组、热应激组B组、热应激+对照AAV组C组、热应激+过表达GBP4L重组AAV组D组四组GLB、ALB、白球比、TP、LDH差异均不显著(P＞0.05)；热应激组B组GLU、ALT、AST、TC水平显著高于对照组A组(P＜0.05)，CHE、ALP、TG水平显著低于对照组A组(P＜0.05)，热应激+过表达GBP4L重组AAV组D组CHE、GLU、AST、TC水平显著低于热应激组B组(P＜0.05)，ALT水平低于热应激组B组(P＞0.05)，CHE、ALP、TG水平显著高于热应激组B组(P＜0.05)，且CHE、TG、GLU、ALT、AST、ALP、TC水平与对照组A组差异不显著(P＜0.05)。

由上述结果可见，注射重组腺相关病毒GBP4L基因可有效缓解热应激所致鸡血清GLU、ALT、AST、TC水平升高，CHE、ALP、TG水平降低，从而有效缓解热应激。

3.8.4、GBP4L对热应激鸡免疫器官指数的影响

脾脏是禽类最大的外周免疫器官，参与机体的细胞免疫和体液免疫，法氏囊是禽类特有的中枢免疫器官，主导机体的体液免疫。免疫器官重量可以用于评价鸡的免疫状态，其相对重量和绝对重量越大，表明机体的细胞免疫和体液免疫机能越强。免疫器官指数是反映家禽免疫功能的重要指标。检测对照组A组、热应激组B组、热应激+对照AAV组C组、热应激+过表达GBP4L重组AAV组D组四组脾脏、法氏囊器官指数，结果如表7所示。

表7 GBP4L对热应激鸡免疫器官指数的影响

结果显示，热应激组B组脾脏、法氏囊器官指数低于对照组A组(P＞0.05)，热应激+过表达GBP4L重组AAV组D组脾脏、法氏囊器官指数高于热应激组B组(P＞0.05)，四组脾脏、法氏囊器官指数差异均不显著(P＞0.05)。

由上述结果可见，热应激导致鸡脾脏、法氏囊免疫器官指数下降，注射pAAV-GBP4L-3FLAG载体，可以提高热应激鸡脾脏和法氏囊免疫器官指数，缓解热应激。

3.8.5、GBP4L对热应激鸡脾脏组织结构的影响

为了解GBP4L对热应激鸡脾脏组织结构的影响，本研究随机采集A、B、C、D四组，各5只鸡脾脏组织，经4％甲醛溶液固定24h以上后制备石蜡组织切片。采用***生物显微镜对切片进行组织学观察，结果如图8所示。

结果显示，对照组A组脾脏组织被膜结构清晰，红白髓混合分布，白髓弥散贯穿整个脾中，主要含有小淋巴细胞、鞘动脉和少量的淋巴小结，红髓中包括静脉窦和含有网状细胞、巨噬细胞、淋巴细胞和红细胞的网状脾窦，未见明显异常；热应激组B组脾脏组织可见少量的淋巴细胞坏死，胞核固缩或碎裂(黑色箭头)，未见其它明显异常；热应激+对照AAV组C组组织可见大量的淋巴细胞坏死，胞核固缩或碎裂(黑色箭头)，间质可见较多的嗜酸性均质状团块(红色箭头)，未见其它明显异常；热应激+过表达GBP4L重组AAV组D组组织被膜结构清晰，红白髓混合分布，白髓弥散贯穿整个脾中，主要含有小淋巴细胞、鞘动脉和少量的淋巴小结，红髓中包括静脉窦和含有网状细胞、巨噬细胞、淋巴细胞和红细胞的网状脾窦，未见明显异常。

由上述结果可见，热应激导致鸡脾脏组织结构受损，导致淋巴细胞坏死，注射pAAV-GBP4L-3FLAG载体，可缓解热应激所致脾脏组织损伤。

在以上实验成果的基础上，可选育出高表达GBP4L基因个体，然后利用通用育种技术选育出耐热应激鸡品种。

<110> 河南农业大学

<120> 鸡GBP4L基因、表达载体及应用

<160> 6

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1881

<212> DNA

<213> Gallus gallus

<221> 鸡GBP4L基因

<400> 1

atggacgctc cggtgctccc gatgccggct ccgctctgcc tggtgaccaa caaggacggc 60

gtgctcgccc tcaaccccgc agcgctggca gtgctgcagg aggtggccca gcctatggtg 120

gtggtggcca tcgctgggcc ctaccgcacc gggaagtcct tcctgatgaa ccggctggca 180

cagaagcgca ctggcttccc gctgggcccc acggtgcagg cagagaccaa gggcatctgg 240

atgtggtgcc tgcagcaccc acgccagcag ggagtgacct tgatgctgct ggacactgag 300

ggcctgggag accccaaaaa gggtgacagc cacaatgacg cctggatctt cacactggcg 360

ctgctgttgt ccagcaccct ggtgtacaac agcataggca ccatcgacca gaaggcactg 420

gagaacctcg agctggtgac acagctgtcg gagctgatcc gggtgcggga cagggacaag 480

gacggcaaca acagcgttga aagagaagat gaggccgagg actgcgagtt cgtgcgctac 540

ttccccagct ttgtgtgggt ggtgagggac ttcacgctgg agctgcgcgt gggcgagcgg 600

cccatcagtg aggatgagta cctggagcag gtgctggaac tcaagcacgg gcatggccgc 660

aaggtgcaga actacaatgg gacgcggctc tgcctccgca actatttccc cacacggaag 720

tgcttcgtgc tgcctccgcc actgggcaca gaggagtgcg ggcgcatgga ggagctgccc 780

gaggctgcac tggccccacg tttcctccaa caggcagccc agttctgcaa ctacgtgctg 840

agctccacca ggctcaagac gctgcctgac ggcagagcac tgacagggcg agccctgtgc 900

atgctgctgc agagctacgt ggaggccatc aacagcgggc atctgccctg cctggaggga 960

gcagcggcag tgatgatggc caacgagaat gcagcggcgg tggcggcagc gctggaggcc 1020

tataccaggg gcatgcgggg gctgtcactg cccacagagc ctgcacagct ctcggccgcg 1080

catggggagc acctgcatga ggcactcatt gtcttccagc gtcgcagctt ccgggatcgt 1140

gaccaggagc accagcggcg cctcatggaa cagatcagca cagagtacag ccacctgcag 1200

gaggagaatg atgaagcatc acggcagcac tgcaaggcac tgctggctga gctggcacag 1260

gcactgcata ccagcctggc ccgtggggcc tacacacagc ccggaggcta ccgcgcctac 1320

gaggccgagc ggcagcggct gctggagggc tatcggcaag cggagggcaa gggccccaag 1380

gccgaggagg tgctgaatga gttcctggcg gagcgtcggg cagaggcaga ggcagtgctg 1440

aaggcagaca atgcactgag cgaggccgag aagcagctgg aggaccagaa gcagcaggcg 1500

cagctcctgg agcagcggca gaaagcgacg gcggagcgcg aacggcagct ggaggcgctg 1560

ctagaggacg agcgcaacag ctacgcgcag aacctgcaag ccctggaggc caagatgcag 1620

gcggaggcgg agagcgcgca gcgggagctg cagcgggcga tggaagcgaa gctacgggag 1680

cagagagagc tgctgcagcg cggcttcaga gagcaggcgg cgctgatgga gcaggagctg 1740

gcggcgctgc ggcgggagag caacaacaac agcaagcagg agctggcggc ctccattttc 1800

gacaccgtgc gcgccgcctg cgacctcgtc agcacgttaa aactgtccaa gctggccaag 1860

tcacggggaa cagcagtgta g 1881

<210> 2

<211> 2874

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 载体序列

<222> (1)...(75)

<220>

<221> 酶切位点

<222> (76)...(81)

<220>

<221> GBP4L序列

<222> (88)...(1965)

<220>

<221> 3flag序列

<222> (1966)...(2037)

<220>

<221> P2A-EGFP序列

<222> (2047)...(2838)

<220>

<221> 酶切位点

<222> (2839)...(2844)

<220>

<221> 载体序列

<222> (2845)...(2874)

<400> 2

ccgtcagatc gcctggagac gccatccacg ctgttttgac ctccatagaa gacaccggga 60

ccgatccagc ctccgggatc cgccaccatg gacgctccgg tgctcccgat gccggctccg 120

ctctgcctgg tgaccaacaa ggacggcgtg ctcgccctca accccgcagc gctggcagtg 180

ctgcaggagg tggcccagcc tatggtggtg gtggccatcg ctgggcccta ccgcaccggg 240

aagtccttcc tgatgaaccg gctggcacag aagcgcactg gcttcccgct gggccccacg 300

gtgcaggcag agaccaaggg catctggatg tggtgcctgc agcacccacg ccagcaggga 360

gtgaccttga tgctgctgga cactgagggc ctgggagacc ccaaaaaggg tgacagccac 420

aatgacgcct ggatcttcac actggcgctg ctgttgtcca gcaccctggt gtacaacagc 480

ataggcacca tcgaccagaa ggcactggag aacctcgagc tggtgacaca gctgtcggag 540

ctgatccggg tgcgggacag ggacaaggac ggcaacaaca gcgttgaaag agaagatgag 600

gccgaggact gcgagttcgt gcgctacttc cccagctttg tgtgggtggt gagggacttc 660

acgctggagc tgcgcgtggg cgagcggccc atcagtgagg atgagtacct ggagcaggtg 720

ctggaactca agcacgggca tggccgcaag gtgcagaact acaatgggac gcggctctgc 780

ctccgcaact atttccccac acggaagtgc ttcgtgctgc ctccgccact gggcacagag 840

gagtgcgggc gcatggagga gctgcccgag gctgcactgg ccccacgttt cctccaacag 900

gcagcccagt tctgcaacta cgtgctgagc tccaccaggc tcaagacgct gcctgacggc 960

agagcactga cagggcgagc cctgtgcatg ctgctgcaga gctacgtgga ggccatcaac 1020

agcgggcatc tgccctgcct ggagggagca gcggcagtga tgatggccaa cgagaatgca 1080

gcggcggtgg cggcagcgct ggaggcctat accaggggca tgcgggggct gtcactgccc 1140

acagagcctg cacagctctc ggccgcgcat ggggagcacc tgcatgaggc actcattgtc 1200

ttccagcgtc gcagcttccg ggatcgtgac caggagcacc agcggcgcct catggaacag 1260

atcagcacag agtacagcca cctgcaggag gagaatgatg aagcatcacg gcagcactgc 1320

aaggcactgc tggctgagct ggcacaggca ctgcatacca gcctggcccg tggggcctac 1380

acacagcccg gaggctaccg cgcctacgag gccgagcggc agcggctgct ggagggctat 1440

cggcaagcgg agggcaaggg ccccaaggcc gaggaggtgc tgaatgagtt cctggcggag 1500

cgtcgggcag aggcagaggc agtgctgaag gcagacaatg cactgagcga ggccgagaag 1560

cagctggagg accagaagca gcaggcgcag ctcctggagc agcggcagaa agcgacggcg 1620

gagcgcgaac ggcagctgga ggcgctgcta gaggacgagc gcaacagcta cgcgcagaac 1680

ctgcaagccc tggaggccaa gatgcaggcg gaggcggaga gcgcgcagcg ggagctgcag 1740

cgggcgatgg aagcgaagct acgggagcag agagagctgc tgcagcgcgg cttcagagag 1800

caggcggcgc tgatggagca ggagctggcg gcgctgcggc gggagagcaa caacaacagc 1860

aagcaggagc tggcggcctc cattttcgac accgtgcgcg ccgcctgcga cctcgtcagc 1920

acgttaaaac tgtccaagct ggccaagtca cggggaacag cagtggacta caaggatgac 1980

gatgacaagg attacaaaga cgacgatgat aaggactata aggatgatga cgacaaaact 2040

agttccggaa gcggagctac taacttcagc ctgctgaagc aggctggaga cgtggaggag 2100

aaccctggac cttccggaat ggtgagcaag ggcgaggagc tgttcaccgg ggtggtgccc 2160

atcctggtcg agctggacgg cgacgtaaac ggccacaagt tcagcgtgtc cggcgagggc 2220

gagggcgatg ccacctacgg caagctgacc ctgaagttca tctgcaccac cggcaagctg 2280

cccgtgccct ggcccaccct cgtgaccacc ctgacctacg gcgtgcagtg cttcagccgc 2340

taccccgacc acatgaagca gcacgacttc ttcaagtccg ccatgcccga aggctacgtc 2400

caggagcgca ccatcttctt caaggacgac ggcaactaca agacccgcgc cgaggtgaag 2460

ttcgagggcg acaccctggt gaaccgcatc gagctgaagg gcatcgactt caaggaggac 2520

ggcaacatcc tggggcacaa gctggagtac aactacaaca gccacaacgt ctatatcatg 2580

gccgacaagc agaagaacgg catcaaggtg aacttcaaga tccgccacaa catcgaggac 2640

ggcagcgtgc agctcgccga ccactaccag cagaacaccc ccatcggcga cggccccgtg 2700

ctgctgcccg acaaccacta cctgagcacc cagtccgccc tgagcaaaga ccccaacgag 2760

aagcgcgatc acatggtcct gctggagttc gtgaccgccg ccgggatcac tctcggcatg 2820

gacgagctgt acaagtaaaa gcttatcgat aatcaacctc tggattacaa aatt 2874

<210> 3

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> WPREs-F

<400> 3

ttacgctatg tggatacg 18

<210> 4

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> WPREs-R

<400> 4

gcaagaacta accaggat 18

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> F

<400> 5

acgcctggat cttcacactg 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<221> R

<213> 人工序列

<400> 6

cagtcctcgg cctcatcttc 20

Claims

1.鸡GBP4L基因、包含所述鸡GBP4L基因的表达载体、包含所述鸡GBP4L基因的腺相关重组病毒在制备缓解鸡热应激产品中的应用，其特征在于，所述鸡GBP4L基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述表达载体的出发载体为腺相关病毒载体。

3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，高表达GBP4L基因，缓解鸡热应激。

4.如权利要求1~3任一项所述的应用，其特征在于，所述鸡为固始鸡。

5.鸡GBP4L基因在耐受热应激鸡品种选育中的应用，其特征在于，所述鸡GBP4L基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述鸡为固始鸡。