CN113633775A - 过表达肌型磷酸果糖激酶的试剂在制备延缓细胞衰老的药物中的应用 - Google Patents

过表达肌型磷酸果糖激酶的试剂在制备延缓细胞衰老的药物中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及过表达肌型磷酸果糖激酶的试剂在制备延缓细胞衰老的药物中的应用，属于基因工程技术领域。本发明提供了过表达肌型磷酸果糖激酶的试剂在制备延缓细胞衰老的药物中的应用。本发明围绕PFKM影响MSCs糖酵解水平调控细胞衰老进行探讨，首次将PFKM与MSCs衰老有机联系，为阐明干细胞衰老的调控机制提供实验依据，将有助于维持干细胞数量及功能，对于延缓机体衰老及防治各种老龄化疾病都具有重要意义。

Description

过表达肌型磷酸果糖激酶的试剂在制备延缓细胞衰老的药物 中的应用
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及过表达肌型磷酸果糖激酶的试剂在制备延缓细胞衰老的药物中的应用。
背景技术
现代社会人类平均寿命逐渐延长，随之而来出现人口老龄化的社会问题[1]，个体的衰老是导致人口老龄化日益严重的重要因素之一。衰老(Aging)是自然规矩使然的一种复杂的现象，机体衰老受到多因素及多基因的调控，随着时间的推移，细胞增殖与分化能力和生理功能逐渐发生衰退，稳态维持和再生能力减弱[2]。伴随个体的衰老，糖尿病、心脑血管疾病等衰老相关性疾病的发病率也逐步提高[3]，死亡率增加。因此衰老已经成为生命科学领域和社会领域亟待解决的重要问题，有关衰老的研究受到更多科研工作者的关注。
机体正常生命活动需要细胞衰老死亡清除与新生细胞生长补充的动态平衡，人体组织的再生能力取决于干细胞取代受损组织或细胞的能力和潜能。干细胞是机体内具有强大自我更新能力与多向分化潜能的特殊细胞群体。再生医学中，成体干细胞可用于衰老相关性疾病的治疗，如患者自体干细胞移植和组织、器官再生和修复等[4]。然而，干细胞也和体细胞一样，在生命进程中会发生形态学变化，其增殖及分化能力也会发生不同程度的下降等，难逃衰老宿命，因此干细胞衰老将会影响机体整体的衰老及各种老龄化疾病的发生[5]。间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)是许多疾病细胞治疗的基础，作为一种研究较早且深入的成体干细胞，具有活力强、免疫原性低、无伦理学争议等优势，广泛应用于临床及基础研究。成功的MSCs治疗需要大规模长时间的体外细胞培养[6]，然而，正常的骨髓样本获取困难，无法获得充足的特定年龄阶段的骨髓MSCs，且经历有限次数的体外传代培养后，细胞出现形态学变化，其增殖及分化能力也发生不同程度的降低，MSCs发生衰老[7]。干细胞衰老极大制约了干细胞的临床应用，降低了患者自体干细胞移植的疗效。由于细胞衰老伴随着许多进行性代谢改变及功能下降[8]，但目前并没有一种能逆转细胞衰老，获得大量“年轻态”的MSCs的方法。
[1]Martineau A,Plard M.Successful aging:analysis of the components ofa gerontological paradigm[J].Geriatrie Et Psychologie Neuropsychiatrie DeVieillissement,2018,16(1):67-77.
[2]VijgJ,Kennedy BK.The Essence of Aging[J].Gerontology,2016,62(4):381-385.
[3]Dodig S,Cepelak I,Pavic I.Hallmarks of senescence and aging[J].Biochem Med(Zagreb),2019,29(3):030501.
[4]Cianflone E,Torella M,Biamonte F,et al.Targeting Cardiac Stem CellSenescence to Treat Cardiac Aging and Disease[J].Cells,2020,9(6).
[5]Sahin E,Depinho RA.Linking functional decline of telomeres,mitochondria and stem cells during ageing[J].Nature,2010,464(7288):520-528.
[6]Khademi-Shirvan M,Ghorbaninejad M,Hosseini S,et al.The Importanceof Stem Cell Senescence in Regenerative Medicine[J].Adv Exp Med Biol,2020,1288:87-102.
[7]Duggal S,Brinchmann JE.Importance of serum source for the in vitroreplicative senescence of human bone marrow derived mesenchymal stem cells[J].J Cell Physiol,2011,226(11):2908-2915.
[8]Kwon SM,Hong SM,Lee YK,et al.Metabolic features and regulation incell senescence[J].BMB Rep,2019,52(1):5-12.
发明内容
本发明的目的在于提供过表达肌型磷酸果糖激酶的试剂在制备延缓细胞衰老的药物中的应用。本发明围绕PFKM影响MSCs糖酵解水平调控细胞衰老进行探讨，首次将PFKM与MSCs衰老有机联系，为阐明干细胞衰老的调控机制提供实验依据，将有助于维持干细胞数量及功能，对于延缓机体衰老及防治各种老龄化疾病都具有重要意义。
本发明提供了过表达肌型磷酸果糖激酶的试剂在制备延缓细胞衰老的药物中的应用。
本发明还提供了过表达肌型磷酸果糖激酶的试剂在制备改善细胞糖酵解水平的药物中的应用。
本发明还提供了过表达肌型磷酸果糖激酶的试剂在制备促进细胞增殖与分化的药物中的应用。
本发明还提供了过表达肌型磷酸果糖激酶的试剂在制备上调细胞以下指标中的一种或两种以上的药物中的应用，所述指标包括：葡萄糖消耗量、乳酸水平、ATP含量和ECAR水平。
本发明还提供了过表达肌型磷酸果糖激酶的试剂在制备下调衰老相关β半乳糖苷酶的表达的药物中的应用。
本发明还提供了过表达肌型磷酸果糖激酶的试剂在制备下调细胞中衰老相关因子的表达的药物中的应用，所述衰老相关因子包括P16INK4a。
优选的是，所述细胞包括间充质干细胞。
优选的是，所述间充质干细胞包括衰老间充质干细胞。
本发明还提供了一种改良的衰老间充质干细胞，所述改良的衰老间充质干细胞能够过表达肌型磷酸果糖激酶。
本发明还提供了一种改良的衰老间充质干细胞的构建方法，包括以下步骤：利用携带肌型磷酸果糖激酶基因的慢病毒感染衰老间充质干细胞；MOI值为50～250，感染时间为48～72h。
本发明提供了过表达肌型磷酸果糖激酶的试剂在制备延缓细胞衰老的药物中的应用。本发明旨在研究MSCs中人为改造PFKM的表达后可以上调MSCs的糖酵解水平，进一步通过PFKM促进糖酵解来延缓MSCs衰老，本发明围绕PFKM影响MSCs糖酵解水平调控细胞衰老进行探讨，首次将PFKM与MSCs衰老有机联系，为阐明干细胞衰老的调控机制提供实验依据，将有助于维持干细胞数量及功能，有助于延缓机体衰老及防治各种老龄化疾病，对社会长久健康发展具有重要意义。利用编码mRNA对细胞的命运进行调控，技术上具有一定可行性，从基因水平改变细胞的特性，能够调控和改造细胞自体及其周围的微环境，从而达到更好的治疗目的。
具体的，本发明从1-2月龄雄性Wistar大鼠骨髓中提取原代细胞，利用全骨髓贴壁法体外传代培养，获得早代次MSCs(EPMSCs，P1-P3)及晚代次MSCs(LPMSCs，P10-P12)。通过形态学观察(细胞形态学特点、细胞表面积和长宽比)、衰老相关-β-gal(SA-β-gal)染色及衰老相关因子P16INK4a的表达，建立复制性衰老的MSCs。通过检测葡糖糖消耗量、ATP含量、乳酸及ECAR水平明确了衰老MSCs糖酵解水平明显降低。
利用携带PFKM的慢病毒感染状态良好的衰老MSCs，MOI值为50～250，感染48h～72h。通过荧光显微镜及RT-qPCR检测其转染效率，发现病毒转染72h时，效率最佳，PFKM的表达可明显上调2.5倍左右。通过细胞的葡糖糖消耗量、ATP含量、乳酸及ECAR水平，发现改良的衰老MSCs的糖酵解水平显著上调。
利用携带PFKM的慢病毒感染状态良好的衰老MSCs，通过观察其形态学特点，SA-β-gal染色及衰老相关因子P16INK4a的表达，发现PFKM通过上调衰老MSCs的糖酵解水平并延缓MSCs衰老，为体外培养获得大量年轻态MSCs提供理论依据和实验方案，加深了对MSCs衰老潜在机制的认识，有助于衰老相关性疾病的预防及治疗新靶点的探索。
试验结果表明，大鼠晚代次MSCs(LPMSCs，P10-P12)形态明显衰老，且PFKM的表达水平显著低于早代次MSCs(EPMSCs，P1-P3)；对细胞的糖酵解水平进行检测发现，衰老MSCs的葡萄糖消耗量、ATP含量、乳酸和细胞外泌酸率水平明显降低。通过人为提高衰老MSCs中PFKM表达水平，能够上调衰老MSCs糖酵解水平，如葡萄糖消耗量、ATP产量、乳酸和ECAR水平。提高PFKM表达后，更有效地催化葡萄糖转化为6-磷酸葡萄糖，决定细胞内的糖代谢方向，重塑衰老MSCs中的糖代谢水平。
附图说明
图1a为本发明提供的倒置相差显微镜下EPMSCs及LPMSCs细胞形态；
图1b为本发明提供的EPMSCs及LPMSCs细胞的形态学统计分析结果；
图1c为本发明提供的SA-β-gal染色和定量分析结果；
图1d为本发明提供的实时荧光定量PCR检测EPMSCs及LPMSCs中衰老相关因子P16INK4amRNA表达水平的结果；
图2a为本发明提供的EPMSCs及LPMSCs的葡萄糖消耗量检测结果；
图2b为本发明提供的EPMSCs及LPMSCs的细胞外液乳酸分泌水平检测结果；
图2c为本发明提供的EPMSCs及LPMSCs的ATP含量检测结果；
图2d为本发明提供的EPMSCs及LPMSCs的ECAR水平检测结果；
图2e为本发明提供的实时荧光定量PCR检测EPMSCs及LPMSCs中的PFKM mRNA表达水平的结果；
图2f为本发明提供的Western Blot检测EPMSCs及LPMSCs中的PFKM蛋白表达水平的结果；
图3a为本发明提供的用不同浓度慢病毒感染衰老MSCs的情况；
图3b为本发明提供的用最佳MOI值病毒感染衰老MSCs 72h后的情况；
图3c为本发明提供的实时荧光定量PCR检测慢病毒转染后MSCs中PFKM mRNA的表达增高倍数；
图3d为本发明提供的Western Blot检测慢病毒转染后MSCs中PFKM蛋白的表达增高倍数；
图4a为本发明提供的改良的衰老MSCs的葡萄糖消耗量检测结果；
图4b为本发明提供的改良的衰老MSCs的细胞乳酸水平检测结果；
图4c为本发明提供的改良的衰老MSCs的ATP含量检测结果；
图4d为本发明提供的改良的衰老MSCs的细胞ECAR水平检测结果；
图4e为本发明提供的倒置相差显微镜下改良的衰老MSCs细胞形态学特点；
图4f为本发明提供的改良的衰老MSCs的细胞形态统计学分析结果；
图4g为本发明提供的改良的衰老MSCs的细胞SA-β-gal染色及定量分析结果；
图4h为本发明提供的实时荧光定量PCR检测改良的衰老MSCs中衰老相关因子P16INK4amRNA表达水平的结果。
具体实施方式
本发明提供了过表达肌型磷酸果糖激酶(phosphofructokinase，muscle，PFKM)的试剂在制备延缓细胞衰老的药物中的应用。在本发明中，所述肌型磷酸果糖激酶的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示：ATGACCCATGAAGAGCATCATGAAGCCAAAACCCTGGGGATCGGCAAGGCCATCGCCGTGTTGACCTCTGGTGGAGATGCCCAAGGTATGAATGCTACGGTCAGGGCTGTGGTACGAGTTGGCATCTTCACCGGGCTCCGCGTCTTCTTTGTCCATGAGGGTTACCAAGGCCTGGTGGATGGTGGAGAGCACATCAGGGAGGCCACCTGGGAGAGCGTGTCCATGATGCTCCAGCTGGGAGGCACGGTGATTGGAAGTGCCCGATGCAAGGACTTCCGGGAGCGAGAAGGACGACTCCGAGCTGCCCACAACCTGGTGAAGCGGGGGATCACCAATCTGTGTGTCATCGGAGGCGATGGCAGCCTCACTGGGGCTGACACTTTTCGTTCAGAGTGGAGTGACTTATTGAATGACCTCCAGAAAGATGGGAAGATCACAGCCGAGGAGCGTACAAAGTCCAGCTACCTGAACATCGTTTTCCTGGTTGGCTCAATCGACAATGACTTCTGTGGCACTGATATGACCATTGGTACTGACTCTGCCCTGCACCGCATTGTAGAGATCGTGGACGCCATCACCACCACCGCTCAGAGCCACCAGAGGACATTTGTGTTAGAAGTGATGGGCCGCCACTGTGGATACCTGGCCCTTGTCACCTCTCTGTCGTGTGGGGCCGACTGGGTTTTCATTCCCGAGTGTCCGCCAGATGACGACTGGGAAGAACACCTTTGTCGCCGTCTCAGTGAGACAAGAACCCGTGGTTCTCGTCTCAACATCATCATTGTTGCTGAGGGTGCAATCGACAAAAACGGGAAGCCAATCACCTCAGAAGACATCAAGAACCTGGTGGTAAAGCGTCTTGGATATGATACCAGGGTCACTGTTCTGGGACATGTACAGAGGGGTGGGACACCATCAGCCTTTGACCGGATCCTGGGCAGCAGGATGGGTGTGGAAGCAGTGATGGCACTTTTGGAGGGGACCCCAGACACCCCAGCCTGTGTGGTGAGCCTCTCTGGTAATACGGCTGTGCGCCTGCCCCTCATGGAGTGTGTCCAGGTGACCAAAGACGTGACCAAGGCTATGGATGAGAAGAGATTTGATGAAGCCATTAAGCTGAGAGGCCGGAGCTTCATGAACAACTGGGAGGTATACAAGCTTCTAGCTCATGTCAGACCCCCAGTCTCTAAGGGCGGGTTGCACACGGTGGCTGTGATGAACGTGGGGGCCCCAGCTGCTGGAATGAATGCTGCAGTTCGCTCTACTGTGAGGATTGGCCTTATCCAAGGCAACCGAGTGCTGGTCGTGCATGATGGCTTTGAGGGTCTGGCCAAAGGTCAGATTGAGGAAGCTGGCTGGAGCTATGTTGGAGGCTGGACTGGTCAAGGTGGTTCCAAACTTGGTACTAAAAGGACTCTACCCAAGAAGAACCTGGAACAGATCAGTGCCAACATAACCAAGTATAACATCCAGGGCCTGGTTATCATTGGGGGCTTTGAGGCTTACACAGGGGGCTTGGAGCTGATGGAGGGCAGGAAGCAGTTTGATGAGCTCTGCATCCCATTTGTGGTCATTCCCGCCACGGTTTCCAATAATGTCCCAGGGTCAGACTTCAGCATCGGGGCTGACACAGCACTGAACACCATCTGCACGACCTGTGACCGAATCAAGCAGTCTGCAGCAGGCACCAAGCGGCGAGTGTTTATCATCGAGACGATGGGTGGTTACTGTGGCTATCTGGCCACCATGGCAGGACTGGCGGCTGGGGCTGATGCTGCCTACATTTTTGAGGAGCCCTTCACCATCCGAGATCTCCAGGTTAATGTTGAACATCTGGTGCAGAAGATGAAAACAACTGTGAAGAGAGGCCTGGTGCTGAGGAATGAGAAGTGCAACGAGAACTACACTACTGATTTCATTTTCAACCTGTACTCTGAGGAGGGGAAGGGCATCTTCGACAGCAGGAAGAACGTGCTTGGCCACATGCAGCAGGGTGGAAACCCAACTCCCTTTGACAGGAATTTTGCCACCAAGATGGGTGCTAAGGCTACGAATTGGATGTCTGGGAAAATCAAAGAGAGTTACCGTAATGGACGGATCTTTGCCAACACTCCCGACTCAGGTTGTGTTCTGGGGATGCGTAAGAGGGCCCTGGTCTTTCAGCCAGTGACTGAGCTGAAGGACCAGACAGATTTTGAGCACCGAATCCCCAAAGAACAGTGGTGGCTGAAGCTGAGGCCAATCCTCAAAATCCTGGCCAAGTACGAGATTGATCTGGACACCTCTGACCACGCCCACCTGGAGCACATTTCCAGGAAGCGGTCTGGAGAAGCTGCTGTC。在本发明中，所述细胞优选包括间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)。在本发明中，所述间充质干细胞优选包括衰老间充质干细胞。间充质干细胞是许多疾病细胞治疗的基础，已经成为干细胞组织工程学的主要种子细胞。正常的骨髓样本获取困难，无法获得充足的特定年龄阶段的骨髓MSCs，且MSCs随着体外培养次数增加，糖酵解水平下调，其增殖活性和存活能力减弱，多向分化潜能也随之降低，细胞发生衰老。干细胞衰老极大制约了干细胞的临床应用，降低了患者自体干细胞移植的疗效。本发明围绕PFKM影响MSCs糖酵解水平调控细胞衰老进行探讨，首次将PFKM与MSCs衰老有机联系，为阐明干细胞衰老的调控机制提供实验依据，将有助于维持干细胞数量及功能，对于延缓机体衰老及防治各种老龄化疾病都具有重要意义。PFKM在改造MSCs细胞学特性及延缓干细胞衰老中发挥重要作用。在本发明所述的过表达肌型磷酸果糖激酶的试剂优选包括通过间接作用提高MSCs的PFKM表达的其他细胞因子、化学分子等；携带PFKM基因的其它载体如质粒、慢病毒、腺病毒或腺相关病毒，或含这些载体的其它微生物。凡是在MSCs中以人为提高细胞内PFKM水平改造MSCs细胞学特性并延缓干细胞衰老的试剂均为本发明保护的内容。
本发明还提供了过表达肌型磷酸果糖激酶的试剂在制备改善细胞糖酵解水平的药物中的应用。在本发明中，所述细胞优选包括间充质干细胞。在本发明中，所述间充质干细胞优选包括衰老间充质干细胞。MSCs中PFKM的过表达对重塑细胞糖酵解水平具有关键意义。在MSCs中通过人为提高细胞内PFKM表达水平来上调细胞葡萄糖消耗量、乳酸水平、ATP含量及ECAR水平等能够反映糖酵解水平指标的技术与方法均为本发明保护的内容。
本发明还提供了过表达肌型磷酸果糖激酶的试剂在制备促进细胞增殖与分化的药物中的应用。在本发明中，所述细胞优选包括间充质干细胞。在本发明中，所述间充质干细胞优选包括衰老间充质干细胞。
本发明还提供了过表达肌型磷酸果糖激酶的试剂在制备上调细胞以下指标中的一种或两种以上的药物中的应用，所述指标包括：葡萄糖消耗量、乳酸水平、ATP含量和ECAR水平。在本发明中，所述细胞优选包括间充质干细胞。在本发明中，所述间充质干细胞优选包括衰老间充质干细胞。
本发明还提供了过表达肌型磷酸果糖激酶的试剂在制备下调衰老相关β半乳糖苷酶的表达的药物中的应用。在本发明中，所述细胞优选包括间充质干细胞。在本发明中，所述间充质干细胞优选包括衰老间充质干细胞。
本发明还提供了过表达肌型磷酸果糖激酶的试剂在制备下调细胞中衰老相关因子的表达的药物中的应用，所述衰老相关因子包括P16INK4a。在本发明中，所述细胞优选包括间充质干细胞。在本发明中，所述间充质干细胞优选包括衰老间充质干细胞。
MSCs中人为高表达PFKM后细胞分泌的细胞因子、生长因子以及外泌体中活性成分发生量和质的改变。过表达PFKM促进MSCs分泌这些细胞因子、生长因子和外泌体，改善细胞的糖酵解水平，促进细胞增殖与分化，进而延缓干细胞衰老。因此凡是从高表达PFKM的MSCs中分离纯化这些活性成分如细胞因子、生长因子和外泌体等并制备成治疗剂应用于改善MSCs的糖酵解水平及延缓MSCs衰老的物质与方法均为本发明保护的内容。
本发明还提供了一种改良的衰老间充质干细胞，所述改良的衰老间充质干细胞能够过表达肌型磷酸果糖激酶。在本发明中，所述改良的衰老间充质干细胞优选包括含有PFKM核苷酸序列的表达载体。本发明通过向衰老MSCs中导入含有PFKM核苷酸序列的表达载体来提高PFKM的表达水平。本发明实验表明，改良的衰老MSCs糖酵解水平增加，衰老MSCs形态趋于年轻化，改良衰老MSCs的衰老相关β半乳糖苷酶(SA-β-gal)染色阳性率降低，衰老相关因子P16INK4a表达显著下调，细胞活力增加，有效地延缓了MSCs的衰老。本发明中人为过表达PFKM可以重塑衰老MSCs糖酵解水平，进而延缓间充质干细胞衰老，为体外培养获得大量年轻态MSCs提供理论依据和实验方案，加深了对MSCs衰老潜在机制的认识，有助于衰老相关性疾病的预防及治疗新靶点的探索。
本发明提供了一种改良的衰老间充质干细胞的构建方法，包括以下步骤：利用携带肌型磷酸果糖激酶基因的慢病毒感染衰老间充质干细胞；MOI值为50～250，感染时间为48～72h。即当过表达肌型磷酸果糖激酶的载体为携带肌型磷酸果糖激酶基因的慢病毒时，本发明优选按照上述方法进行构建。本发明对携带肌型磷酸果糖激酶基因的慢病毒的来源没有特殊限定，采用本领域技术人员熟知的常规市售产品即可，如上海吉凯基因医学科技股份有限公司构建的稳定表达PFKM的慢病毒(以GV358载体：Ubi-MCS-3FLAG-SV40-EGFP-IRES-puromycin为骨架载体，采用双酶切方法(AgeI/AgeI酶切)将PFKM基因构建在此载体上)，所述病毒的滴度为3E+8。在本发明中，所述MOI值优选为200，所述感染时间优选为72h。在本发明具体实施例中，优选按照MOI值为50、100、150、200及250设置PFKM慢病毒感染梯度感染衰老MSCs，培养48h后感染效率大于80％且细胞毒性最小的MOI值为最佳MOI值，选用最佳MOI值用于后续实验，培养72h后获得实验组LV-PFKM，用对照组慢病毒(GV358载体)感染相同状态的衰老MSCs获得阴性对照组LV-Vector。本发明优选采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测慢病毒感染的MSCs中PFKM的表达情况。试验结果表明，根据病毒感染效率超过80％且细胞毒性最小，本发明确定最佳MOI值＝200。构建稳定高表达PFKM的MSCs，实时荧光定量PCR检测慢病毒感染72h后的MSCs，过表达组中PFKM表达与阴性对照组相比，可以稳定维持在2.5倍左右
下面结合具体实施例对本发明所述的过表达肌型磷酸果糖激酶的试剂在制备延缓细胞衰老的药物中的应用做进一步详细的介绍，本发明的技术方案包括但不限于以下实施例。
实施例1
建立大鼠MSCs体外复制衰老模型
1.1原代细胞的分离获取
大鼠置于实验室环境2～3h，使其适应实验室环境，麻醉后脱颈处死，全身用碘伏消毒，75％酒精脱碘，重复3次，快速分离得到大鼠双侧肱骨、股骨及胫骨，用含1％青霉素-链霉素的PBS浸泡骨头，迅速移入超净台中。在超净台中剔除骨头表面附着肌肉及筋膜等组织，骨头置于完全培养液中；咬骨钳去掉骨两端，用5ml注射器吸培养液反复冲洗骨髓腔，待骨髓腔变成半透明即可。用5ml移液器轻柔吸起骨髓冲洗液至50ml离心管上的40μm细胞过滤网，室温离心5min过滤后的液体，1500rpm，之后弃上清，重悬细胞团块，混匀后传入10cm培养皿中，置于37℃，5％CO2细胞孵箱中培养，隔日半量换液，然后根据细胞状态2～3d换液。
1.2构建MSCs体外复制衰老模型
原代MSCs经体外传代培养得到不同代次的MSCs，然后对各个代次MSCs进行衰老评估,包括MSCs的形态学观察及分析、衰老相关β-半乳糖苷酶(SA-β-gal)活性检测及衰老相关因子P16INK4amRNA表达检测，构建MSCs体外复制衰老模型。用早代次MSCs(EPMSCs，P1-P3)及晚代次MSCs(LPMSCs，P10-P12)分别表示年轻及复制衰老细胞。
1.3MSCs形态学观察与分析
显微镜下观察体外传代培养获得的EPMSCs、LPMSCs，对细胞生长状况和形态学特征进行评估，随机选取约20个视野采集图像，用Cell Entry软件记录并计算视野中单个细胞的表面积及长宽比，进行统计学分析。
1.4衰老相关β-半乳糖苷酶(SA-β-gal)活性检测(细胞衰老β-半乳糖苷酶染色试剂盒，碧云天)
将EPMSCs、LPMSCs培养于6孔板中，待细胞生长密度达到80～90％时，用PBS洗涤3次，每次3min，每孔加入200μl固定液，室温固定10-15min，吸弃固定液后用PBS洗3次，每次5min。洗涤之后每孔加入500μl工作液，用封口膜封住孔板边缘以免工作液挥发，置于无CO2的37℃孵箱中过夜。次日在倒置相差显微镜下观察，随机视野下采集图像，记录蓝染细胞的数目即为阳性细胞的数目，计算阳性细胞数占全部细胞数的百分比。
1.5荧光定量PCR(RT-qPCR)检测衰老相关因子mRNA表达水平
(1)提取细胞RNA
细胞生长密度至80～90％时，吸弃培养液，PBS清洗2～3次，培养皿中加入1mlTrizol，室温裂解15min，反复吹打直至所有细胞完全裂解，所有液体吸入1.5mlEP管，4℃离心，12000rpm，15min，吸取上清至另一EP管中。按200μl/mlTrizol加入氯仿，剧烈震荡混和，禁止涡旋，室温静置15min。4℃离心，12000rpm，15min，吸取上层水相至新EP管中，按照500μl/mlTrizol加入异丙醇，轻轻振荡后室温静置15min。4℃离心，12000rpm，15min，弃掉上清，管底部沉淀为RNA，加入提前预冷的75％乙醇1ml，轻弹管底使沉淀悬浮，4℃离心，12000rpm，15min，弃上清，室温干燥约10min，至其变半透明状。加入10-20μlDEPC水充分溶解RNA，上机检测RNA浓度及纯度，可根据RNA浓度酌情加减DEPC水量。
(2)RNA逆转录为cDNA(TransScript All-in-One First-Strand cDNA SynthesisSuperMix for qPCR,TransGen Biotech)
根据试剂盒说明，进行如表1和表2所示的逆转录反应操作：
表1逆转录反应体系
Figure BDA0003240991300000101
Figure BDA0003240991300000111
表2逆转录反应程序
Figure BDA0003240991300000112
合成的cDNA可以直接进行qPCR(qPCR引物组详见表3，其中，β-actin为内参)或存储于-20℃冰箱。
表3 qPCR引物组
Figure BDA0003240991300000113
(3)RT-qPCR检测(TransStart Top Green qPCR SuperMix,TransGen Biotech)
按反应体系配制如表4：
表4逆转录反应体系
Figure BDA0003240991300000114
Figure BDA0003240991300000121
逆转录反应程序如表5：
表5逆转录反应程序
Figure BDA0003240991300000122
测出CT值并进行统计学分析。
体外传代培养获得EPMSCs及LPMSCs，如图1a所示显微镜下观察到两组细胞有明显的形态学差别，EPMSCs生长状态良好，胞体形状为长梭形，边界清楚；而LPMSCs生长状态差，形状不规则且呈铺展样，细胞边界模糊，立体感消失，胞质颗粒感较明显。如图1b对细胞形态的参数进行分析发现，LPMSCs表面积较EPMSCs显著增大，长宽比降低。
图1c中LPMSCs蓝染细胞数目明显多于EPMSCs。统计分析发现LPMSCs中蓝染细胞(SA-β-gal阳性)比例明显高于EPMSCs，说明LPMSCs中衰老细胞数目显著增加。
图1d是RT-qPCR技术检测衰老相关因子P16INK4amRNA水平，结果表明，相对于EPMSCs，LPMSCs中P16INK4amRNA表达水平明显升高。由此本发明成功建立了MSCs体外复制性衰老模型，将EPMSCs作为年轻细胞，LPMSCs作为衰老细胞。
实施例2
衰老MSCs的糖代谢水平及PFKM表达的检测
2.1葡萄糖消耗量的检测(葡萄糖检测试剂盒，南京建成)
将EPMSCs及LPMSCs按照4×103个细胞/孔的密度培养于96孔板，培养于5％CO2，37℃的细胞恒温培养箱。待细胞贴壁生长吸弃原培养液，每孔加入50μl不含血清的DMEM/F-12，次日收集培养上清液。上清液室温，1200prm，离心3min后弃沉淀，收集上清至另一EP管待测；
根据试剂盒说明书具体步骤如表6：
表6葡萄糖消耗量检测操作流程
Figure BDA0003240991300000131
均匀混合液体后放在37℃水浴锅中反应5min，然后用分光光度计在波长505nm处检测每孔吸光度值，计算葡萄糖含量。
2.2乳酸水平的检测(乳酸检测试剂盒，南京建成)
收集细胞培养液上清，方法同葡萄糖消耗量检测，根据试剂盒说明书步骤见表7：
表7乳酸水平检测操作流程
Figure BDA0003240991300000132
混匀液体，用ddH2O调零，检测各管的吸光度值(波长530nm)。
2.3 ATP含量的检测(ATP检测试剂盒，碧云天)
取出6孔板中培养状态良好的细胞，用PBS洗涤细胞3次，每孔加200μl裂解液，使裂解液充分接触细胞，裂解后4℃离心10min，12000rpm，得到的上清液转移到另一个EP管，用来检测细胞内ATP含量。取ATP检测试剂稀释液稀释与ATP检测试剂按照4:1配成ATP检测工作液，无菌96孔检测板每孔加100μlATP检测工作液，静置5～10min，消耗本底ATP。用ATP检测裂解液稀释样品及标准品，将20μl样品或稀释后的标准品加入样品孔内，混匀后用化学发光仪检测RLU值，作出标准曲线，代入公式计算出样品ATP含量。
2.4ECAR水平的检测(胞外泌酸率检测试剂盒，Luxcel Biosciences)
将细胞按照8×104个/孔的密度接种于96孔板，设置3个复孔，置于37℃，5％CO2恒温培养箱培养；次日，按照ECAR检测实验说明书进行药物处理，然后将96孔板置于无CO2的37℃恒温孵箱中孵育，3h后上机检测3～4h。作出标准曲线，进行统计学分析。
2.5 RT-qPCR检测EPMSCs与LPMSCs中PFKM mRNA表达水平
实时定量荧光PCR方法检测EPMSCs与LPMSCs中PFKM的表达，方法同1.5，引物的序列如下：
表8实时定量荧光PCR方法检测引物
Figure BDA0003240991300000141
2.6 Western Blot检测EPMSCs与LPMSCs中PFKM蛋白表达水平
(1)细胞总蛋白提取
细胞融合至80～90％时进行消化，终止消化后置于15ml离心管，室温下离心1200rpm，5min。用3mlPBS重悬，加入适量蛋白裂解液(PMSF:RIPA＝1:100提前配制)，于冰上裂解15min，反复吹打混匀至细胞充***解。裂解后，将细胞和裂解液离心12000rpm，15min；离心后轻轻吸出EP管上部液体，避免吸起沉淀，并转移至新EP管内。取2μl蛋白样品用于测定浓度，剩余的蛋白样品迅速放入-80℃保存，以免蛋白降解。
(2)BCA法测定蛋白浓度
使用96孔板，分别加入0μl、1μl、2μl、4μl、8μl、12μl、16μl、20μl0.5mg/ml的蛋白标准品，孔板中加PBS补齐至20μl。配BCA工作液(比例为试剂A/试剂B＝50:1)，现配现用，每孔加入200μl，然后在无CO2，37℃培养箱中孵育30min。将96孔板放在酶标仪上检测，设置波长为562nm，测出的吸光度值，最后根据标准曲线计算出待测样品的总蛋白浓度。
(3)蛋白印迹法步骤
测完浓度后，取20μg蛋白样品混匀，PBS补齐至20μl，封口膜封闭管口，煮沸约7min。配制12％的分离胶、5％的浓缩胶，上层浓缩胶按80V，50min，下层分离胶按照120V，70min，进行电泳。电泳后取下整块胶板，确定目的蛋白所在的位置，切取大小合适的凝胶，凝胶的面积最小，其次是滤纸，PVDF膜最大，记录PVDF膜面积，用甲醇溶液激活PVDF膜15sec，待膜变半透明表示完成激活。按滤纸-PVDF膜-凝胶-滤纸顺序叠放在半干转膜仪上，设置恒定电压及2.5倍膜面积大小的电流，转膜45min。转完的PVDF膜用奶粉封闭1～2h，然后孵育一抗(PFKM抗体，Proteintech)，将PVDF膜置于一抗溶液(PFKM1:1000；β-actin1:2000)，摇床孵育2h后，4℃冰箱过夜。一抗孵育完成后，1×TBST将膜清洗3次，每次10min；二抗(β-actin抗体，Sangon Biotech)按1:5000稀释之后使用，二抗室温孵育1h，之后用1×TBST清洗膜3次，每次10min。按ECL超敏发光液说明书配制工作液，显色***显色后采集图像。
如图2a所示为细胞葡萄糖消耗量，LPMSCs较EPMSCs葡萄糖消耗量降低，表明衰老MSCs的葡萄糖消耗量明显低于年轻MSCs。
图2b所示为细胞外液的乳酸水平，LPMSCs乳酸水平较EPMSCs下降，结果表明衰老MSCs分泌乳酸的能力减弱，说明衰老细胞的糖酵解水平降低。
如图2c所示为细胞内ATP含量，LPMSCs产生的ATP低于EPMSCs，表明随着MSCs发生衰老，细胞的能量产生逐渐降低。
图2d所示为细胞外泌酸率，LPMSCs的ECAR值低于EPMSCs。表明衰老MSCs的糖酵解水平降低。
图2e所示为RT-qPCR检测EPMSCs与LPMSCs中PFKM mRNA表达水平，LPMSCs的PFKMmRNA低于EPMSCs，表明衰老MSCs中PFKM mRNA的表达降低。
图2f所示为Western Blot检测EPMSCs与LPMSCs中PFKM蛋白表达水平，LPMSCs的PFKM蛋白表达低于EPMSCs，说明MSCs衰老进程中PFKM的蛋白表达逐渐降低。
实施例3
慢病毒感染衰老MSCs以获得改良的衰老MSCs
构建高表达PFKM的改良衰老MSCs
由上海吉凯基因医学科技股份有限公司构建稳定表达PFKM的慢病毒(以GV358载体：Ubi-MCS-3FLAG-SV40-EGFP-IRES-puromycin为骨架载体，采用双酶切方法(AgeI/AgeI酶切)将PFKM基因构建在此载体上)。PFKM过表达慢病毒的滴度为3E+8。确定最佳感染复数，按照50、100、150、200及250设置PFKM慢病毒感染梯度感染衰老MSCs，培养48h后感染效率大于80％且细胞毒性最小的MOI值为最佳MOI值，采用最佳MOI＝200用于后续实验，培养72h后获得实验组LV-PFKM，用对照组慢病毒(GV358载体)感染相同状态的衰老MSCs获得阴性对照组LV-Vector。
RT-qPCR检测慢病毒感染后实验组中PFKM mRNA表达与阴性对照组相比增高的倍数。
Western Blot检测检测慢病毒感染后实验组中PFKM蛋白表达与阴性对照组相比增高的倍数。
图3a和图3b表明采用不同MOI值进行PFKM慢病毒过表达后，各组MSCs均表达绿色荧光蛋白，当MOI值为200时，绿色荧光蛋白表达最强，细胞毒性最小。RT-qPCR检测结果如图3c所示，与阴性对照组相比，过表达组中PFKM的mRNA表达量提高约7倍，图3d结果表明PFKM的蛋白表达量提高约2.5倍。说明过表达PFKM的慢病毒感染衰老MSCs后能使PFKM稳定高表达。
实施例4
改良的衰老MSCs的糖代谢水平及衰老检测
4.1检测过表达PFKM对细胞糖代谢水平的影响
4.1.1检测细胞葡萄糖消耗量
如图4a所示，LV-PFKM组的葡萄糖与LV-Vector组相比上调了1.4倍左右。说明改良的衰老MSCs葡萄糖消耗量明显上调。
4.1.2检测细胞乳酸水平
如图4b所示，LV-PFKM组的细胞乳酸水平与LV-Vector组相比上调了1.6倍左右。说明改良的衰老MSCs的乳酸水平明显上调。
4.1.3检测细胞ATP含量
如图4c所示，LV-PFKM组的ATP含量与LV-Vector组相比上调了1.4倍左右，说明改良的衰老MSCs的ATP含量显著上调。
4.1.4检测细胞ECAR水平
如图4d所示，LV-PFKM组的ECAR水平与LV-Vector组相比上调了1.5倍左右，说明改良的衰老MSCs的ECAR显著上调。
4.2检测过表达PFKM对细胞衰老的影响
4.2.1倒置相差显微镜观察细胞形态学特点及统计分析
如图4e所示，与LV-Vector组相比，LV-PFKM组细胞呈长梭形，立体感更强，边界更清晰。如图4f所示，统计分析两组细胞的形态参数发现，LV-PFKM组的细胞表面积下调1.5倍而长宽比上调了1.7倍。表明过表达PFKM的改良衰老MSCs细胞形态更加趋于年轻化。
4.2.2 SA-β-gal染色检测细胞衰老情况
如图4g所示，与阴性对照组相比，LV-PFKM组中的蓝染细胞数目明显减少，SA-β-gal阳性率下调了1.5倍左右。说明过表达PFKM改善了衰老MSCs的衰老情况。
4.2.3 RT-qPCR检测衰老相关因子的表达
如图4h所示，RT-qPCR检测衰老相关因子P16INK4amRNA的表达水平，结果显示：与阴性对照组相比，LV-PFKM组中P16INK4a的表达下调了1.4倍。说明改良的衰老MSCs中衰老相关因子的表达明显下调。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 吉林大学
<120> 过表达肌型磷酸果糖激酶的试剂在制备延缓细胞衰老的药物中的应用
<160> 7
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 2340
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atgacccatg aagagcatca tgaagccaaa accctgggga tcggcaaggc catcgccgtg 60
ttgacctctg gtggagatgc ccaaggtatg aatgctacgg tcagggctgt ggtacgagtt 120
ggcatcttca ccgggctccg cgtcttcttt gtccatgagg gttaccaagg cctggtggat 180
ggtggagagc acatcaggga ggccacctgg gagagcgtgt ccatgatgct ccagctggga 240
ggcacggtga ttggaagtgc ccgatgcaag gacttccggg agcgagaagg acgactccga 300
gctgcccaca acctggtgaa gcgggggatc accaatctgt gtgtcatcgg aggcgatggc 360
agcctcactg gggctgacac ttttcgttca gagtggagtg acttattgaa tgacctccag 420
aaagatggga agatcacagc cgaggagcgt acaaagtcca gctacctgaa catcgttttc 480
ctggttggct caatcgacaa tgacttctgt ggcactgata tgaccattgg tactgactct 540
gccctgcacc gcattgtaga gatcgtggac gccatcacca ccaccgctca gagccaccag 600
aggacatttg tgttagaagt gatgggccgc cactgtggat acctggccct tgtcacctct 660
ctgtcgtgtg gggccgactg ggttttcatt cccgagtgtc cgccagatga cgactgggaa 720
gaacaccttt gtcgccgtct cagtgagaca agaacccgtg gttctcgtct caacatcatc 780
attgttgctg agggtgcaat cgacaaaaac gggaagccaa tcacctcaga agacatcaag 840
aacctggtgg taaagcgtct tggatatgat accagggtca ctgttctggg acatgtacag 900
aggggtggga caccatcagc ctttgaccgg atcctgggca gcaggatggg tgtggaagca 960
gtgatggcac ttttggaggg gaccccagac accccagcct gtgtggtgag cctctctggt 1020
aatacggctg tgcgcctgcc cctcatggag tgtgtccagg tgaccaaaga cgtgaccaag 1080
gctatggatg agaagagatt tgatgaagcc attaagctga gaggccggag cttcatgaac 1140
aactgggagg tatacaagct tctagctcat gtcagacccc cagtctctaa gggcgggttg 1200
cacacggtgg ctgtgatgaa cgtgggggcc ccagctgctg gaatgaatgc tgcagttcgc 1260
tctactgtga ggattggcct tatccaaggc aaccgagtgc tggtcgtgca tgatggcttt 1320
gagggtctgg ccaaaggtca gattgaggaa gctggctgga gctatgttgg aggctggact 1380
ggtcaaggtg gttccaaact tggtactaaa aggactctac ccaagaagaa cctggaacag 1440
atcagtgcca acataaccaa gtataacatc cagggcctgg ttatcattgg gggctttgag 1500
gcttacacag ggggcttgga gctgatggag ggcaggaagc agtttgatga gctctgcatc 1560
ccatttgtgg tcattcccgc cacggtttcc aataatgtcc cagggtcaga cttcagcatc 1620
ggggctgaca cagcactgaa caccatctgc acgacctgtg accgaatcaa gcagtctgca 1680
gcaggcacca agcggcgagt gtttatcatc gagacgatgg gtggttactg tggctatctg 1740
gccaccatgg caggactggc ggctggggct gatgctgcct acatttttga ggagcccttc 1800
accatccgag atctccaggt taatgttgaa catctggtgc agaagatgaa aacaactgtg 1860
aagagaggcc tggtgctgag gaatgagaag tgcaacgaga actacactac tgatttcatt 1920
ttcaacctgt actctgagga ggggaagggc atcttcgaca gcaggaagaa cgtgcttggc 1980
cacatgcagc agggtggaaa cccaactccc tttgacagga attttgccac caagatgggt 2040
gctaaggcta cgaattggat gtctgggaaa atcaaagaga gttaccgtaa tggacggatc 2100
tttgccaaca ctcccgactc aggttgtgtt ctggggatgc gtaagagggc cctggtcttt 2160
cagccagtga ctgagctgaa ggaccagaca gattttgagc accgaatccc caaagaacag 2220
tggtggctga agctgaggcc aatcctcaaa atcctggcca agtacgagat tgatctggac 2280
acctctgacc acgcccacct ggagcacatt tccaggaagc ggtctggaga agctgctgtc 2340
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ggaggctcca ttactgcctg ta 22
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gactcattgt ctactcctgc ctg 23
<210> 4
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
aaccgtacac tttcgtcc 18
<210> 5
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gtgcgttcgc ctcaatc 17
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
ccaagtgctg ggcaaccgag 20
<210> 7
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
ggtgggtagt cttcttagtc c 21

Claims (10)

1.过表达肌型磷酸果糖激酶的试剂在制备延缓细胞衰老的药物中的应用。
2.过表达肌型磷酸果糖激酶的试剂在制备改善细胞糖酵解水平的药物中的应用。
3.过表达肌型磷酸果糖激酶的试剂在制备促进细胞增殖与分化的药物中的应用。
4.过表达肌型磷酸果糖激酶的试剂在制备上调细胞以下指标中的一种或两种以上的药物中的应用，所述指标包括：葡萄糖消耗量、乳酸水平、ATP含量和ECAR水平。
5.过表达肌型磷酸果糖激酶的试剂在制备下调衰老相关β半乳糖苷酶的表达的药物中的应用。
6.过表达肌型磷酸果糖激酶的试剂在制备下调细胞中衰老相关因子的表达的药物中的应用，所述衰老相关因子包括P16INK4a。
7.根据权利要求1～6任一项所述的应用，其特征在于，所述细胞包括间充质干细胞。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述间充质干细胞包括衰老间充质干细胞。
9.一种改良的衰老间充质干细胞，其特征在于，所述改良的衰老间充质干细胞能够过表达肌型磷酸果糖激酶。
10.一种改良的衰老间充质干细胞的构建方法，包括以下步骤：利用携带肌型磷酸果糖激酶基因慢病毒感染衰老间充质干细胞；MOI值为50～250，感染时间为48～72h。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115029307A (zh) * 2022-07-28 2022-09-09 吉林大学 一种延缓MSCs衰老的方法
CN116041477A (zh) * 2022-10-13 2023-05-02 呈诺再生医学科技(北京)有限公司 Tdgf1基因在制备治疗衰老相关疾病或逆转细胞衰老的药物中的应用

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102382801A (zh) * 2011-10-26 2012-03-21 中国人民解放军军事医学科学院野战输血研究所 蛋白去乙酰化酶sirt1在促进间充质干细胞增殖与延缓衰老中的应用
CN108251359A (zh) * 2017-12-20 2018-07-06 上海华新生物高技术有限公司 一种间充质干细胞无血清培养基及培养方法
WO2019053295A1 (en) * 2017-09-18 2019-03-21 Fundació Institut D'investigació Sanitària Pere Virgili METHODS FOR IMPROVING THE EFFICACY OF CELL THERAPY WITH MESENCHYMAL STEM CELL POPULATIONS
CN110292629A (zh) * 2019-07-11 2019-10-01 吉林大学 己糖激酶1在延缓衰老中的应用
CN112280742A (zh) * 2020-11-05 2021-01-29 北京欣颂生物科技有限公司 干细胞制备的抗衰老的药物组合物或者保健品

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102382801A (zh) * 2011-10-26 2012-03-21 中国人民解放军军事医学科学院野战输血研究所 蛋白去乙酰化酶sirt1在促进间充质干细胞增殖与延缓衰老中的应用
WO2019053295A1 (en) * 2017-09-18 2019-03-21 Fundació Institut D'investigació Sanitària Pere Virgili METHODS FOR IMPROVING THE EFFICACY OF CELL THERAPY WITH MESENCHYMAL STEM CELL POPULATIONS
CN108251359A (zh) * 2017-12-20 2018-07-06 上海华新生物高技术有限公司 一种间充质干细胞无血清培养基及培养方法
CN110292629A (zh) * 2019-07-11 2019-10-01 吉林大学 己糖激酶1在延缓衰老中的应用
CN112280742A (zh) * 2020-11-05 2021-01-29 北京欣颂生物科技有限公司 干细胞制备的抗衰老的药物组合物或者保健品

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115029307A (zh) * 2022-07-28 2022-09-09 吉林大学 一种延缓MSCs衰老的方法
CN116041477A (zh) * 2022-10-13 2023-05-02 呈诺再生医学科技(北京)有限公司 Tdgf1基因在制备治疗衰老相关疾病或逆转细胞衰老的药物中的应用
CN116041477B (zh) * 2022-10-13 2023-08-08 呈诺再生医学科技(北京)有限公司 Tdgf1基因在制备治疗衰老相关疾病或逆转细胞衰老的药物中的应用

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