CN114875013A - 一种使用重组枯草芽孢杆菌分泌天然胞内β-半乳糖苷酶的方法 - Google Patents
一种使用重组枯草芽孢杆菌分泌天然胞内β-半乳糖苷酶的方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种使用重组枯草芽孢杆菌分泌天然胞内β‑半乳糖苷酶的方法。属于基因工程以及微生物工程技术领域,本发明通过人工合成lacZBa基因、设计引物、PCR获得B.aryabhattai Gel‑09来源β‑半乳糖苷酶目的基因,构建重组质粒pCut‑lacZBa,并转化至枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis WB600,得到重组枯草芽孢杆菌。以此枯草芽孢杆菌为菌种,发酵生产β‑半乳糖苷酶lacZBa。本发明以食品安全的枯草芽孢杆菌为表达宿主重组表达β‑半乳糖苷酶,产酶水平高,便于分离纯化,且发酵原料来源广泛,生产成本较低。
Description
技术领域
本发明属于酶工程和微生物工程技术领域,涉及一种使用重组枯草芽孢杆菌分泌天然胞内β-半乳糖苷酶的方法,特别是涉及一种高效分泌天然胞内β-半乳糖苷酶的重组枯草芽孢杆菌。
背景技术
枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)表达***是一种具有重要价值的原核表达***。1958年,枯草芽孢杆菌吸收外源基因这一特性被发现,该***逐渐被广泛研究,目前枯草芽孢杆菌表达***已被广泛用于淀粉酶、蛋白酶、葡聚糖酶等多种工业酶的生产中。
枯草芽孢杆菌表达***具有众多的优点:培养条件相对简单,在成分较为普通的培养基中仍可生长到高密度;发酵工艺成熟,可以进行高密度发酵;该***没有明显的密码子偏好且遗传性较强,噬菌体和质粒均能作为载体;另外,枯草芽孢杆菌属于革兰氏阳性菌,结构简单,不含有内毒素,无致病性,也被称作食品安全菌;枯草芽孢杆菌表达***具有强大的蛋白分泌***,枯草芽孢杆菌中至少有4种依赖于信号肽的蛋白质分泌表达***,具体为经典分泌途径(Sec依赖的蛋白质分泌途径)、双精氨酸分泌途径(Tat依赖的蛋白质分泌途径)、ABC分泌途径(ATP结合性盒式转运蛋白)以及假菌丝蛋白输出途径。因此,相较于大肠杆菌表达***,外源蛋白在枯草芽孢杆菌中更易实现高效的胞外表达,除此之外,通过对枯草芽孢杆菌启动子以及表达强度的调控,更易避免包涵体的产生。
β-半乳糖苷酶(EC 3.2.1.23),全称为β-D-半乳糖苷酶,又称为乳糖酶,能够水解β-1,4-半乳糖苷键,将底物乳糖分解为葡萄糖和半乳糖,有些也兼有转糖苷作用,是一种具有重要应用价值的工业酶。全世界有70%以上的成年人口存在乳糖不耐受问题,其中90%以上是东亚人。β-半乳糖苷酶能催化乳糖分子中β-1,4-糖苷键的水解,可用于无乳糖、低乳糖牛奶等乳制品的生产,具有重要应用价值。同时,乳糖的水解可以形成更多葡萄糖和半乳糖,更利于牛奶的发酵和提高酸奶中乳酸的含量。此外,乳糖水解为溶解度更高的单糖,可避免在炼乳和冰淇淋等产品中形成乳糖结晶(砂砾现象),有利于提高产品的风味和质量。由于乳品工业对β-半乳糖苷酶的巨大需求,近年来β-半乳糖苷酶的生产受到了广泛关注。重组表达是获得高产β-半乳糖苷酶的主要方法,但表达水平却受包括目标蛋白的性质、密码子使用偏好、表达***、发酵条件等多种因素影响。以往的研究表明,大多数细菌来源的β-半乳糖苷酶是胞内酶。胞内酶的工业化生产有许多缺点:可溶性表达较低;容易形成包涵体;下游操作过程复杂且成本高昂。因此,如何实现天然胞内β-半乳糖苷酶的胞外分泌,对β-半乳糖苷酶的高效制备具有重要意义。
发明内容
发明目的:本发明的目的是提供了一种具有高分泌能力的重组枯草芽孢杆菌,能够将天然胞内β-半乳糖苷酶高效地胞外分泌生产。
技术方案:本发明所述的一种使用重组枯草芽孢杆菌分泌天然胞内β-半乳糖苷酶的方法,以重组枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis WB600为宿主,以pCut为表达载体,表达氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的B.aryabhattai Gel-09来源的天然胞内β-半乳糖苷酶。
进一步的,构建权利要求1所述的基因工程菌(重组枯草芽孢杆菌)的方法,将SEQID NO.2所示的编码天然胞内β-半乳糖苷酶lacZBa的基因与表达载体pCut连接,转入宿主重组枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis WB600;具体的:
(1)、扩增SEQ ID NO.2所示的β-半乳糖苷酶基因;
(2)、将克隆出的目的基因SEQ ID NO.2连接到表达载体pCut,构建重组载体pCut-lacZBa,转化至克隆宿主E.coli JM109进一步克隆、
(3)、将重组质粒pCut-lacZBa通过化学转化进入枯草芽孢杆菌表达宿主,获得枯草芽孢杆菌β-半乳糖苷酶基因工程菌。
进一步的,一种高效分泌天然胞内β-半乳糖苷酶的方法,将所述的基因工程菌(重组枯草芽孢杆菌)接种至发酵培养基中,于37℃,200rpm培养60-96h。
具体的,在本发明的一种实施方式中,所述β-半乳糖苷酶lacZBa的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示;所述β-半乳糖苷酶lacZBa的基因序列如SEQ ID NO.2所示。
本发明的第一个目的是提供所述重组枯草芽孢杆菌的构建方法。
在本发明的一种实施方式中,所述方法是将SEQ ID NO.2所示的编码β-半乳糖苷酶lacZBa的基因与表达载体连接,转入重组枯草芽孢杆菌中。
在本发明的一种实施方式中,所述表达载体为pCut。
在本发明的一种实施方式中,所述枯草芽孢杆菌包括Bacillus subtilis WB600或Bacillus subtilis 168,Bacillus subtilis WB400,Bacillus subtilis WB800。
在本发明的一种实施方式中,所述重组枯草芽孢杆菌的构建方法具体如下:
本发明的第二个目的是提供一种高效分泌β-半乳糖苷酶的方法,所述方法是将所述重组芽孢杆菌接种至发酵培养基中,于37℃,200rpm培养60-96h。
在本发明的一种实施方式中,所述发酵培养基为TB培养基。
本发明还提供所述重组枯草芽孢杆菌在食品、医药、化工领域的应用。
有益效果:本发明与现有技术相比,本发明的特点:1、本发明的β-半乳糖苷酶lacZBa原为胞内酶,以食品准入的枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis WB600为宿主构建了表达β-半乳糖苷酶lacZBa的重组枯草芽孢杆菌,可使β-半乳糖苷酶lacZBa胞外分泌表达,并且发酵上清液中的酶活力达到5.3U·mL-1;2、本发明的β-半乳糖苷酶lacZBa在枯草杆菌表达***中并非通过经典分泌途径(Sec依赖的蛋白质分泌途径)或双精氨酸分泌途径(Tat依赖的蛋白质分泌途径)胞外分泌的,而是通过非经典分泌途径胞外分泌;3、本发明对比了在大肠杆菌表达***(Ec)和枯草杆菌表达***(Bs)中的β-半乳糖苷酶lacZBa(Ec)和lacZBa(Bs)的酶学性质的差异,lacZBa(Ec)和lacZBa(Bs)的最适pH分别为5.5和6.0,lacZBa(Bs)最适pH比lacZBa(Ec)低了0.5。lacZBa(Ec)和lacZBa(Bs)的最适温度分别为50℃和45℃,lacZBa(Bs)最适温度比lacZBa(Ec)高了5.0℃。lacZBa(Bs)的pH稳定性较lacZBa(Ec)明显提高,在不同pH条件下,其残余酶活均保持在65%以上。lacZBa(Ec)和lacZBa(Bs)在50℃下的半衰期分别为108h和36h,lacZBa(Bs)热稳定性较lacZBa(Ec)提高了3倍。
附图说明
图1是本发明中重组质粒pCut-lacZBa、pCut-SPphoD-lacZBa和pCut-SPamyE-lacZBa的质粒图谱示意图;
图2是本发明中SDS-PAGE分析Tat信号肽和Sec信号肽和无信号肽对β-半乳糖苷酶lacZBa在Bacillus subtilis WB600胞外分泌的影响示意图;
其中,M,蛋白质标准品;1、2、3,Bacillus subtilis WB600/pCut-lacZBa的发酵液上清、破细胞上清和破细胞沉淀;4、5、6,Bacillus subtilis WB600/pCut-SPphoD-lacZBa的发酵液上清、破细胞上清和破细胞沉淀;7、8、9,Bacillus subtilis WB600/pCut-SPamyE-lacZBa的发酵液上清、破细胞上清和破细胞沉淀;
图3是本发明中枯草芽孢杆菌表达***中蛋白质主要分泌途径示意图;
图4是本发明中通过SDS-PAGE分析比较lacZBa在大肠杆菌表达***和枯草芽孢杆菌表达***中的表达;M,蛋白质分子量标准;1.E.coli/pET24a(+)-lacZBa的破细胞沉淀;2.E.coli/pET24a(+)-lacZBa的破细胞上清;3.E.coli/pET24a(+)-lacZBa的发酵液上清;4.B.subtilis WB600/pCut-lacZBa的发酵液上清;5.B.subtilis WB600/pCut-lacZBa的破细胞上清;6.B.subtilis WB600/pCut-lacZBa的破细胞沉淀;
图5是本发明中在大肠杆菌表达***和枯草芽孢杆菌表达***中表达的β-半乳糖苷酶lacZBa(Ec)和lacZBa(Bs)的最适pH和pH稳定性的比较图;
图6是本发明中在大肠杆菌表达***和枯草芽孢杆菌表达***中表达的β-半乳糖苷酶lacZBa(Ec)和lacZBa(Bs)的最适温度和温度稳定性的比较图。
具体实施方式
下面结合附图及实施例对本发明作进一步的说明。
下述实施例中涉及的大肠杆菌E.coli JM109购自北京索莱宝科技有限公司,Bacillus subtilis WB600购自Novagen公司,质粒pCut由实验室保藏。
(上述菌株枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis WB600、大肠杆菌JM109均可以购买得到,不需要进行用于专利程序的保藏)。
下述实施例中涉及的培养基和溶液配制如下:
LB液体培养基:酵母粉5.0g·L-1、胰蛋白胨10.0g·L-1、NaCl 10.0g·L-1;
LB固体培养基:酵母粉5.0g·L-1、胰蛋白胨10.0g·L-1、NaCl 10.0g·L-1、琼脂粉15g·L-1;
TB培养基:甘油5.0g·L-1、胰蛋白胨12.0g·L-1、酵母粉24.0g·L-1、K2HPO4·3H2O16.4g·L-1、KH2PO4 2.3g·L-1;
10×最低盐溶液:K2HPO4·3H2O 1.834g·L-1,KH2PO4 0.6g·L-1,(NH4)2SO4 0.2g·L-1,Na3C6H5O7·2H2O 0.1g·L-1,MgSO4·7H2O 0.02g·L-1;
GMⅠ溶液:10×最低盐溶液10mL,50%葡萄糖1mL,5%酪蛋白0.4mL,10%酵母汁1mL,2mg·mL-1L-色氨酸2.5mL,无菌水42.5mL;
GMⅡ溶液:10×最低盐溶液10mL,50%葡萄糖1mL,5%酪蛋白0.08mL,10%酵母汁0.04mL,0.5M MgCl2 0.5mL,0.1M CaCl2 0.5mL,2mg·mL-1L-色氨酸0.5mL,无菌水87.5mL;
100×EGTA溶液:EGTA 0.111g·L-1。
下述实施例中涉及的检测方法如下:
β-半乳糖苷酶酶活的测定方法:
在试管中加入1.8mL 100mmol·L-1pH 6.0的磷酸缓冲液,再向反应体系中加入100μL的稀释不同梯度的β-半乳糖苷酶酶液,放入50℃的水浴锅中保温5min,分别向反应体系中加入100μL的oNPG溶液精确反应10min后,加入1mL预冷的1mol·L-1Na2CO3溶液中止反应并显色,于紫外分光光度计420nm处测定吸光值;
另取100μL oNPG溶液、1.8mL 100mmol·L-1pH 6.0的磷酸缓冲液和1mL 1mol·L-1的Na2CO3于50℃水浴中保温10min后,加入100μLβ-半乳糖苷酶酶液,此吸光值作为空白对照;
酶活的(U)定义为:在上述分析测定条件下,将每分钟催化产生1μmol oNP的酶量定义为一个酶活力单位(1U)。
实施例1:含有核苷酸序列如SEQ ID No.2所示的β-半乳糖苷酶基因的pCut-SPamyE-lacZBa表达载体的构建;
所述β-半乳糖苷酶lacZBa的基因序列如SEQ ID NO.2所示:
ATGTACATCGGCGTCGATTATTACCCTGAACATTGGCCAGAGAATATGATAGAAGAAGATATCCAAGGTATTAAAGAGTTAGGATCAAATATGGTGAGAATAGGGGAGTTCGCTTGGCATCTTATGGAGCCTAAAGAAGGGCAATATGACTTTTCTTTTTTTGATAGCGTTATCAATAAGCTTAAAAAACAGAATATTGACGTTATGTTTGGTACCCCTACTGCCACTTTTCCGGCTTGGCTTGCGAAGCAGCATCCTTCTATTTTATCAAAAGATGAAAATGGGGCGGTCAGAGCATTTGGAGGAAGACGTCAATATTGTTTTAATTCTCCTCTTTACCGGCAGTATAGCGCTCAGATTACAGAACAACTAGTAAAGCACTACTGCTCAGAAGAAGCAATCGTAGCATGGCAAGTTGACAATGAATTTGGCCATGAAGGCAGTGATATGTGTTACTGCGAACAATGTCATAAAGAGTTTCAGCAGTTTTTGGAAAGAAAATATAAAGATATTAATGAGTTAAATGAAAAGTATGGCACTATTTTCTGGGGACAAACGTATAACGACTTTACCGAAGTGCCTATGCCTGTAAAAACAATTACGACACACAGCCCTTCGTTAAAGCTAGACTGGGCCCGCTTTCGCTCTTTTTCGTTAAACAGATACGCTCACGAACAAACAGCGATTGTGAAGAAATATAAAGGTGATCACCAGCTGTTGACCACGAACGTATCAGGAGGCTTTTTTGATAAATGGTTCGATCATGAAGAAAACCTAGAAGTAATGGACTTTGTATCCTATGATAATTATCCGGTATGGGGCGGTCAAACAGAGCCAATTACCCCGGCTCATATTGCACTAGGTCATGATTTTAATAGAGGCTTGTTACATAAAAATTTCTGGATTGTAGAGGAATTAATGGGTGCTCAAGGTCATGATATCATCGGTTATCTACCGCGACCTAATCAGGCAAAAATGTGGTCTTATCAAGCTTTTGCTCATGGATGCACGAATATGCTGTATTTTCGCTGGCGCGGAATGACAAGAGGAGCTGAGCAATACTGCTACGGAATTGTAGGTCACGATAATCACTATGGAAAACGTTACAAAGAAGTTCAGTCGTTATTTAGTGAAATCGTTCATTACGAACATGTGCTTGAGTCTGATATTAAATCGGAGATTGCCGTTTTATATGACTATGAAAATATATGGTCATGGCGTTTTCAGCAGCAAAGTGAAGGGTTTGACTTTACGGAAGAGCTTCTTAGAGGGTATACACCGTTTTATAAGTTGAATACACCTATTGATGTTATTCCTGCTACAAGAGATTTTTCAAGCTATAAAGTACTGGTTGTTCCGGCTTTGCAAATCATTGATAAAGAACTAGGTAAAAGATTTACTGAATTTACTGAAAACGGAGGCGTCATCGTTTTTACGTTTAGAACCGGCATTAAAGACAAACAAAATAATATTCACTTTAAACAGACGCTGCCCGGATATGTAAAAGAAATAACAGGGATTGAAATTCATGAAGTGGAAGCACTGTCTTCTACTCAAAAAGCAGCTATTAAAGGAAAAGGACCGTATGAAGGAGAACAAGCAAGTGCGTCCGTGTGGAGAGACATTATCACACCTGTAACAGCTGAAGTGCTGTATGAGTATGATGATCCATTTTATAATCAAGCGGCTGTAACAAAAAATCAGTTTGGTCGCGGGACGGTCTATTATGTAGGCTGTGGAATTGAAGGGCAAACGTTTGAAAAAATGGCGCTTGATATTGTAAAACAGCAGCAGATTGAGCATACGGAAAGTGAAGATGGAGTTGAAGTATATCCTCGCAAGCTTGGAGAGACAAGTTATTACTTCCTTATGAACCATACGCCAGAAGTAAAAGTATTTAAAGATATTGTTCTGCAGCCTTACGAAAGTCGAGTTGTAGAAAACATGTAG;
所述β-半乳糖苷酶基因(SEQ ID NO.2)编码的β-半乳糖苷酶蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示:
MYIGVDYYPEHWPENMIEEDIQGIKELGSNMVRIGEFAWHLMEPKEGQYDFSFFDSVINKLKKQNIDVMFGTPTATFPAWLAKQHPSILSKDENGAVRAFGGRRQYCFNSPLYRQYSAQITEQLVKHYCSEEAIVAWQVDNEFGHEGSDMCYCEQCHKEFQQFLERKYKDINELNEKYGTIFWGQTYNDFTEVPMPVKTITTHSPSLKLDWARFRSFSLNRYAHEQTAIVKKYKGDHQLLTTNVSGGFFDKWFDHEENLEVMDFVSYDNYPVWGGQTEPITPAHIALGHDFNRGLLHKNFWIVEELMGAQGHDIIGYLPRPNQAKMWSYQAFAHGCTNMLYFRWRGMTRGAEQYCYGIVGHDNHYGKRYKEVQSLFSEIVHYEHVLESDIKSEIAVLYDYENIWSWRFQQQSEGFDFTEELLRGYTPFYKLNTPIDVIPATRDFSSYKVLVVPALQIIDKELGKRFTEFTENGGVIVFTFRTGIKDKQNNIHFKQTLPGYVKEITGIEIHEVEALSSTQKAAIKGKGPYEGEQASASVWRDIITPVTAEVLYEYDDPFYNQAAVTKNQFGRGTVYYVGCGIEGQTFEKMALDIVKQQQIEHTESEDGVEVYPRKLGETSYYFLMNHTPEVKVFKDIVLQPYESRVVENM;
表达载体的构建具体步骤如下:
设计并化学合成一段核苷酸序列如SEQ ID No.2所示的β-半乳糖苷酶基因,根据合成的β-半乳糖苷酶基因设计引物F1和R1:
F1:5’-CGAATGAGCTTACAGATGTACATCGGCGTC GATT-3’(SEQ ID No.3);
R1:5’-GGTTATGCTAGAAGCTTCTACATGTTTTCTACAACTCGACT-3’(SEQ ID No.4);
PCR反应体系为:10×buffer 5μL,dNTPsMix(2.5mM)4μL,正向引物(10μM)1μL,反向引物(10μM)1μL,B.aryabhattai Gel-09基因组模板DNA 1μL,Taq plus DNA聚合酶(5U/μL)1μL,加入双蒸水至50μL;PCR扩增条件为:94℃预变性4min;随后进行30个循环(94℃30s,56℃30s,72℃2min);72℃继续延伸20min;收集PCR产物进行胶回收;
根据质粒pCut上下游序列设计一对引物F2和R2:
F2:5’-AAGCTTCTAGCATAACCCCTTG-3’(SEQ ID No.5);
R2:5’-CTGTAAGCTCATTCGATTTGTTCG-3’(SEQ ID No.6);
PCR反应体系为:10×buffer 5μL,dNTPsMix(2.5mM)4μL,正向引物(10μM)1μL,反向引物(10μM)1μL,质粒模板DNA 1μL,Taq plus DNA聚合酶(5U/μL)1μL,加入双蒸水至50μL;PCR扩增条件为:94℃预变性4min;随后进行30个循环(94℃30s,56℃30s,72℃6min20s);72℃继续延伸20min;向反应产物中加入2μL DpnⅠ,枪头吹吸进行混匀,于37℃条件下反应1.5-2h,然后进行胶回收;
将基因lacZBa胶回收片段与表达载体pCut-SPamyE胶回收片段进行连接后,转化E.coli JM109,涂布到含有终浓度100μg·mL-1氨苄青霉素抗性的LB平板,37℃培养10-12h,挑取转化子,提取重组质粒并测序验证;最终,测序正确的重组质粒即为pCut-SPamyE-lacZBa(见图1)。
实施例2:含有核苷酸序列如SEQ ID No.2所示的β-半乳糖苷酶基因的pCut-SPphoD-lacZBa表达载体的构建
具体步骤如下:
含有β-半乳糖苷酶基因lacZBa(SEQ ID No.2)的重组质粒pCut-SPamyE-lacZBa上下游序列设计一对引物:
F3:5’-ATGCTGCGATGTACATCGGCGTCGATT-3’(SEQ ID No.7);
R1:5’-AATAAATCCCCCTTTTTGAAAATAC-3’(SEQ ID No.8);
PCR反应体系为:10×buffer 5μL,dNTPsMix(2.5mM)4μL,正向引物(10μM)1μL,反向引物(10μM)1μL,pCut-SPamyE-lacZBa质粒模板DNA 1μL,Taq plus DNA聚合酶(5U/μL)1μL,加入双蒸水至50μL;PCR扩增条件为:94℃预变性4min;随后进行30个循环(94℃30s,56℃30s,72℃2min);72℃继续延伸20min;向反应产物中加入2μL DpnⅠ,枪头吹吸进行混匀,于37℃条件下反应1.5-2h,进行胶回收,得到片段A;
以B.subtilis 168基因组DNA为模板,根据SPphoD基因片段的上下游序列设计一对引物F4和R4:
F4:5’-AGGGGGATTTATTATGGCATACGACAGTCGTTT-3’(SEQ ID No.9);
R4:5’-GACGCCGATGTACATCGCAGATTTACTTCAAAGGC-3’(SEQ ID No.10);
PCR反应体系为:10×buffer 5μL,dNTPsMix(2.5mM)4μL,正向引物(10μM)1μL,反向引物(10μM)1μL,B.subtilis 168基因组模板DNA 1μL,Taq plus DNA聚合酶(5U/μL)1μL,加入双蒸水至50μL;PCR扩增条件为:94℃预变性4min;随后进行30个循环(94℃30s,56℃30s,72℃15s);72℃继续延伸20min;收集PCR产物进行胶回收,得到片段B;
将胶回收片段A与胶回收片段B进行连接后,转化E.coli JM109,涂布到含有终浓度100μg·mL-1氨苄青霉素抗性的LB平板,37℃培养10-12h,挑取转化子,提取重组质粒并测序验证;最终,测序正确的重组质粒即为pCut-SPphoD-lacZBa(见图1)。
实施例3:含有核苷酸序列如SEQ ID No.2所示的β-半乳糖苷酶基因的pCut-lacZBa表达载体的构建
具体步骤如下:
以B.aryabhattai Gel-09基因组为模板,根据β-半乳糖苷酶基因(SEQ ID No.2)上下游序列设计一对引物F6和R1,如下:
F6:5’-AGGGGGATTTATTATGTACATCGGCGTCGATT-3’(SEQ ID No.11);
R1:5’-GGTTATGCTAGAAGCTTCTACATGTTTTCTACAACTCGACT-3’(SEQ ID No.4)
PCR反应体系为:10×buffer 5μL,dNTPsMix(2.5mM)4μL,正向引物(10μM)1μL,反向引物(10μM)1μL,B.aryabhattai Gel-09基因组模板DNA 1μL,Taq plus DNA聚合酶(5U/μL)1μL,加入双蒸水至50μL;PCR扩增条件为:94℃预变性4min;随后进行30个循环(94℃30s,56℃30s,72℃2min);72℃继续延伸20min;收集PCR产物进行胶回收。
根据质粒pCut上下游序列设计一对引物F2和R2:
F2:5’-ATAATAAATCCCCCTTTTTGAAAATA-3’(SEQ ID No.12);
R2:5’-AAGCTTCTAGCATAACCCCTTG-3’(SEQ ID No.13);
PCR反应体系为:10×buffer 5μL,dNTPsMix(2.5mM)4μL,正向引物(10μM)1μL,反向引物(10μM)1μL,质粒模板DNA 1μL,Taq plus DNA聚合酶(5U/μL)1μL,加入双蒸水至50μL;PCR扩增条件为:94℃预变性4min;随后进行30个循环(94℃30s,56℃30s,72℃6min20s);72℃继续延伸20min;向反应产物中加入2μL DpnⅠ,枪头吹吸进行混匀,于37℃条件下反应1.5-2h,然后进行胶回收;
将基因lacZBa胶回收片段与表达载体pCut胶回收片段进行连接后,转化E.coliJM109,涂布到含有终浓度100μg·mL-1氨苄青霉素抗性的LB平板,37℃培养10-12h,挑取转化子,提取重组质粒并测序验证;最终,测序正确的重组质粒即为pCut-lacZBa(见图1)。
实施例4:重组质粒pCut-SPamyE-lacZBa、pCut-SPphoD-lacZBa和pCut-lacZBa转化枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis WB600
(1)、用接种环沾取冻存的枯草芽孢杆菌,然后在LB固体平板上划线,37℃培养过夜活化;
(2)、挑取单菌落接种于10mL GMⅠ液体培养基中,37℃过夜培养18h,测定光密度值OD600用于计算步骤(3)中的接种量;
(3)、取一定量的过夜培养物,接种到4.5mL的GMⅠ液体培养基中,37℃,200rpm振荡培养4-5h;
(4)、吸取1mL菌液(步骤3中)至含有9mL预热的GMⅡ的液体培养基中,37℃,200rpm,振荡1.5h;
(5)、向上述培养菌液中加入100μL 100×EGTA溶液,37℃,100rpm,振荡10min;此时培养物中有很多感受态细胞形成;
(6)、5000rpm离心10min,缓慢弃掉上清,收集菌体;用1mL GMⅡ的液体培养液轻轻悬浮,分装成0.5mL/管,即为感受态细胞;
重组质粒转化枯草芽孢杆菌感受态细胞:
(1)、利用Nanodrop分别测定pCut-SPamyE-lacZBa,pCut-SPphoD-lacZBa,pCut-lacZBa的质粒浓度,用于计算下一步所加质粒量;
(2)、向3管感受态细胞中分别加入1μg的pCut-SPamyE-lacZBa,pCut-SPphoD-lacZBa,pCut-lacZBa重组质粒,37℃,100rpm振荡培养30min,再200rpm振荡培养60min;
(3)、4000rpm离心5min,离心去除大部分的上清液,重悬细胞,涂在含有终浓度30μg·mL-1的四环素的筛选平板上,37℃培养过夜,挑取阳性克隆子并保存甘油管,最终获得含有目的基因的基因工程菌B.subtilis WB600/pCut-SPamyE-lacZBa,B.subtilis WB600/pCut-SPphoD-lacZBa,B.subtilis WB600/pCut-lacZBa。
实施例5:摇瓶发酵产酶
将实施例4中得到的重组枯草芽孢杆菌菌株接种于LB培养基中,在37℃下培养8h后以5%接种量转接至TB发酵培养基(均含有终浓度30μg·mL-1的四环素)中,放至37℃、200rpm恒温培养60-96h产酶。发酵结束后,离心收集上清液即为粗酶液;
对粗酶液中的酶活进行测定,结果显示,在含有SPamyE信号肽的重组枯草芽孢杆菌B.subtilis WB600/pCut-SPamyE-lacZBa的发酵液中没有检测到lacZBa活性;在含有SPphoD信号肽的重组枯草芽孢杆菌B.subtilis WB600/pCut-SPphoD-lacZBa发酵液中,发酵72h后,上清液中β-半乳糖苷酶酶活仅为0.54U·mL-1;而在不含有任何信号肽的重组枯草芽孢杆菌B.subtilis WB600/pCut-lacZBa的发酵液上清中的β-半乳糖苷酶酶活力为5.3U·mL-1;重组枯草芽孢杆菌B.subtilis WB600/pCut-lacZBa胞外β-半乳糖苷酶活力是含有SPphoD信号肽重组菌株所产胞外酶活力的9.8倍,实现了天然胞内β-半乳糖苷酶胞外的高效分泌(见图2和表1)。
与大肠杆菌相比,枯草芽孢杆菌具有更强的蛋白胞外分泌能力;如图3,在枯草芽孢杆菌表达***中至少有四种不同的蛋白质分泌途径,其中,Sec分泌途径是最主要的分泌途径;Tat分泌途径是枯草芽孢杆菌中另一种重要的蛋白质分泌途径;Sec分泌途径和Tat分泌途径均需要相应的信号肽参与,而在本发明中,lacZBa在存在信号肽时会抑制其分泌表达,因此lacZBa可能通过涉及非经典分泌途径的类似机制分泌。
表1三种不同分泌途径lacZBa产量的比较
将实验室保藏的重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/pET24a-lacZBa接种于LB培养基中,在37℃下培养8h后以5%接种量转接至TB发酵培养基(含有终浓度50μg·mL-1的卡那霉素)中,先放至37℃、200rpm恒温培养3h,再加入0.2mmol·L-1IPTG于30℃、200rpm继续培养36h产酶;发酵结束,离心收集发酵上清和细胞沉淀,细胞沉淀用磷酸缓冲液悬浮后进行细胞破碎,再离心收集细胞破碎上清和沉淀(见图4)。
实施例6:氨基酸序列如SEQ ID No.1所示的β-半乳糖苷酶在大肠杆菌表达***和枯草芽孢杆菌表达中酶学性质的比较研究
具体步骤如下:
(1)、氨基酸序列如SEQ ID No.1所示的β-半乳糖苷酶的最适pH及pH稳定性
在不同的pH(pH 4.5-8.0)条件下,每隔0.5个单位设置一个点测定β-半乳糖苷酶酶活力,以确定重组β-半乳糖苷酶的最适pH。测定的最高酶活力定为100%,计算其他pH条件下的相对酶活(检测结果见图5a);为了研究重组β-半乳糖苷酶的pH稳定性,将酶液分别在pH 4.5-8.0的缓冲体系下于4℃保存24h,测定其残余酶活,定义初始酶活力为100%(检测结果见图5b);
如图5a所示,在大肠杆菌中表达的β-半乳糖苷酶lacZBa(Ec)最适pH为6.0,在枯草芽孢杆菌中表达的β-半乳糖苷酶lacZBa(Bs)最适pH为5.5;如图5b所示,在对比了两者pH稳定性后发现,β-半乳糖苷酶lacZBa(Bs)较lacZBa(Ec)的pH稳定性明显增强,其在不同pH条件下的残余酶活均在65%以上;
(2)、氨基酸序列如SEQ ID No.1所示的β-淀粉酶的最适温度及温度稳定性
在不同的pH(pH 4.5-8.0)条件下,每隔0.5个单位设置一个点测定β-半乳糖苷酶酶活力,以确定重组β-半乳糖苷酶的最适pH;测定的最高酶活力定为100%,计算其他pH条件下的相对酶活(检测结果见图6a);为了研究重组β-半乳糖苷酶的pH稳定性,将酶液分别在pH 4.5-8.0的缓冲体系下于4℃保存24h,测定其残余酶活,定义初始酶活力为100%(检测结果见图6b);
如图6a所示,在大肠杆菌中表达的β-半乳糖苷酶lacZBa(Ec)的最适温度为45℃,在枯草芽孢杆菌中表达的β-半乳糖苷酶lacZBa(Bs)的最适温度为50℃;如图6b,lacZBa(Bs)在50℃下的半衰期为108h,其热稳定性较lacZBa(Ec)明显提高,说明在枯草芽孢杆菌表达***中的β-半乳糖苷酶更耐热,这可能是由于枯草芽孢杆菌具有更加完善的蛋白折叠机制,所表达蛋白折叠更好,从而具有更好的稳定性。
以上所述,仅为本发明的具体实施方式,但本发明的保护范围并不局限于此,任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内,可轻易想到变化或替换,都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此,本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。
Claims (7)
1.一种使用重组枯草芽孢杆菌分泌天然胞内β-半乳糖苷酶的方法,其特征在于,所述β-半乳糖苷酶lacZBa的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示;其基因序列如SEQ ID NO.2所示。
2.根据权利要求1所述的一种使用重组枯草芽孢杆菌分泌天然胞内β-半乳糖苷酶的方法,其特征在于,
所述重组枯草芽孢杆菌的构建方法是:将SEQ ID NO.2所示的编码β-半乳糖苷酶lacZBa的基因与表达载体连接,转入至重组枯草芽孢杆菌中。
3.根据权利要求2所述的一种使用重组枯草芽孢杆菌分泌天然胞内β-半乳糖苷酶的方法,其特征在于,
所述表达载体为pCut。
4.根据权利要求2所述的一种使用重组枯草芽孢杆菌分泌天然胞内β-半乳糖苷酶的方法,其特征在于,
所述重组枯草芽孢杆菌包括Bacillus subtilis WB600或Bacillus subtilis 168,Bacillus subtilis WB400,Bacillus subtilis WB800。
5.根据权利要求1或2所述的一种使用重组枯草芽孢杆菌分泌天然胞内β-半乳糖苷酶的方法,其特征在于,
以重组枯草芽孢杆菌为宿主,以pCut为表达载体,表达氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的B.aryabhattai Gel-09来源的天然胞内β-半乳糖苷酶。
6.根据权利要求5所述的一种使用重组枯草芽孢杆菌分泌天然胞内β-半乳糖苷酶的方法,其特征在于,具体操作方法如下:将所述重组芽孢杆菌接种至发酵培养基中,于37℃,200rpm中培养60-96h。
7.根据权利要求6所述的一种使用重组枯草芽孢杆菌分泌天然胞内β-半乳糖苷酶的方法,其特征在于,
所述发酵培养基为TB培养基。
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