CN114874949B - 一种丁酸梭菌、其发酵物、包含其的菌剂及动物饲料添加剂 - Google Patents

一种丁酸梭菌、其发酵物、包含其的菌剂及动物饲料添加剂 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种丁酸梭菌、其发酵物、包含其的菌剂及动物饲料添加剂，所述丁酸梭菌命名为丁酸梭菌(Clostridium butyricum)DS20菌株，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2022581，保藏日期为2022年5月10日，保藏地址为中国，武汉，武汉大学。所述丁酸梭菌产酸量高，在肠液中有较好的生长适应能力及发酵产酸能力，具有优异的耐酸性、耐胆盐性和耐热能力，将所述丁酸梭菌用作动物饲料添加剂，可显著改善动物肠道健康并提高饲料利用率。

Description

一种丁酸梭菌、其发酵物、包含其的菌剂及动物饲料添加剂
技术领域
本发明属于微生物技术领域，涉及丁酸梭菌、其发酵物、包含其的菌剂及动物饲料添加剂。
背景技术
畜禽用抗菌药品自投入使用以来，畜禽养殖行业得到了快速的发展。养殖成活率不断提高，养殖周期逐渐缩短，养殖收入日益增高。然而，抗生素等添加剂的使用在给我们带来便利的同时也催生了许多新的问题。近几年，养殖业由于抗生素的误用、滥用导致细菌耐药性，受到各界广泛关注。畜牧业要实现可持续发展，抗生素在饲料中的限用和禁用成为必然趋势。因此，饲料减抗、替抗，逐渐成为了畜牧业关注的焦点，其中，微生态制剂在保障畜禽健康方面的作用日益显著，受到了广泛的关注。
微生态制剂又称活菌剂、生菌剂，是指用动物体内正常的有益微生物经特殊工艺而制成的活菌剂。这是我国生物学、医学、兽医学等领域的科学家，针对当前市场名词术语繁多，为了统一定义，于1988年全国微生态学会上，经过反复讨论而提出的新概念，这是一个综合性的概念，其中包括微生物生长促进剂和益生素。微生态制剂是根据动物微生态学原理应用生物技术生产培养的高效生物制剂，其中通常含有一种或多种动物肠道内有益菌。它通过补充动物肠道内的正常菌群，来抑杀肠道内有害菌，阻止外源致病菌进肠道内，从而防止肠道感染性疾病的发生。
丁酸梭菌是一种重要的益生菌，主要存在健康人和动物的肠道中，在天然酸奶、奶酪、树叶以及土壤中也有发现，我国学者曾经在酒曲、窖泥中也分离到该菌。丁酸梭菌属于厌氧菌，在厌氧条件下培养可以产生短链脂肪酸，其产生的短链脂肪酸主要是丁酸、乙酸，还有甲酸、丙酸等短链脂肪酸丁酸只在结肠中合成，是肠道上皮细胞的主要的营养物质，对肠道上皮细胞具有修复和再生的作用，同时丁酸梭菌在肠内可以合成维生素类物质具有促进有益菌的生长的保健作用；丁酸梭菌在培养过程中还能向环境中分泌各种消化酶类，包括能够降解植物饲料中的非淀粉多糖酶类，这些酶类能够降解和利用畜禽类动物食物中难以消化利用的营养物质，以此来提高饲料的利用效率，降低料肉比和饲料使用成本，提高畜禽的养殖效益。
丁酸梭菌帮助动物建立肠道健康屏障。丁酸梭菌作为益生菌制剂中的一种，不仅可以具有抑制肠道有害菌群的生长作用，同时还能够促进有益菌群的增殖。研究发现，丁酸梭菌与大肠杆菌、伤寒杆菌、痢疾杆菌、艰难梭菌、霍乱弧菌等有害菌共同培养时均可显现出明显的抑制或拮抗作用。其作用机理可归结为丁酸梭菌等益生菌产生的非特异性短链脂肪酸和过氧化物以及其代谢产生的特异性的细菌素，可以抑制或杀死这类潜在的致病菌。而有益菌群的大量繁殖能够在肠道形成保护膜，用来抵御有害菌的入侵与定增，以此来修复与重建肠道微生物保护屏障。
动物肠道内，环境复杂，营养组成复杂，普通丁酸梭菌在动物肠道中生长、繁殖、产酸受到一定限制。因此，开发一种对环境要求低或营养需求低，产酸量高的菌株，将其制成菌剂作为微生态制剂应用于畜禽养殖行业，十分必要。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种丁酸梭菌、其发酵物、包含其的菌剂及动物饲料添加剂。
为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供一种丁酸梭菌，所述丁酸梭菌命名为丁酸梭菌(Clostridium butyricum)DS20菌株，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2022581，保藏日期为2022年5月10日，保藏地址为中国，武汉，武汉大学。
第二方面，本发明提供一种丁酸梭菌发酵物，所述丁酸梭菌发酵物由包括如下步骤的方法制备得到：
(1)培养权利要求1所述的丁酸梭菌，得到种子液；
(2)将种子液接种于发酵培养基中进行发酵培养，得发酵液，离心，收集菌泥，即得所述丁酸梭菌发酵物。
优选地，步骤(1)所述培养为厌氧培养。
优选地，步骤(1)所述培养的温度为35-39℃，例如35℃、35.5℃、36℃、 36.5℃、37℃、37.5℃、38℃、38.5℃、39℃等，所述培养的时间为16-32h，例如16h、18h、20h、22h、24h、26h、28h、30h、32h等。
优选地，步骤(1)所述培养是指用RCM培养基进行培养。
优选地，步骤(2)所述发酵培养为厌氧培养。
优选地，步骤(2)所述发酵培养的温度为35-39℃，例如35℃、35.5℃、 36℃、36.5℃、37℃、37.5℃、38℃、38.5℃、39℃等，所述发酵培养的时间为 16-32h，例如16h、18h、20h、22h、24h、26h、28h、30h、32h等。
优选地，步骤(2)所述发酵培养基中包含葡萄糖、蛋白胨、酵母浸膏、牛肉浸膏、玉米淀粉、乙酸钠、碳酸钙、磷酸氢二钾或硫酸镁中的任意一种或至少两种的组合，所述至少两种的组合例如葡萄糖和蛋白胨的组合、酵母浸膏和牛肉浸膏的组合、乙酸钠和碳酸钙的组合等，其他任意的组合方式均可。
优选地，步骤(2)所述发酵培养基中的组分以质量百分含量计包括葡萄糖0.5％-2.5％、蛋白胨0.2％-1.6％、酵母浸膏1％-5％、牛肉浸膏1％-5％、玉米淀粉0.2％-2.5％、乙酸钠0.1％-1％、碳酸钙0.1％-0.8％、磷酸氢二钾0.02％-0.3％和硫酸镁0.01％-0.2％，余量为水。
上述(0.5％-2.5％)中的具体数值例如0.5％、0.7％、1％、1.2％、1.5％、1.7％、2％、2.2％、2.5％等。
上述(0.2％-1.6％)中的具体数值例如0.2％、0.4％、0.6％、0.8％、1％、1.2％、1.4％、1.6％等。
上述(1％-5％)中的具体数值例如1％、1.5％、2％、2.5％、3％、3.5％、4％、4.5％、5％等。
上述(0.2％-2.5％)中的具体数值例如0.2％、0.5％、0.7％、1％、1.2％、1.5％、1.7％、2％、2.2％、2.5％等。
上述(0.1％-1％)中的具体数值例如0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1％等。
上述(0.1％-0.8％)中的具体数值例如0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％等。
上述(0.02％-0.3％)中的具体数值例如0.02％、0.05％、0.07％、0.1％、0.15％、0.2％、0.25％、0.3％等。
上述(0.01％-0.2％)中的具体数值例如0.01％、0.03％、0.05％、0.07％、0.1％、0.13％、0.15％、0.17％、0.2％等。
优选地，在步骤(2)中，当发酵培养9-11h时，补加葡萄糖。
优选地，葡萄糖的补加量为发酵培养基中初始葡萄糖质量的0.8-1.2倍。
优选地，在步骤(2)中，当发酵培养11-13h时，补加牛肉浸膏和酵母浸膏。
优选地，牛肉浸膏的补加量为发酵培养基中初始牛肉浸膏质量的0.4-0.8倍，酵母浸膏的补加量为发酵培养基中初始酵母浸膏质量的0.1-0.4倍。
本发明在发酵培养过程中的特定时间补加适量的葡萄糖、牛肉浸膏和酵母浸膏，显著促进了丁酸梭菌的增殖。
优选地，步骤(2)所述发酵培养后还包括将发酵液升温至65-75℃，并维持5-15min，以杀灭非芽孢形态菌体，然后冷却至15-40℃。
上述(9-11h)中的具体数值例如9h、9.2h、9.5h、9.7h、10h、10.2h、 10.5h、10.7h、11h等。
上述(0.8-1.2倍)中的具体数值例如0.8倍、0.85倍、0.9倍、0.95倍、1 倍、1.05倍、1.1倍、1.15倍、1.2倍等。
上述(11-13h)中的具体数值例如11h、11.2h、11.5h、11.7h、12h、12.2 h、12.5h、12.7h、13h等。
上述(0.4-0.8倍)中的具体数值例如0.4倍、0.45倍、0.5倍、0.55倍、0.6 倍、0.65倍、0.7倍、0.75倍、0.8倍等。
上述(0.1-0.4倍)中的具体数值例如0.1倍、0.15倍、0.2倍、0.25倍、0.3 倍、0.35倍、0.4倍等。
上述(65-75℃)中的具体数值例如65℃、66℃、67℃、68℃、69℃、70℃、 71℃、72℃、73℃、74℃、75℃等。
上述(5-15min)中的具体数值例如5min、6min、7min、8min、9min、 10min、11min、12min、13min、14min、15min等。
上述(15-40℃)中的具体数值例如15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃等。
第三方面，本发明提供一种丁酸梭菌菌剂，所述丁酸梭菌菌剂的制备原料包括如第一方面所述的丁酸梭菌和/或如第二方面所述的丁酸梭菌发酵物，还包括辅料。
优选地，所述辅料包括麦芽糊精和/或玉米淀粉。
优选地，所述麦芽糊精与玉米淀粉的质量比为1:(1-4)。
上述(1-4)中的具体数值例如1、1.5、2、2.5、3、3.5、4等。
优选地，所述丁酸梭菌菌剂由包括如下步骤的方法制备得到：
将如第一方面所述的丁酸梭菌和/或如第二方面所述的丁酸梭菌发酵物与辅料混合，喷雾干燥，即得。
优选地，所述喷雾干燥中，进风温度为135-145℃，例如135℃、136℃、 137℃、138℃、139℃、140℃、141℃、142℃、143℃、145℃等。
优选地，所述喷雾干燥中，进料流量为13.25-15.35mL/min，例如13.25 mL/min、13.5mL/min、13.75mL/min、14mL/min、14.25mL/min、14.5mL/min、 14.75mL/min、15mL/min、15.35mL/min等。
第四方面，本发明提供一种复合菌剂，所述复合菌剂包括如第一方面所述的丁酸梭菌、如第二方面所述的丁酸梭菌发酵物或如第三方面所述的丁酸梭菌菌剂中的任意一种或至少两种的组合；
所述复合菌剂还包括其他菌株及其发酵物，所述其他菌株包括粪肠球菌、植物乳杆菌、凝结芽孢杆菌或枯草芽孢杆菌中的任意一种或至少两种的组合，所述至少两种的组合例如粪肠球菌和植物乳杆菌的组合、植物乳杆菌和凝结芽孢杆菌的组合、凝结芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌的组合等，其他任意的组合方式均可。
优选地，所述其他菌株包括粪肠球菌ATCC 29212和植物乳杆菌CICC 6009。
优选地，在所述复合菌剂中，所述丁酸梭菌、粪肠球菌ATCC 29212与植物乳杆菌CICC 6009的活菌数之比为(3-5):(1-3):1。
上述(3-5)中的具体数值例如3、3.2、3.5、3.7、4、4.2、4.5、4.7、5等。
上述(1-3)中的具体数值例如1、1.2、1.5、1.7、2、2.2、2.5、2.7、3等。
第五方面，本发明提供一种动物饲料添加剂，所述动物饲料添加剂包括如第一方面所述的丁酸梭菌、如第二方面所述的丁酸梭菌发酵物、如第三方面所述的丁酸梭菌菌剂或如第四方面所述的复合菌剂中的任意一种或至少两种的组合。
优选地，所述动物包括畜禽类动物。
本发明所述的数值范围不仅包括上述列举的点值，还包括没有列举出的上述数值范围之间的任意的点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明首先分离筛选得到出发菌株，然后对其进行紫外诱变处理，得到50 株候选菌株，并从中筛选出了丁酸梭菌DS20，其产酸量高(5％以上)，在肠液中有较好的生长适应能力及发酵产酸能力，具有优异的耐酸性(1％的盐酸溶液 37℃处理1h后，存活率达94％以上)、耐胆盐性(0.15％的胆盐溶液处理3h 后存活率达97％以上)及耐热能力(经过90℃水浴10分钟，存活率达98％以上)，将其用作动物饲料添加剂，可显著改善动物肠道健康并提高饲料利用率(抑制病原菌，降低腹泻率，改善料重比)。
此外，当丁酸梭菌DS20、粪肠球菌ATCC 29212和植物乳杆菌CICC 6009 进行组合时，三种菌株相互配合，在改善动物肠道健康、提高饲料利用率方面取得了意料不到的协同增效的功效。
具体实施方式
为更进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合本发明的优选实施例来进一步说明本发明的技术方案，但本发明并非局限在实施例范围内。
以下实施例中，若无特殊说明，所以的试剂及耗材均购自本领域常规试剂厂商；若无特殊说明，所用的实验方法和技术手段均为本领域常规的方法和手段。
本发明所述丁酸梭菌DS20的16S rDNA序列见SEQ ID No:1：
SEQ ID No:1：
GGCTCAGGACGAACGCTGGCGGCGTGCTTAACACATGCAAGTCGAG CGATGAAGTTCCTTCGGGAATGGATTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCTCATAGAGGGGAATAGCCTTTCGAAAGGAAGATTAATA CCGCATAAGATTGTAGTGCCGCATGGCATAGCAATTAAAGGAGTAATCCGCTATGAGATGGACCCGCGTCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACC AAGGCGACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACATTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGC ACAATGGGGGAAACCCTGATGCAGCAACGCCGCGTGAGTGATGACGGTCTTCGGATTGTAAAGCTCTGTCTTCAGGGACGATAATGACGGTACCTGAGGA GGAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGATTTACTGGGCGTAAAGGGAGCGTAGGTGGATATTTAA GTGGGATGTGAAATACTCGGGCTTAACCTGGGTGCTGCATTCCAAACTGGATATCTAGAGTGCAGGAGAGGAAAGTAGAATTCCTAGTGTAGCGGTGAAA TGCGTAGAGATTAGGAAGAATACCAGTGGCGAAGGCGACTTTCTGGACTGTAACTGACACTGAGGCTCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACC CTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAATACTAGGTGTAGGGGTTGTCATGA CCTCTGTGCCGCCGCTAACGCATTAAGTATTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGATTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCAGCGGAG CATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAA.GAACCTTACCTAGACTTGACATCTCCTGAATTACCCTTAATCGGGGAAGCCCTTCGGGGCAGGAAGACAGGT GGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATTGTTAGTTGCTACCATTTAGTTGAGCACTCTAG CGAGACTGCCCGGGTTAACCGGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGTCTAGGGCTACACACGTGCTACAATGGCTGGTACAGA GAGATGCTAAACCGTGAG,GTGGAGCCAAACTTTAAAACCAGTCTCAGTTCGGATTGTAGGCTGAAACTCGCCTACATGAAGCTGGAGTTGCTAGTAATCG CGAATCAGAATGTCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCC CGTCACACCATGAGAGTTGGCAATACCCAAAGTTCGTGAGCTAACGCGCAAGCGGGGCAGCGACCTAAGGTAGGGTCAGCGATTGGGGTGAAGTCGT。
实施例1-分离菌株
在江苏邳州丰源猪场选一头60日龄健康仔猪宰杀，取其盲肠肠道内容物，将肠道内容物于80℃水浴5分钟，后将水浴后的样品装入无菌管中，放入冰盒，带回实验室。在超净台中，挑取一环上述经80℃水浴后肠道内容物，接种于RCM 液体培养基，厌氧环境下，37℃培养24小时，富集培养丁酸梭菌。各挑取上述富集培养液，在RCM培养基上划线20块平板，放入密封盒中，加入厌氧袋， 37℃培养24小时。
在RCM平板上分别挑取呈白色或乳白色或灰白色，圆形，边缘不规则，湿润，中间无凸起，菌落边缘较中间稍薄的菌落，进行标记，分别进行革兰氏染色(革兰氏阳性)，显微镜下观察菌体形态呈梭状或杆状，共得到8株疑似菌株，重新编号为1#、2#、3#、4#、5#、6#、7#、8#。
分别挑取上述8株菌株平板菌落在RCM平板上纯化，划线分离，37℃培养24小时，得到纯化菌落。重复上述操作，进行二次纯化。挑取各菌菌落，分别接种葡萄糖、果糖、麦芽糖、淀粉、鼠李糖、肌醇、明胶、石蕊牛乳、过氧化氢酶等微量生化反应管中，放入37℃培养箱，恒温培养24小时后观察结果。根据细菌生化鉴定管的说明书(伯杰细菌鉴定手册)，丁酸梭菌的反应结果应为能够利用葡萄糖、果糖、麦芽糖等糖类作为碳源，均能够水解淀粉，但是均不能利用松三糖、鼠李糖，不能水解明胶，但均能够发酵牛乳使其产酸、凝固，具有运动性，过氧化氢酶阴性。
经鉴定，编号为1#和3#的菌株符合上述要求。
分别提取编号为1#和3#的菌株的基因组，采用16S rDNA细菌通用引物进行扩增(引物27F：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG，SEQ ID No:2；1492R： GGTTACCTTGTTACGACTT，SEQ IDNo:3)，通过16S rDNA对比分析，确定编号为1#的菌株为丁酸梭菌，作为出发菌株。
实施例2-菌株的紫外诱变处理及筛选
将纯化后的1#菌落，按照以下步骤处理：
(1)挑取1#菌落，接种于装有100mL RCM液体培养基的100mL摇瓶中， 37℃厌氧培养18小时，镜检，观察菌体为梭状且未形成芽孢。取1mL该培养物于9mL无菌水中稀释成10-1稀释度的菌悬液，重复上述操作，稀释至10-5浓度的菌悬液，并将上述菌悬液涂布于RCM平板。
(2)开启紫外诱变箱，预热20分钟，至光波稳定。将上述涂有菌液的RCM 平板，置于紫外诱变箱中。掀开培养皿盖子，用光波长360nm，功率25W紫外灯照射距离为30cm进行照射，照射剂量分别为10s、15s、20s、25s、30s、 40s、50s、60s、70s、80s，照射完成后，关闭紫外灯，盖上培养皿盖子，用黑色防光塑料袋包好平板，放入密封盒中，加入厌氧袋，在避光条件下，厌氧培养48小时，计算各照射时间RCM平板上菌落数，计算各照射剂量致死率。光波长360nm，功率25W紫外灯照射距离为30cm进行照射，照射时长40s，致死率约为88％，可作为紫外诱变致死剂量。将新培养菌液，稀释至10-4，涂布于RCM平板上(含质量百分含量为0.5％的碳酸钙)，按上述剂量照射后，避光厌氧培养48小时。观察RCM平板上(含0.5％碳酸钙)菌落及透明圈大小，挑取菌落大小为3mm以上，且透明圈较大的菌落，共50个，分别编号为L1、L2、L3……L50。将上述菌落以及出发菌株分别在RCM平板上纯化，分别接种于100mL RCM液体培养基中，厌氧培养20h，得培养液待检。
(3)用0.2000mol/L氢氧化钠溶液，以酚酞为指示剂，对上述培养液进行酸碱滴定，测定总酸结果(主要为丁酸)，各菌种在RCM培养基中，总酸生成量超过5％(酸的质量占培养液总质量的5％，以丁酸的摩尔质量为准计算得酸的质量)以上的一共6株，分别为L11、L15、L22、L34、L42、DS20，其中， DS20的发酵产酸量最高，为5.55％，其产酸性能较出发菌株提高了45％。
实施例3-各菌株在空肠肠液中的生长情况
在邳州正大屠宰场收集空肠肠液200mL，冷冻保藏，带回实验室，经解冻处理后，低速离心，去除杂质。用0.5μm滤器将上述液体过滤除菌，分装至10 mL离心管中，每管的装液量分别为5mL。分别挑取出发菌株、L11、L15、L22、 L34、L42、DS20菌落各一环，分别接种于上述空肠肠液中，放入密闭厌氧盒，加入厌氧袋，放置24小时。结果发现，出发菌株在空肠肠液中长出的菌落非常小，甚至几乎不能生长。其他菌株可以正常生长，分别测定pH值，结果为L11、L15、L22、L34、L42、DS20管中pH值分别为7.0、6.8、6.6、6.8、6.6、6.4，说明DS20在空肠肠液中有较好的生长适应能力及发酵产酸能力(pH低，说明产酸能力强)。
实施例4-丁酸梭菌DS20的性能评价
将甘油管保藏的丁酸梭菌DS20在RCM平板上活化，然后接种于100mL RCM液体培养基中，37℃厌氧培养24h，取培养液进行以下实验：
(1)耐酸性试验
取1mL培养液加入99mL质量浓度为1％的盐酸溶液中，混匀后于37℃静置培养1h，取出培养液并立即进行梯度稀释，涂布于RCM平板，37℃厌氧培养24h，计算存活率(与未经酸液处理的活菌数进行比较)，结果为94％。
(2)耐胆盐性
将培养液加入质量分数为0.15％的胆盐溶液中，分别测定静置1、2、3h后的存活率(与0h的活菌数进行比较)，上述实验设三组平行，并计算平均值，经检测，丁酸梭菌DS20经0.15％的胆盐溶液处理1、2、3h后的存活率平均值分别为98.15％、97.25％、97.10％，表明其具有良好的耐胆盐能力。
(3)耐热性
将培养液用80℃水浴5min，杀灭非芽孢形态的菌体，迅速冷却。取一部分上述液体，置于90℃水浴环境中，维持10min。后梯度稀释至10-5涂布于RCM 平板，37℃厌氧培养24h，计算存活率(与未经90℃水浴处理的活菌数进行比较)，结果显示，其存活率为98.20％，说明其芽孢耐热性能较好(较出发菌株提高了15％)。
(4)抑菌效果
指示菌：大肠杆菌K88、猪霍乱沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、采用LB培养基，培养24h，得到指示菌菌液。吸取各指示菌菌液500μL，至装有4.5mL 无菌生理盐水的EP管中，梯度稀释100倍，得指示菌稀释液。
取200μL指示菌稀释液涂布，放置3个牛津杯在培养皿中，分别注入200μL 氨苄(阳性对照)、无菌蒸馏水(阴性对照)、丁酸梭菌培养液。培养皿置于37℃恒温箱培养24h。以上操作每个指示菌做3个重复，并平行测定3次。抑菌圈直径(Diameter Of Inhibition Zone，DIZ)用游标卡尺测量。
以DIZ的最大值和最小值的平均值确定DIZ，并判定抑菌作用。由于丁酸梭菌抑菌作用没有统一的判定标准，依据实测DIZ数据范围，抑菌作用的判定标准为：“不敏感”：DIZ＝7.8mm；“低敏感”：7.8mm<DIZ≤10.0mm；“中敏感”： 10mm<DIZ≤12.0mm；“高敏感”：DIZ>12.0mm。
结果显示，丁酸梭菌对指示菌大肠杆菌K88、猪霍乱沙门氏菌、金黄色葡萄球菌有一定抑制作用，抑制敏感性均为中敏感性。阳性对照为高敏感，阴性对照为不敏感。
实施例5-发酵培养
将丁酸梭菌DS20在RCM平板上活化，接种于100mL RCM液体培养基中， 37℃厌氧培养24h，制备得种子液。将上述种子液以10％的接种量接入10L发酵罐，发酵罐装液量6L。发酵培养基组成为：葡萄糖0.5％、蛋白胨0.5％、酵母浸膏2％、牛肉浸膏2.5％、玉米淀粉2.2％、乙酸钠0.5％、碳酸钙0.5％、磷酸氢二钾0.2％、硫酸镁0.1％，余量为水。发酵过程：向发酵罐中通入氮气，氮气流速15m3/h，用氮气排尽发酵罐中空气，通入10分钟氮气，保持压力0.05MPa，监控并维持发酵液pH为5.5-5.8，发酵温度为37℃，转速100r/min，发酵至10小时，补入0.5％的葡萄糖，发酵至12小时，补入1％牛肉浸膏和0.5％酵母浸膏，发酵至20小时，升温至70℃，维持10分钟，杀灭非芽孢形态菌体，再冷却降温至常温(25℃)，对发酵液中活菌计进行计数，结果为芽孢形成率98％、发酵液芽孢浓度为8.5亿/mL，离心(5000rpm离心10min)，得菌泥。
实施例6-菌粉制备
按照实施例5的工艺进行扩大培养，发酵罐体积5000L，装液量4000L，得到菌泥后，加入菌泥重量的45％的水，打成菌浆，加入由麦芽糊精与玉米淀粉按质量比1:2混合组成的辅料，辅料加入量为菌浆重量的15％(w/w)；将上述混合物过胶体磨，充分研磨过筛，然后进行喷雾干燥，喷雾干燥参数为：进风温度为135℃，进料流量为14.15mL/min，获得丁酸梭菌DS20菌粉。
实施例7-菌粉用作动物饲料添加剂
选用(30±2)日龄体重相近的“杜洛克”断奶仔猪105头，随机分为6个实验组和1个对照组，每组15头；对照组饲喂基础日粮；各实验组分别在基础日粮中加入对应菌粉(20亿活菌/kg基础日粮)。
实验组1：丁酸梭菌DS20；
实验组2：丁酸梭菌DS20+粪肠球菌ATCC 29212+植物乳杆菌CICC 6009 (活菌数比为4:2:1)；
实验组3：丁酸梭菌DS20+粪肠球菌ATCC 29212(活菌数比为2:1)；
实验组4：丁酸梭菌DS20+植物乳杆菌CICC 6009(活菌数比为4:1)；
实验组5：粪肠球菌ATCC 29212+植物乳杆菌CICC 6009(活菌数比为2:1)；
实验组6：丁酸梭菌CICC 23847+粪肠球菌CICC 20419+植物乳杆菌ACCC 20039(活菌数比为4:2:1)。
丁酸梭菌DS20菌粉的制备参照实施例6和实施例7。
丁酸梭菌CICC 23847菌粉的制备参照实施例6和实施例7。
粪肠球菌发酵液：将粪肠球菌(ATCC 29212或CICC 20419)接种于MRS 固体斜面培养基(蛋白陈10g、牛肉膏10g、酵母粉5g、葡萄糖20g、吐温-80 1g、磷酸氢二钾2g、乙酸钠5g、柠檬酸二铵2g、硫酸镁0.2g、疏酸锰0.05g、碳酸钙6g、琼脂16g、蒸馏水配至1000mL，调节pH值7.0)，37℃，转速100r/min 摇床培养12h，得种子液。将种子液接种于发酵罐中，发酵培养基：蛋白胨15g、葡萄糖10g、酵母粉5g、乙酸钠5g、柠檬酸二铵4g、吐温80 1g、磷酸氢二钾2g、硫酸镁0.2g、硫酸锰0.05g、碳酸钙6g、蒸馏水配至1000mL，调节pH值 7.0，37℃，转速100r/min，通气量0.2V/V min，发酵18h，即得。
植物乳杆菌发酵液：将植物乳杆菌(CICC 6009或ACCC 20039)接种于 MRS固体斜面培养基(蛋白陈10g、牛肉膏10g、酵母粉5g、葡萄糖20g、吐温-80 1g、磷酸氢二钾2g、乙酸钠5g、柠檬酸二铵2g、硫酸镁0.2g、疏酸锰0.05g、碳酸钙6g、琼脂16g、蒸馏水配至1000mL，调节pH值7.0)，37℃，转速100 r/min摇床培养12h，得种子液。将种子液接种于发酵罐中，发酵培养基：蛋白胨20g、玉米淀粉10g、酵母粉10g、葡萄糖10g、牛肉膏10g、磷酸氢二钾4g、硫酸镁0.5g、硫酸锰0.05g、碳酸钙10g、蒸馏水配至1000mL，调节pH值7.0， 37℃，转速100r/min，通气量0.2V/V min，发酵18h，即得。
将上述发酵液分别经蒸馏水洗涤、5000rpm离心10min后得到粪肠球菌菌泥、植物乳杆菌菌泥，菌粉的制备方法参照实施例7。
试验仔猪在封闭猪舍中饲养，水泥地面，自由采食和饮水，驱虫、消毒及免疫均按猪场常规饲养管理程序进行，试验期30天。试验期内每天观察仔猪粪便，按照以下公式计算腹泻率：腹泻率(％)＝100×试验期内每组仔猪腹泻头次 /(试验天数×每组仔猪头数)，腹泻头次指的是每天统计一次猪的腹泻头数。试验期满后统计各组仔猪的腹泻率及生长性能的平均值，如表2所示。
表2
结果表明，本发明提供的丁酸梭菌DS20用于动物饲料添加剂，可有效改善料重比和降低腹泻率。此外，当丁酸梭菌DS20、粪肠球菌ATCC 29212和植物乳杆菌CICC 6009进行组合时，三种菌株相互配合，在改善料肉比和降低腹泻率方面取得了意料不到的协同增效的功效。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的一种丁酸梭菌、其发酵物、包含其的菌剂及动物饲料添加剂，但本发明并不局限于上述实施例，即不意味着本发明必须依赖上述实施例才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。
序列表
<110> 江苏三仪生物工程有限公司、大连三仪动物药品有限公司、江苏国托检测有限公司、辽宁国托检测有限公司
<120> 一种丁酸梭菌、其发酵物、包含其的菌剂及动物饲料添加剂
<130> 2022-5-30
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1448
<212> DNA
<213> 丁酸梭菌
<400> 1
ggctcaggac gaacgctggc ggcgtgctta acacatgcaa gtcgagcgat gaagttcctt 60
cgggaatgga ttagcggcgg acgggtgagt aacacgtggg taacctgcct catagagggg 120
aatagccttt cgaaaggaag attaataccg cataagattg tagtgccgca tggcatagca 180
attaaaggag taatccgcta tgagatggac ccgcgtcgca ttagctagtt ggtgaggtaa 240
cggctcacca aggcgacgat gcgtagccga cctgagaggg tgatcggcca cattgggact 300
gagacacggc ccagactcct acgggaggca gcagtgggga atattgcaca atgggggaaa 360
ccctgatgca gcaacgccgc gtgagtgatg acggtcttcg gattgtaaag ctctgtcttc 420
agggacgata atgacggtac ctgaggagga agccacggct aactacgtgc cagcagccgc 480
ggtaatacgt aggtggcaag cgttgtccgg atttactggg cgtaaaggga gcgtaggtgg 540
atatttaagt gggatgtgaa atactcgggc ttaacctggg tgctgcattc caaactggat 600
atctagagtg caggagagga aagtagaatt cctagtgtag cggtgaaatg cgtagagatt 660
aggaagaata ccagtggcga aggcgacttt ctggactgta actgacactg aggctcgaaa 720
gcgtggggag caaacaggat tagataccct ggtagtccac gccgtaaacg atgaatacta 780
ggtgtagggg ttgtcatgac ctctgtgccg ccgctaacgc attaagtatt ccgcctgggg 840
agtacggtcg caagattaaa actcaaagga attgacgggg gcccgcacaa gcagcggagc 900
atgtggttta attcgaagca acgcgaagaa ccttacctag acttgacatc tcctgaatta 960
cccttaatcg gggaagccct tcggggcagg aagacaggtg gtgcatggtt gtcgtcagct 1020
cgtgtcgtga gatgttgggt taagtcccgc aacgagcgca acccttattg ttagttgcta 1080
ccatttagtt gagcactcta gcgagactgc ccgggttaac cgggaggaag gtggggatga 1140
cgtcaaatca tcatgcccct tatgtctagg gctacacacg tgctacaatg gctggtacag 1200
agagatgcta aaccgtgagg tggagccaaa ctttaaaacc agtctcagtt cggattgtag 1260
gctgaaactc gcctacatga agctggagtt gctagtaatc gcgaatcaga atgtcgcggt 1320
gaatacgttc ccgggccttg tacacaccgc ccgtcacacc atgagagttg gcaataccca 1380
aagttcgtga gctaacgcgc aagcggggca gcgacctaag gtagggtcag cgattggggt 1440
gaagtcgt 1448

Claims (24)

1.一种丁酸梭菌，其特征在于，所述丁酸梭菌命名为丁酸梭菌(Clostridium butyricum)DS20菌株，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2022581，保藏日期为2022年5月10日，保藏地址为中国，武汉，武汉大学。
2.一种丁酸梭菌发酵物，其特征在于，所述丁酸梭菌发酵物由包括如下步骤的方法制备得到：
(1)培养权利要求1所述的丁酸梭菌，得到种子液；
(2)将种子液接种于发酵培养基中进行发酵培养，得发酵液，离心，收集菌泥，即得所述丁酸梭菌发酵物。
3.如权利要求2所述的丁酸梭菌发酵物，其特征在于，步骤(1)所述培养为厌氧培养。
4.如权利要求2所述的丁酸梭菌发酵物，其特征在于，步骤(1)所述培养的温度为35-39℃，所述培养的时间为16-32h。
5.如权利要求2所述的丁酸梭菌发酵物，其特征在于，步骤(1)所述培养是指用RCM培养基进行培养。
6.如权利要求2所述的丁酸梭菌发酵物，其特征在于，步骤(2)所述发酵培养为厌氧培养。
7.如权利要求2所述的丁酸梭菌发酵物，其特征在于，步骤(2)所述发酵培养的温度为35-39℃，所述发酵培养的时间为16-32h。
8.如权利要求2所述的丁酸梭菌发酵物，其特征在于，步骤(2)所述发酵培养基中包含葡萄糖、蛋白胨、酵母浸膏、牛肉浸膏、玉米淀粉、乙酸钠、碳酸钙、磷酸氢二钾或硫酸镁中的任意一种或至少两种的组合。
9.如权利要求2所述的丁酸梭菌发酵物，其特征在于，步骤(2)所述发酵培养基中的组分以质量百分含量计包括葡萄糖0.5％-2.5％、蛋白胨0.2％-1.6％、酵母浸膏1％-5％、牛肉浸膏1％-5％、玉米淀粉0.2％-2.5％、乙酸钠0.1％-1％、碳酸钙0.1％-0.8％、磷酸氢二钾0.02％-0.3％和硫酸镁0.01％-0.2％，余量为水。
10.如权利要求2所述的丁酸梭菌发酵物，其特征在于，在步骤(2)中，当发酵培养9-11h时，补加葡萄糖。
11.如权利要求10所述的丁酸梭菌发酵物，其特征在于，葡萄糖的补加量为发酵培养基中初始葡萄糖质量的0.8-1.2倍。
12.如权利要求2所述的丁酸梭菌发酵物，其特征在于，在步骤(2)中，当发酵培养11-13h时，补加牛肉浸膏和酵母浸膏。
13.如权利要求12所述的丁酸梭菌发酵物，其特征在于，牛肉浸膏的补加量为发酵培养基中初始牛肉浸膏质量的0.4-0.8倍，酵母浸膏的补加量为发酵培养基中初始酵母浸膏质量的0.1-0.4倍。
14.如权利要求2所述的丁酸梭菌发酵物，其特征在于，步骤(2)所述发酵培养后还包括将发酵液升温至65-75℃，并维持5-15min，以杀灭非芽孢形态菌体，然后冷却至15-40℃。
15.一种丁酸梭菌菌剂，其特征在于，所述丁酸梭菌菌剂的制备原料包括如权利要求1所述的丁酸梭菌和/或如权利要求2-14中任一项所述的丁酸梭菌发酵物，还包括辅料。
16.如权利要求15所述的丁酸梭菌菌剂，其特征在于，所述辅料包括麦芽糊精和/或玉米淀粉。
17.如权利要求16所述的丁酸梭菌菌剂，其特征在于，所述麦芽糊精与玉米淀粉的质量比为1:(1-4)。
18.如权利要求15所述的丁酸梭菌菌剂，其特征在于，所述丁酸梭菌菌剂由包括如下步骤的方法制备得到：
将如权利要求1所述的丁酸梭菌和/或如权利要求2-14中任一项所述的丁酸梭菌发酵物与辅料混合，喷雾干燥，即得。
19.如权利要求18所述的丁酸梭菌菌剂，其特征在于，所述喷雾干燥中，进风温度为135-145℃。
20.如权利要求18所述的丁酸梭菌菌剂，其特征在于，所述喷雾干燥中，进料流量为13.25-15.35mL/min。
21.一种复合菌剂，其特征在于，所述复合菌剂包括如权利要求1所述的丁酸梭菌、如权利要求2-14中任一项所述的丁酸梭菌发酵物或如权利要求15-20中任一项所述的丁酸梭菌菌剂中的任意一种或至少两种的组合；
所述复合菌剂还包括其他菌株及其发酵物，所述其他菌株为粪肠球菌(Enterococcus faecalis)ATCC 29212和植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)CICC 6009。
22.如权利要求21所述的复合菌剂，其特征在于，在所述复合菌剂中，所述丁酸梭菌、粪肠球菌ATCC 29212与植物乳杆菌CICC 6009的活菌数之比为(3-5):(1-3):1。
23.一种动物饲料添加剂，其特征在于，所述动物饲料添加剂包括如权利要求1所述的丁酸梭菌、如权利要求2-14中任一项所述的丁酸梭菌发酵物、如权利要求15-20中任一项所述的丁酸梭菌菌剂或如权利要求21-22中任一项所述的复合菌剂中的任意一种或至少两种的组合。
24.如权利要求23所述的动物饲料添加剂，其特征在于，所述动物包括畜禽类动物。
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