CN114869977B

CN114869977B - 肺力咳在制备防治乳腺癌的产品中的应用

Info

Publication number: CN114869977B
Application number: CN202210310305.7A
Authority: CN
Inventors: 杨珏; 李艳梅; 张知音; 邱剑飞; 赵鹏; 韦学耐
Original assignee: Key Laboratory of Natural Product Chemistry of Guizhou Academy of Sciences
Current assignee: Key Laboratory of Natural Product Chemistry of Guizhou Academy of Sciences
Priority date: 2022-03-28
Filing date: 2022-03-28
Publication date: 2023-04-14
Anticipated expiration: 2042-03-28
Also published as: CN114869977A

Abstract

本发明提供了肺力咳在制备防治乳腺癌的产品中的应用，属于生物药学技术领域。本发明首次发现，肺力咳可有效治疗乳腺癌，并且肺力咳具有抑制乳腺癌细胞的活力、抑制乳腺癌细胞的增殖并促进乳腺癌细胞凋亡，改变乳腺癌细胞形态的作用，从而达到治疗乳腺癌的效果。肺力咳抑制乳腺癌细胞的增殖，具有浓度依赖性，肺力咳对人乳腺癌细胞周期的影响显著，能够阻滞乳腺癌细胞周期于S期，并且药物浓度越高，阻滞越明显。

Description

肺力咳在制备防治乳腺癌的产品中的应用

技术领域

本发明属于生物药学技术领域，尤其涉及肺力咳在制备防治乳腺癌的产品中的应用。

背景技术

肺力咳，是一种中成药，主要成分包括黄芩、前胡、百部、红花龙胆、梧桐根、白花蛇舌草和红管药。目前市场上流通的肺力咳包括肺力咳合剂和肺力咳胶囊两种药用剂型，肺力咳胶囊剂，内容物为黄褐色至棕色的粉末及颗粒，味苦。肺力咳在临床上的功效是止咳平喘，清热解毒，顺气祛痰，适用于咳喘痰多，呼吸不畅，以及急、慢性支气管炎，肺气肿等症状者。现有技术并未记载肺力咳与乳腺癌治疗或预防有关的技术内容。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供肺力咳在制备防治乳腺癌的产品中的应用，能够抑制乳腺癌细胞的活力、抑制乳腺癌细胞的增殖并促进乳腺癌细胞凋亡，改变乳腺癌细胞形态，从而达到治疗乳腺癌的效果。

为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：

本发明提供了肺力咳在制备防治乳腺癌的产品中的应用。

本发明还提供了肺力咳在制备抑制乳腺癌细胞活力的产品中的应用。

本发明还提供了肺力咳在制备抑制乳腺癌细胞增殖的产品中的应用。

本发明还提供了肺力咳在制备促进乳腺癌细胞凋亡的产品中的应用。

优选的，上述产品包括药物。

优选的，所述肺力咳包括肺力咳合剂和肺力咳胶囊。

优选的，所述药物包括注射剂、散剂、片剂、颗粒剂、胶囊剂、溶液剂、乳剂、混悬剂、喷雾剂、气雾剂、粉雾剂、软膏剂、硬膏剂、贴剂、栓剂、滴剂或滴丸剂。

本发明还提供了一种防治乳腺癌的药物，所述药物包括肺力咳或肺力咳的有效成分。

本发明还提供了一种上述药物的制备方法，包括以下步骤：将所述肺力咳直接制备成防治乳腺癌的药物制剂，或者将所述肺力咳与其他防治乳腺癌的药物复配制备成复方药物制剂，或者将所述肺力咳的有效成分与药学上可接受的载体制备成防治乳腺癌的药物制剂

本发明的有益效果：

本发明首次提供了肺力咳在制备防治乳腺癌的产品中的应用，具体涉及抑制乳腺癌细胞的活力、抑制乳腺癌细胞的增殖并促进乳腺癌细胞凋亡，改变乳腺癌细胞的形态，从而达到有效治疗乳腺癌的效果。另外，肺力咳抑制乳腺癌细胞的增殖，具有浓度依赖性，肺力咳对人乳腺癌细胞周期的影响显著，能够阻滞乳腺癌细胞周期于S期，并且药物浓度越高，阻滞越明显。

本发明首次发现肺力咳在制备防治乳腺癌药物或乳腺癌细胞增殖抑制药物制剂方面具有潜在价值。且肺力咳是已用于临床的中成药，能直接应用于人体而不再需要进行临床安全评估，具有很好的应用前景，可迅速提高此产品的市场占有率。

附图说明

图1是不同浓度肺力咳胶囊对人乳腺癌细胞MDA-MB-231形态的影响。

图2为不同浓度肺力咳胶囊对人乳腺癌细胞MDA-MB-231生长的影响，其中*表明P<0.05，**表明P<0.01。

图3是不同浓度肺力咳胶囊作用于人乳腺癌细胞MDA-MB-231细胞24h后形成克隆数的检测，**表明P<0.01。

图4是不同浓度肺力咳胶囊作用于人乳腺癌细胞MDA-MB-231细胞24h以及48h后流式细胞仪对凋亡的检测，**是与NC组进行比较P<0.01，##是与24h进行比较P<0.01。

图5是不同浓度肺力咳胶囊作用于人乳腺癌细胞MDA-MB-231细胞24h后Hoechst33258染色的检测。

图6是不同浓度肺力咳胶囊作用于人乳腺癌细胞MDA-MB-231细胞24h以及48h后流式细胞仪对周期的检测。

图7是不同组别的4T1荷瘤小鼠肿瘤体积生长情况；其中**表明P<0.01。

图8是不同组别的4T1荷瘤小鼠肿瘤重量情况；其中*表明P<0.05。

具体实施方式

本发明提供了肺力咳在制备防治乳腺癌的产品中的应用。本发明还提供了肺力咳在制备抑制乳腺癌细胞活力、抑制乳腺癌细胞增殖、促进乳腺癌细胞凋亡的产品中的应用。

本发明对于肺力咳的具体来源没有特殊限定，采用本领域常规市售产品即可，在本发明中，所述肺力咳优选的包括肺力咳合剂和肺力咳胶囊，所述产品优选的包括药物。本发明对于乳腺癌细胞的类型没有特殊限定，优选的包括人乳腺癌细胞MCF-7、MDA-MB-231、MDA-MB-468和小鼠乳腺癌细胞4T1。本发明对所述人乳腺癌细胞MCF-7、MDA-MB-231、MDA-MB-468和小鼠乳腺癌细胞4T1的来源并没有特殊限定，可为商业购买，也可实验室冻存，本发明实施例中所述人乳腺癌细胞MCF-7、MDA-MB-231、MDA-MB-468和小鼠乳腺癌细胞4T1均为贵州省中国科学院天然产物化学重点实验室留存。

在本发明中，所述药物的制剂形式优选的包括注射剂、散剂、片剂、颗粒剂、胶囊剂、溶液剂、乳剂、混悬剂、喷雾剂、气雾剂、粉雾剂、软膏剂、硬膏剂、贴剂、栓剂、滴剂或滴丸剂。本发明对于各剂型的辅料没有特殊要求，采用本领域制备该剂型时常规辅料均可。

本发明对于肺力咳的来源、乳腺癌细胞的来源和药物制剂的剂型、辅料等均没有特殊限定。在本发明具体的实施例中，所述肺力咳主要的有效成分优选的包括黄芩、前胡、百部、红花龙胆、梧桐根、白花蛇舌草和红管药。

本发明还提供了一种上述药物的制备方法，包括以下步骤：将所述肺力咳直接制备成防治乳腺癌的药物制剂，或者将所述肺力咳与其他防治乳腺癌的药物复配制备成复方药物制剂，或者将所述肺力咳的有效成分与药学上可接受的载体制备成防治乳腺癌的药物制剂。

在本发明所述药物制剂的制备方法中，对于并未详细记载的内容如辅料、如何制备等，均为本领域的常规选择。

下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

收集对数期的MCF-7细胞、MDA-MB-231细胞、MDA-MB-468细胞和4T1细胞，按照6×10³个/孔的密度接种于96孔板中，培养过夜，待细胞贴壁后，加入0.25mg/ml、0.5mg/ml、1mg/ml、2mg/ml、4mg/ml不同浓度的样品溶液(肺力咳胶囊有效成分(去除胶囊外壳后的药物)的生理盐水溶液，肺力咳胶囊由贵州健兴药业生产制造)处理，以生理盐水为对照组。药物作用72h后，每孔加入10μl浓度为5mg/ml的MTT，37℃孵育4h，弃上清，每孔加入160μlDMSO溶解，待蓝紫色结晶甲臜完全溶解后，酶标仪测定吸光度值OD(490nm)。

抑制率的计算方法：抑制率＝(对照组OD值-处理组OD值)/对照组OD值。半数抑制浓度(IC₅₀)的计算方法：采用forecast函数求得对应的IC₅₀。

结果表明，不同浓度的样品溶液均能抑制MCF-7细胞、MDA-MB-231细胞、MDA-MB-468细胞和4T1细胞的活力，并且具有浓度依赖性，肺力咳胶囊对MCF-7细胞、MDA-MB-231细胞、MDA-MB-468细胞和4T1细胞的IC₅₀值分别为2.91±0.82mg/ml、0.55±0.10mg/ml、1.08±0.08mg/ml和0.74±0.32mg/ml。

实施例2

将MDA-MB-231细胞按4×10⁵个/孔的量接种于60mm的圆形培养皿中进行培养，待细胞贴壁后，加入不同浓度的样品溶液(0.25mg/ml、0.5mg/ml、1mg/ml、2mg/ml)(肺力咳胶囊有效成分(去除胶囊外壳后的药物)的生理盐水溶液，肺力咳胶囊由贵州健兴药业生产制造)作用24h，以生理盐水为对照组。倒置显微镜下观察细胞的形态变化。

结果如图1所示，随着药物浓度的增加，细胞数目明显减少。细胞形态上有所改变，尤其在高浓度时可见细胞形态由长梭形向圆形转变，细胞肿胀。

实施例3

分别收集对数期MDA-MB-231细胞，按照6×10³个/孔的密度接种于96孔板中，培养过夜，待细胞贴壁后，加入不同浓度的样品溶液(0.25mg/ml、0.5mg/ml、1mg/ml、2mg/ml)(肺力咳胶囊有效成分(去除胶囊外壳后的药物)的生理盐水溶液，肺力咳胶囊由贵州健兴药业生产制造)处理，以生理盐水为对照组，分别于0h、24h、48h、72h测定OD 490nm，并绘制生长曲线。

结果如图2所示，与对照组相比，不同浓度的样品溶液均能抑制MDA-MB-231细胞的增殖，并且随着浓度的增加，MDA-MB-231细胞的生长速度逐渐减慢，说明肺力咳胶囊样品溶液能够抑制MDA-MB-231细胞的增殖，且呈浓度和时间依赖性。

实施例4

将MDA-MB-231细胞按4×10⁵个/孔的量接种于60mm的圆形培养皿中进行培养，待细胞贴壁后，加入不同浓度的样品溶液(0.5mg/ml、1mg/ml、2mg/ml)(肺力咳胶囊有效成分(去除胶囊外壳后的药物)的生理盐水溶液，肺力咳胶囊由贵州健兴药业生产制造)作用24h，以生理盐水为对照组，消化收集细胞，计数。按照1000个/孔种植于6孔板中，在培养箱用含5％FBS的DMEM培养基连续培养，每三天更换一次新鲜培养基。14天后，弃培养液，PBS清洗2-3次，甲醇固定15min，0.1％结晶紫染色15min，用PBS清洗5-8次，风干，拍照，于光镜下对含50个细胞以上的克隆数计数。

结果如图3所示，与对照组相比，形成的克隆数目及克隆的直径随着样品溶液浓度的增加均明显下降，并且具有一定的浓度依赖性，这说明肺力咳胶囊样品溶液可以在体外抑制MDA-MB-231细胞的增殖。

实施例5

将MDA-MB-231细胞按4×10⁵个/孔的量接种于60mm的圆形培养皿中进行培养，待细胞贴壁后，加入不同浓度的样品溶液(0.5mg/ml、1mg/ml、2mg/ml)(肺力咳胶囊有效成分(去除胶囊外壳后的药物)的生理盐水溶液，肺力咳胶囊由贵州健兴药业生产制造)作用24h或48h后收集细胞，以生理盐水为对照组。用PBS洗3次，加入500μl 1×Binding Buffer重悬细胞，加入5μl Annexin V-FITC和10μl碘化丙啶，室温避光孵育15min，用流式细胞仪检测计算细胞凋亡率。

结果如图4所示，与对照组相比，不同浓度的样品溶液均能诱导人乳腺癌细胞MDA-MB-231发生凋亡，并且有浓度依赖性。

实施例6

取洁净盖玻片在70％乙醇中浸泡5min或更长时间，生物安全柜内用灭菌PBS洗涤三遍，再用细胞培养液洗涤一遍。将盖玻片置于6孔板内，将MDA-MB-231细胞按4×10⁵个/孔种植于60mm的圆形培养皿中，培养过夜。第二天细胞贴壁后，弃上清，加入不同浓度的样品溶液(0.5mg/ml、1mg/ml、2mg/ml)(肺力咳胶囊有效成分(去除胶囊外壳后的药物)的生理盐水溶液，肺力咳胶囊由贵州健兴药业生产制造)，以生理盐水为对照组。作用24h，吸尽培养液，加入0.5mL固定液，固定10min。用PBS洗两遍，洗涤时手动晃动，每次3min，吸尽液体。加入0.5mL Hoechst 33258染色液，染色5min。期间手动晃动数次。染色结束后用PBS洗两遍，每次3min，吸尽液体。滴一滴抗荧光淬灭封片液于载玻片上，盖上贴有细胞的盖玻片，让细胞接触封片液，尽量避免气泡。倒置荧光显微镜进行观察拍照。

结果如图5所示，与对照组相比，不同浓度的样品溶液都可诱导细胞发生凋亡，凋亡细胞的细胞核呈致密浓染或呈碎块状致密浓染。

实施例7

将MDA-MB-231细胞按4×10⁵个/孔的量接种于60mm的圆形培养皿中进行培养，待细胞贴壁后，加入不同浓度的样品溶液(0.5mg/ml、1mg/ml、2mg/ml)(肺力咳胶囊有效成分(去除胶囊外壳后的药物)的生理盐水溶液，肺力咳胶囊由贵州健兴药业生产制造)作用24h或48h后，收集细胞。1000rpm离心5min，用预冷的PBS洗一次，再用70％预冷的乙醇重悬细胞，-20℃固定过夜。1000rpm离心5min，弃上清，用预冷PBS洗一次，1000rpm离心5min，收集细胞。使用500μl PBS重悬细胞，加入RNase A 5μl，PI 25μl和Triton X-1000.25μl，混匀，1000rpm离心5min，弃染料，用200μl PBS重悬，使用流式细胞仪做细胞周期分析。

结果如图6所示，不同浓度的样品溶液在作用24h以及48h时对人乳腺癌细胞MDA-MB-231周期影响显著，并阻滞细胞周期于S期，并且药物浓度越高，其阻滞越明显。

实施例8

复苏小鼠4T1乳腺癌细胞，培养后将其制成浓度为1×10⁶个/mL的细胞悬液，然后每只小鼠右侧第二***脂肪垫皮下注射细胞悬液50μL。7天后，随机将小鼠分为4组，每组8只。各组小鼠的给药方案分别为：阴性对照组：灌胃生理盐水，每天一次；低剂量实验组(肺力咳胶囊-L)：灌胃给药468mg/kg，每天一次；中剂量实验组(肺力咳胶囊-M)：灌胃给药936mg/kg，每天一次；高剂量实验组(肺力咳胶囊-H)：1872mg/kg，每天一次，直至处死小鼠。每天上午、下午、晚上各观察1次小鼠的饮食、精神等情况。上述肺力咳胶囊购自于贵州健兴药业有限公司。给药后第一天开始每48h用游标卡尺测量肿瘤体积，结果如图7所示。末次给药24h后，处死小鼠，称量肿瘤重量，结果如图8所示。

由图7和图8可以看出，本发明肺力咳胶囊可明显降低荷瘤小鼠肿瘤体积，减少瘤体重量。

本发明的以上实施例中，每个实验独立重复三次，所有数据用mean±SD进行表示，用GraphPad Prism 7进行Student’s t-test检验，P<0.05被认为具有统计学意义。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.肺力咳在制备防治乳腺癌的产品中的应用。

2.肺力咳在制备抑制乳腺癌细胞活力的产品中的应用。

3.肺力咳在制备抑制乳腺癌细胞增殖的产品中的应用。

4.肺力咳在制备促进乳腺癌细胞凋亡的产品中的应用。

5.根据权利要求1-4任意一项所述的应用，其特征在于，所述产品为药物。

6.根据权利要求1-4任意一项所述的应用，其特征在于，所述肺力咳包括肺力咳合剂和肺力咳胶囊。

7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述药物包括注射剂、散剂、片剂、颗粒剂、溶液剂、乳剂、喷雾剂、软膏剂、硬膏剂、贴剂、栓剂或滴丸剂。