CN114836473A - 用于构建筛选药物活性的细胞株模型的慢病毒载体与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种用于构建筛选药物活性的细胞株模型的慢病毒载体与应用。该慢病毒载体包括复制缺陷型慢病毒载体骨架、应答元件微型启动子和荧光蛋白；应答元件微型启动子和位于应答元件微型启动子下游的荧光蛋白形成复合元件，设置于复制缺陷型慢病毒载体骨架上。本发明通过将该慢病毒组载体以病毒液形式感染宿主细胞株，或是将该慢病毒组载体和表达药物受体的重组载体以病毒液形式感染宿主细胞株，筛选鉴定，得到用于药物活性测定的细胞株。该细胞株含有荧光蛋白，检测药物活性时，无需裂解细胞等繁琐步骤，可直接检测活细胞，从而检测成本低，不需要专门配套检测试剂盒；该细胞株响应强，稳定性好。

Description

用于构建筛选药物活性的细胞株模型的慢病毒载体与应用

技术领域

本发明属于药物生物活性测定技术领域，尤其涉及一种用于构建筛选药物活性的细胞株模型的慢病毒载体与应用。

背景技术

药物发现和筛选是创新药物研究的起点，对药物的研究和发展具有决定意义，基于药物筛选模型进行化合物活性筛选是目前药物筛选的主要方法之一。依据筛选模型的差异，药物筛选可以分为生化水平的筛选和细胞水平的筛选。

生化水平的药物筛选操作比较简单，成本较低，筛选机理主要依据药物与靶标的作用强度，而药物效应又不仅仅取决于其与靶标的作用程度，因而不能很好准确地反映药物的作用机制。细胞水平的药物筛选是依据药物作用机制的一种药物筛选模型，其机理是依据药物作用信号传导通路构建相应的活性模型细胞株，候选化合物与活性细胞株的相应受体相互作用后影响细胞的基因表达变化，从而反映候选化合物的相对活性。

目前细胞水平的药物筛选平台发展迅速，针对不同药物开发了多种不同机理的活性细胞株，主要有离子通道、G蛋白偶联受体(G Protein-Coupled Receptor，GPCR)和酶类等。基于细胞水平的药物筛选，最重要的是获得高响应强度、稳定的细胞模型，而获得良好的细胞模型需要长时间的筛选及验证。本发明提供一种利用慢病毒载体快速构建活性细胞株的方法，可以为细胞水平的药物活性筛选模型的建立提供重要的参考依据。

发明内容

为了克服现有技术的缺点与不足，发明人通过设计并合成应答元件微型启动子(Response elementMini promoter)，将其设置于荧光蛋白(FP)上游，得到REMP-FP复合元件；载体为慢病毒载体，特别为自主灭活型(Self inactivating)慢病毒载体，即慢病毒整合到宿主基因组后，5’LTR(long terminal repeat)没有转录功能，且能够阻挡上游启动子序列的转录，因此，应答元件微型启动子的转录活性不受上游启动子活性影响。含有上述REMP-FP复合元件的慢病毒感染并将其基因组整合入宿主细胞基因组，候选药物结合活性细胞模型上药物受体后，激活下游信号转导通路，表达的转录因子结合药物应答元件进而促进荧光蛋白转录表达，通过荧光蛋白表达强度可以反映出候选药物的相对活性。

从而，本发明的首要目的是提供一种用于构建筛选药物活性的细胞株模型的慢病毒载体，其含REMP-FP复合元件。

本发明的另一目的在于提供上述用于构建筛选药物活性的细胞株模型的慢病毒载体的应用。

本发明的再一目的在于提供应用上述用于构建筛选药物活性的细胞株模型的慢病毒载体制备得到的筛选药物活性的细胞株模型及其应用。

为了实现上述目的，本发明通过下述技术方案实现：

一种用于构建筛选药物活性的细胞株模型的慢病毒载体，包括复制缺陷型慢病毒载体骨架、应答元件微型启动子和荧光蛋白；应答元件微型启动子和位于应答元件微型启动子下游的荧光蛋白形成复合元件，设置于复制缺陷型慢病毒载体骨架上。

所述的复制缺陷型慢病毒载体骨架优选为自主灭活型慢病毒载体。

所述的应答元件微型启动子指的是能与转录因子结合后控制基因转录表达的DNA序列，缺少转录因子结合其本身无或很弱的启动转录。

所述的应答元件包括但不限于CRE(cAMP response element)、S6RE(stat6response element)等。

所述的荧光蛋白优选为绿色荧光蛋白或红色荧光蛋白。

所述的设置于复制缺陷型慢病毒载体骨架上优选为设置于复制缺陷型慢病毒载体骨架的多克隆位点上。

所述的用于构建筛选药物活性的细胞株模型的慢病毒载体，优选通过如下步骤制备得到：以序列如SEQ ID NO.1所示的复制缺陷型慢病毒载体pLenti-GFP为骨架，将应答元件微型启动子构建到复制缺陷型慢病毒载体pLenti-GFP的GFP基因上游，得到用于构建筛选药物活性的细胞株模型的慢病毒载体。

所述的用于构建筛选药物活性的细胞株模型的慢病毒载体在制备筛选药物活性的细胞株模型中的应用。

一种筛选药物活性的细胞株模型，含有应答元件微型启动子和荧光蛋白；是将上述用于构建筛选药物活性的细胞株模型的慢病毒载体包装病毒后转导表达药物受体的细胞株得到。

所述的表达药物受体的细胞株是表达内源药物受体的宿主细胞或是表达外源药物受体的宿主细胞。

所述的表达内源药物受体的宿主细胞指的是宿主细胞本身表达有药物受体。

所述的表达外源药物受体的宿主细胞指的是将能表达外源药物受体的核苷酸序列转入宿主细胞得到的细胞株。

所述的表达药物受体的细胞株若是表达有荧光蛋白时，那么所述的用于构建筛选药物活性的细胞株模型的慢病毒载体中的荧光蛋白是与所述的表达药物受体的细胞株的荧光蛋白是不同的，从而背景值低，有利于检测药物活性。

所述的筛选药物活性的细胞株模型的制备方法，是将所述用于构建筛选药物活性的细胞株模型的慢病毒载体包装病毒后转导表达药物受体的细胞株，优选包括如下步骤：

(1)将上述用于构建筛选药物活性的细胞株模型的慢病毒载体与包装质粒共转染包装细胞进行包装，获得可用于感染的病毒液；

(2)将步骤(1)获得的病毒液感染表达药物受体的细胞株；

(3)对步骤(2)的细胞株筛选鉴定获得可以用于药物活性测定的细胞株模型。

步骤(1)中所述的包装的方法按本领域采用的慢病毒载体的包装方法即可，优选的步骤如下为：

(a)将所述的用于构建筛选药物活性的细胞株模型的慢病毒载体与包装质粒混合后，得到DNA混合液转染包装细胞；

(b)转染18-20小时后，加入丁酸钠(Sodium butyrate)以增强病毒包装效率，处理10-12小时后弃上清换新鲜无血清培养基；

(c)转染43-50小时后，培养上清过滤，获得含应答元件微型启动子和荧光蛋白的病毒液。

步骤(a)中所述的包装质粒包括但不限于pRSV-Rev、pMDLg/pRRE、pMD2.G；优选由pRSV-Rev、pMDLg/pRRE和pMD2.G按质量比1:1:1配比得到。

步骤(a)中所述的用于构建活性细胞株模型的慢病毒载体与所述的包装质粒优选按质量比2：3进行配比。

步骤(a)中所述的转染方法包括但不限于电击转染法、脂质体转染法、PEI转染法和磷酸钙转染法；优选为脂质体转染法。

步骤(a)中所述的包装细胞优选为HEK-293T。

所述的包装细胞的汇合度优选为转染时接近90％，如70～90％，进一步为80～90％，尤为85～90％。

步骤(b)中所述的丁酸钠的终浓度优选为10mM。

步骤(b)中所述的培养基优选为DMEM培养基。

步骤(c)中所述的过滤方式优选为通过0.45μm滤膜过滤。

步骤(2)中所述的慢病毒感染的步骤优选如下：

①取步骤(1)获得的病毒液感染表达药物受体的细胞株；

②病毒感染后3～5小时，补加新鲜的完全培养基；

③病毒感染后40～60小时，感染细胞传代培养即为稳转细胞库。

步骤①中所述的表达药物受体的细胞株的细胞汇合度优选感染时为30-50％。

步骤②中所述的补加新鲜的完全培养基的时间优选为病毒感染后4h。

所述的血清优选为小牛血清或胎牛血清。

步骤(2)中所述的表达药物受体的细胞株指的是将能表达外源药物受体的核苷酸序列转入宿主细胞得到的细胞株；优选为以pLenti-GFP载体为骨架，构建能表达相应受体的表达载体，通过慢病毒感染法转导宿主细胞得到。

步骤(2)中所述的表达药物受体的细胞株是将能表达外源药物受体的核苷酸序列转导宿主细胞得到的细胞株时，优选为在将能表达外源药物受体的核苷酸序列转导宿主细胞的同时转导上述用于构建筛选药物活性的细胞株模型的慢病毒载体。

步骤(3)中所述的筛选鉴定的步骤优选为：加入相应药物刺激步骤(2)得到细胞株，作用6～24h后测定位于应答元件微型启动子下游的荧光蛋白的表达强度，得到用于药物活性测定的细胞株模型；好的活性细胞株模型应满足响应强度高、背景低、灵敏度高等要求。

一种筛选药物活性的细胞株模型，通过上述制备方法得到。

所述的筛选药物活性的细胞株模型在药物相对活性测定中的应用，优选包括如下步骤：

(I)将所述的筛选药物活性的细胞株模型接种入96孔板中，静置培养；

(II)制备待测药物标准品溶液，设置稀释浓度梯度；

(III)弃去96孔板培养上清，加入配制好的梯度浓度的标准品溶液，继续静置培养；

(IV)弃上清，加入PBS洗涤，再加入PBS，使用多功能微孔板检测仪测定GFP表达的强度；

(V)以稀释倍数或药物浓度为横坐标，以GFP荧光强度为纵坐标，利用统计软件Graphpad Prism拟合实验数据，得到药物的剂量效应曲线。

步骤(I)中所述的接种量按100μl细胞悬液/孔接种，其中细胞悬液的细胞密度为0.5-0.7M/ml。

步骤(I)中所述的培养条件优选为于37℃、5％CO₂及饱和湿度的条件下培养18-24小时。

步骤(III)中所述的培养的时间优选为6h和24h。

步骤(III)中所述的标准品溶液优选为100μl/孔。

步骤(IV)中所述的洗涤的次数优选为2次。

所述的药物优选为蛋白药物，包括但不限于Dupilumab单抗、胰高血糖素样肽-1(GLP-1)、杜拉鲁肽、利拉鲁肽、索马鲁肽、胰高血糖素(GCG)或葡萄糖依赖性促胰岛素肽(GIP)。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

(1)本发明采用荧光蛋白，特别是绿色荧光蛋白(GFP)检测药物活性，操作简便，无需裂解细胞等繁琐步骤，直接检测活细胞，从而检测成本低，不需要专门配套检测试剂盒。

(2)本发明采用自主灭活型慢病毒载体，其包装、逆转录、整合的过程如图1所示。其具有安全、高效等优点。

(3)本发明采用病毒法制备活性细胞株模型相比传统化学转染方法周期短，且获得的活性细胞株响应强度高。

(4)依据本发明制备活性细胞株的方法可以推广到其他药物活性细胞株模型的建立，高效且响应强度高。

本发明提供一种利用慢病毒载体快速构建活性细胞株的方法，可以为细胞水平的药物活性筛选模型的建立提供重要的参考依据。

附图说明

图1为自主灭活型慢病毒载体包装、逆转录、整合的过程示意图。

图2为载体pLentiCRE-GFP的构建流程图。

图3为载体pLenti-GFP的物理图谱图。

图4为细胞株对杜拉鲁肽(Dulaglutide)标准品的量效曲线关系图。

图5为细胞株对利拉鲁肽(Liraglutide)标准品的量效曲线关系图。

图6为细胞株对索马鲁肽(Semaglutide)标准品的量效曲线关系图。

图7为载体pTBpCRE-GFP的构建流程图。

图8为化学转染活性细胞株对杜拉鲁肽标准品的量效曲线关系。

图9为pLentiSVRFP-GIPR构建流程图。

图10为细胞株对GIP标准品的量效曲线关系图。

图11为pLentiSVRFP-GCGR构建流程图。

图12为细胞株对GCG标准品的量效曲线关系图。

图13为pLentiSVRFP-GLP1R构建流程图。

图14为细胞株对GLP-1标准品的量效曲线关系图。

图15为pLentiS6RE-GFP构建流程图。

图16为pLentiCMVStat6-Neo构建流程图。

图17为细胞株对Dupilumab单抗的量效曲线关系图。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。以下实施例中，未详尽说明的操作为常规操作。

实施例1

一、pLentiCRE-GFP重组载体构建(构建流程如图2所示)

(1)将质粒pLenti-GFP(其物理图谱见图3，序列如SEQ ID NO.1所示)进行ClaI和PstI双酶切，通过胶回收纯化方法获得带开放性粘性末端线性化载体。

(2)合成ClaI-4xCRE-Mini promoter-PstI核酸片段(序列如SEQ ID NO.2所示，南京金斯瑞生物科技有限公司合成)，ClaI和PstI双酶切后胶回收纯化获得带开放性粘性末端的4xCRE-Mini promoter片段。

(3)将pLenti-GFP线性化载体与4xCRE-Mini promoter片段通过T4 DNA连接酶连接，连接产物转化大肠杆菌TOP10感受态细胞，经阳性单克隆筛选实验(通过测序确定ClaI-PstI酶切后大小分别为7792bp、209bp片段的为阳性克隆)，最终可获得pLentiCRE-GFP重组质粒及能够稳定复制该重组质粒的工程菌株。

二、慢病毒重组载体pLentiCRE-GFP包装和感染

(1)质粒提取：将慢病毒重组载体pLentiCRE-GFP及包装载体pRSV-Rev、pMDLg/pRRE、pMD2.G进行质粒提取，获得高浓度高纯度无内毒素的质粒(参照PureLink^TMHiPurePlasmid Filter Midiprep Kit(Thermo)中方法)。

(2)细胞培养：复苏HEK-293T贴壁细胞，以常规传代培养方法在DMEM完全培养基(含10％v/v的胎牛血清，4mM L-谷氨酰胺)中进行传代培养3代以上，用于慢病毒包装实验。

(3)慢病毒重组载体pLentiCRE-GFP的包装

(A)共转染前一天(约24小时)，将铺满的HEK-293T细胞以1：2.5-3的比例进行传代；转染当天，HEK-293T细胞汇合度接近90％。

(B)将1μg pRSV-Rev、1μg pMDLg/pRRE、1μg pMD2.G、2μg pLentiCRE-GFP(质量比为1：1：1：2)混合均匀，得到DNA混合液。

(C)在步骤(B)中混匀的DNA混合液中加入300μl Opti-MEM和12μl P3000，混合均匀，得到稀释的DNA溶液(1号管)；同时，将300μl Opti-MEM和12μl

3000混合均匀，得到转染试剂混合液(2号管)。

(D)分别设置阳性对照组和阴性对照组，阳性对照组以相同的方式共转染pLVX-ZsGreen1-N1(Clontech)质粒和包装质粒pRSV-Rev、pMDLg/pRRE、pMD2.G(质量比为2：1：1：1)，阴性对照组只转染包装质粒pRSV-Rev、pMDLg/pRRE和pMD2.G(质量比为1：1：1)。

(E)将步骤(C)中稀释后的质粒混合液(1号管)分别加入到转染试剂混合液(2号管)中，轻轻混匀(终体积600μl)，室温下静置20分钟使形成DNA-转染试剂复合体。然后，将DNA-转染试剂复合体混合液分别加入待转染HEK-293T细胞中，继续培养。

(F)共转染后第二天(18-20小时后)，在转染HEK-293T细胞中分别加入终浓度为10mM的丁酸钠。

(G)继续培养10-12小时，小心移除上清，分别加入3.5ml新鲜无血清DMEM培养基后继续培养。

(H)培养15-18小时后，培养上清分别经过0.45μm滤膜过滤后即可获得可用于感染的病毒液(含有CRE-Mini promoter-GFP的病毒液)。

(4)慢病毒感染

(A)病毒感染前一天，对待感染大鼠胰岛β细胞瘤细胞RIN-m5F贴壁细胞进行传代，感染当天，RIN-m5F细胞汇合度为30-50％。所用的培养基为RPMI-1640+10％FBS+2mmol/L谷氨酰胺。

(B)吸去RIN-m5F细胞培养上清，加入步骤(3)获得的含有CRE-Mini promoter-GFP的病毒液病毒液3ml，轻轻混匀后，5％CO₂、37℃继续培养。

(C)病毒感染后4小时，补加7ml新鲜的RPMI-1640完全培养基(含10％胎牛血清+2mM L-谷氨酰胺)，5％CO₂、37℃继续培养。

(D)病毒感染2天(约48小时)后，对感染细胞进行传代处理，在此步骤中，荧光显微镜下可见离心收集的阳性对照组细胞具有较强的绿色荧光，阴性对照组未见荧光，慢病毒感染实验成功。

三、建立杜拉鲁肽(Dulaglutide)、利拉鲁肽(Liraglutide)、索马鲁肽(Semaglutide)标准品量效曲线关系

(1)取步骤二感染完获得的活性细胞株以0.07M(M指百万个细胞)/100μl/孔的密度种入96孔板，置于CO₂培养箱，在37℃、5％CO₂及饱和湿度条件下静置培养过夜。

(2)分别制备杜拉鲁肽、利拉鲁肽、索马鲁肽标准品溶液，设置稀释浓度梯度(杜拉鲁肽起始200nmol/L，4倍倍比稀释10个浓度梯度；利拉鲁肽起始3.2nmol/L，3倍倍比稀释10个浓度梯度；索马鲁肽起始200nmol/L，4倍倍比稀释10个浓度梯度)。

(3)小心吸去96孔板培养上清，加入配置好的梯度浓度的标准品溶液100μl/孔，置于CO₂培养箱中静置培养6小时。

(4)再次小心吸去培养上清，加入100μl PBS洗涤2遍，最后加入100μl PBS，多功能微孔板检测仪的荧光检测模块读取荧光强度。

(5)以稀释倍数或药物浓度为横坐标，以荧光强度为纵坐标，利用统计软件Graphpad Prism拟合实验数据，得到药物的剂量效应曲线。

(6)实验结果：筛选得到的单克隆细胞在不同药物刺激下所得到的剂量效应曲线呈典型的反S型曲线，曲线拟合程度高(结果见图4-6)，说明药物浓度与GFP荧光强度存在明显的剂量相关性。

对比例1

化学转染活性细胞株制备与应用

为了比较传统化学转染方法和病毒载体感染法制备细胞株的差异，我们同时将4xCRE-Mini promoter-GFP复合元件亚克隆入pcDNA3.0载体中构建得到pTBpCRE-GFP表达载体(构建流程如图7所示)，再以pTBpCRE-GFP转染RIN-m5F细胞制备了以pTBpCRE-GFP为基础的活性细胞株。具体过程如下所示：

(1)将质粒pcDNA3.0(Invitrogen)进行SmaI和BstBI双酶切，通过胶回收纯化方法获得带开放性粘性末端线性化载体。

(2)以pLPCX质粒(Clontech)为模板，PCR扩增Puro(嘌呤霉素)基因片段，扩增产物大小为640bp，NruI和ClaI双酶切后纯化回收酶切产物。PCR的引物为：

PuroP1:5’-ACATCGCGACCCCTCACAAGGAGACGA-3’；

PuroP2:5’-TGGATCGATTCAGGCACCGGGCTTGC-3’。

PCR反应体系为50μl：模板pLPCX质粒1ng(1μl)、浓度为5μM的引物PuroP1 2μl、浓度为5μM的引物PuroP2 2μl、PrimerSTAR Max mix 25μl、灭菌水补足至50μl。

PCR反应条件如下：98℃3min；98℃10s、55℃5s、72℃45s，共34个循环；最后，72℃5min；4℃∞。

(3)将pcDNA3.0线性化载体与Puro基因片段通过T4 DNA连接酶连接，连接产物转化大肠杆菌TOP10感受态细胞，经阳性单克隆筛选实验(通过测序确定BamHI-SalI酶切后大小分别为7445bp、819bp片段的为阳性克隆)，可获得pcDNA3.0-Puro(简写为pPuro)重组质粒及能够稳定复制该重组质粒的工程菌株。

(4)再将质粒pPuro载体进行XhoI和NruI双酶切，通过胶回收纯化方法获得带开放性粘性末端线性化载体。

(5)合成NruI-Transcription Blocker-4xCRE-Mini promoter-GFP-XhoI核酸片段(序列如SEQ ID NO.3所示，南京金斯瑞生物科技有限公司合成)，并使用NruI和XhoI酶切胶回收获得带开放性粘性末端的NruI-Transcription Blocker-4xCRE-Mini promoter-GFP-XhoI基因片段。

(6)将pPuro线性化载体与纯化回收的NruI-Transcription Blocker-4xCRE-Minipromoter-GFP-XhoI基因片段通过T4 DNA连接酶连接，连接产物转化大肠杆菌TOP10感受态细胞，经阳性单克隆筛选实验(通过测序确定NruI-XhoI酶切后大小分别为4517bp、1429bp片段的为阳性克隆)，最终可获得pTBpCRE-GFP重组质粒及能够稳定复制该重组质粒的工程菌株。

(7)提取高浓度高纯度无内毒素的pTBpCRE-GFP质粒，直接转染RIN-m5F细胞，具体操作方法同实施例1转染步骤(参考Invitrogen^TMLipofectamine^TM3000TransfectionReagent L3000008)。

(8)转染48h后进行终浓度为2μg/ml嘌呤霉素加压筛选，筛选7天，得到稳定细胞库。

(9)步骤(8)获得的稳定细胞库，加入10μmol/L腺甘酸环化酶激活剂Forskolin，刺激6h后测定GFP荧光强度。

(10)步骤(8)获得的稳定细胞库进行杜拉鲁肽量效曲线分析，操作方法同实施例1。

(11)实验结果：化学转染方法加压获得的稳定细胞库加入Forskolin刺激后GFP表达强度增加不明显，远远小于病毒感染法获得的稳定细胞库，由于化学转染法获得的稳定细胞库Forskolin刺激后GFP表达强度较低，筛选获得高响应强度的单克隆细胞株比较困难，而未进行有限稀释分离单克隆细胞株，此稳定细胞库进行杜拉鲁肽量效曲线分析，结果见图8，曲线拟合程度也很高，说明本发明化学转染法制备的低响应强度稳定细胞库进行杜拉鲁肽活性分析，药物浓度与GFP荧光强度也存在较明显的剂量相关性，但GFP表达强度较低。

实施例2

一、pLentiSVRFP-GIPR重组载体构建

(1)以pcDAN3.0质粒(Invitrogen)为模板，通过PCR反应扩增获取SV40片段，ClaI和PstI双酶切后纯化回收酶切产物。PCR的引物为：

SVClaI:5’-ACCATCGATCTGTGGAATGTGTGTCAGTTAGG-3’；

SVPstI:5’-CAACCTGCAGTTGCAAAAGCCTAGGCCTCCA-3’。

体系如下(50μl)：模板pcDNA3.0质粒1ng(1μl)、浓度为5μM的引物SVClaI2μl、浓度为5μM的引物SVPstI2μl、PrimerSTAR Max mix 25μl、灭菌水补足至50μl。

程序：98℃3min；98℃10s、55℃5s、72℃30s，34个循环；72℃5min；4℃∞。

(2)将质粒pLenti-GFP(载体图见图3)进行ClaI和PstI双酶切，通过胶回收纯化方法获得带开放性粘性末端线性化载体。

(3)将pLenti-GFP线性化载体与纯化回收的SV40基因片段通过T4 DNA连接酶连接，连接产物转化大肠杆菌TOP10感受态细胞，经阳性单克隆筛选实验(ClaI-PstI酶切后大小分别为7786bp、348bp片段的为阳性克隆，测序)，最终可获得pLenti-SV40-GFP重组质粒及能够稳定复制该重组质粒的工程菌株。

(4)以pTRIPZ-empty质粒(Invitrogen)为模板，通过PCR反应扩增获取RFP基因片段，PstI和XhoI双酶切后纯化回收酶切产物。PCR的引物为：

RFPstI:5’-CAACCTGCAGGTCGCCACCATGAGCGA-3’；

RFPXhoI:5’-TGAGCTCGAGATCGATTATCTGTGCCCCAGT-3’。

体系如下(50μl)：模板pTRIPZ质粒1ng(1μl)、浓度为5μM的引物RFPstI 2μl、浓度为5μM的引物RFPXhoI 2μl、PrimerSTAR Max mix 25μl、灭菌水补足至50μl。

程序：98℃3min；98℃10s、55℃5s、72℃1min，34个循环；72℃5min；4℃∞。

(5)将质粒pLenti-SV40-GFP进行XhoI和PstI双酶切，通过胶回收纯化方法获得带开放性粘性末端线性化载体。

(6)将pLenti-SV40-GFP线性化载体与纯化回收的RFP基因片段通过T4 DNA连接酶连接，连接产物转化大肠杆菌TOP10感受态细胞，经阳性单克隆筛选实验(XhoI-PstI酶切后大小分别为7352bp、712bp片段的为阳性克隆，测序)，最终可获得pLenti-SV40-RFP重组质粒及能够稳定复制该重组质粒的工程菌株。

(7)委托南京金斯瑞公司合成BamHI-GIPR-SalI核酸片段(序列见SEQ ID NO.4)，BamHI和SalI双酶切后胶回收纯化获得带开放性粘性末端的GIPR片段。

(8)将pLenti-SV40-RFP进行BamHI和SalI双酶切，通过胶回收纯化方法获得带开放性粘性末端线性化载体。

(9)将pLenti-SV40-RFP线性化载体与纯化回收的GIPR基因片段通过T4 DNA连接酶连接，连接产物转化大肠杆菌TOP10感受态细胞，经阳性单克隆筛选实验(BamHI-SalI酶切后大小分别为7444bp、1435bp片段的为阳性克隆，测序)，最终可获得pLentiSVRFP-GIPR重组质粒及能够稳定复制该重组质粒的工程菌株，载体构建流程图见图9。

二、慢病毒载体pLentiCRE-GFP和pLentiSVRFP-GIPR包装和感染

(1)质粒提取：将慢病毒重组载体pLentiCRE-GFP和pLentiSVRFP-GIPR及包装载体pRSV-rev、pMDLg/pRRE、pMD2.G进行质粒提取，获得高浓度高纯度无内毒素的质粒(参照PureLink^TMHiPurePlasmidFilterMidiprepKit(Thermo)中方法)。

(2)细胞培养：复苏293T贴壁细胞(ATCC)，以常规传代培养方法在DMEM完全培养基(含10％胎牛血清，4mM L-谷氨酰胺)中进行传代培养3代以上准备用于共转染病毒包装实验。

(3)慢病毒重组载体pLentiCRE-GFP和pLentiSVRFP-GIPR的包装

(A)共转染前一天(约24小时)，将铺满的293T细胞以1：2.5-3的比例进行传代；转染当天，293T细胞汇合度接近90％。

(B)将1μg pRSV-rev、1μg pMDLg/pRRE、1μg pMD2.G、2μg pLentiCRE-GFP(质量比为1：1：1：2)混合均匀。将1μg pRSV-rev、1μg pMDLg/pRRE、1μg pMD2.G、2μg pLentiSVRFP-GIPR(质量比为1：1：1：2)混合均匀。得到的混匀的DNA溶液分别用于转染进行包装得到病毒。

(C)加入300μl Opti-MEM和12μl P3000到上述混匀的DNA溶液中混合均匀(1号管)，同时将300μl Opti-MEM和12μl

3000混合均匀(2号管)。

(D)同时，分别设置阳性对照组和阴性对照组，阳性对照组以相同的方式共转染pLVX-ZsGreen1-N1(Clontech)质粒和包装质粒(质量比2：1：1：1共转染)，阴性对照组(只转染包装质粒pRSV-rev、pMDLg/pRRE和pMD2.G，质量比1：1：1共同转染)。

(E)将步骤(C)中稀释后的质粒混合液(1号管)加入到转染试剂混合液(2号管)中，轻轻混匀(终体积600μl)，室温下静置20分钟使形成DNA-转染试剂复合体。将DNA-转染试剂复合体混合液加入待转染293T细胞中，继续培养。

(F)共转染后第二天(18-20小时后)，加入终浓度为10mM的丁酸钠。

(G)继续培养10-12小时，小心移除上清，每个T25培养瓶加入3.5ml新鲜无血清DMEM培养基后继续培养。

(H)15-18小时后，培养上清经过0.45μm滤膜过滤后即可获得可用于感染的慢病毒病毒液。

(4)慢病毒感染

(A)病毒感染前一天，对待感染293T贴壁细胞进行传代，感染当天汇合度为30-50％。

(B)吸去293T细胞培养上清，加入经过0.45μm滤膜过滤后的含有CRE-Minipromoter-GFP和PGK-GIPR元件的慢病毒病毒液各1.5ml，轻轻混匀后，8％CO₂、37℃继续培养。

(C)病毒感染后4小时，补加7ml新鲜的DMEM完全培养基(含10％胎牛血清+4mM L-谷氨酰胺)，8％CO₂、37℃继续培养。

(D)病毒感染2天(约48小时)后，细胞进行传代培养，在此步骤中，荧光显微镜下可见离心收集的阳性对照组细胞具有较强的绿色荧光，阴性对照组未见荧光，慢病毒感染实验成功。

三、建立GIP标准品量效曲线关系

(1)取步骤二感染得到的活性细胞株以0.05M/100μl/孔的密度种入96孔板，置于CO₂培养箱，在37℃、5％CO₂及饱和湿度条件下静置培养过夜。

(2)制备GIP标准品溶液，设置稀释浓度梯度(起始30nmol/L，4倍倍比稀释10个浓度梯度)。

(3)小心吸去96孔板培养上清，加入配置好的梯度浓度的标准品溶液100μl/孔，置于CO₂培养箱中静置培养24h。

(4)再次小心吸去培养上清，加入100μl PBS洗涤2遍，最后加入100μl PBS，多功能微孔板检测仪的荧光检测模块读取荧光强度。

(5)以稀释倍数或药物浓度为横坐标，以荧光强度为纵坐标，利用统计软件Graphpad Prism拟合实验数据，得到药物的剂量效应曲线。

(6)实验结果：得到的活性细胞株在药物刺激下所得到的剂量效应曲线呈典型的反S型曲线，曲线拟合程度高(结果见图10)，说明药物浓度与GFP荧光强度存在明显的剂量相关性。

实施例3

一、pLentiSVRFP-GCGR重组载体构建

(1)委托南京金斯瑞公司合成BamHI-GCGR-SalI核酸片段(序列见SEQ ID NO.5)，BamHI和SalI双酶切后胶回收纯化获得带开放性粘性末端的GCGR片段。

(2)将pLenti-SV40-RFP进行BamHI和SalI双酶切，通过胶回收纯化方法获得带开放性粘性末端线性化载体。

(9)将pLenti-SV40-RFP线性化载体与纯化回收的GCGR基因片段通过T4 DNA连接酶连接，连接产物转化大肠杆菌TOP10感受态细胞，经阳性单克隆筛选实验(BamHI-SalI酶切后大小分别为7444bp、1468bp片段的为阳性克隆，测序)，最终可获得pLentiSVRFP-GCGR重组质粒及能够稳定复制该重组质粒的工程菌株，载体构建流程图见图11。

二、慢病毒载体pLentiCRE-GFP和pLentiSVRFP-GCGR包装和感染

(1)质粒提取：将慢病毒重组载体pLentiCRE-GFP和pLentiSVRFP-GCGR及包装载体pRSV-rev、pMDLg/pRRE、pMD2.G进行质粒提取，获得高浓度高纯度无内毒素的质粒(参照PureLink^TMHiPure Plasmid Filter Midiprep Kit(Thermo)中方法)。

(2)细胞培养：复苏293T贴壁细胞(ATCC)，以常规传代培养方法在DMEM完全培养基(含10％胎牛血清，4mM L-谷氨酰胺)中进行传代培养3代以上准备用于共转染病毒包装实验。

(3)慢病毒重组载体pLentiCRE-GFP和pLentiSVRFP-GCGR的包装

(A)共转染前一天(约24小时)，将铺满的293T细胞以1：2.5-3的比例进行传代；转染当天，293T细胞汇合度接近90％。

(B)将1μg pRSV-rev、1μg pMDLg/pRRE、1μg pMD2.G、2μg pLentiCRE-GFP(质量比为1：1：1：2)混合均匀。将1μg pRSV-rev、1μg pMDLg/pRRE、1μg pMD2.G、2μg pLentiSVRFP-GCGR(质量比为1：1：1：2)分别混合均匀。得到的混匀的DNA溶液分别用于转染进行包装得到病毒。

(C)加入300μl Opti-MEM和12μl P3000到上述混匀的DNA溶液中混合均匀(1号管)，同时将300μl Opti-MEM和12μl

3000混合均匀(2号管)。

(D)同时，分别设置阳性对照组和阴性对照组，阳性对照组以相同的方式共转染pLVX-ZsGreen1-N1(Clontech)质粒和包装质粒(质量比2：1：1：1共转染)，阴性对照组(只转染包装质粒pRSV-rev、pMDLg/pRRE和pMD2.G，质量比1：1：1共同转染)。

(E)将步骤(C)中稀释后的质粒混合液(1号管)加入到转染试剂混合液(2号管)中，轻轻混匀(终体积600μl)，室温下静置20分钟使形成DNA-转染试剂复合体。将DNA-转染试剂复合体混合液加入待转染293T细胞中，继续培养。

(F)共转染后第二天(18-20小时后)，加入终浓度为10mM的丁酸钠。

(G)继续培养10-12小时，小心移除上清，每个T25培养瓶加入3.5ml新鲜无血清DMEM培养基后继续培养。

(H)15-18小时后，培养上清经过0.45μm滤膜过滤后即可获得可用于感染的慢病毒病毒液。

(4)慢病毒感染

(A)病毒感染前一天，对待感染293T贴壁细胞进行传代，感染当天汇合度为30-50％。

(B)吸去293T细胞培养上清，加入经过0.45μm滤膜过滤后的含有CRE-Minipromoter-GFP和PGK-GCGR元件的慢病毒病毒液各1.5ml，轻轻混匀后，8％CO₂、37℃继续培养。

(C)病毒感染后4小时，补加7ml新鲜的DMEM完全培养基(含10％胎牛血清+4mM L-谷氨酰胺)，8％CO₂、37℃继续培养。

(D)病毒感染2天(约48小时)后，细胞进行传代培养，在此步骤中，荧光显微镜下可见离心收集的阳性对照组细胞具有较强的绿色荧光，阴性对照组未见荧光，慢病毒感染实验成功。

三、建立GCG标准品量效曲线关系

(1)取步骤二感染得到的活性细胞株以0.05M/100μl/孔的密度种入96孔板，置于CO₂培养箱，在37℃、5％CO₂及饱和湿度条件下静置培养过夜。

(2)制备GCG标准品溶液，设置稀释浓度梯度(起始30nmol/L，4倍倍比稀释10个浓度梯度)。

(3)小心吸去96孔板培养上清，加入配置好的梯度浓度的标准品溶液100μl/孔，置于CO₂培养箱中静置培养24h。

(4)再次小心吸去培养上清，加入100μl PBS洗涤2遍，最后加入100μl PBS，多功能微孔板检测仪的荧光检测模块读取荧光强度。

(5)以稀释倍数或药物浓度为横坐标，以荧光强度为纵坐标，利用统计软件Graphpad Prism拟合实验数据，得到药物的剂量效应曲线。

(6)实验结果：得到的活性细胞株在药物刺激下所得到的剂量效应曲线呈典型的反S型曲线，曲线拟合程度高(结果见图12)，说明药物浓度与GFP荧光强度存在明显的剂量相关性。

实施例4

一、pLentiSVRFP-GLP1R重组载体构建

(1)委托南京金斯瑞公司合成BamHI-GLP1R-SalI核酸片段(序列见SEQ ID NO.6)，BamHI和SalI双酶切后胶回收纯化获得带开放性粘性末端的GLP1R片段。

(2)将pLenti-SV40-RFP进行BamHI和SalI双酶切，通过胶回收纯化方法获得带开放性粘性末端线性化载体。

(9)将pLenti-SV40-RFP线性化载体与纯化回收的GLP1R基因片段通过T4 DNA连接酶连接，连接产物转化大肠杆菌TOP10感受态细胞，经阳性单克隆筛选实验(BamHI-SalI酶切后大小分别为7444bp、1422bp片段的为阳性克隆，测序)，最终可获得pLentiSVRFP-GLP1R重组质粒及能够稳定复制该重组质粒的工程菌株，载体构建流程图见图13。

二、慢病毒载体pLentiCRE-GFP和pLentiSVRFP-GLP1R包装和感染

(1)质粒提取：将慢病毒重组载体pLentiCRE-GFP和pLentiSVRFP-GLP1R及包装载体pRSV-rev、pMDLg/pRRE、pMD2.G进行质粒提取，获得高浓度高纯度无内毒素的质粒(参照PureLink^TMHiPure Plasmid Filter Midiprep Kit(Thermo)中方法)。

(2)细胞培养：复苏293T贴壁细胞(ATCC)，以常规传代培养方法在DMEM完全培养基(含10％胎牛血清，4mM L-谷氨酰胺)中进行传代培养3代以上准备用于共转染病毒包装实验。

(3)慢病毒重组载体pLentiCRE-GFP和pLentiSVRFP-GLP1R的包装

(A)共转染前一天(约24小时)，将铺满的293T细胞以1：2.5-3的比例进行传代；转染当天，293T细胞汇合度接近90％。

(B)将1μg pRSV-rev、1μg pMDLg/pRRE、1μg pMD2.G、2μg pLentiCRE-GFP(质量比为1：1：1：2)混合均匀。将1μg pRSV-rev、1μg pMDLg/pRRE、1μg pMD2.G、2μg pLentiSVRFP-GCGR(质量比为1：1：1：2)分别混合均匀。得到的混匀的DNA溶液分别用于转染进行包装得到病毒。

(C)加入300μl Opti-MEM和12μl P3000到上述混匀的DNA溶液中混合均匀(1号管)，同时将300μl Opti-MEM和12μl

3000混合均匀(2号管)。

(D)同时，分别设置阳性对照组和阴性对照组，阳性对照组以相同的方式共转染pLVX-ZsGreen1-N1(Clontech)质粒和包装质粒(质量比2：1：1：1共转染)，阴性对照组(只转染包装质粒pRSV-rev、pMDLg/pRRE和pMD2.G，质量比1：1：1共同转染)。

(E)将步骤(C)中稀释后的质粒混合液(1号管)加入到转染试剂混合液(2号管)中，轻轻混匀(终体积600μl)，室温下静置20分钟使形成DNA-转染试剂复合体。将DNA-转染试剂复合体混合液加入待转染293T细胞中，继续培养。

(F)共转染后第二天(18-20小时后)，加入终浓度为10mM的丁酸钠。

(G)继续培养10-12小时，小心移除上清，每个T25培养瓶加入3.5ml新鲜无血清DMEM培养基后继续培养。

(H)15-18小时后，培养上清经过0.45μm滤膜过滤后即可获得可用于感染的慢病毒病毒液。

(4)慢病毒感染

(A)病毒感染前一天，对待感染293T贴壁细胞进行传代，感染当天汇合度为30-50％。

(B)吸去293T细胞培养上清，加入经过0.45μm滤膜过滤后的含有CRE-Minipromoter-GFP和PGK-GLP1R元件的慢病毒病毒液各1.5ml，轻轻混匀后，8％CO₂、37℃继续培养。

(C)病毒感染后4小时，补加7ml新鲜的DMEM完全培养基(含10％胎牛血清+4mM L-谷氨酰胺)，8％CO₂、37℃继续培养。

(D)病毒感染2天(约48小时)后，细胞进行传代培养，在此步骤中，荧光显微镜下可见离心收集的阳性对照组细胞具有较强的绿色荧光，阴性对照组未见荧光，慢病毒感染实验成功。

三、建立GLP-1标准品量效曲线关系

(1)取步骤二感染得到的活性细胞株以0.05M/100μl/孔的密度种入96孔板，置于CO₂培养箱，在37℃、5％CO₂及饱和湿度条件下静置培养过夜。

(2)制备GLP-1标准品溶液，设置稀释浓度梯度(起始30nM/L，4倍倍比稀释10个浓度梯度)。

(3)小心吸去96孔板培养上清，加入配置好的梯度浓度的标准品溶液100μl/孔，置于CO₂培养箱中静置培养24h。

(4)再次小心吸去培养上清，加入100μl PBS洗涤2遍，最后加入100μl PBS，多功能微孔板检测仪的荧光检测模块读取荧光强度。

(5)以稀释倍数或药物浓度为横坐标，以荧光强度为纵坐标，利用统计软件Graphpad Prism拟合实验数据，得到药物的剂量效应曲线。

(6)实验结果：得到的活性细胞株在药物刺激下所得到的剂量效应曲线呈典型的反S型曲线，曲线拟合程度高(结果见图14)，说明药物浓度与GFP荧光强度存在明显的剂量相关性。

实施例5

一、pLentiS6RE-GFP重组载体构建

(1)将质粒pLenti-GFP(其物理图谱见图3，序列如SEQ ID NO.1所示)进行ClaI和PstI双酶切，通过胶回收纯化方法获得带开放性粘性末端线性化载体。

(2)合成ClaI-S6RE-Mini promoter-PstI核酸片段(序列如SEQ ID NO.7所示，南京金斯瑞生物科技有限公司合成)，ClaI和PstI双酶切后胶回收纯化获得带开放性粘性末端的S6RE-Mini promoter片段。

(3)将pLenti-GFP线性化载体与S6RE-Mini promoter片段通过T4 DNA连接酶连接，连接产物转化大肠杆菌TOP10感受态细胞，经阳性单克隆筛选实验(通过测序确定ClaI-PstI酶切后大小分别为7792bp、209bp片段的为阳性克隆)，最终可获得pLentiS6RE-GFP重组质粒及能够稳定复制该重组质粒的工程菌株，构建流程如图15所示。

二、pLentiCMVStat6-Neo重组载体构建

(1)将质粒pLentiCMV-GFP(其序列如SEQ ID NO.8所示)进行NheI和XhoI双酶切，通过胶回收纯化方法获得带开放性粘性末端线性化载体。

(2)合成NheI-Stat6-XhoI核酸片段(序列如SEQ ID NO.9所示，南京金斯瑞生物科技有限公司合成)，NheI和XhoI双酶切后胶回收纯化获得带开放性粘性末端的NheI-Stat6-XhoI片段。

(3)将pLentiCMV-GFP线性化载体与NheI-Stat6-XhoI片段通过T4 DNA连接酶连接，连接产物转化大肠杆菌TOP10感受态细胞，经阳性单克隆筛选实验(通过测序确定NheI-XhoI酶切后大小分别为7792bp、209bp片段的为阳性克隆)，最终可获得pLentiCMV-Stat6重组质粒及能够稳定复制该重组质粒的工程菌株。

(4)将质粒pLentiCMV-Stat6进行BamHI和SalI双酶切，通过胶回收纯化方法获得带开放性粘性末端线性化载体。

(5)合成BamHI-Neomycin-SalI核酸片段(序列如SEQ ID NO.10所示，南京金斯瑞生物科技有限公司合成)，BamHI和SalI双酶切后胶回收纯化获得带开放性粘性末端的BamHI-Neomycin-SalI片段。

(6)将pLentiCMV-Stat6线性化载体与BamHI-Neomycin-SalI片段通过T4 DNA连接酶连接，连接产物转化大肠杆菌TOP10感受态细胞，经阳性单克隆筛选实验(通过测序确定BamHI-SalI酶切后大小分别为7792bp、209bp片段的为阳性克隆)，最终可获得pLentiCMVStat6-Neo重组质粒及能够稳定复制该重组质粒的工程菌株，构建流程如图16所示。

三、慢病毒重组载体pLentiS6RE-GFP和pLentiCMVStat6-Neo包装和感染

(1)质粒提取：将慢病毒重组载体pLentiS6RE-GFP、pLentiCMVStat6-Neo及包装载体pRSV-Rev、pMDLg/pRRE、pMD2.G进行质粒提取，获得高浓度高纯度无内毒素的质粒(参照PureLink^TMHiPure Plasmid Filter Midiprep Kit(Thermo)中方法)。

(2)细胞培养：复苏HEK-293T贴壁细胞，以常规传代培养方法在DMEM完全培养基(含10％胎牛血清，4mM L-谷氨酰胺)中进行传代培养3代以上，用于慢病毒包装实验。

(3)慢病毒重组载体pLentiS6RE-GFP和pLentiCMVStat6-Neo的包装

(A)共转染前一天(约24小时)，将铺满的HEK-293T细胞以1：2.5-3的比例进行传代；转染当天，HEK-293T细胞汇合度接近90％。

(B)将1μg pRSV-Rev、1μg pMDLg/pRRE、1μg pMD2.G、2μg pLentiS6RE-GFP(质量比为1：1：1：2)和1μg pRSV-Rev、1μg pMDLg/pRRE、1μg pMD2.G、2μg pLentiCMVStat6-Neo(质量比为1：1：1：2)分别混合均匀，得到DNA混合液A和DNA混合液B。

(C)在步骤(B)中混匀的DNA混合液A中加入300μl Opti-MEM和12μl P3000，混合均匀，得到稀释的DNA溶液(1号管)；同时，将300μl Opti-MEM和12μl

3000混合均匀，得到转染试剂混合液(2号管)。对混合液B的处理方式同对混合液A的处理方式。

(D)分别设置阳性对照组和阴性对照组，阳性对照组以相同的方式共转染pLVX-ZsGreen1-N1(Clontech)质粒和包装质粒pRSV-Rev、pMDLg/pRRE、pMD2.G(质量比为2：1：1：1)，阴性对照组只转染包装质粒pRSV-Rev、pMDLg/pRRE和pMD2.G(质量比为1：1：1)。

(E)将步骤(C)中稀释后的质粒混合液(1号管)分别加入到转染试剂混合液(2号管)中，轻轻混匀(终体积600μl)，室温下静置20分钟使形成DNA-转染试剂复合体。然后，将DNA-转染试剂复合体混合液分别加入待转染HEK-293T细胞中，继续培养。

(F)共转染后第二天(18-20小时后)，在转染HEK-293T细胞中分别加入终浓度为10mM的丁酸钠。

(G)继续培养10-12小时，小心移除上清，分别加入3.5ml新鲜无血清DMEM培养基后继续培养。

(H)培养15-18小时后，培养上清分别经过0.45μm滤膜过滤后即可获得可用于感染的病毒液(分别为含有S6RE-Mini promoter-GFP的病毒液和含有CMV-Stat6元件的病毒液)。

(4)慢病毒感染

(A)病毒感染前一天，对待感染293T进行传代，感染当天，293T细胞汇合度为30-50％。所用的培养基为DMEM+10％FBS+4mmol/L谷氨酰胺。

(B)吸去293T细胞培养上清，加入步骤(3)获得的含有S6RE-Mini promoter-GFP的病毒液和含有CMV-Stat6元件的病毒液各1.5ml，轻轻混匀后，5％CO₂、37℃继续培养。

(C)病毒感染后4小时，补加7ml新鲜的DMEM完全培养基(含10％胎牛血清+4mM L-谷氨酰胺)，5％CO₂、37℃继续培养。

(D)病毒感染2天(约48小时)后，感染的293T细胞传代培养，在此步骤中，荧光显微镜下可见离心收集的阳性对照组细胞具有较强的绿色荧光，阴性对照组未见荧光，慢病毒感染实验成功。

四、建立Dupilumab单抗原研标准品量效曲线关系

(1)取步骤三感染得到的活性细胞株以0.05M/100μl/孔的密度种入96孔板，置于CO₂培养箱，在37℃、5％CO₂及饱和湿度条件下静置培养过夜。

(2)制备Dupilumab单抗原研标准品溶液，设置稀释浓度梯度(起始0.15mg/ml，3倍倍比稀释10个浓度梯度)。

(3)首先加入10μl 125ng/ml Il4溶液，再加入配置好的梯度浓度的标准品溶液10μl/孔，置于CO₂培养箱中静置培养24h。

(4)再次小心吸去培养上清，加入100μl PBS洗涤2遍，最后加入100μl PBS，多功能微孔板检测仪的荧光检测模块读取荧光强度。

(5)以稀释倍数或药物浓度为横坐标，以荧光强度为纵坐标，利用统计软件Graphpad Prism拟合实验数据，得到药物的剂量效应曲线。

(6)实验结果：得到的活性细胞株在对应药物刺激下所得到的剂量效应曲线呈典型的S型曲线，曲线拟合程度高(结果见图17)，说明药物浓度与GFP荧光强度存在明显的剂量相关性。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 珠海联邦制药股份有限公司

<120> 用于构建筛选药物活性的细胞株模型的慢病毒载体与应用

<160> 16

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 8108

<223> 载体pLenti-GFP

acgcgtgtag tcttatgcaa tactcttgta gtcttgcaac atggtaacga tgagttagca 60

acatgcctta caaggagaga aaaagcaccg tgcatgccga ttggtggaag taaggtggta 120

cgatcgtgcc ttattaggaa ggcaacagac gggtctgaca tggattggac gaaccactga 180

attgccgcat tgcagagata ttgtatttaa gtgcctagct cgatacataa acgggtctct 240

ctggttagac cagatctgag cctgggagct ctctggctaa ctagggaacc cactgcttaa 300

gcctcaataa agcttgcctt gagtgcttca agtagtgtgt gcccgtctgt tgtgtgactc 360

tggtaactag agatccctca gaccctttta gtcagtgtgg aaaatctcta gcagtggcgc 420

ccgaacaggg acttgaaagc gaaagggaaa ccagagctct ctcgacgcag gactcggctt 480

gctgaagcgc gcacggcaag aggcgagggg cggcgactgg tgagtacgcc aaaaattttg 540

actagcggag gctagaagga gagagatggg tgcgagagcg tcagtattaa gcgggggaga 600

attagatcgc gatgggaaaa aattcggtta aggccagggg gaaagaaaaa atataaatta 660

aaacatatag tatgggcaag cagggagcta gaacgattcg cagttaatcc tggcctgtta 720

gaaacatcag aaggctgtag acaaatactg ggacagctac aaccatccct tcagacagga 780

tcagaagaac ttagatcatt atataataca gtagcaaccc tctattgtgt gcatcaaagg 840

atagagataa aagacaccaa ggaagcttta gacaagatag aggaagagca aaacaaaagt 900

aagaccaccg cacagcaagc ggccgctgat cttcagacct ggaggaggag atatgaggga 960

caattggaga agtgaattat ataaatataa agtagtaaaa attgaaccat taggagtagc 1020

acccaccaag gcaaagagaa gagtggtgca gagagaaaaa agagcagtgg gaataggagc 1080

tttgttcctt gggttcttgg gagcagcagg aagcactatg ggcgcagcgt caatgacgct 1140

gacggtacag gccagacaat tattgtctgg tatagtgcag cagcagaaca atttgctgag 1200

ggctattgag gcgcaacagc atctgttgca actcacagtc tggggcatca agcagctcca 1260

ggcaagaatc ctggctgtgg aaagatacct aaaggatcaa cagctcctgg ggatttgggg 1320

ttgctctgga aaactcattt gcaccactgc tgtgccttgg aatgctagtt ggagtaataa 1380

atctctggaa cagatttgga atcacacgac ctggatggag tgggacagag aaattaacaa 1440

ttacacaagc ttaatacact ccttaattga agaatcgcaa aaccagcaag aaaagaatga 1500

acaagaatta ttggaattag ataaatgggc aagtttgtgg aattggttta acataacaaa 1560

ttggctgtgg tatataaaat tattcataat gatagtagga ggcttggtag gtttaagaat 1620

agtttttgct gtactttcta tagtgaatag agttaggcag ggatattcac cattatcgtt 1680

tcagacccac ctcccaaccc cgaggggacc cgacaggccc gaaggaatag aagaagaagg 1740

tggagagaga gacagagaca gatccattcg attagtgaac ggatctcgac ggtatcggtt 1800

aacttttaaa agaaaagggg ggattggggg gtacagtgca ggggaaagaa tagtagacat 1860

aatagcaaca gacatacaaa ctaaagaatt acaaaaacaa attacaaaat tcaaaatttt 1920

atcgatgcag gtccgaggtt ctagacgagt ttactcccta tcagtgatag agaacgatgt 1980

cgagtttact ccctatcagt gatagagaac gtatgtcgag tttactccct atcagtgata 2040

gagaacgtat gtcgagttta ctccctatca gtgatagaga acgtatgtcg agtttatccc 2100

tatcagtgat agagaacgta tgtcgagttt actccctatc agtgatagag aacgtatgtc 2160

gaggtaggcg tgtacggtgg gaggcctata taagcagagc tcgtttagtg aaccgtcaga 2220

tcgcaccggt cagctagcac tgcagcgtct caagcttcag aattctcaga tccgctagcg 2280

ctaccggtcg ccaccatggt gagcaagggc gaggagctgt tcaccggggt ggtgcccatc 2340

ctggtcgagc tggacggcga cgtaaacggc cacaagttca gcgtgtccgg cgagggcgag 2400

ggcgatgcca cctacggcaa gctgaccctg aagttcatct gcaccaccgg caagctgccc 2460

gtgccctggc ccaccctcgt gaccaccctg acctacggcg tgcagtgctt cagccgctac 2520

cccgaccaca tgaagcagca cgacttcttc aagtccgcca tgcccgaagg ctacgtccag 2580

gagcgcacca tcttcttcaa ggacgacggc aactacaaga cccgcgccga ggtgaagttc 2640

gagggcgaca ccctggtgaa ccgcatcgag ctgaagggca tcgacttcaa ggaggacggc 2700

aacatcctgg ggcacaagct ggagtacaac tacaacagcc acaacgtcta tatcatggcc 2760

gacaagcaga agaacggcat caaggtgaac ttcaagatcc gccacaacat cgaggacggc 2820

agcgtgcagc tcgccgacca ctaccagcag aacaccccca tcggcgacgg ccccgtgctg 2880

ctgcccgaca accactacct gagcacccag tccgccctga gcaaagaccc caacgagaag 2940

cgcgatcaca tggtcctgct ggagttcgtg accgccgccg ggatcactct cggcatggac 3000

gagctgtaca agtccggact ctgatctcga gggggttggg gttgcgcctt ttccaaggca 3060

gccctgggtt tgcgcaggga cgcggctgct ctgggcgtgg ttccgggaaa cgcagcggcg 3120

ccgaccctgg gtctcgcaca ttcttcacgt ccgttcgcag cgtcacccgg atcttcgccg 3180

ctacccttgt gggccccccg gcgacgcttc ctgctccgcc cctaagtcgg gaaggttcct 3240

tgcggttcgc ggcgtgccgg acgtgacaaa cggaagccgc acgtctcact agtaccctcg 3300

cagacggaca gcgccaggga gcaatggcag cgcgccgacc gcgatgggct gtggccaata 3360

gcggctgctc agcagggcgc gccgagagca gcggccggga aggggcggtg cgggaggcgg 3420

ggtgtggggc ggtagtgtgg gccctgttcc tgcccgcgcg gtgttccgca ttctgcaagc 3480

ctccggagcg cacgtcggca gtcggctccc tcgttgaccg aatcaccgac ctctctcccc 3540

agggggatcc accggagctt accatgaccg agtacaagcc cacggtgcgc ctcgccaccc 3600

gcgacgacgt ccccagggcc gtacgcaccc tcgccgccgc gttcgccgac taccccgcca 3660

cgcgccacac cgtcgatccg gaccgccaca tcgagcgggt caccgagctg caagaactct 3720

tcctcacgcg cgtcgggctc gacatcggca aggtgtgggt cgcggacgac ggcgccgcgg 3780

tggcggtctg gaccacgccg gagagcgtcg aagcgggggc ggtgttcgcc gagatcggcc 3840

cgcgcatggc cgagttgagc ggttcccggc tggccgcgca gcaacagatg gaaggcctcc 3900

tggcgccgca ccggcccaag gagcccgcgt ggttcctggc caccgtcggc gtctcgcccg 3960

accaccaggg caagggtctg ggcagcgccg tcgtgctccc cggagtggag gcggccgagc 4020

gcgccggggt gcccgccttc ctggagacct ccgcgccccg caacctcccc ttctacgagc 4080

ggctcggctt caccgtcacc gccgacgtcg aggtgcccga aggaccgcgc acctggtgca 4140

tgacccgcaa gcccggtgcc tgagtcgaca atcaacctct ggattacaaa atttgtgaaa 4200

gattgactgg tattcttaac tatgttgctc cttttacgct atgtggatac gctgctttaa 4260

tgcctttgta tcatgctatt gcttcccgta tggctttcat tttctcctcc ttgtataaat 4320

cctggttgct gtctctttat gaggagttgt ggcccgttgt caggcaacgt ggcgtggtgt 4380

gcactgtgtt tgctgacgca acccccactg gttggggcat tgccaccacc tgtcagctcc 4440

tttccgggac tttcgctttc cccctcccta ttgccacggc ggaactcatc gccgcctgcc 4500

ttgcccgctg ctggacaggg gctcggctgt tgggcactga caattccgtg gtgttgtcgg 4560

ggaagctgac gtcctttcca tggctgctcg cctgtgttgc cacctggatt ctgcgcggga 4620

cgtccttctg ctacgtccct tcggccctca atccagcgga ccttccttcc cgcggcctgc 4680

tgccggctct gcggcctctt ccgcgtcttc gccttcgccc tcagacgagt cggatctccc 4740

tttgggccgc ctccccgcct ggaattaatt cgagctcggt acctttaaga ccaatgactt 4800

acaaggcagc tgtagatctt agccactttt taaaagaaaa ggggggactg gaagggctaa 4860

ttcactccca acgaagacaa gatctgcttt ttgcttgtac tgggtctctc tggttagacc 4920

agatctgagc ctgggagctc tctggctaac tagggaaccc actgcttaag cctcaataaa 4980

gcttgccttg agtgcttcaa gtagtgtgtg cccgtctgtt gtgtgactct ggtaactaga 5040

gatccctcag acccttttag tcagtgtgga aaatctctag cagtagtagt tcatgtcatc 5100

ttattattca gtatttataa cttgcaaaga aatgaatatc agagagtgag aggaacttgt 5160

ttattgcagc ttataatggt tacaaataaa gcaatagcat cacaaatttc acaaataaag 5220

catttttttc actgcattct agttgtggtt tgtccaaact catcaatgta tcttatcatg 5280

tctggctcta gctatcccgc ccctaactcc gcccatcccg cccctaactc cgcccagttc 5340

cgcccattct ccgccccatg gctgactaat tttttttatt tatgcagagg ccgaggccgc 5400

ctcggcctct gagctattcc agaagtagtg aggaggcttt tttggaggcc taggcttttg 5460

cgggcccaaa ttcgtaatca tggtcatagc tgtttcctgt gtgaaattgt tatccgctca 5520

caattccaca caacatacga gccggaagca taaagtgtaa agcctggggt gcctaatgag 5580

tgagctaact cacattaatt gcgttgcgct cactgcccgc tttccagtcg ggaaacctgt 5640

cgtgccagct gcattaatga atcggccaac gcgcggggag aggcggtttg cgtattgggc 5700

gctcttccgc ttcctcgctc actgactcgc tgcgctcggt cgttcggctg cggcgagcgg 5760

tatcagctca ctcaaaggcg gtaatacggt tatccacaga atcaggggat aacgcaggaa 5820

agaacatgtg agcaaaaggc cagcaaaagg ccaggaaccg taaaaaggcc gcgttgctgg 5880

cgtttttcca taggctccgc ccccctgacg agcatcacaa aaatcgacgc tcaagtcaga 5940

ggtggcgaaa cccgacagga ctataaagat accaggcgtt tccccctgga agctccctcg 6000

tgcgctctcc tgttccgacc ctgccgctta ccggatacct gtccgccttt ctcccttcgg 6060

gaagcgtggc gctttctcat agctcacgct gtaggtatct cagttcggtg taggtcgttc 6120

gctccaagct gggctgtgtg cacgaacccc ccgttcagcc cgaccgctgc gccttatccg 6180

gtaactatcg tcttgagtcc aacccggtaa gacacgactt atcgccactg gcagcagcca 6240

ctggtaacag gattagcaga gcgaggtatg taggcggtgc tacagagttc ttgaagtggt 6300

ggcctaacta cggctacact agaaggacag tatttggtat ctgcgctctg ctgaagccag 6360

ttaccttcgg aaaaagagtt ggtagctctt gatccggcaa acaaaccacc gctggtagcg 6420

gtggtttttt tgtttgcaag cagcagatta cgcgcagaaa aaaaggatct caagaagatc 6480

ctttgatctt ttctacgggg tctgacgctc agtggaacga aaactcacgt taagggattt 6540

tggtcatgag attatcaaaa aggatcttca cctagatcct tttaaattaa aaatgaagtt 6600

ttaaatcaat ctaaagtata tatgagtaaa cttggtctga cagttaccaa tgcttaatca 6660

gtgaggcacc tatctcagcg atctgtctat ttcgttcatc catagttgcc tgactccccg 6720

tcgtgtagat aactacgata cgggagggct taccatctgg ccccagtgct gcaatgatac 6780

cgcgagaccc acgctcaccg gctccagatt tatcagcaat aaaccagcca gccggaaggg 6840

ccgagcgcag aagtggtcct gcaactttat ccgcctccat ccagtctatt aattgttgcc 6900

gggaagctag agtaagtagt tcgccagtta atagtttgcg caacgttgtt gccattgcta 6960

caggcatcgt ggtgtcacgc tcgtcgtttg gtatggcttc attcagctcc ggttcccaac 7020

gatcaaggcg agttacatga tcccccatgt tgtgcaaaaa agcggttagc tccttcggtc 7080

ctccgatcgt tgtcagaagt aagttggccg cagtgttatc actcatggtt atggcagcac 7140

tgcataattc tcttactgtc atgccatccg taagatgctt ttctgtgact ggtgagtact 7200

caaccaagtc attctgagaa tagtgtatgc ggcgaccgag ttgctcttgc ccggcgtcaa 7260

tacgggataa taccgcgcca catagcagaa ctttaaaagt gctcatcatt ggaaaacgtt 7320

cttcggggcg aaaactctca aggatcttac cgctgttgag atccagttcg atgtaaccca 7380

ctcgtgcacc caactgatct tcagcatctt ttactttcac cagcgtttct gggtgagcaa 7440

aaacaggaag gcaaaatgcc gcaaaaaagg gaataagggc gacacggaaa tgttgaatac 7500

tcatactctt cctttttcaa tattattgaa gcatttatca gggttattgt ctcatgagcg 7560

gatacatatt tgaatgtatt tagaaaaata aacaaatagg ggttccgcgc acatttcccc 7620

gaaaagtgcc acctgacgtc taagaaacca ttattatcat gacattaacc tataaaaata 7680

ggcgtatcac gaggcccttt cgtctcgcgc gtttcggtga tgacggtgaa aacctctgac 7740

acatgcagct cccggagacg gtcacagctt gtctgtaagc ggatgccggg agcagacaag 7800

cccgtcaggg cgcgtcagcg ggtgttggcg ggtgtcgggg ctggcttaac tatgcggcat 7860

cagagcagat tgtactgaga gtgcaccata tgcggtgtga aataccgcac agatgcgtaa 7920

ggagaaaata ccgcatcagg cgccattcgc cattcaggct gcgcaactgt tgggaagggc 7980

gatcggtgcg ggcctcttcg ctattacgcc agctggcgaa agggggatgt gctgcaaggc 8040

gattaagttg ggtaacgcca gggttttccc agtcacgacg ttgtaaaacg acggccagtg 8100

ccaagctg 8108

<210> 2

<211> 218

<223> ClaI-4xCRE-Mini promoter-PstI片段

atcgataacc ggattaccgg gatccatgct agcgcaccag acagtgacgt cagctgccag 60

atcccatggc cgtcatactg tgacgtcttt cagacacccc attgacgtca atgggagaac 120

agatctggcc tcggcggcca agcttcgaag acactagagg gtatataatg gaagctcgac 180

ttccagcttg gcaatccggt actgttggta cactgcag 218

<210> 3

<211> 1251

<223> NruI-Transcription Blocker-4xCRE-Mini promoter-GFP-XhoI片段

tcgcgaaacg ccagcaacgc ggccttttta cggttcctgg ccttttgctg gccttttgct 60

cacatgtaat aaaatatctt tattttcatt acatctgtgt gttggttttt tgtgtgaatc 120

catagtacta acatacgctc tccatcaaaa caaaacgaaa caaaacaaac tagcaaaata 180

ggctgtcccc agtgcaagtg caggtgccag aacatttctc tggcctaact ggccggtacc 240

tgagctcatc gataaccgga ttaccgggat ccatgctagc gcaccagaca gtgacgtcag 300

ctgccagatc ccatggccgt catactgtga cgtctttcag acaccccatt gacgtcaatg 360

ggagaacaga tctggcctcg gcggccaagc ttcgaagaca ctagagggta tataatggaa 420

gctcgacttc cagcttggca atccggtact gttggtacac tgcagcgtct caagcttcag 480

aattctcaga tccgctagcg ctaccggtcg ccaccatggt gagcaagggc gaggagctgt 540

tcaccggggt ggtgcccatc ctggtcgagc tggacggcga cgtaaacggc cacaagttca 600

gcgtgtccgg cgagggcgag ggcgatgcca cctacggcaa gctgaccctg aagttcatct 660

gcaccaccgg caagctgccc gtgccctggc ccaccctcgt gaccaccctg acctacggcg 720

tgcagtgctt cagccgctac cccgaccaca tgaagcagca cgacttcttc aagtccgcca 780

tgcccgaagg ctacgtccag gagcgcacca tcttcttcaa ggacgacggc aactacaaga 840

cccgcgccga ggtgaagttc gagggcgaca ccctggtgaa ccgcatcgag ctgaagggca 900

tcgacttcaa ggaggacggc aacatcctgg ggcacaagct ggagtacaac tacaacagcc 960

acaacgtcta tatcatggcc gacaagcaga agaacggcat caaggtgaac ttcaagatcc 1020

gccacaacat cgaggacggc agcgtgcagc tcgccgacca ctaccagcag aacaccccca 1080

tcggcgacgg ccccgtgctg ctgcccgaca accactacct gagcacccag tccgccctga 1140

gcaaagaccc caacgagaag cgcgatcaca tggtcctgct ggagttcgtg accgccgccg 1200

ggatcactct cggcatggac gagctgtaca agtccggact ctgatctcga g 1251

<210> 4

<211> 1441

<223> BamHI-GIPR-SalI片段

ggatccacga accagaccct tcgccgccct caccatgact acctctccga tcctccagct 60

gctgctgcgg ctctcactgt gcgggctgct gctccagagg gcggagacag gctctaaggg 120

gcagacggcg ggggagctgt accagcgctg ggaacggtac cgcagggagt gccaggagac 180

cttggcagcc gcggaaccgc cttcaggcct cgcctgtaac gggtccttcg atatgtacgt 240

ctgctgggac tatgctgcac ccaatgccac tgcccgtgcg tcctgcccct ggtacctgcc 300

ctggcaccac catgtggctg ccggtttcgt cctccgccag tgtggcagtg atggccaatg 360

gggactttgg agagaccata cacaatgtga gaacccagag aagaatgagg cctttctgga 420

ccaaaggctc atcttggagc ggttgcaggt catgtacact gtcggctact ccctgtctct 480

cgccacactg ctgctagccc tgctcatctt gagtttgttc aggcggctac attgcactag 540

aaactatatc cacatcaacc tgttcacgtc tttcatgctg cgagctgcgg ccattctcag 600

ccgagaccgt ctgctacctc gacctggccc ctaccttggg gaccaggccc ttgcgctgtg 660

gaaccaggcc ctcgctgcct gccgcacggc ccagatcgtg acccagtact gcgtgggtgc 720

caactacacg tggctgctgg tggagggcgt ctacctgcac agtctcctgg tgctcgtggg 780

aggctccgag gagggccact tccgctacta cctgctcctc ggctgggggg cccccgcgct 840

tttcgtcatt ccctgggtga tcgtcaggta cctgtacgag aacacgcagt gctgggagcg 900

caacgaagtc aaggccattt ggtggattat acggaccccc atcctcatga ccatcttgat 960

taatttcctc atttttatcc gcattcttgg cattctcctg tccaagctga ggacacggca 1020

aatgcgctgc cgggattacc ggctgaggct ggctcgctcc acgctgacgc tggtgcccct 1080

gctgggtgtc cacgaggtgg tgtttgctcc cgtgacagag gaacaggccc ggggcgccct 1140

gcgcttcgcc aagctcggct ttgagatctt cctcagctcc ttccagggct tcctggtcag 1200

cgtcctctac tgcttcatca acaaggaggt gcagtcggag atccgccgtg gctggcacca 1260

ctgccgcctg cgccgcagcc tgggcgagga gcaacgccag ctcccggagc gcgccttccg 1320

ggccctgccc tccggctccg gcccgggcga ggtccccacc agccgcggct tgtcctcggg 1380

gaccctccca gggcctggga atgaggccag ccgggagttg gaaagttact gctaggtcga 1440

c 1441

<210> 5

<211> 1474

<223> BamHI-GCGR-SalI片段

ggatcctgtg ggaggcagct agctgcccag aggcatgccc ccctgccagc cacagcgacc 60

cctgctgctg ttgctgctgc tgctggcctg ccagccacag gtcccctccg ctcaggtgat 120

ggacttcctg tttgagaagt ggaagctcta cggtgaccag tgtcaccaca acctgagcct 180

gctgccccct cccacggagc tggtgtgcaa cagaaccttc gacaagtatt cctgctggcc 240

ggacaccccc gccaatacca cggccaacat ctcctgcccc tggtacctgc cttggcacca 300

caaagtgcaa caccgcttcg tgttcaagag atgcgggccc gacggtcagt gggtgcgtgg 360

accccggggg cagccttggc gtgatgcctc ccagtgccag atggatggcg aggagattga 420

ggtccagaag gaggtggcca agatgtacag cagcttccag gtgatgtaca cagtgggcta 480

cagcctgtcc ctgggggccc tgctcctcgc cttggccatc ctggggggcc tcagcaagct 540

gcactgcacc cgcaatgcca tccacgcgaa tctgtttgcg tccttcgtgc tgaaagccag 600

ctccgtgctg gtcattgatg ggctgctcag gacccgctac agccagaaaa ttggcgacga 660

cctcagtgtc agcacctggc tcagtgatgg agcggtggct ggctgccgtg tggccgcggt 720

gttcatgcaa tatggcatcg tggccaacta ctgctggctg ctggtggagg gcctgtacct 780

gcacaacctg ctgggcctgg ccaccctccc cgagaggagc ttcttcagcc tctacctggg 840

catcggctgg ggtgccccca tgctgttcgt cgtcccctgg gcagtggtca agtgtctgtt 900

cgagaacgtc cagtgctgga ccagcaatga caacatgggc ttctggtgga ttctgcggtt 960

ccccgtcttc ctggccatcc tgatcaactt cttcatcttc gtccgcatcg ttcagctgct 1020

cgtggccaag ctgcgggcac ggcagatgca ccacacagac tacaagttcc ggctggccaa 1080

gtccacgctg accctcatcc ctctgctggg cgtccacgaa gtggtcttcg ccttcgtgac 1140

ggacgagcac gcccagggca ccctgcgctc cgccaagctc ttcttcgacc tcttcctcag 1200

ctccttccag ggcctgctgg tggctgtcct ctactgcttc ctcaacaagg aggtgcagtc 1260

ggagctgcgg cggcgttggc accgctggcg cctgggcaaa gtgctatggg aggagcggaa 1320

caccagcaac cacagggcct catcttcgcc cggccacggc cctcccagca aggagctcca 1380

gtttgggagg ggtggtggca gccaggattc atctgcggag acccccttgg ctggtggcct 1440

ccctagattg gctgagagcc ccttctgagt cgac 1474

<210> 6

<211> 1428

<223> BamHI-GLP1R-SalI片段

ggatcctggc ccagtcctga actccccgcc atggccggcg cccccggccc gctgcgcctt 60

gcgctgctgc tgctcgggat ggtgggcagg gccggccccc gcccccaggg tgccactgtg 120

tccctctggg agacggtgca gaaatggcga gaataccgac gccagtgcca gcgctccctg 180

actgaagatc cacctcctgc cacagacttg ttctgcaacc ggaccttcga tgaatacgcc 240

tgctggccag atggggagcc aggctcgttc gtgaatgtca gctgcccctg gtacctgccc 300

tgggccagca gtgtgccgca gggccacgtg taccggttct gcacagctga aggcctctgg 360

ctccagaagg acaactccag cctgccctgg agggacttgt cggagtgcga ggagtccaag 420

cgaggggaaa gaagctcccc ggaggagcag ctcctgttcc tctacatcat ctacacggtg 480

ggctacgcac tctccttctc tgctctggtt atcgcctctg cgatcctcct cggcttcaga 540

cacctgcact gcaccaggaa ctacatccac ctgaacctgt ttgcatcctt catcctgcga 600

gcattgtccg tcttcatcaa ggacgcagcc ctgaagtgga tgtatagcac agccgcccag 660

cagcaccagt gggatgggct cctctcctac caggactctc tgagctgccg cctggtgttt 720

ctgctcatgc agtactgtgt ggcggccaat tactactggc tcttggtgga gggcgtgtac 780

ctgtacacac tgctggcctt ctcggtctta tctgagcaat ggatcttcag gctctacgtg 840

agcataggct ggggtgttcc cctgctgttt gttgtcccct ggggcattgt caagtacctc 900

tatgaggacg agggctgctg gaccaggaac tccaacatga actactggct cattatccgg 960

ctgcccattc tctttgccat tggggtgaac ttcctcatct ttgttcgggt catctgcatc 1020

gtggtatcca aactgaaggc caatctcatg tgcaagacag acatcaaatg cagacttgcc 1080

aagtccacgc tgacactcat ccccctgctg gggactcatg aggtcatctt tgcctttgtg 1140

atggacgagc acgcccgggg gaccctgcgc ttcatcaagc tgtttacaga gctctccttc 1200

acctccttcc aggggctgat ggtggccata ttatactgct ttgtcaacaa tgaggtccag 1260

ctggaatttc ggaagagctg ggagcgctgg cggcttgagc acttgcacat ccagagggac 1320

agcagcatga agcccctcaa gtgtcccacc agcagcctga gcagtggagc cacggcgggc 1380

agcagcatgt acacagccac ttgccaggcc tcttgcagct gagtcgac 1428

<210> 7

<211> 270

<223> ClaI-S6RE-Mini promoter-PstI片段

atcgataact ggccggtacc cgctgttgct caatcgactt cccaagaaca gcgctgttgc 60

tcaatcgact tcccaagaac agcagggatc tggcctcggc ggccaagctc cgctgttgct 120

caatcgactt cccaagaaca gcgctgttgc tcaatcgact tcccaagaac agcagggatc 180

tggcctcggc ggccaagctt agacactaga gggtatataa tggaagctcg acttccagct 240

tggcaatccg gtactgttgg tacactgcag 270

<210> 8

<211> 8411

<223> 质粒pLentiCMV-GFP

acgcgtgtag tcttatgcaa tactcttgta gtcttgcaac atggtaacga tgagttagca 60

acatgcctta caaggagaga aaaagcaccg tgcatgccga ttggtggaag taaggtggta 120

cgatcgtgcc ttattaggaa ggcaacagac gggtctgaca tggattggac gaaccactga 180

attgccgcat tgcagagata ttgtatttaa gtgcctagct cgatacataa acgggtctct 240

ctggttagac cagatctgag cctgggagct ctctggctaa ctagggaacc cactgcttaa 300

gcctcaataa agcttgcctt gagtgcttca agtagtgtgt gcccgtctgt tgtgtgactc 360

tggtaactag agatccctca gaccctttta gtcagtgtgg aaaatctcta gcagtggcgc 420

ccgaacaggg acttgaaagc gaaagggaaa ccagagctct ctcgacgcag gactcggctt 480

gctgaagcgc gcacggcaag aggcgagggg cggcgactgg tgagtacgcc aaaaattttg 540

actagcggag gctagaagga gagagatggg tgcgagagcg tcagtattaa gcgggggaga 600

attagatcgc gatgggaaaa aattcggtta aggccagggg gaaagaaaaa atataaatta 660

aaacatatag tatgggcaag cagggagcta gaacgattcg cagttaatcc tggcctgtta 720

gaaacatcag aaggctgtag acaaatactg ggacagctac aaccatccct tcagacagga 780

tcagaagaac ttagatcatt atataataca gtagcaaccc tctattgtgt gcatcaaagg 840

atagagataa aagacaccaa ggaagcttta gacaagatag aggaagagca aaacaaaagt 900

aagaccaccg cacagcaagc ggccgctgat cttcagacct ggaggaggag atatgaggga 960

caattggaga agtgaattat ataaatataa agtagtaaaa attgaaccat taggagtagc 1020

acccaccaag gcaaagagaa gagtggtgca gagagaaaaa agagcagtgg gaataggagc 1080

tttgttcctt gggttcttgg gagcagcagg aagcactatg ggcgcagcgt caatgacgct 1140

gacggtacag gccagacaat tattgtctgg tatagtgcag cagcagaaca atttgctgag 1200

ggctattgag gcgcaacagc atctgttgca actcacagtc tggggcatca agcagctcca 1260

ggcaagaatc ctggctgtgg aaagatacct aaaggatcaa cagctcctgg ggatttgggg 1320

ttgctctgga aaactcattt gcaccactgc tgtgccttgg aatgctagtt ggagtaataa 1380

atctctggaa cagatttgga atcacacgac ctggatggag tgggacagag aaattaacaa 1440

ttacacaagc ttaatacact ccttaattga agaatcgcaa aaccagcaag aaaagaatga 1500

acaagaatta ttggaattag ataaatgggc aagtttgtgg aattggttta acataacaaa 1560

ttggctgtgg tatataaaat tattcataat gatagtagga ggcttggtag gtttaagaat 1620

agtttttgct gtactttcta tagtgaatag agttaggcag ggatattcac cattatcgtt 1680

tcagacccac ctcccaaccc cgaggggacc cgacaggccc gaaggaatag aagaagaagg 1740

tggagagaga gacagagaca gatccattcg attagtgaac ggatctcgac ggtatcggtt 1800

aacttttaaa agaaaagggg ggattggggg gtacagtgca ggggaaagaa tagtagacat 1860

aatagcaaca gacatacaaa ctaaagaatt acaaaaacaa attacaaaat tcaaaatttt 1920

atcgatgtac gggccagata tacgcgttga cattgattat tgactagtta ttaatagtaa 1980

tcaattacgg ggtcattagt tcatagccca tatatggagt tccgcgttac ataacttacg 2040

gtaaatggcc cgcctggctg accgcccaac gacccccgcc cattgacgtc aataatgacg 2100

tatgttccca tagtaacgcc aatagggact ttccattgac gtcaatgggt ggactattta 2160

cggtaaactg cccacttggc agtacatcaa gtgtatcata tgccaagtac gccccctatt 2220

gacgtcaatg acggtaaatg gcccgcctgg cattatgccc agtacatgac cttatgggac 2280

tttcctactt ggcagtacat ctacgtatta gtcatcgcta ttaccatggt gatgcggttt 2340

tggcagtaca tcaatgggcg tggatagcgg tttgactcac ggggatttcc aagtctccac 2400

cccattgacg tcaatgggag tttgttttgg caccaaaatc aacgggactt tccaaaatgt 2460

cgtaacaact ccgccccatt gacgcaaatg ggcggtaggc gtgtacggtg ggaggtctat 2520

ataagcagag ctctctggct aactgcagcg tctcaagctt cagaattctc agatccgcta 2580

gcgctaccgg tcgccaccat ggtgagcaag ggcgaggagc tgttcaccgg ggtggtgccc 2640

atcctggtcg agctggacgg cgacgtaaac ggccacaagt tcagcgtgtc cggcgagggc 2700

gagggcgatg ccacctacgg caagctgacc ctgaagttca tctgcaccac cggcaagctg 2760

cccgtgccct ggcccaccct cgtgaccacc ctgacctacg gcgtgcagtg cttcagccgc 2820

taccccgacc acatgaagca gcacgacttc ttcaagtccg ccatgcccga aggctacgtc 2880

caggagcgca ccatcttctt caaggacgac ggcaactaca agacccgcgc cgaggtgaag 2940

ttcgagggcg acaccctggt gaaccgcatc gagctgaagg gcatcgactt caaggaggac 3000

ggcaacatcc tggggcacaa gctggagtac aactacaaca gccacaacgt ctatatcatg 3060

gccgacaagc agaagaacgg catcaaggtg aacttcaaga tccgccacaa catcgaggac 3120

ggcagcgtgc agctcgccga ccactaccag cagaacaccc ccatcggcga cggccccgtg 3180

ctgctgcccg acaaccacta cctgagcacc cagtccgccc tgagcaaaga ccccaacgag 3240

aagcgcgatc acatggtcct gctggagttc gtgaccgccg ccgggatcac tctcggcatg 3300

gacgagctgt acaagtccgg actctgatct cgagggggtt ggggttgcgc cttttccaag 3360

gcagccctgg gtttgcgcag ggacgcggct gctctgggcg tggttccggg aaacgcagcg 3420

gcgccgaccc tgggtctcgc acattcttca cgtccgttcg cagcgtcacc cggatcttcg 3480

ccgctaccct tgtgggcccc ccggcgacgc ttcctgctcc gcccctaagt cgggaaggtt 3540

ccttgcggtt cgcggcgtgc cggacgtgac aaacggaagc cgcacgtctc actagtaccc 3600

tcgcagacgg acagcgccag ggagcaatgg cagcgcgccg accgcgatgg gctgtggcca 3660

atagcggctg ctcagcaggg cgcgccgaga gcagcggccg ggaaggggcg gtgcgggagg 3720

cggggtgtgg ggcggtagtg tgggccctgt tcctgcccgc gcggtgttcc gcattctgca 3780

agcctccgga gcgcacgtcg gcagtcggct ccctcgttga ccgaatcacc gacctctctc 3840

cccaggggga tccaccggag cttaccatga ccgagtacaa gcccacggtg cgcctcgcca 3900

cccgcgacga cgtccccagg gccgtacgca ccctcgccgc cgcgttcgcc gactaccccg 3960

ccacgcgcca caccgtcgat ccggaccgcc acatcgagcg ggtcaccgag ctgcaagaac 4020

tcttcctcac gcgcgtcggg ctcgacatcg gcaaggtgtg ggtcgcggac gacggcgccg 4080

cggtggcggt ctggaccacg ccggagagcg tcgaagcggg ggcggtgttc gccgagatcg 4140

gcccgcgcat ggccgagttg agcggttccc ggctggccgc gcagcaacag atggaaggcc 4200

tcctggcgcc gcaccggccc aaggagcccg cgtggttcct ggccaccgtc ggcgtctcgc 4260

ccgaccacca gggcaagggt ctgggcagcg ccgtcgtgct ccccggagtg gaggcggccg 4320

agcgcgccgg ggtgcccgcc ttcctggaga cctccgcgcc ccgcaacctc cccttctacg 4380

agcggctcgg cttcaccgtc accgccgacg tcgaggtgcc cgaaggaccg cgcacctggt 4440

gcatgacccg caagcccggt gcctgagtcg acaatcaacc tctggattac aaaatttgtg 4500

aaagattgac tggtattctt aactatgttg ctccttttac gctatgtgga tacgctgctt 4560

taatgccttt gtatcatgct attgcttccc gtatggcttt cattttctcc tccttgtata 4620

aatcctggtt gctgtctctt tatgaggagt tgtggcccgt tgtcaggcaa cgtggcgtgg 4680

tgtgcactgt gtttgctgac gcaaccccca ctggttgggg cattgccacc acctgtcagc 4740

tcctttccgg gactttcgct ttccccctcc ctattgccac ggcggaactc atcgccgcct 4800

gccttgcccg ctgctggaca ggggctcggc tgttgggcac tgacaattcc gtggtgttgt 4860

cggggaagct gacgtccttt ccatggctgc tcgcctgtgt tgccacctgg attctgcgcg 4920

ggacgtcctt ctgctacgtc ccttcggccc tcaatccagc ggaccttcct tcccgcggcc 4980

tgctgccggc tctgcggcct cttccgcgtc ttcgccttcg ccctcagacg agtcggatct 5040

ccctttgggc cgcctccccg cctggaatta attcgagctc ggtaccttta agaccaatga 5100

cttacaaggc agctgtagat cttagccact ttttaaaaga aaagggggga ctggaagggc 5160

taattcactc ccaacgaaga caagatctgc tttttgcttg tactgggtct ctctggttag 5220

accagatctg agcctgggag ctctctggct aactagggaa cccactgctt aagcctcaat 5280

aaagcttgcc ttgagtgctt caagtagtgt gtgcccgtct gttgtgtgac tctggtaact 5340

agagatccct cagacccttt tagtcagtgt ggaaaatctc tagcagtagt agttcatgtc 5400

atcttattat tcagtattta taacttgcaa agaaatgaat atcagagagt gagaggaact 5460

tgtttattgc agcttataat ggttacaaat aaagcaatag catcacaaat ttcacaaata 5520

aagcattttt ttcactgcat tctagttgtg gtttgtccaa actcatcaat gtatcttatc 5580

atgtctggct ctagctatcc cgcccctaac tccgcccatc ccgcccctaa ctccgcccag 5640

ttccgcccat tctccgcccc atggctgact aatttttttt atttatgcag aggccgaggc 5700

cgcctcggcc tctgagctat tccagaagta gtgaggaggc ttttttggag gcctaggctt 5760

ttgcgggccc aaattcgtaa tcatggtcat agctgtttcc tgtgtgaaat tgttatccgc 5820

tcacaattcc acacaacata cgagccggaa gcataaagtg taaagcctgg ggtgcctaat 5880

gagtgagcta actcacatta attgcgttgc gctcactgcc cgctttccag tcgggaaacc 5940

tgtcgtgcca gctgcattaa tgaatcggcc aacgcgcggg gagaggcggt ttgcgtattg 6000

ggcgctcttc cgcttcctcg ctcactgact cgctgcgctc ggtcgttcgg ctgcggcgag 6060

cggtatcagc tcactcaaag gcggtaatac ggttatccac agaatcaggg gataacgcag 6120

gaaagaacat gtgagcaaaa ggccagcaaa aggccaggaa ccgtaaaaag gccgcgttgc 6180

tggcgttttt ccataggctc cgcccccctg acgagcatca caaaaatcga cgctcaagtc 6240

agaggtggcg aaacccgaca ggactataaa gataccaggc gtttccccct ggaagctccc 6300

tcgtgcgctc tcctgttccg accctgccgc ttaccggata cctgtccgcc tttctccctt 6360

cgggaagcgt ggcgctttct catagctcac gctgtaggta tctcagttcg gtgtaggtcg 6420

ttcgctccaa gctgggctgt gtgcacgaac cccccgttca gcccgaccgc tgcgccttat 6480

ccggtaacta tcgtcttgag tccaacccgg taagacacga cttatcgcca ctggcagcag 6540

ccactggtaa caggattagc agagcgaggt atgtaggcgg tgctacagag ttcttgaagt 6600

ggtggcctaa ctacggctac actagaagga cagtatttgg tatctgcgct ctgctgaagc 6660

cagttacctt cggaaaaaga gttggtagct cttgatccgg caaacaaacc accgctggta 6720

gcggtggttt ttttgtttgc aagcagcaga ttacgcgcag aaaaaaagga tctcaagaag 6780

atcctttgat cttttctacg gggtctgacg ctcagtggaa cgaaaactca cgttaaggga 6840

ttttggtcat gagattatca aaaaggatct tcacctagat ccttttaaat taaaaatgaa 6900

gttttaaatc aatctaaagt atatatgagt aaacttggtc tgacagttac caatgcttaa 6960

tcagtgaggc acctatctca gcgatctgtc tatttcgttc atccatagtt gcctgactcc 7020

ccgtcgtgta gataactacg atacgggagg gcttaccatc tggccccagt gctgcaatga 7080

taccgcgaga cccacgctca ccggctccag atttatcagc aataaaccag ccagccggaa 7140

gggccgagcg cagaagtggt cctgcaactt tatccgcctc catccagtct attaattgtt 7200

gccgggaagc tagagtaagt agttcgccag ttaatagttt gcgcaacgtt gttgccattg 7260

ctacaggcat cgtggtgtca cgctcgtcgt ttggtatggc ttcattcagc tccggttccc 7320

aacgatcaag gcgagttaca tgatccccca tgttgtgcaa aaaagcggtt agctccttcg 7380

gtcctccgat cgttgtcaga agtaagttgg ccgcagtgtt atcactcatg gttatggcag 7440

cactgcataa ttctcttact gtcatgccat ccgtaagatg cttttctgtg actggtgagt 7500

actcaaccaa gtcattctga gaatagtgta tgcggcgacc gagttgctct tgcccggcgt 7560

caatacggga taataccgcg ccacatagca gaactttaaa agtgctcatc attggaaaac 7620

gttcttcggg gcgaaaactc tcaaggatct taccgctgtt gagatccagt tcgatgtaac 7680

ccactcgtgc acccaactga tcttcagcat cttttacttt caccagcgtt tctgggtgag 7740

caaaaacagg aaggcaaaat gccgcaaaaa agggaataag ggcgacacgg aaatgttgaa 7800

tactcatact cttccttttt caatattatt gaagcattta tcagggttat tgtctcatga 7860

gcggatacat atttgaatgt atttagaaaa ataaacaaat aggggttccg cgcacatttc 7920

cccgaaaagt gccacctgac gtctaagaaa ccattattat catgacatta acctataaaa 7980

ataggcgtat cacgaggccc tttcgtctcg cgcgtttcgg tgatgacggt gaaaacctct 8040

gacacatgca gctcccggag acggtcacag cttgtctgta agcggatgcc gggagcagac 8100

aagcccgtca gggcgcgtca gcgggtgttg gcgggtgtcg gggctggctt aactatgcgg 8160

catcagagca gattgtactg agagtgcacc atatgcggtg tgaaataccg cacagatgcg 8220

taaggagaaa ataccgcatc aggcgccatt cgccattcag gctgcgcaac tgttgggaag 8280

ggcgatcggt gcgggcctct tcgctattac gccagctggc gaaaggggga tgtgctgcaa 8340

ggcgattaag ttgggtaacg ccagggtttt cccagtcacg acgttgtaaa acgacggcca 8400

gtgccaagct g 8411

<210> 9

<211> 2583

<223> NheI-Stat6-XhoI片段

ggatccgcta gcgctaccgg tcgccaccat gtctctgtgg ggtctggtct ccaagatgcc 60

cccagaaaaa gtgcagcggc tctatgtgga ctttccccaa cacctgcggc atcttctggg 120

tgactggctg gagagccagc cctgggagtt cctggtcggc tccgacgcct tctgctgcaa 180

cttggctagt gccctacttt cagacactgt ccagcacctt caggcctcgg tgggagagca 240

gggggagggg agcaccatct tgcaacacat cagcaccctt gagagcatat atcagaggga 300

ccccctgaag ctggtggcca ctttcagaca aatacttcaa ggagagaaaa aagctgttat 360

ggaacagttc cgccacttgc caatgccttt ccactggaag caggaagaac tcaagtttaa 420

gacaggcttg cggaggctgc agcaccgagt aggggagatc caccttctcc gagaagccct 480

gcagaagggg gctgaggctg gccaagtgtc tctgcacagc ttgatagaaa ctcctgctaa 540

tgggactggg ccaagtgagg ccctggccat gctactgcag gagaccactg gagagctaga 600

ggcagccaaa gccctagtgc tgaagagaat ccagatttgg aaacggcagc agcagctggc 660

agggaatggc gcaccgtttg aggagagcct ggccccactc caggagaggt gtgaaagcct 720

ggtggacatt tattcccagc tacagcagga ggtaggggcg gctggtgggg agcttgagcc 780

caagacccgg gcatcgctga ctggccggct ggatgaagtc ctgagaaccc tcgtcaccag 840

ttgcttcctg gtggagaagc agccccccca ggtactgaag actcagacca agttccaggc 900

tggagttcga ttcctgttgg gcttgaggtt cctgggggcc ccagccaagc ctccgctggt 960

cagggccgac atggtgacag agaagcaggc gcgggagctg agtgtgcctc agggtcctgg 1020

ggctggagca gaaagcactg gagaaatcat caacaacact gtgcccttgg agaacagcat 1080

tcctgggaac tgctgctctg ccctgttcaa gaacctgctt ctcaagaaga tcaagcggtg 1140

tgagcggaag ggcactgagt ctgtcacaga ggagaagtgc gctgtgctct tctctgccag 1200

cttcacactt ggccccggca aactccccat ccagctccag gccctgtctc tgcccctggt 1260

ggtcatcgtc catggcaacc aagacaacaa tgccaaagcc actatcctgt gggacaatgc 1320

cttctctgag atggaccgcg tgccctttgt ggtggctgag cgggtgccct gggagaagat 1380

gtgtgaaact ctgaacctga agttcatggc tgaggtgggg accaaccggg ggctgctccc 1440

agagcacttc ctcttcctgg cccagaagat cttcaatgac aacagcctca gtatggaggc 1500

cttccagcac cgttctgtgt cctggtcgca gttcaacaag gagatcctgc tgggccgtgg 1560

cttcaccttt tggcagtggt ttgatggtgt cctggacctc accaaacgct gtctccggag 1620

ctactggtct gaccggctga tcattggctt catcagcaaa cagtacgtta ctagccttct 1680

tctcaatgag cccgacggaa cctttctcct ccgcttcagc gactcagaga ttgggggcat 1740

caccattgcc catgtcatcc ggggccagga tggctctcca cagatagaga acatccagcc 1800

attctctgcc aaagacctgt ccattcgctc actgggggac cgaatccggg atcttgctca 1860

gctcaaaaat ctctatccca agaagcccaa ggatgaggct ttccggagcc actacaagcc 1920

tgaacagatg ggtaaggatg gcaggggtta tgtcccagct accatcaaga tgaccgtgga 1980

aagggaccaa ccacttccta ccccagagct ccagatgcct accatggtgc cttcttatga 2040

ccttggaatg gcccctgatt cctccatgag catgcagctt ggcccagata tggtgcccca 2100

ggtgtaccca ccacactctc actccatccc cccgtatcaa ggcctctccc cagaagaatc 2160

agtcaacgtg ttgtcagcct tccaggagcc tcacctgcag atgcccccca gcctgggcca 2220

gatgagcctg ccctttgacc agcctcaccc ccagggcctg ctgccgtgcc agcctcagga 2280

gcatgctgtg tccagccctg accccctgct ctgctcagat gtgaccatgg tggaagacag 2340

ctgcctgagc cagccagtga cagcgtttcc tcagggcact tggattggtg aagacatatt 2400

ccctcctctg ctgcctccca ctgaacagga cctcactaag cttctcctgg aggggcaagg 2460

ggagtcgggg ggagggtcct tgggggcaca gcccctcctg cagccctccc actatgggca 2520

atctgggatc tcaatgtccc acatggacct aagggccaac cccagttggt gactcgagtc 2580

gac 2583

<210> 10

<211> 625

<223> BamHI-Neomycin-SalI片段

ggatccaccg gagcttacca tgaccgagta caagcccacg gtgcgcctcg ccacccgcga 60

cgacgtcccc agggccgtac gcaccctcgc cgccgcgttc gccgactacc ccgccacgcg 120

ccacaccgtc gatccggacc gccacatcga gcgggtcacc gagctgcaag aactcttcct 180

cacgcgcgtc gggctcgaca tcggcaaggt gtgggtcgcg gacgacggcg ccgcggtggc 240

ggtctggacc acgccggaga gcgtcgaagc gggggcggtg ttcgccgaga tcggcccgcg 300

catggccgag ttgagcggtt cccggctggc cgcgcagcaa cagatggaag gcctcctggc 360

gccgcaccgg cccaaggagc ccgcgtggtt cctggccacc gtcggcgtct cgcccgacca 420

ccagggcaag ggtctgggca gcgccgtcgt gctccccgga gtggaggcgg ccgagcgcgc 480

cggggtgccc gccttcctgg agacctccgc gccccgcaac ctccccttct acgagcggct 540

cggcttcacc gtcaccgccg acgtcgaggt gcccgaagga ccgcgcacct ggtgcatgac 600

ccgcaagccc ggtgcctgag tcgac 625

<210> 11

<211> 27

<223> 引物PuroP1

acatcgcgac ccctcacaag gagacga 27

<210> 12

<211> 26

<223> 引物PuroP2

tggatcgatt caggcaccgg gcttgc 26

<210> 13

<211> 32

<223> 引物SVClaI

accatcgatc tgtggaatgt gtgtcagtta gg 32

<210> 14

<211> 31

<223> 引物SVPstI

caacctgcag ttgcaaaagc ctaggcctcc a 31

<210> 15

<211> 27

<223> 引物RFPstI

caacctgcag gtcgccacca tgagcga 27

<210> 16

<211> 31

<223> 引物RFPXhoI

tgagctcgag atcgattatc tgtgccccag t 31

Claims (10)

1.一种用于构建筛选药物活性的细胞株模型的慢病毒载体，其特征在于：包括复制缺陷型慢病毒载体骨架、应答元件微型启动子和荧光蛋白；应答元件微型启动子和位于应答元件微型启动子下游的荧光蛋白形成复合元件，设置于复制缺陷型慢病毒载体骨架上。

2.根据权利要求1所述的用于构建筛选药物活性的细胞株模型的慢病毒载体，其特征在于：

所述的复制缺陷型慢病毒载体骨架为自主灭活型慢病毒载体；

所述的应答元件微型启动子指的是能与转录因子结合后控制基因转录表达的DNA序列，缺少转录因子结合其本身无或很弱的启动转录；

所述的应答元件包括但不限于CRE或S6RE；

所述的荧光蛋白为绿色荧光蛋白或红色荧光蛋白；

所述的设置于复制缺陷型慢病毒载体骨架上为设置于复制缺陷型慢病毒载体骨架的多克隆位点上。

3.根据权利要求1或2所述的用于构建筛选药物活性的细胞株模型的慢病毒载体，其特征在于通过如下步骤制备得到：以序列如SEQ ID NO.1所示的复制缺陷型慢病毒载体pLenti-GFP为骨架，将应答元件微型启动子构建到复制缺陷型慢病毒载体pLenti-GFP的GFP基因上游，得到用于构建筛选药物活性的细胞株模型的慢病毒载体。

4.权利要求1～3任一项所述的用于构建筛选药物活性的细胞株模型的慢病毒载体在制备筛选药物活性的细胞株模型中的应用。

5.一种筛选药物活性的细胞株模型，其特征在于：是将权利要求1～3任一项所述的用于构建筛选药物活性的细胞株模型的慢病毒载体包装病毒后转导表达药物受体的细胞株得到。

6.根据权利要求5所述的筛选药物活性的细胞株模型，其特征在于：

所述的表达药物受体的细胞株是表达内源药物受体的宿主细胞或是表达外源药物受体的宿主细胞；

所述的表达药物受体的细胞株若是表达有荧光蛋白时，所述的用于构建筛选药物活性的细胞株模型的慢病毒载体中的荧光蛋白是与所述的表达药物受体的细胞株的荧光蛋白是不同的。

7.权利要求5或6所述的筛选药物活性的细胞株模型的制备方法，其特征在于包括如下步骤：

(1)将上述用于构建筛选药物活性的细胞株模型的慢病毒载体与包装质粒共转染包装细胞进行包装，获得可用于感染的病毒液；

(2)将步骤(1)获得的病毒液感染表达药物受体的细胞株；

(3)对步骤(2)的细胞株筛选鉴定获得可以用于药物活性测定的细胞株模型。

8.根据权利要求7所述的筛选药物活性的细胞株模型的制备方法，其特征在于：

步骤(1)中所述的包装的步骤如下：

(a)将所述的用于构建筛选药物活性的细胞株模型的慢病毒载体与包装质粒混合后，得到DNA混合液转染包装细胞；

(b)转染18-20小时后，加入丁酸钠以增强病毒包装效率，处理10-12小时后弃上清换新鲜无血清培养基；

(c)转染43-50小时后，培养上清过滤，获得含应答元件微型启动子和荧光蛋白的病毒液；

步骤(2)中所述的慢病毒感染的步骤如下：

①取步骤(1)获得的病毒液感染表达药物受体的细胞株；

②病毒感染后3～5小时，补加新鲜的完全培养基；

③病毒感染后40～60小时，感染细胞传代培养即为稳转细胞库；

步骤(3)中所述的筛选鉴定的步骤为：加入相应药物刺激步骤(2)得到细胞株，作用6～24h后测定位于应答元件微型启动子下游的荧光蛋白的表达强度，得到用于药物活性测定的细胞株模型。

9.权利要求5或6所述的筛选药物活性的细胞株模型在药物相对活性测定中的应用，其特征在于包括如下步骤：

(I)将所述的筛选药物活性的细胞株模型接种入96孔板中，静置培养；

(II)制备待测药物标准品溶液，设置稀释浓度梯度；

(III)弃去96孔板培养上清，加入配制好的梯度浓度的标准品溶液，继续静置培养；

(IV)弃上清，加入PBS洗涤，再加入PBS，使用多功能微孔板检测仪测定GFP表达的强度；

(V)以稀释倍数或药物浓度为横坐标，以GFP荧光强度为纵坐标，利用统计软件Graphpad Prism拟合实验数据，得到药物的剂量效应曲线。

10.根据权利要求9所述的筛选药物活性的细胞株模型在药物相对活性测定中的应用，其特征在于：

所述的药物为蛋白药物；进一步为Dupilumab单抗、胰高血糖素样肽-1、杜拉鲁肽、利拉鲁肽、索马鲁肽、胰高血糖素或葡萄糖依赖性促胰岛素肽。

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